DE69719497T2

DE69719497T2 - Verfahren zur proteinaufreinigung aus einer proteinhaltigen lösung

Info

Publication number: DE69719497T2
Application number: DE69719497T
Authority: DE
Inventors: Aage Laustsen; Anders Rancke-Madsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2017-03-15
Also published as: ATE233784T1; CN1216899C; EP0894091A1; AU2151997A; EP0894091B1; DK0894091T3; WO1997034919A1; JP2000506534A; DE69719497D1; IN190120B; US6087148A; CN1213377A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches, billiges und sehr effektives Verfahren zur Kristallisation eines Proteins, im speziellen eines Enzyms, das in einer proteinenthaltenden Lösung, wie z. B. einer Fermentationslösung, vorliegt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Enzyme für industrielle Zwecke werden normalerweise als Flüssigkeiten oder amorphe Stoffe bereitgestellt. Ihre bessere Verfügbarkeit als amorphe und nicht als kristalline Stoffe ist vor allen Dingen darauf zurückzuführen, dass die bisher bekannten Verfahren zur Kristallisation von Enzymen im allgemeinen als zu teurer für die Durchführung im industriellen Maßstab angesehen werden.
Eine Vielzahl von Artikeln befasst sich mit der Kristallisation von Enzymen. Es ist schwierig, im Hinblick auf das Ergebnis der spezifischen Kristallisationsmethoden zu verallgemeinern, da die Vorgehensweisen im Hinblick auf das Ergebnis spezifischer Kristallisationsmethoden zu verallgemeinern, da die Technik der Enzymkristallisation höchst empirisch ist.
Die wesentlichen Anforderungen an die meisten der bisher bekannten Proteinas Kristallisationsverfahren sind: Reine, konzentrierte Ausgangslösungen; sehr lange Kristallisationszeiten und große Mengen an Chemikalien, z. B. Salzen [siehe z. B.. Biotechnology and Bioengineering 48 (1995) Seiten 316-323].
Ein industrielles Enzym-Kristallisationsverfahren, in welchem ein wasserlösliches Polymer (wie z. B. Polyethylenglycol) eingesetzt wird, wurde beschrieben (siehe WO 95/0 1989).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein effektives und billiges Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch welches ein kristallines Protein, im speziellen ein Enzym, aus einer Lösung, die das Protein enthält, gewonnen werden kann, und welches keinen Zusatz großer Mengen an Chemikalien, wie z. B. Salzen, erfordert. Ein wichtiger und sehr wertvoller Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass es die Isolierung von kristallinen Proteinen, im besonderen Enzymen, aus einer unreinen, proteinenthaltenden Lösung (im allgemeinen einer Lösung, die zusätzlich zu dem fraglichen Protein noch verschiedene andere Substanzen enthält), im speziellen einer Lösung, die andere Proteine enthält, wie z. B. einer Lösung, die aus einer Fermentationslösung abstammt, in einem hochreinen Zustand ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, hohe Erträge innerhalb kurzer Kristallisationszeiten zu erhalten, und es ist einfach, billig, umweltverträglich und mit den industriellen Anforderung zu vereinbaren.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung und Isolierung eines Proteins in kristalliner Form aus einer proteinenthaltenden Lösung bereit, z. B. einer Lösung, die aus mehr als einem Protein besteht, wie z. B. einer Lösung, die aus einer Fermentationslösung abstammt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Behandeln der proteinenthaltenden Lösung mit einer für die Kristallisation wirksamen Menge eines wassermischbaren (wasserlöslichen) organischen Lösungsmittels; und
b) Isolieren des fraglichen Proteins in kristalliner Form.
Es versteht sich, dass die proteinenthaltenden Lösungen, die im Sinne der Erfindung von besonderer Bedeutung sind, wässrige Lösungen sind (z. B. im allgemeinen Lösungen, in denen Wasser im wesentlichen den gesamten oder zumindest einen Großteil der lösenden Flüssigkeit ausmacht, in der das Protein von Interesse gelöst ist).

