CN119677762A

CN119677762A - 使用多种蛋白质进料使能够在盐溶条件下结晶的蛋白质结晶

Info

Publication number: CN119677762A
Application number: CN202280099011.2A
Authority: CN
Inventors: H·贝特尔森; K·博格伦德·劳里森; N·德拉赫曼
Original assignee: Arla Foods AMBA
Current assignee: Arla Foods AMBA
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2025-03-21
Also published as: WO2024032881A1

Abstract

本发明涉及一种通过目标蛋白质(TP)的结晶来生产包含能够在盐溶条件下结晶的所述TP的产品的改进方法。本发明使用至少两种不同的含TP的蛋白质进料，将其混合以制备TP在其中结晶的过饱和蛋白质溶液。所述蛋白质进料中的一种必须具有至少为提供所述TP的最大结晶产率的pH(pH_MCY,TP)加0.1的pH，并且所述蛋白质进料中的一种必须具有至多为pH_MCY,TP减0.1的pH。

Description

使用多种蛋白质进料使能够在盐溶条件下结晶的蛋白质结晶

技术领域

本发明涉及一种纯化能够在盐溶条件下结晶的蛋白质(目标蛋白质，缩写为TP)的改进方法。在盐溶条件下的结晶通常仅在某个pH范围内才有可能。本发明使用至少两种不同的含TP的蛋白质进料，其pH值确保它们相对于TP不过饱和。然后将含TP的蛋白质进料混合，以提供混合物，所述混合物具有使在盐溶条件下的结晶可行的pH并且相对于TP过饱和。本发明需要使用i)pH高于提供TP的最大结晶产率的pH(pH_MCY,TP)的蛋白质进料，称为“A型进料”，和ii)pH低于pH_MCY,TP的蛋白质进料，称为“B型进料”。

背景技术

蛋白质分级的概念在本领域中是众所周知的，并且在过去几十年期间已经发展成一系列用于制备富含各种蛋白质种类的产品的技术，其中每种蛋白质种类都具有特定的性质和特性。

从乳浆(milk serum)或乳清中分离β-乳球蛋白(BLG)是许多出版物的主题，并且通常涉及多个分离步骤且往往涉及色谱技术以获得纯化的β-乳球蛋白产品。

WO2018/115520描述了通过以盐溶方式和在pH范围5-6下结晶从蛋白质溶液中工业规模分离BLG。然而，WO2018/115520没有公开通过混合如本发明所定义的含BLG的A型蛋白质进料和B型蛋白质进料来制备过饱和乳清蛋白溶液。

WO 2020/002422描述了通过以盐溶方式和在5-6范围内的pH下使用BLG结晶从乳清蛋白溶液中以工业规模去除BLG来生产富含α-乳白蛋白的乳清蛋白产品。然而，WO 2020/002422没有公开通过混合如本发明所定义的含BLG的A型蛋白质进料和B型蛋白质进料来制备过饱和乳清蛋白溶液。

de Jongh等人(Mild Isolation Procedure Discloses New ProteinStructural Properties ofβ-Lactoglobulin,J Dairy Sci.,第84(3)卷,2001,第562-571页)描述了通过酪蛋白的低温酸性凝固以及通过对获得的酸性乳清进行亲和色谱法(DEAE琼脂糖凝胶)和凝胶渗透色谱法的组合，从新鲜挤出的乳汁中纯化出BLG。据称获得的BLG产品中每1g蛋白质含有0.985gβ-乳球蛋白。

Slack等人(Journal of Food Processing and Preservation,第10卷,1986,第19-30页)探究了一种不同的方法，并且通过将脱盐酸性乳清和甜乳清的pH调整至pH 4.65以及通过离心和倾析分离形成的沉淀物，制备了富含BLG的沉淀物。获得的沉淀物粒料被描述为相对不溶，并且在附加BLG中含有显著量的蛋白质杂质。没有观察到晶体形成。应当指出的是，可能在pH 4.65下形成的BLG沉淀物不是BLG晶体。

Palmer(Crystalline Globulin from Cow's Milk,J.Biol.Chem.,第104卷,1934,第359-372页)报告了一种费力且耗时的用于基于酸性乳清生产蛋白质晶体的过程，其使用对不需要的蛋白质的盐沉淀、pH调整和渗析的多种顺序以去除其他不需要的蛋白质。最后，当获得了高度纯化的BLG溶液时，BLG结晶。所述过程持续多于12天并且需要添加甲苯。因此，Palmer中公开的程序与安全食品生产不相容，并且提供的产品显然不可食用。

Aschaffenburg等人(Improved Method for the Preparation of Crystallinebeta-Lactoglobulin and alpha-Lactalbumin from Cow's Milk,Bioch.,第65卷,1957,第273-277页)公开了一种相对于Palmer过程的过程改进的方法，所述改进允许在约几天而不是几周的时间内制备β-乳球蛋白晶体。然而，该改进的方法仍然需要在结晶之前去除不需要的蛋白质，并且还采用甲苯以用于结晶，这使其与安全食品生产不相容。

JP H10 218755A公开了含有产黑色素抑制剂的化妆产品的生产，所述化妆产品包含BLG作为活性成分。该文件还表明，BLG可以例如通过以下过程来分离：将盐酸添加到乳汁中以使酪蛋白沉淀，之后进行过滤以获得乳清。将乳清的pH调整为6.0，并且添加半饱和量的硫酸铵；通过盐析去除沉淀的蛋白质，并且回收滤液。用硫酸铵使滤液饱和并且回收沉淀的蛋白质。将回收的蛋白质再次溶解于水中并且在pH 5.2下渗析以分离出晶体，并且以1L乳清约1.8g的比例制备β-乳球蛋白。然而，JP H10 218755A中描述的所提出的过程的一般过程步骤不足以导致BLG晶体的形成。因此，该文件不含BLG的结晶或BLG晶体的赋能公开。

US2790790公开一种用于从溶液中沉淀出蛋白质的方法，并且更具体地，涉及通过使用氯化钠作为沉淀剂从水溶液中分级沉淀出相对未缀合的蛋白质。该过程表明了可用于在pH 3.6-3.8下通过NaCl诱导的沉淀来分离BLG。在该文件的实例II中，表明可以以平常方式渗析NaCl-沉淀物以形成结晶的β-乳球蛋白。然而，US2790790未证明在pH 3.6-3.8下形成BLG晶体实际上是可能的，并且不含渗析BLG沉淀物的“平常方式”的含义。因此，该文件不含BLG的结晶或BLG晶体的赋能公开。

发明内容

先前已发现，β-乳球蛋白(BLG)可以通过结晶以工业规模有效分离(参见PCT申请WO2018/115520)。这种结晶方法需要加工和处理大量过饱和蛋白质溶液。

本发明人随后发现，WO2018/115520的大规模实施可能导致在过程的预期结晶之前有BLG的非所需结晶。例如，如果BLG结晶发生在对颗粒物的存在敏感的膜过滤单元或其他设备中，这便是个问题。

本发明人还发现，可以通过混合两种或更多种含BLG的蛋白质进料来制备过饱和蛋白质溶液而改进通过结晶的BLG分离并使其更稳健，所述蛋白质进料就其本身而论不具有或仅具有低水平的BLG过饱和，但是当将合并时提供较高的过饱和度。这些蛋白质进料中的一种的pH应为至少5.6并且更优选至少6.0，并且另一种的pH应为至多5.4并且更优选至多5.0。当合并时，两种进料提供pH接近5.5的过饱和BLG蛋白质溶液，本发明人已发现这是对于BLG结晶的产率来说最佳的pH。

合并蛋白质进料的步骤优选通过混合进料来进行，并且不需要使用对蛋白质的结晶敏感的设备。因此，本发明降低或甚至完全避免了早期和不需要的BLG结晶的风险，所述结晶可能导致涉及的过程设备的堵塞和故障。本发明在PCT/EP2022/053010中有所描述。

本发明人还认识到，PCT/EP2022/053010中描述的蛋白质结晶的技术可以应用于能够在盐溶条件下结晶的其他蛋白质种类，诸如像酶和免疫球蛋白。

过饱和蛋白质溶液的形成的示意图示于图1中，其中以足以提供初始蛋白质溶液的量，将一种或多种B型蛋白质进料(其pH小于pH_MCY,TP，并且优选更低)与一种或多种A型蛋白质进料(其pH高于pH_MCY,TP)混合，所述初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP±0.7范围内并且其相对于BLG过饱和。

本发明人发现这种方法对于BLG的大规模结晶非常有利，因为可以在没有或仅有非常有限的早期(因此是不想要的)BLG结晶的风险的情况下生产出单独的A型和B型蛋白质进料。然而，一旦将A型蛋白质进料和B型进料混合，就形成过饱和的初始蛋白质溶液。

图2示意性地示出了BLG结晶的产率如何取决于发生结晶的蛋白质溶液的pH。本发明人已发现最佳pH为大约5.5。因此，通过将酸性较强的B型蛋白质进料与酸性较弱的A型蛋白质进料混合，获得相对于BLG过饱和的初始蛋白质溶液。如果A型蛋白质进料和/或B型蛋白质进料相对于BLG略微过饱和，则初始蛋白质溶液必须甚至更加过饱和。

通过本申请的公开和公知常识所指导，技术人员可以制备A型蛋白质进料和B型蛋白质进料并且将它们混合以提供如本文所述的初始蛋白质溶液。

因此，本发明的一个方面涉及一种制备包含能够在盐溶条件下结晶的目标蛋白质(TP)的产品、优选可食用或药学上可接受的产品的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备包含TP的初始蛋白质溶液，所述初始蛋白质溶液相对于所述TP过饱和并且具有所述TP能够在盐溶条件下结晶的pH，优选在提供所述TP的最大结晶产率的pH(pH_MCY,TP)的+/-0.7个pH单位范围内并且最优选在所述pH_MCY,TP的+/-0.5个pH单位范围内，

b)以盐溶方式使所述过饱和初始蛋白质溶液中的所述TP结晶，从而获得含TP晶体的溶液，以及

c)优选地，将TP晶体与所述含TP晶体的溶液的剩余液体分离，

其中步骤a)涉及通过将一种或多种A型蛋白质进料与一种或多种B型蛋白质进料合并来制备所述初始蛋白质溶液，

并且其中：

-“A型蛋白质进料”被定义为包含所述TP并且pH比pH_MCY,TP高至少0.1个pH单位的蛋白质进料，并且

-“B型蛋白质进料”被定义为包含所述TP并且pH比pH_MCY,TP低至少0.1个pH单位的蛋白质进料，

并且优选地，条件是所述TP不是β-乳球蛋白。

在通过所述方法获得的产品中，TP优选以结晶和/或分离的形式存在。

在本发明上下文中，术语“产品”、“包含TP的产品”和“TP产品”可互换使用并且涉及本发明方法的产品。

“提供TP的最大结晶产率的pH”，缩写为“pH_MCY,TP”，如下进行确定：

确定提供TP的最大结晶产率的pH：

i)制备TP的储备溶液，所述储备溶液具有与本发明方法的步骤a)的预期初始蛋白质溶液相同的组成，但pH为TP的等电点(pI)。确定储备溶液中TP(包括游离TP、可逆沉淀的TP和结晶的TP)的重量百分比。

ii)制备一组样品，每个样品具有不同的pH，因此该组样品的pH范围的跨度为2-11，步长为0.1个pH单位。该组样品通过以下来制备：将相同量的储备溶液计量到玻璃烧杯中，并且通过在搅拌下添加尽可能最小重量的0.5M HCl(水溶液)或0.5M NaOH(水溶液)来调整其pH，以达到每个样品的所需pH。

iii)将样品的温度调整至在本发明方法的步骤b)期间使用的最低温度，但不低于0℃。

iv)将每个样品以TP晶体材料引晶，其添加量使TP晶体材料占引晶的样品中TP的总重量的1％w/w。

v)然后将引晶的样品在温和搅拌下储存24小时，维持步骤iii)中提到的最低温度。随后，将样品在步骤iii)的温度下以10000g离心60分钟；分别回收上清液和沉淀物。通过显微镜法使用偏振光检查每个样品的沉淀物以检查TP晶体材料(其将为双折射的)的存在。如果在沉淀物中发现双折射材料，则分析对应的上清液(优选通过HPLC)以确定其TP的重量百分比。随后，计算回收的上清液中TP的重量和引晶的样品中TP的重量。

vi)每个含TP晶体的样品的结晶产率计算如下：

vii)pH_MCY,TP被确定为提供最高结晶产率的样品的pH。

在本发明的上下文中，短语“在pH_MCY,TP的+/-x个pH单位范围内的pH”意指pH在(pH_MCY,TP-x)至(pH_MCY,TP+x)范围内。例如，如果x＝0.5并且pH_MCY,TP＝5.7，则pH应在(5.7-0.5)至(5.7+0.5)范围内，即在5.2-6.2范围内。

本发明的另一方面涉及可通过本发明方法获得的TP产品。

附图说明

图1示出了方法的步骤a)，其中将A型蛋白质进料与B型蛋白质进料混合以制备初始蛋白质溶液。

图2是如何相对于通过结晶来分离BLG的最佳pH而定位A型蛋白质进料、B型蛋白质进料和初始蛋白质溶液的pH的示意图。

具体实施方式

如上所述，本发明的一个方面涉及一种制备包含能够在盐溶条件下结晶的目标蛋白质(TP)的产品、优选可食用或药学上可接受的产品的方法，所述方法包括以下步骤：

c)优选地，将TP晶体与含TP晶体的溶液的剩余液体分离，

并且其中：

并且优选地，条件是所述TP不是β-乳球蛋白。

在本发明的上下文中，术语“可食用产品”涉及一种产品，其对人类食用和用作食品成分来说是安全的且不含问题量的毒性成分，诸如甲苯或其他不需要的有机溶剂。

在本发明的上下文中，术语“晶体”涉及固体材料，其成分(诸如原子、分子或离子)以高度有序的微观结构排列，从而形成在所有方向上延伸的晶格。TP晶体是以高度有序的微观结构排列，从而形成在所有方向上延伸的晶格的主要含有TP的蛋白质晶体。TP晶体可以例如是单片的或多晶的，并且可以例如是完整的晶体、晶体片段或其组合。例如，当完整的晶体在加工期间受到机械剪切时，形成晶体片段。晶体片段也具有高度有序的晶体微观结构，但可能缺乏完整晶体的均匀表面和/或均匀边缘或角部。对于许多完整BLG晶体的实例，参见例如WO2018115520 A1的图18，并且对于BLG晶体片段的实例，参见WO2018115520A1的图13。在这两种情况下，使用光学显微术可以在视觉上鉴定BLG晶体或晶体片段作为明确定义的紧凑和相干的结构。TP晶体或晶体片段通常至少部分透明。此外，已知蛋白质晶体是双折射的，并且这种光学性质可以用于将未知粒子鉴定为具有晶体结构。另一方面，非结晶TP聚集体看起来轮廓不明确、不透明，并且是大小不规则的开放或多孔团块。

在本发明的上下文中，术语“结晶”涉及蛋白质晶体的形成。结晶可以例如自发地发生或通过添加结晶晶种来引发。

产品优选包含结晶和/或分离形式的TP。包含分离形式的TP的可食用产品包含相对于总固体至少50％w/w的TP。包含结晶形式的TP的可食用产品包含至少一些TP晶体，并且优选显著量的TP晶体。

TP晶体往往可以通过显微术观察，并且甚至可以达到使所述晶体肉眼可见的大小。

在本发明的上下文中，“过饱和”或“关于TP过饱和”的液体含有的溶解的TP的浓度高于在给定物理和化学条件下所述液体中TP的饱和点。术语“过饱和”是在结晶领域中众所周知的(参见例如Gérard Coquerela,“Crystallization of molecular systems fromsolution:phase diagrams,supersaturation and other basic concepts”,ChemicalSociety Reviews,第2286-2300页,第7期,2014)，并且过饱和可以通过许多不同的测量技术(例如，通过光谱学或粒径分析)来确定。在本发明的上下文中，关于TP过饱和是通过以下程序确定的。

用于测试特定条件集合下的液体是否关于TP过饱和的程序：

a)将50ml待测试的液体样品转移至高度115mm、内径25mm并且容量50mL的离心管(VWR目录号525-0402)中。应注意在步骤a)-h)期间保持样品及其后续级分处于液体的原始物理和化学条件下。

b)立即将样品以3000g离心3.0分钟，最大30秒加速并且最大30秒减速。

c)离心之后立即将尽可能多的上清液(如果已形成粒料，则不干扰粒料)转移至第二离心管(与步骤a中的类型相同)。

d)取0.05mL上清液子样品(子样品A)。

e)将10mg粒径为至多200微米的TP晶体(相对于总固体至少98％纯的TP)添加到第二离心管中并搅动所述混合物。

f)使第二离心管在原始温度下静置60分钟。

g)在步骤f)之后立即将第二离心管以500g离心10分钟，然后再取0.05mL上清液子样品(子样品B)。

h)回收步骤g)的离心粒料(如果有的话)，将它重悬于milliQ水中，并立即检查悬浮液中通过显微术可见的晶体的存在。

i)确定子样品A和B中TP的浓度，结果表示为相对于子样品总重量的％TP w/w。子样品A的TP浓度被称为C_TP,A，并且子样品B的TP浓度被称为C_TP,B。

j)如果C_TP,B低于C_TP,A并且在步骤i)中观察到晶体，则步骤a)的样品所取自的液体是过饱和的(在特定条件下)。

在本发明的上下文中，术语“液体”和“溶液”涵盖含有液体和固体或半固体粒子(诸如像蛋白质晶体或其他蛋白质粒子)的组合的组合物。因此，“液体”或“溶液”可以是悬浮液或甚至浆液。然而，“液体”和“溶液”优选是可泵送的。