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt somit unter anderem ein Verfahren zur Kristallisation eines Proteins (oder eines Polypeptids), das in einer Fermentationslösung vorliegt, zur Verfügung. In diesem Zusammenhang soll sich der Begriff "Fermentation" nicht nur auf durch Mikroorganismen (wie z. B. Bakterien oder Pilze) verursachte Zersetzungs- oder Umsetzungsprozesse beziehen, sondern auch auf entsprechende Prozesse, die durch die Aktivität von Zellen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs verursacht werden.
Eine Fermentationslösung wird normalerweise neben den Proteinen oder Polypeptiden von Interesse zahlreiche andere Substanzen enthalten, wie z. B. Carbohydrate, Salze, Zellen, und andere Metaboliten (z. B. Nukleinsäuren und Proteine oder andere Polypeptide als das bestimmte Protein oder Polypeptid von Interesse
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einer Fermentationslösung angewendet werden soll, ist es vorzuziehen, die Lösung zuerst einer oder mehrerer fest/flüssig Auftrennungstechniken zu unterziehen, z. B. der Ausflockung, der Zentrifugation, der Filtration oder Mikrofiltration, oder irgendeiner Kombination davon.
Das erfindungsgemäße Verfahren scheint überraschend gut bei relativ unreinen Lösungen zu funktionieren, und es wird normalerweise nicht nötig sein, eine Fermentationslösung (oder eine proteinenthaltende Lösung, die z. B. durch Behandlung einer Fermentationslösung mit fest/flüssig-Trennmethoden erhalten wurde) durch die Anwendung chromatographischer Verfahren (z. B. zum Zwecke des Entfernens der Fremdproteine aus der Lösung) vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufzureinigen.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die proteinenthaltende Lösung vor Behandlung mit dem organischen Lösungsmittel bzw. den organischen Lösungsmitteln aufkonzentriert. Solche Konzentrationen können geeigneterweise durch eine oder mehrere bekannte Methoden, z. B. durch Ultrafiltration (reverse Osmose) oder durch Evaporation erreicht werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die proteinenthaltende Lösung einer Methode zur Entfernung von niedermolekularen Substanzen (z. B. Salzen) unterzogen werden. Solche Behandlungen schließen Diafiltration und Dialyse mit ein.
Während das Aufkonzentrieren der proteinenthaltenden Lösung für das Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht essenziell ist, wird es - im Hinblick auf Ertrag und Einfachheit der Handhabung - oft erwünscht sein. Allgemein gesagt, das Aufkonzentrieren des interessierenden Proteins in einer proteinenthaltenden Lösung, die erfindungsgemäß mit organischem Lösungsmittel behandelt werden soll, wird in einem Bereich von 0,1-25% Gewichtsprozent liegen (% w/w; basierend auf dem Gewicht der proteinenthaltenden Lösung), bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 15% w/w, im speziellen 5-15% w/w.
Bevorzugte Proteine im Sinne der Erfindung sind - wie bereits in gewissem Ausmaß oben angedeutet - Enzyme, z. B.:
Hydrolasen (EC 3) [eingeschlossen Proteasen (Peptidasen, EC 3.4); carboxylische Esterhydrolasen (EC 3.1.1), wie z. B. Lipasen (z. B. Triacylglycerollipasen, EC 3.1.1.3); Glycosidasen (EC 3.2), wie z. B. Amylasen (z. B. α-Amylasen, EC 3.2.1.1, β-Amylasen, EC 3.2.1.2, und Glucoamylasen, EC 3.2.1.3), Cellulasen (z. B. Endo- 1,4-β-glucanasen, EC 3.2.1.4) und Xylanasen (z. B. Xylanendo-1,3-β-xylosidasen, EC 3.2.1.32)];
Oxidoreduktasen (EC 1) [eingeschlossen Phenol-Oxidasen wie z. B. Laccasen (EC 3.10.3.2) und andere laccaseverwandte Enzyme, die unter EC 1.10.3 klassifiziert sind; und Peroxidasen (EC 1.11), wie z. B. diejenigen, die unter EC 1.11.1.7 klassifiziert sind]; und
Isomerasen (EC 5) [eingeschlossen Xyloseisomerasen (EC 5.3.1.5)].
Enzyme: Nummern zur Klassifizierung der Enzyme (EC Nummern), die in der vorliegenden Beschreibung mit Ansprüchen belegt werden, stimmen mit denen in Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press Inc., 1992, überein.

Proteasen

Proteasen (Peptidasen), die gemäß der vorliegenden Erfindung kristallisiert werden können, schließen Proteasen mit ein, die durch das Anwenden von Zellen bei Fermentationsprozessen, wie z. B. Zellen eines Mikroorganismus, insbesondere eines Bakteriums oder eines Pilzes, erhältlich sind. Chemisch oder genetisch veränderte Mutanten solcher Proteasen sind mit eingeschlossen.
Die Protease kann eine Serinprotease sein, bevorzugt eine alkalische mikrobielle Protease oder eine trypsinähnliche Protease. Beispiele solcher alkalischer Proteasen sind Subtilisine, vor allen Dingen solche, die aus Bacillus abstammen, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele für trypsinähnliche Proteasen sind Trypsin (z. B. aus dem Schwein oder bovinen Ursprungs) und die Fusarium Protease, beschrieben in WO 89/06270.
Geeignete kommerziell erhältliche Proteaseenzyme schließen solche mit ein, die unter den Handelsnamen Alcalase, Savinase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Maxatase, Maxacal, Maxapem und Properase von Gist-Brocades verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauft werden, und solche, die unter den Handelsnamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauft werden.

Lipasen

Lipasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung kristallisiert werden können, schließen Lipasen mit ein, die durch das Anwenden von Zellen bei Fermentationsprozessen, wie z. B. Zellen eines Mikroorganismus, insbesondere eines Bakteriums oder eines Pilzes, erhältlich sind. Chemisch oder genetisch veränderte Mutanten solcher Lipasen sind eingeschlossen.
Beispiele geeigneter Lipasen schließen eine Humicola lanuginosa Lipase, z. B. wie in EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben, mit ein, eine Rhizomucor miehei Lipase, z. B. wie in EP 238 023 beschrieben, eine Candida Lipase, wie z. B. eine C. antarctica Lipase, z. B. die C. antarctica Lipase A oder B, beschrieben in EP 214 761, eine Pseudomonas Lipase, wie z. B. eine P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes Lipase, z. B. wie in EP 218 272 beschrieben, eine P. cepacia Lipase, z. B. wie in EP 331 376 beschrieben, eine P. stutzeri Lipase, z. B. wie in GB 1,372,034 offenbart, eine P. fluorescens Lipase, eine Bacillus Lipase, z. B. eine B. subtilis Lipase [Dartois et al., Biochemica et Biophysica Acta 1131 (1993), Seiten 253-260], eine B. stearothermophilus Lipase (JP 64/744992) oder eine B. pumilus Lipase (WO 91/16422).
Zahlreiche klonierte Lipasen können im Sinne der Erfindung von Interesse sein. Klonierte Lipasen schließen die Penicillium camembertii Lipase, beschrieben von Yamaguchi et al. [Gene 103 (1991), Seiten 61-67], die Geotricum candidum Lipase [Schimada et al., J. Biochem. 106 (1989), Seiten 383-388], und verschiedene Rhizopus Lipasen, wie z. B. eine R. delemar Lipase [Hass et al., Gene 109 (1991), Seiten 117-113], eine R. niveus Lipase [Kugimiya et al., Biosci. Biotech.Biochem 56 (1992), Seiten 716-719] und eine R. oryzae Lipase mit ein.
Andere Arten von lipolytischen Enzymen, wie z. B. Cutinasen, können ebenso gemäß der Erfindung kristallisiert werden. Beispiele. relevanter Cutinasen sind Cutinasen, die von Pseudomonas mendocina (wie in WO 88/09367 beschrieben) abstammen und Cutinasen, die von Fusarium solani pisi (z. B. in WO 90/09446 beschrieben) abstammen.
Lipasen von besonderem Interesse sind kommerziell erhältliche Lipasen, wie z. B. M1 LipaseTM, LumafastTM und LipomaxTM (Gist-Brocades), LipolaseTM und Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S), und Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).