在本发明的上下文中，包含“TP晶体”的干燥产品(诸如粉末)含有通过干燥TP晶体的悬浮液获得的产品，并且湿TP晶体的晶体结构可能已经在干燥过程期间扭曲并且可能至少部分地已经失去了其X射线衍射特性。同样，术语“干燥TP晶体”和“干燥的TP晶体”是指通过干燥湿TP晶体获得的粒子，并且这种干燥粒子本身不需要具有晶体结构。然而，本发明人已经观察到，当将干燥的TP晶体以2份水比1份干燥的TP晶体的重量比重悬于冷(4℃)的脱盐水中时，TP晶体被再水合并且恢复与干燥之前基本相同的晶体结构(空间群类型和单位晶格尺寸)。

PCT申请WO 2018/115520的上下文中描述的分析方法同样适用于本发明并且应当用于确定本文所述的参数。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述方法不含步骤c)的分离并且提供包含TP晶体和附加蛋白质二者的产品。如果这种方法变体还包括步骤f)的干燥，则它提供含有TP晶体和附加蛋白质的干燥产品。优选地，所述方法含有直接顺序的步骤a)、b)和f)。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述方法还包括洗涤TP晶体，例如从步骤c)获得的分离的TP晶体的步骤d)。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述方法还包括使TP晶体、例如从步骤c)或d)获得的TP晶体重结晶的步骤e)。

所述方法可以例如包括步骤a)、b)、c)、d)和e)或甚至由其组成。替代地，所述方法可以包括步骤a)、b)、c)和e)或甚至由其组成。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，所述方法还包括干燥来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的步骤f)。

所述方法可以例如包括步骤a)、b)和f)或甚至由其组成。

替代地，所述方法可以包括步骤a)、b)、c)和f)或甚至由其组成。

替代地，所述方法可以包括步骤a)、b)、c)、d)和f)或甚至由其组成。

替代地，所述方法可以包括步骤a)、b)、c)、d)、e)和f)或甚至由其组成。

本发明方法优选附带条件，即TP不是β-乳球蛋白并且/或者具有至多50％或甚至更优选至多26％的相对于牛BLG的序列同一性。

在本发明的上下文中，术语“BLG”或“β-乳球蛋白”属于来自哺乳动物物种的例如天然和/或糖基化形式的BLG，并且包括天然存在的遗传变体。术语BLG还涵盖由重组微生物产生的哺乳动物BLG。如本文所用的术语“BLG”或“β-乳球蛋白”排除未折叠和聚集的BLG。β-乳球蛋白是一种脂质运载蛋白，并且可以结合许多疏水分子，表明在它们的运输中起作用。β-乳球蛋白还显示能够通过铁载体结合铁，并且因此可能在对抗病原体方面发挥作用。摄入之后，BLG能够使复合铁穿梭到人免疫细胞中，从而为这些细胞提供微量营养并参与免疫耐受。

所述目标蛋白质优选包含有包含至少30个连续氨基酸残基、更优选至少50个连续氨基酸残基、甚至更优选至少100个连续氨基酸残基并且更优选至少150个连续氨基酸残基的多肽序列。

优选地，TP是球状蛋白，并且优选为球蛋白或珠蛋白。

术语“TP”或“目标蛋白质”属于尚未被热变性或通过其他手段变性的天然目标蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP选自由酶、免疫球蛋白、激素组成的组。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP是酶，并且优选氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)或异构酶(EC 5)。

本文提到的“EC”编号是指用于根据酶的催化功能对其进行分类的“酶学委员会编号(enzyme commision number)”。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP是氧化还原酶(EC 1)，优选选自以下中的一种或多种：漆酶(EC 1.10.3.2)、过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、木质素酶(EC 1.11.1.14)和过氧化物酶(EC 1.11.1)。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP是转移酶(EC2)，优选选自酰基转移酶(EC2.3)或糖基转移酶(EC 2.4)。

在本发明的另外优选的实施方案中，TP是水解酶(EC 3)。

在TP具有水解活性的一些实施方案中，TP是酯酶(EC 3.1)，优选选自植酸酶(EC3.1.3)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、磷酸酶(EC 3.1.3)、植酸酶和/或核酸酶(EC 3.1.11-3.1.31)。

特别优选的是，TP是脂肪酶(EC 3.1.1.3)，其为一类可能具有重要的工业应用的酶。能够在盐溶条件下结晶的脂肪酶的实例见于例如美国专利号5,719,048，其以引用的方式并入本文。

在TP具有水解活性的其他实施方案中，TP是糖基化酶(EC 3.2)，优选选自α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、淀粉葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.3或EC 3.2.1.33)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、半纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、胞壁质酶(EC 3.2.1.17)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、果胶酶(EC 3.2.1.67)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、乳糖酶(EC3.2.1.108)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或EC 3.2.1.3)和葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)。

在TP具有水解活性的另外实施方案中，TP是肽酶或蛋白酶(EC 3.4)，例如选自糜蛋白酶(EC 3.4.21.1)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶(EC 3.4.23.4)或碱性蛋白酶。

替代地，TP可以是裂解酶(EC 4)，例如果胶酸裂解酶或α-乙酰乳酸脱羧酶。

在其他优选的实施方案中，其中TP是异构酶(EC 5)，例如葡萄糖异构酶。

替代地，但也是优选的，TP可以是蛋白质激素，优选人胰岛素(uniprot ID:P01308)、人胰岛素类似物、人胰岛素激动剂、人GLP-1、人GLP-1类似物或人GLP-1激动剂。

在本发明的上下文中，关于第一蛋白质激素使用的术语“类似物”是指相对于第一蛋白质激素具有至少90％的序列同一性并且具有与第一蛋白质激素相同或相似的激素功能性的第二蛋白质。序列同一性的确定基于成熟蛋白质，并且因此忽略信号肽。

在本发明的上下文中，术语“序列同一性”涉及两个氨基酸序列之间的相关性。两个氨基酸序列之间的序列同一性使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

另一类型的可用TP是免疫球蛋白，并且优选单克隆免疫球蛋白。TP可以是任何类型的免疫球蛋白，然而，免疫球蛋白G(IgG)是目前优选的，并且优选呈单克隆IgG的形式。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP是双特异性IgG。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP是干扰素、干扰素类似物或干扰素激动剂。

作为免疫球蛋白或来源于免疫球蛋白的治疗性蛋白质的可用实例可见于Lu等人；Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases.J BiomedSci 27,1(2020).https://doi.org/10.1186/s12929-019-0592-z，其出于所有目的并入本文。

TP可以通过从天然来源纯化、通过在重组生物体中发酵和/或通过随后的蛋白质重排来制备。

TP就其本身而论可以是重组蛋白，并且例如融合蛋白，或者在自然界或人体中发现的蛋白质。

特别优选的是，TP是治疗性蛋白质，即具有治疗效果的蛋白质。具有治疗效果的TP的可用实例见于例如Lagassé等人(“Recent advances in(therapeutic protein)drugdevelopment”[version 1；referees:2approved]F1000Research 2017,6(F1000 FacultyRev):113(doi:10.12688/f1000research.9970.1))和/或Leader等人(“Proteintherapeutics:a summary and pharmacological classification”；Nature ReviewsDrug Discovery；第7卷,第21-39页(2008))中，其以引用的方式并入本文。

优选地，TP是选自由以下组成的组的治疗性蛋白质：莫罗单抗(Muromonab)-CD3、阿昔单抗(Abciximab)、利妥昔单抗(Rituximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、奥马珠单抗(Omalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、依库珠单抗(Eculizumab)、培塞利珠单抗(Certolizumab pegol)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、卡那单抗(Canakinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、地舒单抗(Denosumab)、贝利木单抗(Belimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、恩美曲妥珠单抗(Trastuzumab emtansine)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、贝林妥欧单抗(Blinatumomab)、纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、依达赛珠单抗(Idarucizumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、达妥昔单抗(Dinutuximab)、司库奇尤单抗(Secukinumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、阿利西尤单抗(Alirocumab)、依洛尤单抗(Evolocumab)、达妥木单抗(Daratumumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、依奇珠单抗(Ixekizumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、奥拉单抗(Olaratumab)、贝洛托单抗(Bezlotoxumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、奥托昔单抗(Obiltoxaximab)、奥加伊妥珠单抗(Inotuzumabozogamicin)、博达路单抗(Brodalumab)、古塞库单抗(Guselkumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、沙利鲁单抗(Sarilumab)、阿维单抗(Avelumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、艾美赛珠单抗(Emicizumab)、本瑞利珠单抗(Benralizumab)、奥加吉妥珠单抗(Gemtuzumabozogamicin)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、布洛舒单抗(Burosumab)、拉那鲁单抗(Lanadelumab)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab)、依瑞奈尤单抗(Erenumab)、加卡奈珠单抗(Galcanezumab)、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、依玛鲁单抗(Emapalumab)、瑞玛奈珠单抗(Fremanezumab)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、莫赛妥莫单抗(Moxetumomab pasudodox)、雷夫利珠单抗(Ravulizumab)、卡拉西单抗(Caplacizumab)、罗莫佐单抗(Romosozumab)、瑞莎珠单抗(Risankizumab)、维泊妥珠单抗(Polatuzumabvedotin)、布洛赛珠单抗(Brolucizumab)和立赞利珠单抗(Crizanlizumab)。

技术人员知道如何量化TP的量，并且通常将使用基于色谱法(优选HPLC)的方法与合适的测定方法的组合。

步骤a)涉及制备包含TP的初始蛋白质溶液，所述初始蛋白质溶液关于所述TP过饱和并且具有所述TP能够在盐溶条件下结晶的pH，优选在提供所述TP的最大结晶产率的pH(pH_MCY,TP)的+/-0.7个pH单位范围内并且最优选在所述pH_MCY,TP的+/-0.5个pH单位范围内。

步骤a)的初始蛋白质溶液通过将一种或多种A型蛋白质进料与一种或多种B型蛋白质进料合并，优选通过将一种或多种A型蛋白质进料与一种或多种B型蛋白质进料混合来制备。

在本发明的上下文中，“A型蛋白质进料”被定义为包含TP并且pH比pH_MCY,TP高至少0.1个pH单位的蛋白质进料。因此，pH比pH_MCY,TP高至少0.1个pH单位并且用于制备初始蛋白质溶液的任何含TP的蛋白质进料均被视为A型蛋白质进料。

在本发明的上下文中，“B型蛋白质进料”被定义为包含TP并且pH比pH_MCY,TP低至少0.1个pH单位的蛋白质进料。因此，pH比pH_MCY,TP低至少0.1个pH单位并且用于制备初始蛋白质溶液的任何含TP的蛋白质进料均被视为B型蛋白质进料。

在本发明的上下文中，术语“初始蛋白质溶液”属于通过组合并优选混合一种或多种A型蛋白质进料和一种或多种B型蛋白质进料制备的蛋白质溶液。所述初始蛋白质溶液是含TP的溶液，所述含TP的溶液关于TP过饱和并且在所述含TP的溶液中引发步骤b)的结晶。如果所使用的蛋白质进料中的一种或多种已经含有TP晶体，则初始蛋白质溶液是pH在pH_MCY,TP的+/-0.7个pH单位范围内的第一蛋白质溶液，其关于TP过饱和并且通过合并、并且优选混合A型蛋白质进料和B型蛋白质进料来获得。

在本发明的上下文中，术语“一种或多种A型蛋白质进料”意指本发明可以用单一A型蛋白质进料或用若干种A型蛋白质进料来实施，在初始蛋白质溶液的制备期间，其与B型蛋白质进料合并。

在本发明的上下文中，术语“一种或多种B型蛋白质进料”意指本发明可以用单一B型蛋白质进料或用若干种B型蛋白质进料来实施，在初始蛋白质溶液的制备期间，其与A型蛋白质进料合并。

在本发明的上下文中，术语“在合并的情况下，A型蛋白质进料……”描述了这样的一种或多种A型蛋白质进料，所述一种或多种A型蛋白质进料基于如果它们假设以与用于制备初始蛋白质溶液相同的量混合成单一A型蛋白质进料时它们应具有的特性。重要的是需注意，这个术语还涵盖仅使用单一A型蛋白质进料，在这种情况下所述特性涉及单一A型蛋白质进料。还重要的是需注意，这个术语并不要求在与一种或多种B型蛋白质进料混合之前实际上合并多种A型蛋白质进料。

在本发明的上下文中，术语“在合并的情况下，B型蛋白质进料……”描述了这样的一种或多种B型蛋白质进料，所述一种或多种B型蛋白质进料基于如果它们假设以与用于制备初始蛋白质溶液相同的量混合成单一B型蛋白质进料时它们应具有的特性。重要的是需注意，这个术语还涵盖仅使用单一B型蛋白质进料，在这种情况下所述特性涉及单一B型蛋白质进料。还重要的是需注意，这个术语并不要求在与一种或多种A型蛋白质进料混合之前实际上合并多种B型蛋白质进料。

除了TP之外，步骤a)的初始蛋白质溶液通常还包含非TP固体。在本发明的上下文中，术语“非TP固体”属于固体，诸如像碳水化合物、矿物质、脂质、肽以及除TP之外的其他蛋白质。初始蛋白质溶液中存在的固体具有用于制备蛋白质进料的一种或多种蛋白质源的特性。通过发酵制备的基于TP来源的蛋白质进料通常含有来自发酵液的杂质，例如残留营养物和代谢副产物，诸如像其他蛋白质、肽和代谢营养物。

除了TP之外，所述初始蛋白质溶液通常还含有附加蛋白质。在本发明的上下文中，术语“附加蛋白质”意指不是TP的蛋白质。附加蛋白质通常是来自发酵液的蛋白质杂质或细胞碎片，例如在TP已通过重组细胞培养物的发酵产生的情况下。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于总固体的至少1％w/w、更优选至少2％w/w、甚至更优选至少5％w/w并且最优选至少10％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于总固体的至少15％w/w、更优选至少20％w/w、甚至更优选至少30％w/w并且最优选至少40％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于总固体的0-70％w/w、更优选1-60％w/w、甚至更优选2-50％w/w并且最优选3-40％w/w的非TP固体。

在本发明的其他优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于总固体的0-20％w/w、更优选0-15％w/w、甚至更优选0-10％w/w并且最优选0-5％w/w的非TP固体。

在本发明的另外优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于总固体的15-70％w/w、更优选20-65％w/w、甚至更优选25-60％w/w并且最优选30-50％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少5％w/w的附加蛋白质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少10％w/w的附加蛋白质。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少15％w/w的附加蛋白质。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少20％w/w的附加蛋白质。最优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少30％w/w的附加蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少35％w/w的附加蛋白质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少40％w/w的附加蛋白质。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量的至少45％w/w的附加蛋白质。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少50％w/w的附加蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在5-90％w/w范围内的附加蛋白质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在10-80％w/w范围内的附加蛋白质。步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量在20-70％w/w范围内的附加蛋白质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在30-70％w/w范围内的附加蛋白质。

如上所述，本发明人已发现可以在不使用有机溶剂的情况下使TP结晶。这种纯化方法还可用于精制含有其他蛋白质的制剂，所述制剂已经经受某种TP纯化并提供了更进一步提高TP纯度的简单方法。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在1-20％w/w范围内的附加蛋白质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在2-15％w/w范围内的附加蛋白质。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量在3-10％w/w范围内的附加蛋白质。

初始蛋白质溶液和蛋白质进料中TP和其他蛋白质的量和浓度全部指溶解的蛋白质，并且不包括沉淀或结晶的蛋白质。

在本发明的上下文中，术语组分X与组分Y之间的“重量比”意指通过计算m_X/m_Y获得的值，其中m_X是组分X的量(重量)并且m_Y是组分Y的量(重量)。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少1％w/w的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少2％w/w的TP。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少5％w/w的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少10％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少12％w/w的TP。例如，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少15％w/w的TP。步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量的至少20％w/w的TP。替代地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少30％w/w的TP。

在本发明的其他优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至少40％w/w的TP。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少45％w/w的TP。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量的至少50％w/w的TP。最优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至少55％w/w的TP。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量的至多95％w/w的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至多90％w/w的TP。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量的至多85％w/w的TP。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以例如包含相对于蛋白质总量的至多80％w/w的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至多78％w/w的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量的至多75％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在1-95％w/w范围内的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在5-90％w/w范围内的TP。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在10-85％w/w范围内的TP。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在10-80％w/w范围内的TP。最优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在20-70％w/w范围内的TP。

在本发明的其他优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在10-95％w/w范围内的TP。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在12-90％w/w范围内的TP。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在15-85％w/w范围内的TP。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含相对于蛋白质总量在15-80％w/w范围内的TP。最优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液可以包含相对于蛋白质总量在30-70％w/w范围内的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于初始蛋白质溶液重量的至少0.4％w/w的TP。优选地，初始蛋白质溶液包含量为至少1.0％w/w的TP。更优选地，初始蛋白质溶液包含量为至少2.0％w/w的TP。甚至更优选的是，初始蛋白质溶液包含量为至少4％w/w的TP。