Amylasen

Amylasen (wie z. B. α- oder β-Amylasen), die gemäß der vorliegenden Erfindung kristallisiert werden können, schließen Amylasen mit ein, die durch das Anwenden von Zellen, wie z. B. Zellen von einem Mikroorganismus, im speziellen eines Bakteriums oder eines Pilzes, bei Fermentationsprozessen erhältlich sind. Chemisch oder genetisch veränderte Mutanten solcher Amylasen sind mit eingeschlossen.
Relevante Amylasen schließen z. B. α-Amylasen mit ein, die aus Bacillus erhalten werden, im besonderen aus einem speziellen Stamm von B. licheniformis, genauer beschrieben im britischen Patent Nr. 1,296,839. Besonders interessante Amylasen sind kommerziell erhältliche Amylasen, einige nicht-beschränkende Beispiele von diesen sind TermamylTM, FungamylTM und BANTM (erhältlich von Novo Nordisk A/S), und RapidaseTM und Maxamyl PTM (erhältlich von Gist-Brocades).
Ähnliche im Sinne der Erfindung interessante Enzyme schließen CGTasen (Cyclodextringlucanotransferasen, EC 2.4.1.19) mit ein, erhältlich z. B. aus Bakterien der Genera Bacillus, Thermoanaerobactor oder Thermoanaerobacterium.

Cellulasen

Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff "Cellulase" auf Enzyme, die die Degradierung von Zellulose zu Glucose, Cellobiose, Cellotriose und anderen Cello-Oligosacchariden katalysieren.
Ein im Sinne der Erfindung besonders geeigneter Typ von Cellulase ist eine Endo- 1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4), bevorzugt eine rekombinante Endo-1,4-β-glucanase.
Cellulasen, die im Sinne der Erfindung für die Kristallisation geeignet sind, schließen mikrobielle Cellulasen, besonders bakterielle Cellulasen oder Cellulasen aus Pilzen, mit ein. Relevante Beispiele bakterieller Cellulasen sind Cellulasen, die aus Bakterien der Stämme entstammen oder von Bakterien der folgenden Genera produziert werden können: Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Clostridium, Microspora, Thermotoga und Caldocellum, sowie Actinomyceten wie z. B. Streptomyceten, Thermonospora und Acidothemus. Relevante Bakterienarten in diesem Zusammenhang schließen Pseudomonas cellulolyticus, Bacillus lautus, Cellulomonas fimi, Microspora bispora, Termomonospora fusca, Termomonospora cellulolyticum und Acidothemus cellulolyticus, mit ein.
Relevante Cellulasen aus Pilzen schließen saure Cellulasen, die aus Pilzen entstammen oder von Pilzen produziert werden können innerhalb der Genera Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Phanaerochaete, Neurospora, Neocallimastix und Botrytis, insbesondere eines Pilzes, der ausgewählt wurde aus Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Myrothecium verrucaria, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Phanaerochaete chrysosporium, Neurospora crassa, Neocallimastix partriciarum und Botrytis cinerea, mit ein.
Andere interessante Cellulasen aus Pilzen sind neutrale oder alkalische Cellulasen, die aus Pilzen abstammen oder von Pilzen produziert werden können, innerhalb der Genera Aspergillus, Penicillium, Myceliophthora, Humicola, Irpex, Fusarium, Stachybotrys, Scopulariopsis, Chaetomium, Mycogone, Verticillium, Myrothecium, Papulospora, Gliocladium, Cephalosporium und Acremonium, wie z. B. ein Pilz, der ausgewählt wurde aus Humicola insolens, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Penicillium janthinellum und Cephalosporium sp., bevorzugt ein Pilz, der ausgewählt wurde unter Humicola insolens DSM 1800, Fusarium oxysporum DSM 2672, Myceliophthora thermophila CBS 117.65, und Cephalosporium sp. RYM-202.
Weitere interessierende Cellulasen sind Varianten, die als Stammcellulase eine aus Pilzen stammende Cellulase oder eine Cellulase bakteriellen Ursprungs haben, z. B. eine Cellulase, die aus einem Pilzstamm innerhalb einer der Genera Humicola, Trichoderma und Fusarium erhalten werden kann.
Oxidoreduktasen: Oxidoreduktasen, die gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zur Kristallisation sind, schließen Peroxidasen und Oxidasen, wie z. B. Laccasen, mit ein.

Peroxidasen

Besonders interessante Enzyme, die eine Peroxidaseaktivität zeigen, sind diejenigen, die unter der Enzymklassifikation EC 1.11.1.7 klassifiziert sind, ebenso wie Fragmente dieser Peroxidaseaktivität- zeigenden Enzyme.
Peroxidasen, die zur Kristallisation nach erfindungsgemäßem Verfahren geeignet sind, sind geeigneterweise Peroxidasen, die durch Mikroorganismen, wie z. B. Pilze oder Bakterien, produziert werden können. Einige bevorzugte Pilze schließen Stämme mit ein, die zur Unterabteilung Deuteromycotina, Klasse Hyphomycetes, z. B. Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium oder Dreschlera gehören, insbesondere Fusarium oxysporum DSM 2672, Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucana IFO 6113, Verticillium alboatrum, Verticillium dahlie, Arthromyces ramosus FERM P-7754, Caldariomyces fumago, Ulacladium chartarum, Embellisia alli oder Dreschlera halodes.
Andere bevorzugte Pilze schließen Stämme mit ein, die zur Unterabteilung Basidiomycotina, Klasse der Basidiomyceten, z. B. Coprinus, Phanerochaete, Coriuolus oder Trametes, gehören, insbesondere Coprinus cinereus f. microsporus IFO 8371, Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (z. B. NA-12) oder Trametes (vorher Polyporus genannt), z. B. T. versicolor (z. B. PR4 28-A).
Weitere bevorzugte Pilze schließen Stämme mit ein, die zur Unterabteilung Zygomycotina, Klasse Mycoraceae, z. B. Rhizopus oder Mucor, gehören, insbesondere Mucor hiemalis.
Einige bevorzugte Bakterien schließen Stämme der Ordnung Actinomycetales, z. B. Streptomyces spheroides ATTC 23965, Streptomyces thermoviolaceus IFO 123 82 oder Streptovarticillum verticillium ssp. verticillium mit ein.
Andere bevorzugte Bakterien schließen Bacillus pumilus ATCC 12905, Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Steptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia ATCC 15958 und Pseudomonas fluorescens NRRL B-11 mit ein.
Weitere bevorzugte Bakterien schließen Stämme mit ein, die zu Myxococcus, z. B. M. virescens, gehören.
Besonders interessante Peroxidasen bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens sind rekombinant hergestellte Peroxidasen, z. B. eine Peroxidase, die von Coprinus sp. abstammt, insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus, wie in WO 92/16634 beschrieben, oder eine Variante davon, wie z. B. eine Variante wie in WO 94/12621 beschrieben.