更高浓度的TP是甚至更优选的，并且优选地，初始蛋白质溶液包含量为至少6％w/w的TP。更优选地，初始蛋白质溶液包含量为至少10％w/w的TP。甚至更优选的是，初始蛋白质溶液包含量为至少15％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于初始蛋白质溶液的重量在0.4-40％w/w范围内的TP。优选地，初始蛋白质溶液包含量在1-35％w/w范围内的TP。更优选地，初始蛋白质溶液包含量在4-30％w/w范围内的TP。甚至更优选的是，初始蛋白质溶液包含量在10-25％w/w范围内的TP。

在本发明的其他优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于初始蛋白质溶液的重量在1-45％w/w范围内的TP。优选地，初始蛋白质溶液包含量在3-40％w/w范围内的TP。更优选地，初始蛋白质溶液包含量在5-36％w/w范围内的TP。甚至更优选的是，初始蛋白质溶液包含量在7-34％w/w范围内的TP。

在本发明的另外优选的实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含量为相对于初始蛋白质溶液重量的在6-32％w/w范围内的TP。优选地，初始蛋白质溶液包含量在8-30％w/w范围内的TP。更优选地，初始蛋白质溶液包含量在10-28％w/w范围内的TP。甚至更优选的是，初始蛋白质溶液包含量在12-26％w/w范围内的TP。

优选的是，初始蛋白质溶液是脱盐初始蛋白质溶液。

在此上下文中，术语脱盐意指初始蛋白质溶液的电导率为至多15mS/cm、并且优选至多10mS/cm、并且甚至更优选至多8mS/cm。脱盐初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率优选为至多7mS/cm、更优选至多4mS/cm并且甚至更优选至多1mS/cm。

术语“基本上由……组成(consists essentially of/consisting essentiallyof)”是指所讨论的权利要求或特征涵盖指定的材料或步骤，以及那些不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。

初始蛋白质溶液的蛋白质优选尽可能接近其天然状态，并且优选地仅经过温和的、非变性的热处理(在任何情况下，如果有的话)。

本发明方法对于从含有除TP之外的其他固体的粗初始蛋白质溶液中分离TP特别有利。

初始蛋白质溶液可以例如含有碳水化合物，诸如像蔗糖、葡萄糖、乳糖、寡糖和/或乳糖的水解产物(即葡萄糖和半乳糖)。初始蛋白质溶液可以例如含有在0-40％w/w范围内，诸如在1-30％w/w范围内或在2-20％w/w范围内的碳水化合物。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液含有至多20％w/w的碳水化合物、优选至多10％w/w的碳水化合物、更优选至多5％w/w的碳水化合物并且甚至更优选至多2％w/w的碳水化合物。

初始蛋白质溶液还可包含脂质，例如呈甘油三酯和/或其他脂质类型(诸如磷脂)的形式。

在本发明的一些实施方案中，步骤a)的初始蛋白质溶液包含总量为相对于总固体的至多15％w/w的脂质。优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含总量为相对于总固体的至多10％w/w的脂质。更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含总量为相对于总固体的至多6％w/w的脂质。甚至更优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含总量为相对于总固体的至多1.0％w/w的脂质。最优选地，步骤a)的初始蛋白质溶液包含总量为相对于总固体的至多0.5％w/w的脂质。

初始蛋白质溶液的蛋白质总量通常是相对于初始蛋白质溶液重量的至少1％w/w。优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量为至少5％w/w。更优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量为至少10％w/w。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量为至少15％w/w。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的蛋白质总量在1-50％w/w范围内。优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量在5-40％w/w范围内。更优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量在10-30％w/w范围内。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质总量在15-25％w/w范围内。

初始蛋白质溶液的总固体通常是相对于初始蛋白质溶液重量的至少1％w/w。优选地，初始蛋白质溶液的总固体为至少5％w/w。更优选地，初始蛋白质溶液的总固体为至少10％w/w。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的总固体为至少15％w/w。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的总固体在5-50％w/w范围内。优选地，初始蛋白质溶液的总固体在8-40％w/w范围内。更优选地，初始蛋白质溶液的总固体在10-30％w/w范围内。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的总固体在15-25％w/w范围内。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的总固体在8-50％w/w范围内。优选地，初始蛋白质溶液的总固体在10-45％w/w范围内。更优选地，初始蛋白质溶液的总固体在12-40％w/w范围内。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的总固体在15-35％w/w范围内。

初始蛋白质溶液的蛋白质总量根据WO2018/115520的实施例9.2确定。

步骤a)的初始蛋白质溶液通过将一种或多种A型蛋白质进料与一种或多种B型蛋白质进料合并且优选混合来制备。

在最优选的实施方案中，初始蛋白质溶液通过将单一A型蛋白质进料与单一B型蛋白质进料合并且优选混合来制备。优选地通过随后添加晶种组合物(优选呈液体形式或替代地呈粉末形式)来引发结晶。

初始蛋白质溶液还可以含有既不是A型也不是B型的蛋白质进料，例如pH为pH_MCY,TP的蛋白质进料或不含TP的蛋白质进料，但优选的是限制或甚至避免此类附加蛋白质进料的存在，除非它们用于优化工艺，例如通过提供TP晶体或其他晶种材料来引发结晶。

初始蛋白质溶液的制备可以涉及除了蛋白质进料之外还添加其他成分，例如添加酸或碱以提供具有合适pH的初始蛋白质溶液。然而，优选的是，一种或多种A型蛋白质进料和一种或多种B型蛋白质进料已经被调整以在合并时提供所需pH，并因此限制或甚至避免添加其他成分。

蛋白质进料通常是包含TP和杂质的水性液体和/或粉末。典型杂质的实例是矿物质、碳水化合物、其他蛋白质，诸如像附加蛋白质。

因此，一种或多种A型蛋白质进料、一种或多种B型蛋白质进料以及任何另外的成分可以以任何次序合并以提供初始蛋白质溶液。

初始蛋白质溶液通过将蛋白质进料合并，优选通过将一种或多种A型蛋白质进料与一种或多种B型蛋白质进料、以及任选地与任何另外的蛋白质进料或成分混合来制备。

所有蛋白质进料和任何另外的成分都提供为具有适当的化学组成，并且以足以提供如本文所述的初始蛋白质溶液的量合并。

本发明人已发现TP结晶的最大TP产率在大约pH_MCY,TP下获得。因此优选的是，初始蛋白质溶液的pH比以下更接近pH_MCY,TP：

-在合并的情况下，A型蛋白质进料的pH，或

-在合并的情况下，B型蛋白质进料的pH，或

-在合并的情况下，A型蛋白质进料的pH，以及在合并的情况下，B型蛋白质进料的pH。

通常优选的是将蛋白质进料合并以提供初始蛋白质溶液，所述初始蛋白质溶液关于TP过饱和处于亚稳定区域中，即在其中当使用引晶时TP晶体可以生长但结晶不会自发开始的过饱和区域中。

在本发明的一些优选的实施方案中：

-在合并的情况下，A型蛋白质进料的pH将为至少pH_MCY,TP+0.1、更优选至少pH_MCY,TP+0.2、甚至更优选至少pH_MCY,TP+0.3并且最优选至少pH_MCY,TP+0.4，并且

-在合并的情况下，B型蛋白质进料的pH将为至多pH_MCY,TP-0.1、更优选至多pH_MCY,TP-0.2、甚至更优选至多pH_MCY,TP-0.3并且最优选至多pH_MCY,TP-0.4。

在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，短语“在合并的情况下，将”是指单一A型蛋白质进料本身。类似地，在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，短语“在合并的情况下，将”是指单一B型蛋白质进料本身。

因此，短语“在混合的情况下，A型蛋白质进料的[特定性质]将”意指

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，其[特定性质]，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其[特定性质]。

例如，叙述在混合的情况下，A型蛋白质进料的pH将为至少pH_MCY,TP+0.1，意指：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.1

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.1。

例如，在使用两种A型蛋白质进料的实施方案中，短语“在合并的情况下，将”意指在将两种A型蛋白质进料混合的情况下，将获得特定性质。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.1、更优选至少pH_MCY,TP+0.2、甚至更优选至少pH_MCY,TP+0.3并且最优选至少pH_MCY,TP+0.4，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至多pH_MCY,TP-0.1、更优选至多pH_MCY,TP-0.2、甚至更优选至多pH_MCY,TP-0.3并且最优选至多pH_MCY,TP-0.4。

优选地：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.5、更优选至少pH_MCY,TP+0.6、甚至更优选至少pH_MCY,TP+0.7并且最优选至少pH_MCY,TP+0.8，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至多pH_MCY,TP-0.5、更优选至多_pHMCY,TP-0.6、甚至更优选至多pH_MCY,TP-0.7并且最优选至多pH_MCY,TP-0.8。

在本发明的其他优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.9、更优选至少pH_MCY,TP+1.0、甚至更优选至少pH_MCY,TP+1.2并且最优选至少pH_MCY,TP+1.5，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH为至多pH_MCY,TP-0.9、更优选至多_pHMCY,TP-1.0、甚至更优选至多pH_MCY,TP-1.2并且最优选至多pH_MCY,TP-1.5。

优选地，关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，

其pH的范围为pH_MCY,TP+0.1至pH_MCY,TP+4.5、更优选pH_MCY,TP+0.3至pH_MCY,TP+2.5、甚至更优选pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+1.5并且最优选pH_MCY,TP+0.6至pH_MCY,TP+1.0。

替代地，但同样优选地：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其pH的范围为pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+2.5、更优选pH_MCY,TP+0.6至pH_MCY,TP+2.0、甚至更优选pH_MCY,TP+0.7至pH_MCY,TP+1.5并且最优选pH_MCY,TP+0.7至pH_MCY,TP+1.0。

在本发明的另外优选的实施方案中，关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其pH的范围为pH_MCY,TP+0.7至pH_MCY,TP+3.0、更优选pH_MCY,TP+0.8至pH_MCY,TP+2.5、甚至更优选pH_MCY,TP+0.9至pH_MCY,TP+2.0并且最优选pH_MCY,TP+1.0至pH_MCY,TP+1.5。

在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其pH的范围为pH_MCY,TP-3.5至pH_MCY,TP-0.1、更优选pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.3、甚至更优选pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5，并且最优选pH_MCY,TP-1.0至pH_MCY,TP-0.6。

优选地：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，

其pH的范围为pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5、更优选pH_MCY,TP-1.4至pH_MCY,TP-0.6、甚至更优选pH_MCY,TP-1.2至pH_MCY,TP-0.7，并且最优选pH_MCY,TP-1.0至pH_MCY,TP-0.7。

替代地，但同样优选地，关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其pH的范围为pH_MCY,TP-2.0至pH_MCY,TP-0.7、更优选pH_MCY,TP-1.8至pH_MCY,TP-0.8、甚至更优选pH_MCY,TP-1.6至pH_MCY,TP-0.9，并且最优选pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-1.0。

在本发明的一些优选的实施方案中，一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种关于TP不饱和，更优选地一种或多种A型蛋白质进料全部都关于TP不饱和。

在本发明的其他优选的实施方案中，一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种关于TP不饱和，并且更优选地一种或多种B型蛋白质进料全部都关于TP不饱和。

在本发明的另外优选的实施方案中，A型或B型蛋白质进料全部都关于TP饱和。

在本发明的一些优选的实施方案中，一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种不含TP晶体，更优选地一种或多种A型蛋白质进料全部都不含TP晶体。

在本发明的其他优选的实施方案中，一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种不含TP晶体，更优选地一种或多种B型蛋白质进料全部都不含TP晶体。

应当指出的是，即使进料不含TP晶体，该进料仍然可以关于TP饱和或甚至过饱和。

在本发明的另外优选的实施方案中，A型或B型蛋白质进料全部都不含TP晶体。

在本发明的其他优选的实施方案中，A型或B型蛋白质进料全部都不含TP晶体。

在本发明的一些优选的实施方案中，一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种关于TP不过饱和，更优选地一种或多种A型蛋白质进料全部都关于TP不过饱和。

在本发明的其他优选的实施方案中，一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种关于TP不过饱和，并且更优选地一种或多种B型蛋白质进料全部都关于TP不过饱和。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种关于TP饱和。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤a)的一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种关于TP饱和。

在本发明的一些优选的实施方案中，一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种关于TP过饱和，但处于其中不发生自发结晶的亚稳定区中。

在本发明的其他优选的实施方案中，一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种关于TP过饱和，但处于其中不发生自发结晶的亚稳定区中。

在本发明的一些优选的实施方案中，不含TP晶体的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少1％w/w、更优选至少10％w/w、甚至更优选至少20％w/w并且最优选至少40％w/w。

优选地，不含TP晶体的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w。

在本发明的其他优选的实施方案中，不含TP晶体的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少92％w/w、更优选至少94％w/w、甚至更优选至少96％w/w并且最优选至少99％w/w。

例如，可能优选的是，不含TP晶体的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的100％w/w。例如，如果在制备初始蛋白质溶液之后添加晶种材料，则通常是这种情况。

本发明人已经发现，通常期望蛋白质进料中的至少一些蛋白质进料关于TP不过饱和，因为这显著降低了生产期间不可控结晶的风险。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，关于TP不过饱和的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少1％w/w、更优选至少10％w/w、甚至更优选至少20％w/w并且最优选至少40％w/w。

优选地，关于TP不过饱和的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w。

在本发明另外优选的实施方案中，关于TP不过饱和的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的至少92％w/w、更优选至少94％w/w、甚至更优选至少96％w/w并且最优选至少99％w/w。

通常优选的是，关于TP不过饱和的A型和B型蛋白质进料贡献了初始蛋白质溶液的TP含量的约100％w/w。

优选的是在避免蛋白质变性和/或降解的温度下制备、存储和使用A型和B型蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料的温度为至多60℃、更优选至多50℃、甚至更优选至多40℃并且最优选至多30℃。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其温度为至多60℃、更优选至多50℃、甚至更优选至多40℃并且最优选至多30℃。

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料的温度为至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

因此，在本发明的其他优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其温度为至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料的温度为至多60℃、更优选至多50℃、甚至更优选至多40℃并且最优选至多30℃。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其温度为至多60℃、更优选至多50℃、甚至更优选至多40℃并且最优选至多30℃。

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料的温度为至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

因此，在本发明的其他优选的实施方案中，关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其温度为至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

本发明人已发现，由具有低电导率的蛋白质进料制备的初始蛋白质溶液通常提供较高的TP结晶产率。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，A型蛋白质进料的电导率为至多10mS/cm、更优选至多7mS/cm、甚至更优选至多5mS/cm并且最优选至多4mS/cm。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其电导率为至多10mS/cm、更优选至多7mS/cm、甚至更优选至多5mS/cm并且最优选至多4mS/cm。

在本发明的其他优选的实施方案中，在混合的情况下，其A型蛋白质进料的电导率为至多3mS/cm、更优选至多2mS/cm、甚至更优选至多1mS/cm并且最优选至多0.5mS/cm。

因此，在本发明的其他优选的实施方案中，关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其电导率为至多3mS/cm、更优选至多2mS/cm、甚至更优选至多1mS/cm并且最优选至多0.5mS/cm。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，B型蛋白质进料的电导率为至多10mS/cm、更优选至多7mS/cm、甚至更优选至多5mS/cm并且最优选至多4mS/cm。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其电导率为至多10mS/cm、更优选至多7mS/cm、甚至更优选至多5mS/cm并且最优选至多4mS/cm。

在本发明的其他优选的实施方案中，在混合的情况下，B型蛋白质进料的电导率为至多3mS/cm、更优选至多2mS/cm、甚至更优选至多1mS/cm并且最优选至多0.5mS/cm。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

本发明人还已观察到，如果A型蛋白质进料和B型蛋白质进料的电导率(以mS/cm表示)与蛋白质总量(以相对于进料总重量的总蛋白重量％表示)之间的比率保持在或低于某一阈值，则获得TP结晶产率。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，A型蛋白质进料的电导率与蛋白质总量之间的比率将为至多0.3、更优选至多0.25、更优选至多0.20、更优选至多0.18、甚至更优选至多0.12并且最优选至多0.10。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3、更优选至多0.25、更优选至多0.20、更优选至多0.18、甚至更优选至多0.12并且最优选至多0.10。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，B型蛋白质进料的电导率与蛋白质总量之间的比率将为至多0.3、更优选至多0.25、更优选至多0.20、更优选至多0.18、甚至更优选至多0.12并且最优选至多0.10。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3、更优选至多0.25、更优选至多0.20、更优选至多0.18、甚至更优选至多0.12并且最优选至多0.10。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含相对于A型蛋白质进料组合的重量的至少1％w/w、更优选至少3％w/w、甚至更优选至少5％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料组合的重量的至少7％w/w的TP。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于A型蛋白质进料的总重量的至少1％w/w、更优选至少3％w/w、甚至更优选至少5％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料的总重量的至少7％w/w的TP。

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含相对于A型蛋白质进料组合的重量的1-45％w/w、更优选3-40％w/w、甚至更优选5-36％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料组合的重量的7-34％w/w的TP。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于A型蛋白质进料的总重量的1-45％w/w、更优选3-40％w/w、甚至更优选5-36％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料的总重量的7-34％w/w的TP。

在本发明另外优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料包含相对于A型蛋白质进料组合的重量的6-32％w/w、更优选8-30％w/w、甚至更优选10-28％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料组合的重量的12-26％w/w的TP。

因此，在本发明另外优选的实施方案中，关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于A型蛋白质进料的总重量的6-32％w/w、更优选8-30％w/w、甚至更优选10-28％w/w的TP并且最优选相对于A型蛋白质进料的总重量的12-26％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含相对于B型蛋白质进料组合的重量的至少1％w/w、更优选至少3％w/w、甚至更优选至少5％w/w的TP并且最优选相对于B型蛋白质进料组合的重量的至少7％w/w的TP。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于B型蛋白进料的总重量的至少1％w/w、更优选至少3％w/w、甚至更优选至少5％w/w的TP，并且最优选相对于B型蛋白质进料的总重量，至少7％w/w的TP。

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含相对于B型蛋白质进料组合的重量的1-45％w/w、更优选3-40％w/w、甚至更优选5-36％w/w的TP并且最优选相对于B型蛋白质进料组合的重量的7-34％w/w的TP。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于B型蛋白质进料的总重量的1-45％w/w、更优选3-40％w/w、甚至更优选5-36％w/w的TP并且最优选相对于B型蛋白质进料的总重量的7-34％w/w的TP。

在本发明的另外优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含相对于B型蛋白质进料组合的重量的6-32％w/w、更优选8-30％w/w、甚至更优选10-28％w/w的TP并且最优选相对于B型蛋白质进料组合的重量的12-26％w/w的TP。

因此，在本发明另外优选的实施方案中，关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于B型蛋白质进料的总重量的6-32％w/w、更优选8-30％w/w、甚至更优选10-28％w/w的TP并且最优选相对于B型蛋白质进料的总重量的12-26％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于蛋白质总量的至少30％w/w、更优选至少40％w/w、甚至更优选至少50％w/w并且最优选至少55％w/w的TP。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于蛋白质总量的至少30％w/w、更优选至少40％w/w、甚至更优选至少50％w/w并且最优选至少55％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于蛋白质总量的至少30％w/w、更优选至少40％w/w、甚至更优选至少50％w/w并且最优选至少55％w/w的TP。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的至少1％w/w、更优选至少2％w/w、甚至更优选至少5％w/w并且最优选至少10％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于总固体的至少1％w/w、更优选至少2％w/w、甚至更优选至少5％w/w并且最优选至少10％w/w的非TP固体。

在本发明的其他优选的实施方案中，在混合的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的至少15％w/w、更优选至少20％w/w、甚至更优选至少30％w/w并且最优选至少40％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于总固体的至少15％w/w、更优选至少20％w/w、甚至更优选至少30％w/w并且最优选至少40％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的0-70％w/w、更优选1-60％w/w、甚至更优选2-50％w/w并且最优选3-40％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于总固体的0-70％w/w、更优选1-60％w/w、甚至更优选2-50％w/w并且最优选3-40％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，在混合的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的0-70％w/w、更优选0-60％w/w、甚至更优选0-50％w/w并且最优选0-40％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的0-20％w/w、更优选0-15％w/w、甚至更优选0-10％w/w并且最优选0-5％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于总固体的0-20％w/w、更优选0-15％w/w、甚至更优选0-10％w/w并且最优选0-5％w/w的非TP固体。

在本发明另外优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的15-70％w/w、更优选20-65％w/w、甚至更优选25-60％w/w并且最优选30-50％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其包含量为相对于总固体的15-70％w/w、更优选20-65％w/w、甚至更优选25-60％w/w并且最优选30-50％w/w的非TP固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的至少1％w/w、更优选至少2％w/w、甚至更优选至少5％w/w并且最优选至少10％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的至少15％w/w、更优选至少20％w/w、甚至更优选至少30％w/w并且最优选至少40％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的0-70％w/w、更优选1-60％w/w、甚至更优选2-50％w/w并且最优选3-40％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的其他优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的0-20％w/w、更优选0-15％w/w、甚至更优选0-10％w/w并且最优选0-5％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明另外优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料将包含量为相对于总固体的15-70％w/w、更优选20-65％w/w、甚至更优选25-60％w/w并且最优选30-50％w/w的非TP固体。

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

在本发明的一些实施方案中，蛋白质进料具有低的变性蛋白质含量。优选地，在合并的情况下，蛋白质进料的蛋白质变性程度将为至多20％、更优选至多10％、甚至更优选至多5％并且最优选至多2％。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含总量在相对于初始蛋白质溶液重量的1-99％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含总量在相对于初始蛋白质溶液重量的5-95％w/w、更优选15-80％w/w、甚至更优选20-75％w/w并且最优选35-70％w/w范围内的A型蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含总量在相对于初始蛋白质溶液重量的1-99％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含总量在相对于初始蛋白质溶液重量的5-95％w/w、更优选15-80％w/w、甚至更优选20-75％w/w并且最优选35-70％w/w范围内的B型蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含：

-总量为相对于初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料，以及

-总量为相对于初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含：

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP+0.3至pH_MCY,TP+3.5的A型蛋白质进料，以及

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP-3.0至pH_MCY,TP-0.3的B型蛋白质进料。

在本发明的另外优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含：

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+2.5的A型蛋白质进料，以及

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.5的B型蛋白质进料。

在本发明的甚至另外优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含：

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP+0.6至pH_MCY,TP+1.5的A型蛋白质进料，以及

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量为5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w的pH为pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.6的B型蛋白质进料。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液包含：

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的pH为pH_MCY,TP+0.8至pH_MCY,TP+1.5的A型蛋白质进料，以及

-总量为相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内、pH为pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.8的B型蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，所有蛋白质进料都为液体形式。

在本发明的其他优选的实施方案中，蛋白质进料中的至少一种为干燥形式。

在本发明的另外优选的实施方案中，蛋白质进料中的至少一种为干燥形式，优选粉末形式，并且蛋白质进料中的至少一种为液体形式。

涉及初始蛋白质溶液的化学组成的实施方案同样适用于A型蛋白质进料和B型蛋白质进料，然而通常设置蛋白质进料的至少一个参数以避免过饱和或至少自发结晶。

通常优选的是初始蛋白质溶液的TP的过饱和度高于：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，所述A型蛋白质进料的过饱和度，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在合并的情况下，所述A型蛋白进料的过饱和度。

此外，通常优选的是初始蛋白质溶液的TP的过饱和度高于：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，所述B型蛋白质进料的过饱和度，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在合并的情况下，所述B型蛋白质进料的过饱和度。

特别优选的是，初始蛋白质溶液的TP的过饱和度高于以下两者：

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在合并的情况下，所述A型蛋白进料的过饱和度，

以及以下两者：

液体的过饱和度是通过用TP晶体对液体样品进行引晶，以及定量当将样品保持在相同条件(例如温度、压力和湿度)下24小时时在样品中生成的附加TP晶体质量的量来确定的。TP晶体质量的定量是通过在液体温度下以15000g离心5分钟，以及随后使用WO 2018/115520A1的分析9.9定量所获得的沉淀物中的TP含量完成的。过饱和度是液体样品中能够以粒料分离的TP的百分比。

在本发明的一些优选的实施方案中，关于A型蛋白质进料，在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下：

-其TP含量为相对于A型蛋白质进料的总重量的4-32％w/w、更优选6-32％w/w、更优选8-30％w/wBLG含量、甚至更优选10-28％w/w并且最优选相对于A型蛋白质进料的总重量的12-26％w/w，

-其pH的范围为pH_MCY,TP+0.1至pH_MCY,TP+3.5、更优选pH_MCY,TP+0.3至pH_MCY,TP+2.5、甚至更优选pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+1.5并且最优选pH_MCY,TP+0.6至pH_MCY,TP+1.5，

-优选地，其温度为至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃，

-优选地，其TP含量的量为相对于蛋白质总量的至少30％w/w、更优选至少40％w/w、甚至更优选至少50％w/w并且最优选至少55％w/w，

-其具有以下中的一种或多种：

-其电导率为至多7mS/cm、甚至更优选至多5mS/cm并且最优选至多3mS/cm，以及

-其电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3、更优选至多0.25、最优选至多0.20。

在本发明的一些优选的实施方案中，关于B型蛋白质进料，在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下：

-其TP含量为相对于B型蛋白质进料的总重量的4-32％w/w、更优选6-32％w/w、更优选8-30％w/wBLG含量、甚至更优选10-28％w/w并且最优选相对于B型蛋白质进料的总重量的12-26％w/w，

-其pH的范围为pH_MCY,TP-3.5至pH_MCY,TP-0.1、更优选pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.3、甚至更优选pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5并且最优选pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.6，

-其具有以下中的一种或多种：

在本发明的特别优选的实施方案中，

-关于A型蛋白质进料，在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下，

-其具有以下中的一种或多种：

并且

-关于B型蛋白质进料，在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在混合的情况下：

-其具有以下中的一种或多种：

-其电导率为至多7mS/cm、更优选至多5mS/cm并且最优选至多3mS/cm，以及

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料通过以下过程步骤中的一者或多者制备：

-调整pH，

-降低电导率

-降低温度

-增加蛋白质浓度

-添加降低水活度的试剂

-改变离子组成。

本发明人已发现压力驱动膜过滤非常适合于制备液体蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料中的至少一种通过涉及蛋白质源的压力驱动膜过滤的过程制备。优选的压力驱动膜过滤包括通过超滤、微滤、纳滤和反渗透进行过滤。已经发现超滤对于制备蛋白质进料是特别优选的，并且可以用作蛋白质进料的制备期间唯一类型的压力驱动膜过滤，或者可以与其他过滤方法组合使用。

蛋白质进料的制备往往涉及进行pH调整以提供具有所需pH的蛋白质进料。优选地，当制备A型蛋白质进料时，将pH调整至pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+1.5范围内的pH，并且当制备B型蛋白质进料时，将pH调整至在pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5范围内的pH。优选地使用食品可接受的酸和/或碱来调整pH。食品可接受的酸是特别优选的，诸如像羧酸。此类酸的可用实例是例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸或葡萄糖酸和/或其混合物。

在本发明的一些优选的实施方案中，使用内酯(例如D-葡萄糖酸-δ-内酯)调整pH，所述内酯缓慢水解并同时降低含有其的水性液体的pH。可以精确计算内酯水解已经结束后的目标pH。

食品可接受的碱的有用示例是例如氢氧化物源、诸如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙，食品酸的盐、诸如像柠檬酸三钠，和/或其组合。

在本发明的其他优选的实施方案中，通过添加H⁺形式的阳离子交换材料来调整pH。珠粒型/大粒子型阳离子交换材料很容易在结晶之前或甚至在结晶之后从初始蛋白质溶液中去除。通过添加H⁺形式的阳离子交换材料来调整pH在本发明中是特别有利的，因为所述调整在不添加显著影响蛋白质进料的电导率的负抗衡离子的情况下降低了pH。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的制备涉及降低蛋白质进料的电导率。

除非另有说明，否则本文提到的电导率值已归一化为25℃。

本发明人已发现，降低初始蛋白质溶液的电导率导致更高的TP晶体产率。初始蛋白质溶液的最小可获得的电导率取决于蛋白质级分和脂质级分(如果有的话)的组成。一些蛋白质种类比其他蛋白质种类对电导率的贡献更大。因此，优选的是使蛋白质进料的电导率接近其中蛋白质和蛋白质的抗衡离子是电导率的主要贡献者的水平。电导率的降低通常涉及去除存在于液相中且未与蛋白质紧密结合的小游离离子中的至少一些。

通常优选的是蛋白质进料的电导率为至多10mS/cm。在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的电导率为至多5mS/cm。优选地，蛋白质进料的电导率为至多4mS/cm。

更低的电导率甚至是更优选的，并且产生更高的TP晶体产率。因此，蛋白质进料的电导率优选地为至多3mS/cm。在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的电导率为至多1mS/cm。优选地，蛋白质进料的电导率为至多0.5mS/cm。

蛋白质进料的低电导率优选通过渗析或渗滤获得。通过超滤进行的渗滤是特别优选的，因为它允许洗掉盐和小带电分子，与此同时保留蛋白质。在本发明的一些优选的实施方案中，相同的UF单元用于UF/渗滤和随后的蛋白质进料浓缩。

本发明人已看到以下迹象：电导率(以mS/cm表示)与初始蛋白质溶液中的蛋白质总量(以相对于初始蛋白质溶液总重量的重量％总蛋白质表示)之间的比率可以有利地保持为处于或低于某个阈值以促进TP结晶。

在本发明的一些优选的实施方案中，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.3。优选地，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.25。优选地，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.20。更优选地，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.18。甚至更优选地，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.12。最优选地，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为至多0.10。

例如，优选的是，电导率与蛋白质进料的蛋白质总量之间的比率为约0.07或甚至更低。

本发明人还发现可以有利地调节蛋白质进料以获得至多10mS/cm的UF渗透物电导率。UF渗透物电导率是液体的小分子级分的电导率的度量并且是根据WO2018/115520的实施例9.10测量的。当本文使用术语“电导率”时，其是指所讨论液体的电导率。当使用术语“UF渗透物电导率”时，其是指液体的小分子级分的电导率并且是根据WO2018/115520的实施例9.10测量的。

优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率为至多7mS/cm。更优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多5mS/cm。甚至更优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多3mS/cm。

如果应获得高产率的TP，则可使用甚至更低的UF渗透物电导率并且是特别优选的。因此，优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率为至多1.0mS/cm。更优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.4mS/cm。甚至更优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.1mS/cm。最优选地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.04mS/cm。

例如，在MilliQ水在渗滤期间用作稀释剂(MilliQ水的电导率为约0.06μS/cm)的情况下，可以达到甚至更低的UF渗透物电导率。因此，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.01mS/cm。替代地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.001mS/cm。替代地，蛋白质进料的UF渗透物电导率可以为至多0.0001mS/cm。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及温度降低。

蛋白质进料的温度可以为至多30℃、优选至多20℃并且甚至更优选至多10℃。本发明人已发现，当混合蛋白质进料时，甚至更低的温度提供了获得的更高的过饱和度，因此，蛋白质进料的温度可以例如降低到至多5℃、优选至多2℃并且甚至更优选至多0℃。温度甚至可以低于0℃，然而优选地蛋白质进料应当保持可泵送，例如为冰浆液形式。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料在它们被合并以制备初始蛋白质溶液之前是冰浆液。

蛋白质进料的制备优选涉及一个或多个蛋白质浓缩步骤，诸如超滤、纳滤、反渗透和/或蒸发。

超滤是特别优选的，因为其允许蛋白质的选择性浓缩。如上所提及，在蛋白质进料的制备期间，优选将超滤用于渗滤和浓缩两者。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的TP浓度低于发生TP自发结晶的情况下的水平。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及添加一种或多种水活度降低剂。

此类水活度降低剂的可用但非限制性实例是多糖和/或聚乙二醇(PEG)。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及通过添加新的离子种类、通过渗析或渗滤进行离子交换。

在本发明的另外其他优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及降低电导率，例如通过使用保留至少TP的膜进行渗滤来降低电导率。通过超滤进行渗滤是特别优选的。

任何合适的蛋白质源可以用于制备蛋白质进料。在本发明的一些优选的实施方案中，通过发酵能够产生TP的哺乳动物细胞、重组植物细胞、重组哺乳动物细胞和/或重组微生物中的一者或多者来产生蛋白质源。

通常，通过合并且优选混合上述方法中的两种或更多种来制备蛋白质进料。

在本发明的一些优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及对蛋白质源进行：

-pH调整至所需pH，优选地当制备A型蛋白质进料时，在pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+1.5范围内的pH，并且当制备B型蛋白质进料时，在pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5范围内的pH，以及

-通过超滤、纳滤和/或反渗透进行浓缩。

在本发明的优选的实施方案中，蛋白质进料的制备涉及对蛋白质源进行：

-pH调整至所需pH，优选地当制备A型蛋白质进料时，在pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+1.5范围内的pH，并且当制备B型蛋白质进料时，在pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5范围内的pH，

-通过超滤、纳滤和/或反渗透进行浓缩，

-进行超滤/渗滤以提供具有低电导率的蛋白质进料，以及

-进行温度调节以将加工期间液体料流的温度保持在至多20℃、更优选至多15℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

本发明人还已发现，可以通过控制钠+钾的总和与钙和镁的总和之间的摩尔比来提高本发明方法的TP产率。令人惊奇的是，较高的钙和镁相对量似乎增加了TP的产率，并因此增加了本发明方法的TP回收效率。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，A型蛋白质进料的在Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比将为至多4。更优选地，在合并的情况下，A型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比将为至多2。甚至更优选地，在合并的情况下，A型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比为至多1.5，并且甚至更优选至多1.0。最优选地，在合并的情况下，A型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比为至多0.5，诸如像至多0.2。

Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比被计算为(m_Na+m_K)/(m_Ca+m_Mg)，其中m_Na是以mol计的元素Na的含量，m_K是以mol计的元素K的含量，m_Ca是以mol计的元素Ca的含量，并且m_Mg是以mol计的元素Mg的含量。