Laccasen und laccaseverwandte Enzyme

Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließen Laccasen und laccaseverwandte Enzyme die folgenden mit ein: jegliches Laccaseenzym, das in der Enzymklassifikation EC 1.10.3.2 enthalten ist; jegliches Catecholoxidaseenzym, die in der Enzymklassifikation EC 1.10 : 3.1 enthalten sind; jegliches Bilirubinoxidaseenzym, das in der Enzymklassifikation EC 1.3.3.5 enthalten ist; und jegliches Monophenolmonooxygenaseenzym, das in der Enzymklassifikation EC 1.14.18.1 enthalten ist.
Geeignete Laccasen sind Laccasen mikrobiellen Ursprungs, vor allen Dingen Laccasen, die aus Bakterien oder Pilzen (einschließlich filamentöse Pilze und Hefen) gewonnen werden können. Geeignete Beispiele schließen Laccasen mit ein, die aus den Stämmen Aspergillus, Neurospora, z. B. N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, z. B. T. villosa und T. versicolor, Rhizoctonia, z. B. R. solani, Coprinus, z. B. C. plicatilis und C. cinereus, Psarella,Myceliophthora, z. B. M. thermophila, Schytalidium, Polyporus, wie z. B. P. pinsitus, Phlebia, z. B. P. radita (WO 92/01046), oder Coriolus, z. B. C. hirsutus JP 2- 238885, insbesondere Laccasen, die aus Trametes, Myceliophthora, Schytalidium oder Polyporus erhältlich sind, entstammen können.