在本发明的一些优选的实施方案中，在合并的情况下，B型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比将为至多4。更优选地，在合并的情况下，B型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比将为至多2。甚至更优选地，在合并的情况下，B型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比为至多1.5，并且甚至更优选至多1.0。最优选地，在合并的情况下，A型蛋白质进料的Na+K与Ca+Mg之间的摩尔比为至多0.5，诸如像至多0.2。

在本发明的一些实施方案中，蛋白质进料具有低的变性蛋白质含量。优选地，蛋白质进料的蛋白质变性程度为至多20％、优选至多10％、更优选至多5％并且最优选至多2％。

在步骤a)中，初始蛋白质溶液被制备成其具有TP能够在盐溶条件下结晶的pH，通常在pH_MCY,TP的+/-0.7个pH单位范围内。

所有pH值都使用pH玻璃电极测量并且归一化为25℃。

更优选地，初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP的+/-0.5个pH单位范围内。

本发明人已观察到最大TP结晶产率在pH_MCY,TP下获得，并且初始蛋白质溶液的pH可以有利地选择在pH_MCY,TP之外，但在结晶期间移动到更接近最佳pH，例如通过添加食用酸或附加的B型蛋白质进料或A型蛋白质进料来进行。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP-0.7至pH_MCY,TP-0.2范围内。替代地但是也优选的是，初始蛋白质溶液的pH可以在pH_MCY,TP+0.2至pH_MCY,TP+0.7范围内。

在本发明的其他优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP-0.2范围内。替代地但是也优选的是，初始蛋白质溶液的pH可以在pH_MCY,TP+0.2至pH_MCY,TP+0.5范围内。

本发明人已发现有利的是避免在结晶期间自发结晶，并且与由自发TP结晶产生的TP晶体相比，通过在亚稳定区中受控结晶形成的TP晶体具有更均匀的粒径分布并且更容易有效地从母液中分离。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，控制初始蛋白质溶液以及优选地结晶蛋白质溶液以避免自发TP结晶。例如优选的是初始蛋白质溶液是关于TP过饱和的，但处于亚稳定区中，意味着无法发生自发TP结晶。

本发明人已发现初始蛋白质溶液的低电导率导致较高的TP晶体产率。初始蛋白质溶液的最小可获得的电导率取决于蛋白质级分和脂质级分(如果有的话)的组成。一些蛋白质种类比其他蛋白质种类对电导率的贡献更大。因此，优选的是使蛋白质进料的电导率接近其中蛋白质和蛋白质的抗衡离子是电导率的主要贡献者的水平。电导率的降低通常涉及去除存在于液相中且未与蛋白质紧密结合的小游离离子中的至少一些。

通常优选的是初始蛋白质溶液的电导率为至多10mS/cm。在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的电导率为至多5mS/cm。优选地，初始蛋白质溶液的电导率为至多4mS/cm。

更低的电导率甚至是更优选的，并且产生更高的TP晶体产率。因此，初始蛋白质溶液的电导率优选为至多3mS/cm。在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的电导率为至多1mS/cm。优选地，初始蛋白质溶液的电导率为至多0.5mS/cm。

本发明人已看到以下迹象：初始蛋白质溶液的电导率(以mS/cm表示)与蛋白质总量(以相对于初始蛋白质溶液总重量的重量％总蛋白质表示)之间的比率可以有利地保持为处于或低于某个阈值以促进TP结晶。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.3。优选地，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.25。优选地，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.20。更优选地，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.18。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.12。最优选地，初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为至多0.10。

例如优选的是初始蛋白质溶液的电导率与蛋白质总量之间的比率为约0.07，或甚至更低。

本发明人还已发现初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率有利地可为至多10mS/cm。UF渗透物电导率是液体的小分子级分的电导率的度量并且是根据WO2018/115520的实施例9.10测量的。当本文使用术语“电导率”时，其是指所讨论液体的电导率。当使用术语“UF渗透物电导率”时，其是指液体的小分子级分的电导率并且是根据WO2018/115520的实施例9.10测量的。

优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率为至多7mS/cm。更优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多5mS/cm。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多3mS/cm。

如果应获得高产率的TP，则可使用甚至更低的UF渗透物电导率并且是特别优选的。因此，优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率为至多1.0mS/cm。更优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.4mS/cm。甚至更优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.1mS/cm。最优选地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.04mS/cm。

例如，在MilliQ水在渗滤期间用作稀释剂(MilliQ水的电导率为约0.06μS/cm)的情况下，可以达到甚至更低的UF渗透物电导率。因此，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.01mS/cm。替代地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.001mS/cm。替代地，初始蛋白质溶液的UF渗透物电导率可以为至多0.0001mS/cm。

本发明人已发现低温提高了TP结晶产率。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的温度为至多30℃、更优选至多20℃并且最优选至多10℃。更低的温度提供甚至更高的过饱和度，因此，初始蛋白质溶液的温度为优选至多5℃、更优选至多2℃并且甚至更优选至多0℃。温度甚至可以低于0℃，然而优选地初始蛋白质溶液应当保持可泵送，例如为冰浆液形式。

在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液在TP结晶初始化时为冰浆液。替代地或另外地，使初始蛋白质溶液结晶可在步骤b)的TP结晶期间转化为或维持为冰浆液。

特别优选的是，初始蛋白质溶液通过盐溶而关于TP过饱和，因此TP可以以盐溶方式从初始蛋白质溶液中结晶。

在本发明的一些实施方案中，初始蛋白质溶液具有低的变性蛋白质含量，特别是在本发明的TP产品也应具有一定程度的蛋白质变性的情况下更是如此。优选地，初始蛋白质溶液的蛋白质变性程度为至多20％、优选至多10％、更优选至多5％并且最优选至多2％。

所述方法的步骤b)涉及使过饱和初始蛋白质溶液的TP中的至少一些TP结晶。

特别优选的是，步骤b)的结晶以盐溶方式进行，即在具有低离子强度和电导率的液体中进行。这与将显著量的盐添加到溶液中以引发结晶的盐析模式相反。

步骤b)的TP结晶可以例如涉及以下中的一者或多者：

-等待结晶发生，

-添加结晶晶种，

-更进一步提高TP的过饱和度，和/或

-进行机械刺激。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)涉及将结晶晶种添加到初始蛋白质溶液中。本发明人已发现，添加结晶晶种使得可以控制TP结晶何时和在何处发生，以避免生产期间工艺设备的突然堵塞和意外停止。例如，通常期望避免在浓缩蛋白质进料的同时使结晶起始。

原则上，可以使用任何引发TP结晶的晶种材料。然而，优选的是使用水合TP晶体或干燥TP晶体进行引晶，以避免将附加杂质添加到初始蛋白质溶液中。

结晶晶种可以是干燥形式，或者可以在添加到初始蛋白质溶液中时形成悬浮液的一部分。目前优选的是添加含有结晶晶种(例如TP晶体)的悬浮液，因为它似乎提供更快的结晶起始。优选的是，这种含有结晶晶种的悬浮液的pH在5-6范围内并且电导率为至多10mS/cm。

在本发明的一些实施方案中，结晶晶种中的至少一些结晶晶种位于与初始蛋白质溶液接触的固相上。

所述结晶晶种优选具有比TP晶体的所需大小更小的粒径。可以通过筛分或其他大小分级过程去除最大的晶种，以改变结晶晶种的大小。还可以在大小分级之前采用例如借助于研磨减小粒径。

在本发明的一些实施方案中，至少90％w/w的结晶晶种的(通过筛分分析测量的)粒径在0.1-600微米范围内。例如，至少90％w/w的结晶晶种的粒径可在1-400微米范围内。优选地，至少90％w/w的结晶晶种的粒径可在5-200微米范围内。更优选地，至少90％w/w的结晶晶种的粒径可在5-100微米范围内。

可以定制结晶晶种的粒径和剂量以提供最佳的TP结晶。

在本发明的一些优选的实施方案中，一种或多种A型或B型蛋白质进料中的至少一者已含有TP晶体，在这种情况下不需要进一步引晶，但通常优选的是确保足够量的结晶晶种。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)涉及更进一步提高TP的过饱和度，优选达到TP结晶立即(即在至多20分钟内，优选至多5分钟内)开始的过饱和度。这也称为成核区，在成核区中微晶自发形成并开始结晶过程。

过饱和度可以例如通过以下中的一者或多者来增加：

-进一步提高初始蛋白质溶液的蛋白质浓度

-进一步冷却初始蛋白质溶液

-使初始蛋白质溶液更接近TP结晶的最佳pH

-更进一步降低电导率。

特别优选的是通过加入附加A型或B型蛋白质进料来进一步提高初始蛋白质溶液的蛋白质浓度和/或使初始蛋白质溶液更接近TP结晶的最佳pH(pH_MCY,TP)。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)涉及等待TP晶体形成。这可能需要几个小时并且通常用于初始蛋白质溶液，所述初始蛋白质溶液关于TP仅稍微过饱和并且尚未添加结晶晶种。

在本发明的一些优选的实施方案中，提供初始蛋白质溶液(步骤a)和TP结晶(步骤b)作为两个单独的步骤进行。然而，如果初始蛋白质溶液已经含有至少一些TP晶体，则步骤b)在已经制备初始蛋白质溶液的时刻开始。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)涉及对结晶蛋白质溶液进行附加调整，优选地以提高TP的过饱和度，或至少维持过饱和。附加调整优选地导致TP晶体产率增加或提供具有更好品质的TP晶体，例如为具有更大且更均匀的晶体大小的形式。

此类附加调整可以涉及以下中的一者或多者：

-更进一步提高结晶蛋白质溶液的蛋白浓度

-将结晶蛋白质溶液冷却至甚至更低的温度

-使结晶蛋白质溶液更接近TP结晶的最佳pH

-更进一步降低结晶蛋白质溶液的电导率。

在本发明的一些优选的实施方案中，在步骤b)期间将结晶蛋白质溶液维持在亚稳定区中以避免新微晶的自发形成。

特别优选的是通过加入附加A型或B型蛋白质进料来进一步提高结晶蛋白质溶液的蛋白质浓度和/或使结晶蛋白质溶液更接近TP结晶的最佳pH(pH_MCY,TP)。优选缓慢地执行pH调整以避免自发结晶或大的局部pH差异。已发现在0.05-0.5个pH单位/小时范围内的pH调整速率对于受控TP结晶是有利的。

此外特别优选的是，在步骤b)期间将结晶蛋白质溶液的温度降低至比初始蛋白质溶液的温度低至少2℃、更优选低至少4℃、最优选比初始蛋白质溶液的温度低至少6℃。然而，优选的是结晶蛋白质溶液不会完全冷冻。

本发明人已观察到最大TP结晶产率是在pH_MCY,TP时获得的，并且初始蛋白质溶液的pH可以有利地选择在最佳值之外，但在结晶期间移动到更接近最佳pH，例如通过添加食用酸或更优选地通过附加的B型蛋白质进料或A型蛋白质进料来实现。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP-0.2范围内或在pH_MCY,TP+0.2至pH_MCY,TP+0.5范围内。在本发明的此类优选的实施方案中，还优选的是调整结晶蛋白质溶液的pH以使结晶蛋白质溶液的pH比初始蛋白质溶液的pH更接近pH_MCY,TP，优选地通过添加附加A型蛋白质进料或附加B型蛋白质进料来实现。特别优选的是在结晶期间将结晶蛋白质溶液调节至大约pH_MCY,TP。用于调整结晶蛋白质溶液的附加A型蛋白质进料或附加B型蛋白质进料的电导率优选具有等于或低于结晶蛋白质溶液。还优选的是将上述结晶期间的pH调整与结晶蛋白质溶液的温度降低进行组合，使得例如同时或顺序地，结晶蛋白质溶液冷却至低于初始蛋白质溶液温度的温度。

在本发明的一些优选的实施方案中：

-步骤a)的初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP-0.2范围内或在pH_MCY,TP+0.2至pH_MCY,TP+0.5范围内，并且初始蛋白质溶液的温度在5-20℃范围内，

-在步骤b)期间，将使结晶蛋白质溶液的pH调整至pH_MCY,TP-0.1至pH_MCY,TP+0.1范围内的pH，如果初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP-0.2范围内则优选通过添加附加A型蛋白质进料来实现，或者如果初始蛋白质溶液的pH在pH_MCY,TP+0.2至pH_MCY,TP+0.5范围内则优选通过添加附加B型蛋白质进料来实现，并且

-在步骤b)期间，将使结晶蛋白质溶液的温度降低至比初始蛋白质溶液的温度低至少2℃的温度。

术语“附加A型蛋白质进料”和“附加B型蛋白质进料”涉及含有TP的组合物，所述含有TP的组合物被添加到初始蛋白质溶液中以引发结晶或添加到结晶蛋白质溶液中以至少改变所述结晶蛋白质溶液的pH和TP含量。在“A型蛋白质进料”和“B型蛋白质进料”的上下文中描述的特征和优选项分别等同地适用于“附加A型蛋白质进料”和“附加B型蛋白质进料”。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，所述方法包括将TP晶体中的至少一些TP晶体与含TP晶体的溶液的剩余液体分离的步骤c)。当需要纯化TP时，这是特别优选的。

步骤c)可以例如包括将TP晶体分离至固体含量为至少30％w/w。优选地，步骤c)包括将TP晶体分离至固体含量为至少40％w/w。甚至更优选地，步骤c)包括将TP晶体分离至固体含量为至少50％w/w。

本发明人已发现，高固体含量对于TP纯化是有利的，因为粘附到分离的TP晶体的水性部分通常含有应避免的杂质。另外，高固体含量降低了将分离的TP晶体转化为干燥产品(诸如像粉末)的能量消耗，并且增加了从具有给定容量的干燥单元获得的TP产率。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤c)包括将TP晶体分离至固体含量为至少60％。优选地，步骤c)包括将TP晶体分离至固体含量为至少70％。甚至更优选地，步骤c)包括将TP晶体分离至固体含量为至少80％。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤c)的分离涉及以下操作中的一种或多种：

-离心，

-倾析，

-过滤，

-沉淀，

-上述的组合。

这些单元操作是对于本领域技术人员来说众所周知且容易实现的。通过过滤进行的分离可以例如涉及使用真空过滤、动态错流过滤(DCF)、压滤机或过滤式离心机。

基于所需的结果，可以采用不同的过滤孔径。优选地，过滤器允许天然蛋白质和小聚集体穿过但保留TP晶体。过滤器的标称孔径优选为至少0.1微米。过滤器的标称孔径可以例如为至少0.5微米。甚至更优选地，过滤器的标称孔径可以为至少2微米。

也可以使用具有较大孔径的过滤器，并且实际上如果主要应将大晶体与含TP晶体的液体分离，则过滤器是优选的。在本发明的一些实施方案中，过滤器的标称孔径为至少5微米。优选地，过滤器的标称孔径为至少20微米。甚至更优选地，过滤器的孔径可以为至少40微米。

过滤器的孔径可以在例如0.03-5000微米范围内，诸如像0.1-5000微米。优选地，过滤器的孔径可以在0.5-1000微米范围内。甚至更优选地，过滤器的孔径可以在5-800微米范围内，例如在10-500微米范围内或在50-500微米范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤器的孔径在0.03-100微米范围内。优选地，过滤器的孔径可以在0.1-50微米范围内。更优选地，过滤器的孔径可以在4-40微米范围内。甚至更优选地，过滤器的孔径可以在5-30微米范围内，诸如在10-20微米范围内。

使用孔径大于1微米的过滤器的优点在于，细菌和其他微生物在分离期间并且任选地也在洗涤和/或重结晶期间也被至少部分地去除。因此，本发明方法使得可以生产高纯度TP，其细菌载量非常低，同时避免了对蛋白质的热损伤。

使用孔径大于1微米的过滤器的另一个优点是去除水和随后的干燥变得更容易并且消耗更少的能量。

在初始蛋白质溶液的制备期间，与TP晶体分离的剩余液体可以再循环到一种或多种蛋白质进料中。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤c)采用过滤式离心机。在本发明的其他优选的实施方案中，步骤c)采用沉降式离心机。结果(参见WO2018/115520的实施例13)显示，使用过滤式离心机和/或沉降式离心机从母液中分离TP晶体提供了比例如真空过滤更稳健的方法操作。

通常优选的是用干燥气体干燥所形成的滤饼以降低滤饼的水分含量并且优选使得可以将滤饼从过滤器上剥离。干燥气体的使用可以形成分离步骤的一部分，或者替代地，如果滤饼直接转化为干的TP产品，则可以形成最终干燥步骤。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤c)采用DCF单元。

在本发明的一些优选的实施方案中，使用配备有能够保留TP晶体的膜的DCF单元执行步骤c)，DCF渗透物被再循环以形成初始蛋白质溶液或蛋白质进料的一部分，并且DCF渗余物可以被回收或返回至结晶罐。优选地，在与初始蛋白质溶液或蛋白质进料混合之前，例如通过超滤/渗滤处理DCF渗透物以使其关于TP过饱和。

有利地，这些实施方案不需要将液体料流的温度升高到高于15℃，因此与需要更高温度的方法变体相比更不易受到微生物污染。这些实施方案的另一个工业优点是过饱和水平易于控制并且可以保持在不发生不希望的自发结晶的水平。因此，在所述方法的这些实施方案期间液体料流的温度优选为至多15℃、更优选至多12℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

这些实施方案例示于WO2018/115520的实施例10中，并且可以同样用TP来实现。这些实施方案可实现为分批方法或连续方法。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述方法包括洗涤TP晶体、例如c)中分离的TP晶体的步骤d)。洗涤可以由单次洗涤或多次洗涤步骤组成。

步骤d)的洗涤优选涉及使TP晶体与洗涤液接触而不完全溶解TP晶体，以及随后将剩余的TP晶体与洗涤液分离。

洗涤液优选地经选择为避免TP晶体完全溶解，并且可例如包含或甚至基本上由冷的脱盐水、冷的自来水或冷的反渗透渗透物组成。

洗涤液的pH可以在pH_MCY,TP-0.7至pH_MCY,TP+0.7范围内、更优选在pH_MCY,TP-0.5topH_MCY,TP+0.5范围内并且甚至更优选在pH_MCY,TP-0.4至pH_MCY,TP+0.4范围内，诸如像在pH_MCY,TP-0.3至pH_MCY,TP+0.3范围内。

洗涤液的电导率可以为至多0.1mS/cm、优选至多0.02mS/cm并且甚至更优选至多0.005mS/cm。

可以使用具有甚至更低电导率的洗涤液。例如，洗涤液的电导率可以为至多1μS/cm。替代地，洗涤液的电导率可以为至多0.1μS/cm，诸如像约0.05μS/cm。

洗涤步骤优选在低温下执行以限制结晶TP的溶解。洗涤液的温度优选为至多30℃、更优选为至多20℃并且甚至更优选至多10℃。

洗涤步骤可以例如在至多5℃、更优选至多2℃、诸如像约0℃下执行。只要洗涤液在低于0℃的温度下不会冻结，例如由于存在一种或多种冰点抑制剂，就可以使用该温度。

在本发明的一些实施方案中，洗涤液含有例如量为至少1％w/w、优选量为至少3％w/w、诸如像量为4％w/w的TP。

步骤d)的洗涤通常溶解初始量的TP晶体的至多80％w/w、优选至多50％w/w并且甚至更优选溶解初始量的TP晶体的至多20％w/w。优选地，步骤d)的洗涤溶解初始量的TP晶体的至多15％w/w、更优选至多10％w/w并且甚至更优选溶解初始量的TP晶体的至多5％w/w。

洗涤液的总量与分离的TP晶体的初始量之间的重量比通常为至少1、优选至少2并且更优选至少5。例如，洗涤液的量与分离的TP晶体的初始量之间的重量比可以为至少10。替代地，洗涤液的总量与分离的TP晶体的初始量之间的重量比可以为至少20，诸如像至少50或至少100。

术语“洗涤液的总量”是指整个过程期间使用的洗涤液的总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，一个或多个洗涤程序发生在与TP晶体分离相同的过滤器布置中或相似的过滤器布置中。向主要含有TP晶体的滤饼添加一个或多个程序的洗涤液，所述洗涤液被经由过滤器去除，而TP晶体的剩余部分保留在滤饼中。

在本发明的特别优选的实施方案中，步骤c)的分离是使用保留TP晶体的过滤器执行的。随后，使滤饼与移动穿过滤饼和过滤器的一份或多份洗涤液接触。通常优选的是每份洗涤液为滤饼体积的至多10倍，优选为滤饼体积的至多5倍，更优选为滤饼体积的至多1倍，甚至更优选为滤饼体积的至多0.5倍，诸如像为滤饼体积的至多0.2倍。滤饼的体积包括滤饼的固体和流体(液体和气体)两者。优选以这种方式洗涤滤饼至少2次，优选至少4次，并且甚至更优选至少6次。

来自步骤d)的用过的洗涤液可以例如再循环至蛋白质进料或初始蛋白质溶液，其中可以再次分离洗出的TP。

所述方法还可以包括步骤e)，所述步骤涉及重结晶步骤。重结晶步骤例如可以包括：

-将分离的TP晶体溶解在重结晶液中，

-调整重结晶液体以获得关于TP过饱和，

-使TP在过饱和的、经调整的重结晶液中结晶，以及

-从剩余的经调整的重结晶液中分离TP晶体。

替代地且通常更优选地，将分离的TP晶体转化成一种或多种A型蛋白质进料和一种或多种B型蛋白质进料，所述蛋白质进料经合并以形成如在步骤a)中的新的过饱和蛋白质溶液，并且在所述新的蛋白质溶液中TP再次结晶。

步骤e)可以包括单个重结晶程序或多个重结晶程序。

在本发明的一些实施方案中，步骤c)或d)的TP晶体重结晶至少2次。例如，TP晶体可以重结晶至少3次，诸如像至少4次。

洗涤和重结晶步骤可以以任何顺序组合，并且如果需要的话可以执行多次。

可以使步骤c)的分离的TP晶体例如经历以下过程程序：

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，然后是

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)。

替代地，可以使步骤c)的分离的TP晶体经历以下过程程序：

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，然后是

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)。

还可以将多个洗涤和重结晶步骤组合起来，例如按顺序为：

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，以及

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)。

或者例如按顺序为：

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)，

-一个或多个重结晶步骤(步骤e)，

-一个或多个洗涤步骤(步骤d)。

在本发明的一些实施方案中，所述方法还涉及使分离的TP经历附加的TP富集步骤，例如基于色谱法或选择性过滤。然而，在本发明的其他优选的实施方案中，所述方法在步骤b)之后不包括附加的TP富集步骤。术语“附加的TP富集步骤”意指相对于蛋白质总量富集TP的过程步骤，所述步骤与TP的结晶或TP晶体的处理无关。这种附加的TP富集步骤的实例是离子交换色谱法。TP晶体的洗涤和/或TP重结晶不被视为“附加的TP富集步骤”。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，所述方法涉及干燥步骤f)，其中将来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物转化为干燥组合物。

在本发明的上下文中，术语“干燥”意指所考虑的组合物或产品包含至多6％w/w的水，并且优选甚至更少。

在本发明的上下文中，术语“含TP的组合物”用于描述经受步骤f)的干燥的组合物。

在本发明的上下文中，“来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物”意指包含来自步骤b)、c)、d)或e)的TP中的至少一些TP的组合物。在本发明的一些优选的实施方案中，“来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物”直接从步骤b)、c)、d)或e)获得。然而，在本发明的其他优选的实施方案中，“来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物”是对直接从步骤b)、c)、d)或e)获得的组合物的进一步加工的结果。

通常优选的是，含TP的组合物含有存在于直接从步骤b)、c)、d)或e)获得的组合物中的显著量的TP。在本发明的一些优选的实施方案中，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物包含至少50％w/w、优选至少70％并且甚至更优选至少80％的从步骤b)、c)、d)或e)获得的TP。

优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物包含至少85％w/w的从步骤b)、c)、d)或e)获得的TP。更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物包含至少90％w/w的从步骤b)、c)、d)或e)获得的TP。甚至更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物包含至少95％w/w的从步骤b)、c)、d)或e)获得的TP。最优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物包含至少100％w/w的从步骤b)、c)、d)或e)获得的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，干燥步骤涉及喷雾干燥、冷冻干燥、旋转闪蒸干燥、旋转干燥和/或流化床干燥中的一种或多种。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，干燥步骤涉及其中已溶解有TP晶体的含TP的组合物，并且其中所得粉末不包含通过步骤b)或通过在干燥步骤之前的重结晶形成的TP晶体。

TP晶体可以例如通过以下方式溶解：

-升高温度，

-增大电导率，例如通过添加一种或多种盐来增大电导率，

-改变pH，例如超出范围pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP+0.5，更优选超出范围pH_MCY,TP-0.7至pH_MCY,TP+0.7，

-降低TP浓度，例如通过稀释来降低TP浓度，

-或上述的组合。

喷雾干燥是目前优选的干燥不含TP晶体的含TP的组合物的方法。

在本发明的其他特别优选的实施方案中，干燥步骤涉及仍含有TP晶体的含TP的组合物，并且其中所得粉末含有TP晶体。在TP产品应具有比常规干燥的TP粉末更高的密度的情况下，这些实施方案是优选的。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，干燥步骤涉及仍含有TP晶体的含TP的组合物，并且其中所得粉末含有TP晶体。在TP产品具有比常规干燥的TP粉末更高的密度的情况下，这些实施方案是优选的。

在本发明的一些实施方案中，含有TP晶体的含TP的组合物当到达喷雾装置(例如喷嘴或雾化器)的出口时的温度为至多70℃、优选至多60℃、更优选至多50℃。在本发明的一些优选的实施方案中，含有TP晶体的含TP的组合物当到达喷雾装置的出口时的温度为至多40℃、优选至多30℃、更优选至多20℃、甚至更优选至多10℃并且最优选至多5℃。

喷雾干燥器的喷雾装置是将待干燥的溶液或悬浮液转化成进入喷雾干燥器的干燥室的液滴的装置，例如喷嘴或雾化器。

特别优选的是，含有TP晶体的含TP的组合物当到达喷雾装置的出口时的温度在0-50℃范围内、优选在2-40℃范围内、更优选在4-35℃范围内并且最优选地在5-10℃范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，含TP的组合物当到达喷雾装置的出口时的TP结晶度为至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％，诸如像优选97-100％。含TP的组合物可以是TP分离物，例如含有相对于总蛋白大于为90％w/w的量的TP，或者它可以含有显著量的其他蛋白质并且因此含有相对于总蛋白为至多90％w/w的量的TP。

喷雾干燥器的气体入口温度优选在140-220℃范围内、更优选在160-200℃范围内并且甚至更优选在170-190℃范围内，诸如像优选约180℃。来自喷雾干燥器的气体的出口温度优选在50-95℃范围内、更优选在70-90℃范围内并且甚至更优选在80-88℃范围内，诸如像优选约85℃。根据经验法则，据称经受喷雾干燥的固体被加热到比气体出口温度低10-15℃的温度。

在本发明的一些优选的实施方案中，喷雾干燥器优选在50-85℃范围内、更优选在60-80℃范围内并且甚至更优选在65-75℃范围内，诸如像优选约70℃。

在本发明的一些优选的实施方案中，将待干燥的含TP的组合物与干燥的TP分离物混合，以将固体含量提高至可通过流化床干燥来干燥混合物的水平。这也称为返混，并且允许对TP产品进行非常经济有效的干燥。这些实施方案对于含有TP晶体的含TP的组合物来说是特别优选的。

本发明方法的优点是待干燥的含TP的组合物在干燥步骤之前可以具有非常高的固体含量，并且因此在干燥操作中必须去除的水较少且消耗的能量较少。

在本发明的一些优选的实施方案中，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量为至少20％w/w。优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量为至少30％w/w。更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量为至少40％w/w。甚至更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量为至少50％w/w，诸如像至少60％w/w。

在本发明的其他优选的实施方案中，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量在20-80％w/w范围内。优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量在30-70％w/w范围内。更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量在40-65％w/w范围内。甚至更优选地，来源于步骤b)、c)、d)或e)的含TP的组合物的固体含量在50-65％w/w范围内，诸如像约60％w/w。

本发明人已发现，含TP的组合物的结晶度越高，与含TP的组合物结合的水就越少，并且在干燥步骤之前可以实现含TP的组合物的越高总固体含量。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，含TP的组合物的TP结晶度为至少10％w/w。优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少20％w/w。更优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少30％w/w。甚至更优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少40％w/w。

甚至更高的结晶度通常是优选的。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，含TP的组合物的TP的结晶度为至少50％w/w。优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少60％w/w。更优选地，TP组合物的TP结晶度为至少70％w/w。甚至更优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少80％w/w。最优选地，含TP的组合物的TP结晶度为至少90％w/w、优选至少95％w/w、更优选至少97％w/w并且甚至更优选至少99％w/w。

本发明人已发现，水含量的降低倾向于增大组合物的TP的结晶度。因此，在相同条件下，水:TP比率高的组合物(例如，4％ TP晶体在水中的悬浮液)倾向于比水:TP比率更低的组合物(例如，滤饼或潮湿的孤立晶体)具有更低的TP结晶度。

本发明的方法可以使用不破坏TP的温和温度进行操作。

在本发明的一些优选的实施方案中，在所述方法期间TP不经受高于90℃的温度。优选地，在所述方法期间TP不经受高于80℃的温度。甚至更优选地，在所述方法期间TP不经受高于75℃的温度。应当指出的是，尽管喷雾干燥通常采用超过150℃的温度，但较短的暴露时间和同时发生的水蒸发意味着喷雾干燥的蛋白质不会经历高于50-70℃的温度。

本发明人已看到以下迹象，在干燥步骤期间延长加热减少了晶体形式的TP的量。在本发明的一些优选的实施方案中，将干燥步骤期间的热暴露保持足够低以提供至多10％、优选至多4％、更优选至多1％、甚至更优选至多0.4％并且甚至更优选至多0.1％的TP变性程度。最优选地，干燥步骤完全不导致可检测到的TP变性。

由干燥步骤引起的变性程度通过确定在步骤f)中待干燥的含TP的组合物中的TP含量(相对于总固体)(c_{步骤f之前})和再溶解的干燥组合物中的TP含量(相对于总固体)并使用下式来计算：

变性程度＝((c_{步骤f之前}-c_{步骤f之后})/c_{步骤f之前})×100％

本发明方法的优点在于其比现有技术的可比TP结晶方法快得多。从最初调整蛋白质进料到完成步骤c的分离的持续时间可以为至多10小时、优选至多4小时、更优选至多2小时并且甚至更优选至多1小时。

TP产品优选含有量为相对于蛋白质总量的至少30％w/w的TP以及量为相对于总固体的至少30％w/w的总蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品的TP结晶度为至少10％w/w。优选地，TP产品的TP结晶度为至少20％w/w。更优选地，TP产品的TP结晶度为至少30％w/w。甚至更优选地，TP产品的TP结晶度为至少40％w/w。

甚至更高的结晶度通常是优选的。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品的TP结晶度为至少50％w/w。优选地，TP产品的TP结晶度为至少60％w/w。更优选地，TP产品的TP结晶度为至少70％w/w。甚至更优选地，TP产品的TP结晶度为至少80％w/w。最优选地，TP产品的TP结晶度为至少90％w/w，并且优选至少95％w/w。

如在WO2018/115520的实施例9.7中所概述那样，但测量TP而不是BLG，测量pH在pH_MCY,TP-0.5至pH_MCY,TP+0.5范围内的液体的TP结晶度。如在WO2018/115520的实施例9.8中所概述那样，但测量TP而不是BLG，测量粉末状材料的TP结晶度。如果产品是干燥产品但不是粉末形式，则在对其进行WO2018/115520的实施例9.8的方法之前必须将其例如通过研磨或碾磨转化为粉末。

TP产品可以例如包含相对于蛋白质总量至多90％w/w的TP，并且TP结晶度为至少10％。例如，TP产品可以包含相对于蛋白质总量至多80％w/w的TP，并且TP结晶度为至少10％。TP产品可以例如包含相对于蛋白质总量为30-70％w/w的TP，并且TP结晶度为至少10％。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP产品包含相对于蛋白质总量为至多90％w/w的TP，并且TP结晶度为至少30％。优选地，TP产品可以包含相对于蛋白质总量为至多80％w/w的TP，并且TP结晶度为至少30％。甚至更优选地，TP产品可以包含相对于蛋白质总量为30-70％w/w的TP，并且TP结晶度为至少30％。

本发明人已发现，本发明使得可以制备磷和其他矿物质含量非常低的TP产品，这对于患有肾病或肾功能下降的患者是有利的。

TP产品优选是低磷产品。

在本发明的上下文中，术语“低磷”涉及磷总含量为每100g蛋白质至多100mg磷的产品，例如液体、粉末或另一种食品。优选地，低磷产品的总含量为每100g蛋白质至多80mg磷。更优选地，低磷产品的总含量可以为每100g蛋白质至多50mg磷。甚至更优选地，低磷组合物的磷总含量可以为每100g蛋白质至多20mg磷。甚至更优选地，低磷组合物的磷总含量可以为每100g蛋白质至多5mg磷。根据本发明的低磷产品可以用作食品成分，以用于生产用于肾功能下降的患者群体的食品。

因此，在本发明的一些特别优选的实施方案中，TP产品包含每100g蛋白质至多80mg磷。优选地，TP产品包含每100g蛋白质至多30mg磷。更优选地，TP产品包含每100g蛋白质至多20mg磷。甚至更优选地，TP产品包含每100g蛋白质至多10mg磷。最优选地，TP产品包含每100g蛋白质至多5mg磷。

磷含量涉及所讨论的组合物的元素磷的总量并且根据WO2018/115520的实施例9.5确定。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP产品是低矿物质组合物。