Organische Lösungsmittel

Wassermischbare organische Lösungsmittel, die zum Einsatz in dem erfindungsgemäßem Verfahren geeignet sind, sind, allgemein gesprochen, Substanzen, die bei Standartatmosphärendruck bei einer Temperatur oder in der Nähe einer Temperatur von 25ºC (einschließlich Temperaturen bis ungefähr 30ºC) Flüssigkeiten sind. Wasserlösliche Polymere, wie z. B. die in WO 95/01989 beanspruchten wasserlöslichen Polymere (einige von diesen - wie z. B. Polyethylenglycole am unteren Ende der molekularen Gewichtsskala derselbigen - können unter den oben erwähnten Temperatur- und Druckbedingungen Flüssigkeiten sein) befinden sich nicht innerhalb des Schutzbereiches der wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel im Kontext der vorliegenden Erfindung.
Geeignete wassermischbare Lösungsmittel im Sinne der Erfindung schließen verschiedene niedere aliphatische Alkohole, besonders C&sub1;-C&sub3;-aliphatische Alkohole, und niedere aliphatische Ketone, besonders C&sub3;-C&sub5;-Ketone, mit ein.
Bevorzugte wassermischbare organische Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die in allen Verhältnissen mit Wasser mischbar sind. Niedere aliphatische Alkohole innerhalb dieser Kategorie schließen alle der C&sub1;-C&sub3;-aliphatischen Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 2-Propanol) und den C&sub4;-Alkohol Tert- Butylalkohol (2-Methyl-2-propanol) mit ein; besonders bevorzugt sind Methanol, Ethanol und 2-Propanol. Des weiteren ist Aceton (2-Propanon) ein bevorzugtes C&sub3;-C&sub5;-Keton.
Andere wassermischbare, niedere aliphatische Alkohole wie z. B. 2-Butanol und Isobutylalkohol (2-Methyl-1-propanol), und wassermischbare C&sub3;-C&sub5;-Ketone wie z. B. Methylethylketon (2-Butanon) und Diethylketon (3-Pentanon) können für bestimmte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sein.
Weitere, im Sinne der vorliegenden Erfindung interessante, wassermischbare organische Lösungsmittel, schließen Glycole, besonders niedere aliphatische Glycole (Diole), wie z. B. Ethylenglycol (1,2-Dihydroxyethan), 1,2-Propylenglycol (1,2-Dihydroxypropan) und 1,3-Propylenglycol (1,3-Dihydroxypropan; auch bekannt als Trimethylenglycol), mit ein.
Obwohl der Gebrauch von wasserlöslichen Polymeren, wie z. B. Polyethylenglycolen und Polypropylenglycolen, zur Kristallisation von industriellen Enzymen aus proteinenthaltenden Lösungen, die verschiedene andere Substanzen/Verunreinigungen (einschließlich andere Proteine) enthalten, beschrieben wurde (siehe WO 95/01989), sind sich die jetzigen Erfinder keiner früheren Offenbarung bewusst, die andeutet oder umfasst, dass einfache, wassermischbare organische Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol oder Ähnliche, erfolgreich und verlässlich dazu verwendet werden können, kristalline Proteine aus unreinen Lösungen zu erhalten, insbesondere aus Lösungen, die andere Proteinarten enthalten (wie Lösungen, die aus Fermentationslösungen abstammen). In der Tat scheint es so, als ob von derartigen Lösungsmitteln bisher im allgemeinen angenommen wurde, dass sie einen schädlichen (z. B. denaturierenden) Effekt auf Proteinmoleküle, wie z. B. Enzyme, in wässrigen Lösungen haben. So z. B. unterrichtet uns ein Übersichtsartikel von A. McPherson (siehe Seite S des Artikels) [Eur. J. Biochem. 189 (1990), Seiten 1-23] im Zusammenhang mit der Kristallisation von Proteinen und Nukleinsäuren, dass (Hervorhebungen hinzugefügt):
"... allgemeine Methoden für die Kristallisation von herkömmlichen Molekülen wie z. B. Evaporation oder Lösen, dramatische Temperaturschwankungen, oder Zusatz von starken organischen Lösungsmitteln ungeeignet und schädlich sind. Sie müssen durch schonendere und begrenztere Techniken ersetzt werden."
Letztgenannte Referenz lehrt ferner (siehe Seite 12 des Dokuments) in Bezug auf frühere Berichte von dem Gebrauch von organischen Lösungsmitteln als Fällmittel für Proteine oder Nukleinsäuren, dass (Hervorhebungen hinzugefügt):
"Im allgemeinen waren die bisher am häufigsten angewendeten organischen Lösungsmittel Ethanol, Aceton, Butanole und einige andere gängige Laborreagenzien... Es mag hier zur Kenntnis genommen werden, dass organische Lösungsmittel bisher im Allgemeinen eher zur Kristallisation von Nukleinsäuren, vor allem tRNA und Doppeloligonukleotiden, angewendet wurden. Hier waren sie das Hauptmittel für das Wachstum der Kristalle. Dies rührt teilweise von der größeren Toleranz von Polynukleotiden gegenüber organischen Lösungsmitteln und ihren polyanionischen Oberflächen her, die anscheinend noch empfindlicher gegenüber dielektrischer Effekten sind als Proteine.
Die einzigen allgemeinen Regeln sind, dass organische Lösungsmittel bei niedrigen Temperaturen oder bei Temperaturen unter 0ºC angewendet werden sollten, und dass sie sehr langsam und unter guter Durchmischung zugefügt werden sollten..."
Die Referenz von McPherson lehrt ferner (siehe Seite 19 derselben) im Zusammenhang mit der Förderung der Kristallbildung von Proteinen, dass (Hervorhebung hinzugefügt):
"Natürlich ist eines der Hauptmittel zur Förderung der periodischen Bildung von Bindungen das, sicherzustellen, dass die Population der zu kristallisierenden Moleküle so homogen wie möglich ist... Das bedeutet nicht nur, dass die kontaminierenden Proteine ungewollter Arten entfernt werden, sondern auch, dass innerhalb einer Zielpopulation alle Individuen absolute physikalische und chemische Konformität annehmen." Daher war es sehr überraschend zu entdecken, dass die Kristallisation eines gewünschten Proteins, im speziellen eines Enzyms, aus einer unreinen, proteinenthaltenden Lösung (wie z. B. einer Lösung, die von einer Fermentationslösung abstammt, die mehr als eine Proteinart enthält) durch die Anwendung eines einfachen, wassermischbaren organischen Lösungsmittels, wie z. B. Ethanol, erreicht werden kann, ohne dass es im allgemeinen nötig ist, z. B. bei niedrigen Temperaturen zu arbeiten oder irgendwelche speziellen Maßnahmen in Bezug auf das Hinzufügen des organischen Lösungsmittels zu ergreifen, wie es McPherson lehrt (siehe Zitat).
Das wassermischbare Lösungsmittel, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet wird, wird normalerweise zu der fraglichen proteinenthaltenden Lösung in einer derartigen Menge hinzugefügt werden, dass die Konzentration des Lösungsmittels in der resultierenden Mischung innerhalb eines Bereichs von 1-50 Gew.-% (% w/w), oft 5-50% w/w, wie 10-50% w/w, z. B. 20-45% w/w, liegt. Jedoch kann es in einigen Fällen, wie z.B bei der Kristallisation bestimmter Lipasen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, nötig sein, einen viel höheren prozentualen Anteil des Lösungsmittels einzusetzen, z. B. einen Anteil, der etwa 90% w/w der Lösungsmittel/Proteinenthaltenden Lösungsmittelmischung entspricht, oder möglicherweise sogar mehr.
Das Hinzufügen von erfindungsgemäßen wassermischbaren organischen Lösungsmitteln zu der proteinenthaltenden Lösung kann z. B. folgendermaßen geschehen: Stufenweise und im wesentlichen kontinuierliche Zugabe des Lösungsmittels; oder Zugabe des Lösungsmittels in mehreren Portionen von gleicher oder verschiedener Größe; oder Zugabe des gesamten Lösungsmittels in einer Portion. Die Wahl der Art, wie das Lösungsmittel zugegeben wird, wird u. a. auf den Löslichkeitseigenschaften nicht nur des interessierenden Proteins oder des interessierenden Polypeptids, sondern auch der verschiedenen Substanzen/Verunreinigungen aufbauen, die sich vom fraglichen Protein unterscheiden.
Als Beispiel kann eine Situation in Betracht gezogen werden, in welcher eine Lipase aus einer sehr unreinen proteinenthaltenden Lösung (erhalten z. B. aus einer Fermentationslösung, die viele Bestandteile enthält), kristallisiert werden soll: Wie in gewisser Weise oben angedeutet wurde, ist die Löslichkeit von Lipasen in wässrigen Medien, die einen hohen Anteil z. B. an einem niedrigen Alkohol wie z. B. Ethanol, enthalten, oft viel größer als die von vielen anderen Arten von Enzymen, und die Kristallisation von solchen Lipasen wird eine Konzentration von z. B. Ethanol erfordern, die so hoch ist, dass sich andere Bestandteile der proteinenthaltenden Lösung abtrennen (z. B. Präzipitieren), ehe eine Konzentration des Lösungsmittels erreicht wird, die ausreichend ist, um die Kristallisation der Lipase zu starten. In solchen Fällen wird es wünschenswert sein, das organische Lösungsmittel in Portionen in Intervallen zuzugeben, die ausreichend sind, damit eine Trennung und darauf folgende Entfernung (z. B. durch Filtration) der ungewollten Feststoffverunreinigungen stattfindet, um Kontaminationen der festen, kristallinen Lipase mit Feststoffverunreinigungen zu vermeiden. Wenn solche Verunreinigungen von der Lösung abgetrennt und entfernt worden sind, kann weiteres organisches Lösungsmittel hinzugefügt werden, um die Konzentration desselben auf einen Spiegel zu erhöhen, der ausreichend ist, um die Kristallisation des interessierenden Enzyms zu starten. Falls geeignet, kann mehr als ein wassermischbares organisches Lösungsmittel in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden. So kann z. B. eine für die Kristallisation wirksame Menge einer Mischung von 2 oder mehreren wassermischbaren organischen Lösungsmitteln in geeigneten Verhältnissen eingesetzt werden, um die Kristallisation des interessierenden Proteins zu bewirken. Als Alternative können z. B. geeignete Mengen verschiedener wassermischbarer organischer Lösungsmittel schrittweise in die proteinenthaltende Lösung zugegeben werden.
In einigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können, zusätzlich zu dem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, geeignete Salze zu der proteinenthaltenden Lösung hinzugefügt werden. Diese werden geeigneterweise Salze sein, die gemäß ihrer eigenen Kristallisationsregeln für Proteine, z. B. Enzyme, angewendet werden können, und solche Salze schließen Acetate-, Sulfate (HSO&sub4;&supmin;/SO&sub4;²&supmin;)-, Carbonate (HCO&sub3;&supmin;/CO&sub3;²&supmin;)- und Phosphate (H&sub2;PO&sub4;&supmin;/HPO&sub4;²&supmin;YPO&sub4;³&supmin;)- z. B. Alkalimetalle (wie z. B. Li&spplus;, Na&spplus; oder K&spplus;)-Salze, Erdalkalimetalle (wie z. B. Ca²&spplus;)-Salze oder deren Mg²&spplus;-Salze mit ein.
Wenn solche Salze im Sinne der Erfindung zusammen mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel zu einer proteinenthaltenden Lösung hinzugefügt werden, wird die geeignete Menge eines solchen Salzes, das hinzugefügt werden soll, unter anderem von der Menge des organischen Lösungsmittels, das hinzugefügt wird, abhängen. So wird z. B., wenn eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird, in dem die Konzentration eines Lösungsmittels (in der Mischung einer proteinenthaltenden Lösung und eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels) im oberen Ende des normalen Bereiches (z. B. in der Nähe von 50% w/w) liegt, typischerweise ein Salz des zu untersuchenden Typs eingeführt, um eine Salzkonzentration bis zu 0,5-1% w/w zu ergeben. Falls jedoch eine niedrigere Konzentration des organischen Lösungsmittels zu benutzen ist, kann diese geeignet sein, die Konzentration des Salzes zu erhöhen.
Es wird offensichtlich sein, dass wassermischbare organische Lösungsmittel des bevorzugten Typs im allgemeinen wieder aus der Lösung, die, nachdem die Kristallisation des zu untersuchenden Proteins fertiggestellt wurde, zurückbleibt, im allgemeinen regeneriert werden können (z. B. durch Destillation) und daher wird es praktikabel - und von einem auf die Umwelt und die Wirtschaft bezogenen Standpunkt aus höchst wünschenswert - sein, solche im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren stehende organische Lösungsmittel zu recyceln und wiederzuverwenden.