在本发明的上下文中，术语“低矿物质”涉及具有以下中的至少一种、优选两种并且甚至更优选全部的组合物，例如液体、粉末或另一种食品：

-相对于总固体为至多1.2％w/w的灰分含量，

-相对于总固体为至多0.3％w/w的钙和镁总含量，

-相对于总固体为至多0.10％w/w的钠和钾总含量，

-每100g蛋白质至多100mg磷的磷总含量。

优选地，低矿物质产品具有以下中的至少一种、优选两种或更多种并且甚至更优选全部：

-相对于总固体为至多0.7％w/w的灰分含量，

-相对于总固体为至多0.2％w/w的钙和镁总含量，

-相对于总固体为至多0.08％w/w的钠和钾总含量，

-每100g蛋白质至多80mg磷的磷总含量。

甚至更优选地，低矿物质产品具有以下中的至少一种、优选两种或更多种并且甚至更优选全部：

-相对于总固体为至多0.5％w/w的灰分含量，

-相对于总固体为至多0.15％w/w的钙和镁总含量，

-相对于总固体为至多0.06％w/w的钠和钾总含量，

-每100g蛋白质至多50mg磷的磷总含量。

特别优选的是，低矿物质产品具有以下：

-相对于总固体为至多0.5％w/w的灰分含量，

-相对于总固体为至多0.15％w/w的钙和镁总含量，

-相对于总固体为至多0.06％w/w的钠和钾总含量，

-每100g蛋白质至多50mg磷的磷总含量。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品包含总量为相对于TP产品的总固体为至少25％w/w的蛋白质。优选地，TP产品包含总量为相对于TP产品的总固体为至少50％w/w的蛋白质。更优选地，TP产品包含总量为相对于TP产品的总固体为至少75％w/w的蛋白质。甚至更优选地，TP产品包含总量为相对于TP产品的总固体为至少90％w/w的蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品的蛋白质的总量在相对于总固体的25-100％w/w范围内。优选地，TP产品的蛋白质的总量在50-100％w/w范围内。更优选地，TP产品的蛋白质的总量在相对于总固体的75-100％w/w范围内。甚至更优选地，TP产品的蛋白质的总量在相对于总固体的90-100％w/w范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品包含相对于蛋白质总量为至少75％w/w的TP。优选地，TP产品可包含相对于蛋白质总量为至少90％w/w的TP。更优选地，TP产品可以包含相对于蛋白质总量为至少95％w/w的TP。甚至更优选地，TP产品可以包含相对于蛋白质总量为至少97％w/w的TP。最优选地，TP产品包含相对于蛋白质总量为约100％w/w的TP。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品含有至多10％w/w的碳水化合物、优选至多5％w/w的碳水化合物、更优选至多1％w/w的碳水化合物并且甚至更优选至多0.1％w/w的碳水化合物。

TP产品还可以包含脂质，例如呈甘油三酯和/或其他脂质类型(诸如磷脂)形式的脂质。

在本发明的一些实施方案中，TP产品包含总量为相对于总固体为至多1％w/w的脂质。优选地，TP产品包含总量为相对于总固体为至多0.5％w/w的脂质。更优选地，TP产品包含总量为相对于总固体为至多0.1％w/w的脂质。甚至更优选地，TP产品包含总量为相对于总固体为至多0.05％w/w的脂质。优选地，TP产品包含总量为相对于总固体为至多0.01％w/w的脂质。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品是干燥产品，例如粉末。特别优选的是，TP产品是喷雾干燥粉末。

本发明人已看到以下迹象，粉末形式的TP产品(其中至少一些TP在干燥时为晶体形式)具有比不含TP晶体的可比TP产品更高的堆积密度。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.40g/mL。优选地，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.45g/mL。更优选地，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.50g/mL。甚至更优选的是，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.6g/mL。粉末形式的TP产品的堆积密度可以为例如至少0.7g/mL。

在本发明的一些优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.45g/mL并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。更优选地，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.50g/mL并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.6g/mL并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。粉末形式的TP产品的堆积密度可以例如为至少0.7g/mL并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.45g/mL并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。更优选地，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.50g/mL并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末形式的TP产品的堆积密度为至少0.6g/mL并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。粉末形式的TP产品的堆积密度可以例如为至少0.7g/mL并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。

粉末形式的TP产品的堆积密度可以例如在0.40-1.5g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.45-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。更优选地，粉末状TP产品的堆积密度可以在0.50-0.9g/mL范围内，并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状TP产品的堆积密度在0.6-0.9g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。粉末状TP产品的堆积密度可以例如在0.6-0.8g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。

本发明人已发现，本发明的高密度粉末有利地允许更经济有效的粉末包装和物流，因为每kg粉末需要更少的包装材料并且给定的容器或卡车可以运输更多的粉末(质量)。

粉末形式的TP产品的堆积密度可以例如在0.40-1.5g/mL范围内。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.45-1.0g/mL范围内。更优选地，粉末状可食用TP产品的堆积密度可以在0.50-0.9g/mL范围内。甚至更优选的是粉末状TP产品的堆积密度在0.6-0.9g/mL范围内。粉末状TP产品的堆积密度可以例如在0.6-0.8g/mL范围内。

在本发明的其他优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度在0.50-1.5g/mL范围内。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.55-1.0g/mL范围内。更优选地，粉末状TP产品的堆积密度可以在0.60-1.0g/mL范围内。甚至更优选的是粉末状TP产品的堆积密度在0.65-1.0g/mL范围内。粉末状TP产品的堆积密度可优选在0.70-1.0g/mL范围内。

粉末形式的TP产品的堆积密度可以例如在0.40-1.5g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.45-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。更优选地，粉末状TP产品的堆积密度可以在0.50-0.9g/mL范围内，并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状TP产品的堆积密度在0.6-0.9g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。粉末状TP产品的堆积密度可以例如在0.6-0.8g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度在0.50-1.5g/mL的范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.55-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。更优选地，粉末状TP产品的堆积密度可以在0.60-1.0g/mL范围内，并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状TP产品的堆积密度在0.65-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。粉末状TP产品的堆积密度可优选在0.70-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少70％w/w的蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，粉末形式的TP产品的堆积密度在0.50-1.5g/mL的范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。优选地，粉末状TP产品的堆积密度在0.55-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。更优选地，粉末状TP产品的堆积密度可以在0.60-1.0g/mL范围内，并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。甚至更优选的是，粉末状TP产品的堆积密度在0.65-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。粉末状TP产品的堆积密度可优选在0.70-1.0g/mL范围内并且包含相对于产品总重量为至少80％w/w的蛋白质。

粉末的堆积密度是根据WO2018/115520的实施例9.3测量的。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品是液体组合物。液体TP产品优选包含至少20％w/w的水、更优选至少30％w/w的水并且甚至更优选至少40％w/w的水。

液体TP产品可以例如包含在20-90％w/w范围内的水、更优选在30-80％w/w范围内的水并且甚至更优选至少40％w/w的水。

本发明人已看到以下迹象，根据本发明的TP产品具有令人惊讶的低蛋白质变性程度，即使已经使用喷雾干燥来制备TP粉末产品也是如此。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品的蛋白质变性程度为至多10％。优选地，TP产品的蛋白质变性程度为至多5％。更优选地，TP产品的蛋白质变性程度为至多2％。甚至更优选地，TP产品的蛋白质变性程度为至多1％。甚至更优选地，TP产品的蛋白质变性程度为至多0.5％。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品是干粉，并且优选地喷雾干燥粉末，并且蛋白质变性程度为至多2％，并且优选至多1.5％。更优选地，例如喷雾干燥粉末形式的干燥TP产品的蛋白质变性程度为至多1.0％。甚至更优选地，例如喷雾干燥粉末形式的干燥TP产品的蛋白质变性程度为至多0.8％。甚至更优选地，例如喷雾干燥粉末形式的干燥TP产品的蛋白质变性程度为至多0.5％。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少80％的总蛋白

-相对于总蛋白为至少95％的TP，并且

所述TP产品：

-是干粉，并且

-堆积密度为至少0.50g/mL，优选至少0.60g/mL。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少80％的总蛋白

-相对于总蛋白为至少95％的TP，并且

所述TP产品：

-是干粉，

-堆积密度为至少0.50g/mL，并且优选至少0.60g/mL，并且-TP结晶度为至少20％，优选至少40％。

在本发明的另外的优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少80％的总蛋白

-相对于总蛋白为至少95％的TP，并且

所述TP产品：

-是干粉，

-堆积密度为至少0.50g/mL，并且优选至少0.60g/mL，并且-蛋白质变性程度为至多2％，并且优选至多1.0％。

在本发明的另外的优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少80％的总蛋白，

-相对于总蛋白为至少95％的TP，

-每100g蛋白质至多80mg的磷。

所述TP产品：

-是干粉。

在本发明的仍优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少90％的总蛋白，

-相对于总蛋白为至少97％的TP，

-每100g蛋白质至多50mg的磷。

所述TP产品：

-是干粉。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP产品包含：

-至多6％w/w的水

-相对于总固体为至少80％的总蛋白，并且优选地相对于总固体至少90％的总蛋白，

-相对于总蛋白为30-90％的TP，

所述TP产品：

-是干粉，并且

-TP结晶度为至少20％，优选至少40％。

在本发明的一些优选的实施方案中，TP产品包含：

-20-80％w/w的水，并且优选20-60％w/w的水，

-相对于总固体为至少80％的总蛋白质，并且优选至少90％的总蛋白质

-相对于总蛋白为至少95％的TP，

-每100g蛋白质至多80mg的磷。

所述TP产品：

-TP结晶度为至少20％，优选至少40，并且

-任选地，蛋白质变性程度为至多2％，并且优选至多1.0％。

根据这些实施方案的液体TP产品尤其可用于制备干燥形式的TP产品，并且尤其适合于喷雾干燥和制备具有其他蛋白质种类的正常浓度分布但含有呈干燥TP晶体形式的TP中的至少一些的高密度TP蛋白质粉末。

在本发明的其他优选的实施方案中，TP产品包含：

-20-80％w/w的水，并且优选20-60％w/w的水，

-相对于总固体为至少80％的总蛋白，并且优选地相对于总固体为至少90％的总蛋白，

-相对于总蛋白为30-79％的TP，

所述TP产品：

-TP结晶度为至少20％，优选至少40％。

根据这些实施方案的产品尤其可用于制备干燥形式的TP产品，并且尤其适合于喷雾干燥和制备具有其他蛋白种类的正常浓度分布但含有呈干燥TP晶体形式的TP中的至少一些的高密度TP蛋白质粉末。

本发明方法优选在1-65℃范围内、优选在2-50℃范围内、更优选在3-20℃范围内、甚至更优选在4-15℃范围内的温度下执行。

本发明的另一方面涉及可通过本发明方法获得的TP产品。

本发明已在上文参照特定实施方案加以描述。然而，在本发明范围内，除了上述之外的其他实施方案同样是可能的。除非另有说明，否则本发明的各种实施方案和方面的不同特征和步骤可以以不同于本文描述的方式的其他方式组合。

实施例

实施例1：基于两种WPI料流的混合的β-乳球蛋白(BLG)结晶。

引言：

在大规模实现WO2018/115520的方法的初始试验期间，在用于制备乳清蛋白质溶液的超滤单元中观察到频繁的自发BLG结晶事件。自发BLG结晶事件导致生产中断，并导致对受结晶影响的工艺单元进行耗时的清洁。

关于BLG的新方法(在PCT/EP2022/053010中描述)：

本发明人随后已想到以下想法，即代替从在制备期间的不利条件(例如，在出现高的局部蛋白质浓度和/或突然冷却时)下可能变成关于BLG过饱和的单一进料生产WO2018/115520的过饱和蛋白质溶液，更明智的做法是从两种(或更多种)进料生产过饱和乳清蛋白质溶液，每种进料具有使其关于BLG明显不过饱和(或仅有限程度的过饱和)的pH，然后混合这两种(或更多种)进料以获得用于BLG过饱和的正确pH，即接近pH 5.5的pH。

这种新方法使得可以制备蛋白质含量非常高的蛋白质进料，而不存在不受控制的BLG结晶的风险。此外，这种方法使得可以在显著低于微生物生长最佳温度的温度下制备进料并随后制备初始蛋白质溶液，这是有利的，因为将最终产品的微生物含量降低到可接受的水平所需的热处理更少。本发明人还已发现，与用传统的食用酸或食用碱进行相同的pH变化相比，通过本发明的A型和/或B型蛋白质进料进行的pH调整仅导致初始蛋白质溶液的电导率的非常有限的变化。这是有益的，因为初始蛋白质溶液的电导率降低通常会产生更高的BLG结晶产率。

所述新方法也适用于其他蛋白质种类(本发明)：

本发明人已经意识到，PCT/EP2022/053010中公开的新方法也适用于除BLG之外的能够在盐溶条件下结晶的其他蛋白质种类，只要pH范围如本文所述进行调整即可。新方法的可行性在本实施例中使用BLG作为能够在盐溶条件下结晶的模型蛋白质得到了证明，但是可以应用于能够在盐溶条件下结晶的其他蛋白质种类。

在本实施例中，蛋白质进料基于含BLG的乳清蛋白分离物，并且第一蛋白质进料(批次一，A型蛋白质进料)的pH为6.2，并且第二蛋白质进料(批次二，B型蛋白质进料)的pH为4.9。尽管BLG的蛋白质浓度很高，但没有一种蛋白质进料是过饱和的。然而，通过简单地将两种进料以适当的量混合(以获得接近pH 5.5的pH，本发明人已发现其为提供BLG的最大结晶产率的pH，pH_MCY,BLG)，获得了相对于BLG过饱和的初始蛋白质溶液，可以使BLG从所述初始蛋白质溶液中结晶。

过程：

本实施例中的乳清原材料是一种来源于标准奶酪生产工艺中的甜乳清的脱乳糖UF渗余物，乳清在使用前已经由Synder FR膜进行了减脂处理。从这种原材料生产两个批次，并通过超滤装置，使用Alfa Laval GR82PE膜以30磨机间隔件和1.5-3.0巴的进料压力进行调整。使用精制水作为渗滤介质对产品进行脱矿物质，并且进料的浓度为18％ TS(总固体)±5％。继续渗滤至少直到20min时段内渗余物中的电导率下降低于0.02mS/cm，此时渗余物中的TS是稳定的(±0.5％ TS)。然后将渗余物浓缩至约22％ TS，批次一和批次二的进料组成可见于表1.1和表1.2中。

在10℃至12℃下进行UF处理之前，将第一批(批次一)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH 6.1。在10℃至12℃下进行UF处理之前，将另一批(批次二)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH 4.9。

表1.1：描述批次一的数据

ALA＝α-乳白蛋白。

表1.2：描述批次二的数据*BDL＝低于检测限

在UF处理后，将两个批次的温度调节至10℃，然后将所述批次的部分以五种不同的比率混合在一起以产生进行结晶的蛋白质溶液，详情参见表1.3。每种混合物在10℃下用0.1％w/w晶种材料引晶，并在引晶后冷却至5℃并搅动过夜。

为了检查批次一和批次二是否已经过饱和，在上述混合之前对两个批次中的每个批次取样，并且也进行引晶并在10℃下存储过夜。第二天早上通过显微镜进行的目视检查表明，培育后不存在晶体，并且因此可以得出的结论是批次一和批次二没有过饱和。

通过将批次一和批次二的一小部分混合在一起以达到5.5的最终pH并随后添加少量干燥的BLG晶体材料来生产晶种材料。然后将晶种溶液放置在冰上并搅拌一小时。

在引晶之前和结晶之后取出蛋白质溶液的样品，并以3000g离心5分钟，如WO2018/115520的实施例1中所述通过RP-HPLC分析上清液的样品，并通过以下公式计算结晶产率：

其中％BLG_结晶之前是在引晶和结晶之前通过HPLC测量的样品中的BLG浓度，并且％BLG_结晶之后是在结晶之后通过HPLC测量的样品上清液中的BLG浓度。结果：

如从下表可以看出，可以在关于BLG具有较低过饱和度(或甚至没有过饱和)的pH范围内调整乳清蛋白质进料，从而降低UF设备中自发结晶的风险并增大可在没有自发BLG结晶的情况下使用的最大蛋白质浓度。随后将两种进料混合以提供具有高BLG过饱和度的初始蛋白质溶液。

表1.3：蛋白质溶液数据。

本发明人认识到，实施例1的结果表明，如果相对于如本文所述的蛋白质的pH_MCY,TP修改进料的pH范围，则能够在盐溶条件下结晶的任何蛋白质均可以根据实施例1的方法结晶。

实施例2：使用可商购获得的WPI，基于两种WPI料流的混合的结晶。

用于本实施例的乳清材料是市售的Lacprodan DI-9213和第二种自制的pH6.2WPI。

pH 6.2WPI由来源于标准奶酪生产工艺中的甜乳清的脱乳糖UF渗余物制成，乳清在使用前已经由Synder FR膜进行了减脂处理。在10℃至12℃下进行UF处理之前，用食品级盐酸将原材料的pH调整至pH 6.2。从这种原材料生产一个批次，并通过超滤装置，使用AlfaLaval GR82PE膜以30磨机间隔件和1.5-3.0巴的进料压力进行调整。使用精制水作为渗滤介质对产品进行脱盐，并且进料的浓度为18％ TS±5％。继续渗滤至少直到20min时段内渗余物中的电导率下降低于0.02mS/cm，此时渗余物中的TS是稳定的(±0.5％ TS)。然后将渗余物浓缩至约22％ TS，批次一和批次二的进料组成可见于表2.1和表2.2中。