Einstellen des pH

Der pH der proteinenthaltenden Lösung, zu der das wassermischbare Lösungsmittel (die wassermischbaren Lösungsmittel) zugegeben wird (werden) bzw. zugegeben wurde (wurden), wird normalerweise auf einen Wert eingestellt werden, der im Hinblick auf die Kristallisation und bevorzugt im Hinblick auf die Proteinstabilität optimal ist. Der optimale Wert für ein gegebenes Protein (z. B. ein Enzym) wird unter anderem von der genauen Natur desselben abhängen und kann z. B. dadurch bestimmt werden, indem ein Versuch durchgeführt wird, bei dem typischerweise begonnen wird, die Kristallisationsmethode bei pH 10 durchzuführen, dann bei pH 9, bei pH 8, bei pH 7.... und so weiter bis hinunter zu pH 3. Falls für ein gegebenes Enzym ein bestimmtes pH-Optimum von z. B. pH 4 und pH 5 gefunden wird, kann innerhalb dieses pH-Bereiches ein Versuch durchgeführt werden, um den optimalen pH-Wert präzise zu ermitteln. Der optimale pH-Wert für die meisten Enzyme wird normalerweise in dem Bereich von pH 4 bis pH 9 liegen.
In einigen Fällen wird es von Vorteil sein, den pH-Wert auf einen Wert einzustellen, der mit dem isoelektrischen Punkt (pI) gleich ist oder der in der Nähe des isoelektrischen Punktes des zu untersuchenden Proteins ist. So wird in einigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens der pH auf einen Wert eingestellt, so dass (pI - 1) = pH = (pI + 1) ist.
In anderen Fällen kann es von Vorteil sein, den pH-Wert allmählich während des Kristallisationsprozesses zu ändern (z. B. um einen pH-Gradienten aufzustellen), oder schrittweise Veränderungen des pH-Wertes während des Kristallisationsprozesses durchzuführen.
Jede geeignete Säure oder Base kann zum Einstellen des pH eingesetzt werden. Verwendete Säuren können entweder anorganisch oder organisch sein. Einige Beispiel sind Hydrochloridsäure, Schwefelsäure, salpetrige Säure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure und Ameisensäure. Bevorzugte Säuren sind Phosphorsäure, Ameisensäure, Zitronensäüre und Essigsäure. Bevorzugte Basen sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid, insbesondere Natriumhydroxid.

Kristallisation

Beim Anwendendes erfindungsgemäßen Verfahrens wird es normalerweise möglich sein, die Kristallisation - ohne dass man irgendwelche Impfkristalle zum Starten der Kristallisation zufügen muss - zu einem zufriedenstellenden Ausmaß innerhalb einer Kristallisationsperiode von weniger als 48 Stunden, häufig innerhalb einer Periode von 36 Stunden oder weniger, und oft innerhalb einer Periode von 24 Stunden oder weniger, durchzuführen. Abhängig von den spezifisch angewendeten Bedingungen, eingeschlossen der Natur des zu kristallisierenden Proteins oder Polypeptids und der Natur der anderen Substanzen (Verunreinigungen), die in der proteinenthaltenden Lösung vorhanden sind, kann die Kristallisation zu einem zufriedenstellenden Ausmaß oft innerhalb einer Periode von 12 Stunden oder weniger, und in einigen Fällen sogar innerhalb einer Periode von ungefähr 6 Stunden, erreicht werden.

Temperatur

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewendet wird, wird die Kristallisation des interessierenden Proteins (z. B. Enzyms) normalerweise bei einer Temperatur über 0ºC sehr zufriedenstellend stattfinden. Im Allgemeinen wird die geeignete Temperatur der proteinenthaltenden Lösung, aus der das Protein auskristallisiert werden soll, zwischen 0ºC und 40ºC liegen, vorzugsweise von 0ºC bis 30ºC, typischerweise eher von 5ºC bis 30ºC, wie z. B. von ungefähr 7ºC bis ungefähr 28ºC.
Falls geeignet, kann auch ein Temperaturgradient über eine geeignete Zeitspanne hinweg (z. B. über eine Zeitspanne von bis zu einigen Stunden) durchgeführt werden, z. B. beginnend bei relativ niedrigen Temperaturen (wie z. B. eine Temperatur im Bereich von ungefähr 0ºC bis ungefähr 7ºC) und dann allmählich (oder alternativ in Schritten) die Temperatur erhöhen bis zur endgültig gewünschten Temperatur. In zahlreichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die endgültige Temperatur oft in der Nähe von 25ºC (z. B. von ungefähr 22ºC bis ungefähr 28ºC) liegen, falls ein allmählicher oder schrittweiser Temperaturanstieg angewendet wird.

Isolation nach der Kristallisation

Das erfindungsgemäße Verfahren verursacht die Kristallisation des Proteins, z. B. des Enzyms. Die Isolation des kristallisierten Proteins kann durch herkömmliche Methoden erreicht werden, z. B. durch Zentrifugation und/oder Filtration, wahlweise mit Trocknen des isolierten Produkts.
Falls das isolierte Protein, speziell ein Enzym, daraufhin zu granulieren ist, kann es angezeigt sein, direkt eine Standartgranulationsmethode durchzuführen, beginnend mit dem feuchten, ungetrockneten Produkt. Das Trocknen wird dann während des Granulationsprozesses stattfinden.
Falls Kristallisationsprodukte von einer sehr hohen Reinheit gewünscht sind, kann das anfängliche, kristalline Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens (welches im allgemeinen von ziemlich hoher Reinheit sein wird) bei einer geeigneten Konzentration in einem angemessenem wässrigen Medium erneut z. B. nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst werden und rekristallisiert werden. Andere Methoden zur Rekristallisation von im wesentlichen reinen Proteinen, wie z. B. Enzymen, können auch angewendet werden. Die Rekristallisation kann natürlich, wie gewünscht, einmal oder mehrere Male wiederholt werden.
Das endgültige kristalline Produkt kann vertrieben und/oder als solches gebraucht werden. Falls gewünscht, können die Kristalle bis zum Erhalt einer passenden Konzentration z. B. in geeignetem Medium gelöst werden (durch den Erzeuger oder durch einen Verbraucher), um ein Flüssig-Phase-Produkt zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein kristallines Proteinprodukt, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden kann oder erhalten wird.
Es wird davon ausgegangen, dass das vorliegende erfindungsgemäße Aufreinigungs-/Kristallisationsverfahren ist nicht nur anwendbar auf Proteine oder Polypeptide ist, sondern auch auf verschiedene andere Arten von Substanzen, eingeschlossen Oligopeptide und Verbindungen, die Oligopeptidsequenzen enthalten.
Solche Substanzen schließen z. B. bestimmte Peptidhormone mit ein.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen dargestellt, die nicht beabsichtigen, den Schutzbereich der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken:

BEISPIEL 1

Kristallisation von Humicola insolens Cellulase unter Einsatz von Ethanol

Eine H. insolens Cellulase (endo-1,4-β-Glucanase) wurde in Aspergillus oryzae kloniert. Die Fermentationslösung, die das fragliche Enzym und ändere Fermentationsnebenprodukte enthält, wurde einer Trommelfiltration und dann einer Ultrafiltration unterzogen (Verwendung von Dow DDS Gr6lpp Membranen; cut-off bei ca. 20 kD). Weiterhin wurde das Ultrafiltrationskonzentrat einer Diafiltration unter der Verwendung von 2 Volumina deionisierten Wassers zur Entfernung von niedermolekularen Substanzen (wie z. B. Salzen) unterzogen. Die resultierende Lösung enthielt 87 g Cellulase pro Liter (51% w/w des Trockenmassegehalts der Lösung ausmachend), und hatte einen pH von 6,7 und eine spezifische Leitfähigkeit von 0,7 mS/cm.
45,9 g von absolutem (99,9%) Ethanol wurden unter Rühren zu 100 g Cellulaselösung hinzugefügt. Die Temperatur wurde bei 27ºC gehalten. Nach 17 Stunden wurden die resultierenden Kristalle durch Zentrifugation geerntet. Die Ausbeute war 85,4%, basierend auf der Bestimmung der cellulolytischen Aktivität des wieder in einer 0,1% w/w wässrigen NaCl-Lösung (das 8-fache Volumen desselben bezogen auf das Volumen der Kristalle) gelösten kristallinen Produkts.
Zur Bestimmung der cellulolytischen Aktivität (z. B. ausgedrückt in sog. S-CEVU- Einheiten) wird ein gemessenes Aliquot der letztgenannten Enzymlösung (das kristalline Produkt, wieder gelöst in 0,1% w/w NaCl) mit Carboxymethylcellulose (CMC; Enzymsubstrat) inkubiert. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt:
Temperatur: 40ºC (temperaturüberwacht)
pH: 7,5 (0,1 M Phosphatpuffer, der 0,1% w/w PEG 6000 enthält)
Substratkonzentration: 3,11% (in dem pH 7,7 Puffer)
Bereich der Enzymkonzentration: 0,097-0,181 S-CEVU/ml
Inkubationszeit: 30 Minuten.
Der cellulolytische Abbau des Substrats resultiert in einer Abnahme der Viskosität, die mit Hilfe eines Vibrationsviskosimeters (Mivi 3000, Sofraser, Frankreich) gemessen wird. Die Abnahme der Viskosität ist proportional zu der cellulolytischen Aktivität der Probe. Die Aktivität in S-CEVU (Stabilized Cellulase Viscosity Units) wird in Relation zu einem geeigneten cellulolytischen Enzymstandart von Novo Nordisk A/S bestimmt.