批次二从粉末形式的LacprodanDI-9213制成。

通过将粉末再水合至TS为16.3并将其在10℃下搅拌直至所有粉末溶解来调整粉末。

表2.1：批次一的特性

表2.2：描述批次二的数据

在调整后，如实施例1中所述地处理两个批次(不同之处在于仅制备两种溶液)并进行分析。

混合物的特性可见于表2.3中。

结果：

如从下表可以看出，可以在乳清蛋白质进料关于BLG不过饱和的pH范围内调整乳清蛋白质进料，从而使得可以降低自发结晶的风险并提高蛋白质浓度水平，而不会产生在UF设备中结晶的风险，然后将两者混合在一起以获得高过饱和度。可以看出，较高的电导率如所预期地影响产率。

表2.3：蛋白质溶液数据。

本发明人认识到，实施例2的结果表明，如果相对于如本文所述的蛋白质的pH_MCY,TP修改进料的pH范围，则能够在盐溶条件下结晶的任何蛋白质均可以根据实施例2的方法结晶。

实施例3：基于两种WPI料流(pH 4.0和6.1)的混合的结晶。

本实施例中的乳清原材料是一种来源于标准奶酪生产工艺中的甜乳清的脱乳糖UF渗余物，乳清在使用前已经由Synder FR膜进行了减脂处理。从这种原材料生产两个批次，并通过超滤装置，使用Alfa Laval GR82PE膜以30磨机间隔件和1.5-3.0巴的进料压力进行调节。使用精制水作为渗滤介质对产品进行脱盐，并且进料的浓度为18％ TS±5％。继续渗滤至少直到20min时段内渗余物中的电导率下降低于0.02mS/cm，此时渗余物中的TS是稳定的(±0.5％ TS)。然后将渗余物浓缩至约22％ TS，批次一和批次二的进料组成可见于表3.1和表3.2中。

在10℃至12℃下进行UF处理之前，将一个批次(批次一)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH 6.1。在10℃至12℃下进行UF处理之前，将另一批(批次二)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH 4.0。

表3.1：描述批次一的数据

表3.2：描述批次二的数据*BDL＝低于检测限

在调整后，如WO2018/115520的实施例1中所述地处理两个批次(不同之处在于仅制备四种溶液)并进行分析。

混合物的特性可见于表3.3中。

结果：

如从下表可以看出，可以在乳清蛋白质进料具有关于BLG的低过饱和度的pH范围内调整乳清蛋白质进料，从而使得可以降低自发结晶的风险并提高蛋白质浓度水平，而不会产生在UF设备中结晶的风险，然后将两者混合在一起以获得高过饱和度。

表3.3：蛋白质溶液数据。

本发明人认识到，实施例3的结果表明，如果相对于如本文所述的蛋白质的pH_MCY,TP修改进料的pH范围，则能够在盐溶条件下结晶的任何蛋白质均可以根据实施例3的方法结晶。

实施例4：晶体大小分布

本实施例中的乳清原材料是一种来源于标准奶酪生产工艺中的甜乳清的脱乳糖UF渗余物，乳清在使用前已经由Synder FR膜进行了减脂处理。从这种原材料针对每次结晶产生两个批次，并通过超滤装置，使用Alfa Laval GR82PE膜以30磨机间隔件和1.5-3.0巴的进料压力进行调节。使用精制水作为渗滤介质对产品进行脱盐，并且进料的浓度为18％TS±5％。继续渗滤至少直到20min时段内渗余物中的电导率下降低于0.02mS/cm，此时渗余物中的TS是稳定的(±0.5％TS)。然后将渗余物浓缩至约22％ TS，批次一和批次二的进料组成可见于下表中。

在10℃至12℃下进行UF处理之前，将一个批次(批次一)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH约6.1。在10℃至12℃下进行UF处理之前，将另一批(批次二)用食品级盐酸(HCl)调整pH至pH 4.8。

结晶在300L结晶罐中进行并使用0.1％w/w晶种材料。如实施例1中那样生产晶种材料。

第1次结晶

表4.1：描述批次一的数据

表4.2：描述批次二的数据*BDL＝低于检测限

在调整后，将两个批次混合在一起以获得5.50的最终pH，将混合物引晶并快速冷却至5℃并放置过夜以结晶。如实施例1中所述分析浆液样品以计算产率。通过马尔文粒径表征来分析晶体浆液的粒径分布。

第2次结晶

表4.3：描述批次一的数据

表4.4：描述批次二的数据*BDL＝低于检测限

在调整后，将两个批次混合在一起以获得5.45的最终pH，将混合物引晶并快速冷却至5℃并放置过夜以结晶。如实施例1中所述分析浆液样品以计算产率。通过马尔文粒径表征来分析晶体浆液的粒径分布。

第3次结晶

表4.5：描述批次一的数据

表4.6：描述批次二的数据*BDL＝低于检测限

在将两个批次混合在一起以获得5.80的pH后，将混合物进行引晶并培育1小时，然后通过在2小时内进一步添加批次二将其调节至5.45的最终pH，然后快速冷却至5℃并放置过夜以结晶。如实施例1中所述分析浆液样品以计算产率。通过马尔文粒径表征来分析晶体浆液的粒径分布。

结果：

在表4.7中显示了结晶结果，并且如可以看出的，尽管使用不同的原材料且结晶过程不同，但晶体大小分布是相似的。

表4.7：结晶结果的概述

结晶	BLG产率(％)	Dx(10)	Dx(50)	Dx(90)
					1	73	80	167	263
2	75	58	153	253
					3	71	57	127	248

本发明人认识到，实施例4的结果表明，如果相对于如本文所述的蛋白质的pH_MCY,TP修改进料的pH范围，则能够在盐溶条件下结晶的任何蛋白质均可以根据实施例4的方法结晶。

实施例5

US 5,719,048的实施例1-4可以根据本发明如下进行修改。

US5,719,048的实施例1：

将US5,719,048的实施例1的渗滤液分成两个批次并进行pH调整，并且进一步渗滤以制备：

-A型进料，其pH为5.1，电导率为3mS/cm，并且含有13％w/w的脂肪酶，以及

-B型进料，其pH为3.9，电导率为3mS/cm，并且含有13％w/w的脂肪酶。

本发明步骤a)的初始蛋白质溶液通过将A型进料与足以在混合物中提供4.5的pH的量的B型进料混合来制备。

US5,719,048的实施例2：

将US5,719,048的实施例2的渗滤液分成两个批次并进行pH调整，并且进一步渗滤以制备：

-A型进料，其pH为4.9，电导率为3mS/cm，并且含有11％w/w的脂肪酶，以及

-B型进料，其pH为3.9，电导率为3mS/cm，并且含有11％w/w的脂肪酶。

本发明步骤a)的初始蛋白质溶液通过将A型进料与足以在混合物中提供4.3的pH的量的B型进料来制备。

US5,719,048的实施例3：

将US5,719,048的实施例3的渗滤液分成两个批次并进行pH调整，并且进一步渗滤以制备：

-A型进料，其pH为5.6，电导率为3mS/cm，并且含有10％w/w的脂肪酶，以及

-B型进料，其pH为4.4，电导率为3mS/cm，并且含有10％w/w的脂肪酶。

本发明步骤a)的初始蛋白质溶液通过将A型进料与足以在混合物中提供5.0的pH的量的B型进料来制备。

US5,719,048的实施例4：

将US5,719,048的实施例4的渗滤液分成两个批次并进行pH调整，并且进一步渗滤以制备：

-A型进料，其pH为4.9，电导率为3mS/cm，并且含有10％w/w的脂肪酶，以及

-B型进料，其pH为3.9，电导率为3mS/cm，并且含有10％w/w的脂肪酶。

Claims

1.一种制备包含能够在盐溶条件下结晶的目标蛋白质(TP)的产品、优选可食用或药学上可接受的产品的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备包含所述TP的初始蛋白质溶液，所述初始蛋白质溶液相对于所述TP过饱和并且具有所述TP能够在盐溶条件下结晶的pH，

b)以盐溶方式使过饱和的所述初始蛋白质溶液中的所述TP结晶，从而获得含TP晶体的溶液，以及

c)优选地，将TP晶体与所述含TP晶体的溶液的剩余液体分离，

并且其中：

-“A型蛋白质进料”被定义为包含所述TP并且具有比pH_MCY,TP高至少0.1个pH单位的pH的蛋白质进料，并且

-“B型蛋白质进料”被定义为包含所述TP并且具有比pH_MCY,TP低至少0.1个pH单位的pH的蛋白质进料，

并且优选地，条件是所述TP不是β-乳球蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，并且在混合的情况下，其pH为至少pH_MCY,TP+0.1、更优选至少pH_MCY,TP+0.2、甚至更优选至少pH_MCY,TP+0.3并且最优选至少pH_MCY,TP+0.4，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，并且在混合的情况下，

其pH为至多pH_MCY,TP-0.1、更优选至多pH_MCY,TP-0.2、甚至更优选至多pH_MCY,TP-0.3并且最优选至多pH_MCY,TP-0.4。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，并且在混合的情况下，

其pH为至少pH_MCY,TP+0.5、更优选至少pH_MCY,TP+0.6、甚至更优选至少pH_MCY,TP+0.7并且最优选至少pH_MCY,TP+0.8，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其pH为至多pH_MCY,TP-0.5、更优选至多_pHMCY,TP-0.6、甚至更优选至多pH_MCY,TP-0.7并且最优选至多pH_MCY,TP-0.8。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

-关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其pH为至少pH_MCY,TP+0.9、更优选至少pH_MCY,TP+1.0、甚至更优选至少pH_MCY,TP+1.2并且最优选至少pH_MCY,TP+1.5，并且

-关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其pH为至多pH_MCY,TP-0.9、更优选至多_pHMCY,TP-1.0、甚至更优选至多pH_MCY,TP-1.2并且最优选至多pH_MCY,TP-1.5。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其pH的范围为pH_MCY,TP-3.5至pH_MCY,TP-0.1、更优选pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.3、甚至更优选pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.5，并且最优选pH_MCY,TP-1.0至pH_MCY,TP-0.6。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，

其中所述一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种不含TP晶体，更优选地所述一种或多种A型蛋白质进料全部都不含TP晶体，并且/或者

其中所述一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种不含TP晶体，更优选地所述一种或多种B型蛋白质进料全部都不含TP晶体。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种A型蛋白质进料中的至少一种关于TP不过饱和，并且更优选地所述一种或多种A型蛋白质进料全部都关于TP不过饱和，并且/或者

其中所述一种或多种B型蛋白质进料中的至少一种关于TP不过饱和，并且更优选地所述一种或多种类型全部都关于TP不过饱和。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中不含TP晶体的A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少1％w/w、更优选至少10％w/w、甚至更优选至少20％w/w并且最优选至少40％w/w的TP含量。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中不含TP晶体的A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w的TP含量。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

其温度为至多60℃、更优选至多50℃、甚至更优选至多40℃并且最优选至多30℃。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于A型蛋白质进料：

-在仅使用单一A型蛋白质进料的情况下，或者

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中关于B型蛋白质进料：

-在仅使用单一B型蛋白质进料的情况下，或者

其包含相对于B型蛋白进料的总重量的至少1％w/w、更优选至少3％w/w、甚至更优选至少5％w/w的TP，并且最优选相对于B型蛋白质进料的总重量的至少7％w/w的TP。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，

其中所述初始蛋白质溶液包含相对于所述初始蛋白质溶液的重量在1-99％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料总量。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，

其中所述初始蛋白质溶液包含相对于所述初始蛋白质溶液的重量在1-99％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料总量。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液包含：

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料总量，所述A型蛋白质进料具有pH_MCY,TP+0.3至pH_MCY,TP+2.5的pH，以及

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料总量，所述B型蛋白质进料具有pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.3的pH。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液包含：

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料总量，所述A型蛋白质进料具有pH_MCY,TP+0.5至pH_MCY,TP+2.5的pH，以及

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料总量，所述B型蛋白质进料具有pH_MCY,TP-2.5至pH_MCY,TP-0.5的pH。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液包含：

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料总量，所述A型蛋白质进料具有pH_MCY,TP+0.6至pH_MCY,TP+1.0的pH，以及

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料总量，所述B型蛋白质进料具有pH_MCY,TP-1.0至pH_MCY,TP-0.6的pH。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液包含：

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的A型蛋白质进料总量，所述A型蛋白质进料具有pH_MCY,TP+0.8至pH_MCY,TP+1.5的pH，以及

-相对于所述初始蛋白质溶液的重量在5-90％w/w、更优选10-80％w/w、甚至更优选20-70％w/w并且最优选30-60％w/w范围内的B型蛋白质进料总量，所述B型蛋白质进料具有pH_MCY,TP-1.5至pH_MCY,TP-0.8的pH。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w的蛋白质含量。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少92％w/w、更优选至少94％w/w、甚至更优选至少96％w/w并且最优选至少99％w/w的蛋白质含量。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w的固体含量。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少92％w/w、更优选至少94％w/w、甚至更优选至少96％w/w并且最优选至少99％w/w的固体含量。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少50％w/w、更优选至少70％w/w、甚至更优选至少80％w/w并且最优选至少90％w/w的重量。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中A型蛋白质进料和B型蛋白质进料贡献所述初始蛋白质溶液的至少92％w/w、更优选至少94％w/w、甚至更优选至少96％w/w并且最优选至少99％w/w的重量。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液的TP的过饱和度高于以下两者：

-在使用两种或更多种A型蛋白质进料的情况下，在其合并的情况下，所述A型蛋白进料的过饱和度，

以及以下两者：

-在使用两种或更多种B型蛋白质进料的情况下，在其合并的情况下，所述B型蛋白质进料的过饱和度。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初始蛋白质溶液的pH在提供所述TP的最大结晶产率的pH(pH_MCY,TP)的+/-0.7个pH单位范围内并且最优选在所述pH_MCY,TP的+/-0.5个pH单位范围内。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是球状蛋白，并且优选球蛋白或珠蛋白。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP选自由酶、免疫球蛋白、激素组成的组。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是酶，优选氧化还原酶(EC1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)或异构酶(EC 5)。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是氧化还原酶(EC 1)，优选选自以下中的一种或多种：漆酶(EC 1.10.3.2)、过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)、葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、木质素酶(EC 1.11.1.14)和过氧化物酶(EC 1.11.1)。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是水解酶(EC 3)。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是酯酶(EC 3.1)，优选选自植酸酶(EC 3.1.3)、脂肪酶(EC编号3.1.1.3)、磷酸酶(EC 3.1.3)、植酸酶和/或核酸酶(EC3.1.11-3.1.31)。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是糖基化酶(EC 3.2)，优选选自α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、淀粉葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.3或EC 3.2.1.33)、纤维素酶(EC3.2.1.4)、半纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、胞壁质酶(EC 3.2.1.17)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、果胶酶(EC 3.2.1.67)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、乳糖酶(EC3.2.1.108)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.20或EC 3.2.1.3)和葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是肽酶或蛋白酶(EC 3.4)，例如选自糜蛋白酶(EC 3.4.21.1)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶(EC 3.4.23.4)或碱性蛋白酶。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是裂解酶(EC 4)，例如果胶酸裂解酶或α-乙酰乳酸脱羧酶。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是异构酶(EC 5)，例如葡萄糖异构酶。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是激素，优选人胰岛素(uniprot ID:P01308)、人胰岛素类似物、人胰岛素激动剂、人GLP-1、人GLP-1类似物或人GLP-1激动剂。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是免疫球蛋白，并且优选单克隆免疫球蛋白。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是免疫球蛋白G(IgG)，并且优选单克隆IgG。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是双特异性IgG。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是干扰素、干扰素类似物或干扰素激动剂。

48.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述TP是选自由以下组成的组的治疗性蛋白质：莫罗单抗-CD3、阿昔单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、阿达木单抗、替伊莫单抗、奥马珠单抗、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、那他珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、依库珠单抗、培塞利珠单抗、乌司奴单抗、卡那单抗、戈利木单抗、奥法木单抗、托珠单抗、地舒单抗、贝利木单抗、伊匹单抗、维布妥昔单抗、帕妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、雷昔库单抗、奥妥珠单抗、司妥昔单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、贝林妥欧单抗、纳武单抗、派姆单抗、依达赛珠单抗、耐昔妥珠单抗、达妥昔单抗、司库奇尤单抗、美泊利单抗、阿利西尤单抗、依洛尤单抗、达妥木单抗、埃罗妥珠单抗、依奇珠单抗、瑞利珠单抗、奥拉单抗、贝洛托单抗、阿特珠单抗、奥托昔单抗、奥加伊妥珠单抗、博达路单抗、古塞库单抗、度匹鲁单抗、沙利鲁单抗、阿维单抗、奥瑞珠单抗、艾美赛珠单抗、本瑞利珠单抗、奥加吉妥珠单抗、度伐利尤单抗、布洛舒单抗、拉那鲁单抗、莫格利珠单抗、依瑞奈尤单抗、加卡奈珠单抗、替曲吉珠单抗、西米普利单抗、依玛鲁单抗、瑞玛奈珠单抗、伊巴珠单抗、莫赛妥莫单抗、雷夫利珠单抗、卡拉西单抗、罗莫佐单抗、瑞莎珠单抗、维泊妥珠单抗、布洛赛珠单抗和立赞利珠单抗。

49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP通过从天然来源纯化、通过重组生物体的发酵和/或通过后续蛋白质重排来制备。

50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TP是治疗性蛋白质。

51.一种TP产品，其能够通过根据权利要求1-50中的一项或更多项所述的方法获得。