BEISPIEL 2 (vergleichendes Beispiel)

Kristallisation von Humicola insolens Cellulase unter Verwendung von PEG 300

39,6 g Polyethylenglycol 300 (PEG 300; von BASF) wurden unter Rühren zu 100 g der gleichen Cellulaselösung wie in Beispiel 1 benutzt hinzugefügt. Die Temperatur wurde bei 27ºC gehalten. Nach 20 Stunden wurden die resultierenden Kristalle durch Zentrifugation geerntet. Die Ausbeute, bestimmt wie in Beispiel 1 beschrieben, betrug 83%.
Aus den oberen Beispielen ist ersichtlich, dass der Gebrauch von Ethanol zu einer höheren Ausbeute des kristallinen Produkts führt als der Gebrauch von PEG 300.

BEISPIEL 3

Kristallisation von Humicola insolens Cellulase unter Verwendung von 2- Propanol oder Aceton

Eine Charge einer rohen Fermentationslösung, die in Aspergillus oryzae klonierte H. insolens Cellulase (endo-1,4-β-Glucanase) enthält, wurde mit einem gleichen Gewichtsanteil Wasser verdünnt. Nach Einstellen des pH der verdünnten Lösung auf 9,5 durch Hinzufügen von 10% (w/w) wässriger Natriumhydroxidlösung wurde die Lösung einer Trommelfiltration und dann einer Keimfiltration unter Benutzung einer Seitz EK1 Filterkissen unterzogen.
Das resultierende Filtrat wurde einer Ultrafiltration (unter Benutzung von Dow DDS Gr61pp Membranen) bis zu einem Feststoffgehalt von 22% w/w unterzogen. Weiterhin wurde das Ultrafiltrationskonzentrat einer Diafiltration unter Einsatz von 3 Volumina Leitungswasser unterzogen und dann einer Kohlenstoffbehandlung unter Verwendung von 3% (w/w) PicatifTM FGV 120 Aktivkohle bei einem pH von 5,5 für 2 Stunden bei 30ºC. Der Kohlenstoff wurde dann durch Filtration mit Seitz K900 Filterkissen und Seitz EK1 Filterkissen entfernt. Das resultierende Konzentrat hatte eine spezifische Leitfähigkeit von 1,06 mS/cm.
Der Reinheitsgrad eines gegebenen Konzentrats (cellulaseenthaltende Lösung) wird durch das Bestimmen der Größe des Verhältnisses der optischen Dichte (OD) des Konzentrats bei 440 nm zu dem Gewicht (in Gramm) der aktiven Cellulase in einem Liter der Lösung, z. B. OD&sub4;&sub4;&sub0; nm/g aktive Cellulase, angegeben. Je größer der Wert, um so geringer die Reinheit. Für das oben genannte, kohlenstoffbehandelte, filtrierte Konzentrat betrug der Wert dieses Verhältnisses 21,7, was mit den unten angegebenen Werten (siehe unten) verglichen werden kann, und, auf die gleiche Weise gemessen, mit Lösungen, die aus kristallisierter Cellulase unter der Verwendung von 2-Propanol bzw. Aceton als das wassermischbare Lösungsmittel des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurden.
Nach Einstellen des pH des kohlenstoffbehandelten, filtrierten Konzentrates auf 6,5 wurden Aliquots einbehalten, um die Effektivität von 2-Propanol bzw. Aceton im Hinblick auf die Kristallisation der interessierenden Cellulase zu untersuchen.
Von jedem der 2 Lösungsmittel würden Mengen von 30% w/w bzw. 35% w/w (relativ zum Gewicht des Aliquots des Konzentrats) hinzugefügt und mit den entsprechenden Aliquots der Konzentrate bei einer Temperatur von ungefähr 5ºC gemischt. Nach 15 Minuten bei dieser Temperatur wurde die Temperatur auf 28ºC erhöht und diese Temperatur wurde für 24 Stunden beibehalten. Die resultierenden Kristallsuspensionen wurden durch Zentrifugation geerntet, und jeder der Kristallkuchen wurde durch Auflösen in einem 8-fachen Volumen von 0,1% (w/w) wässriger Natriumchloridlösung formuliert. Für jede Lösung wurden die Cellulaseaktivität (in S-CEVU; siehe Beispiel 1) und OD&sub4;&sub4;&sub0; nm gemessen. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle zusammengefasst:
Aus den obigen Resultaten ist ersichtlich, dass hohe Erträge und hohe Reinheiten des kristallinen Enzymprodukts (in diesem Fall eine Cellulase) mit der Benutzung von 2-Propanol oder Aceton als wassermischbare Lösungsmittel bei den Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden können.

Claims

1. Verfahren zur Aufreinigung und Isolierung eines Proteins in kristalliner Form aus einer proteinenthaltenden Lösung, die aus mehr als einem Protein besteht, wobei das Verfahren umfasst:

a) Behandeln der proteinenthaltenden Lösung mit einer für die Kristallisation wirksamen Menge eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels; und

b) Isolieren des fraglichen Proteins in kristalliner Form, unter der Bedingung, dass das wassermischbare organische Lösungsmittel kein wasserlösliches Polymer ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die proteinenthaltende Lösung einer Fermentationslösung entstammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die proteinenthaltende Lösung eine Lösung ist, die erhalten wird, indem die Fermentationslösung einer Flüssig/Fest-Trennmethode unterzogen wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die proteinenthaltende Lösung vor Zugabe des organischen Lösungsmittels aufkonzentriert wird.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration des Proteins in der proteinenthaltenden Lösung vor Zugabe des organischen Lösungsmittels im Bereich von 0,1-25% w/w, bevorzugt im Bereich von 0,5-15% w/w, wie z. B. im Bereich von 5-15% w/w liegt.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Kristallisation bei einer Temperatur über 0ºC stattfindet.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das aufzureinigende Protein ein Enzym ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Lipasen, Cellulasen, Amylasen und Oxidoreduktasen ausgewählt.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das wassermischbare organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, 2-Propanol und Aceton.