DE69734708T2

DE69734708T2 - Kristallisation eines proteins mit einem schwefelsalz

Info

Publication number: DE69734708T2
Application number: DE69734708T
Authority: DE
Inventors: Stig Nielsson; Aage Mads LAUSTSEN
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: DE69734708D1; WO1997032894A1; CN1213375A; DK0892810T3; US6066481A; EP0892810A1; AU2021797A; ATE310745T1; JP2000506145A; EP0892810B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches, kostengünstiges und sehr effektives Verfahren zur Kristallisation eines Proteins mit einem Salz.
STAND DER TECHNIK
Enzyme werden für industrielle Zwecke üblicherweise als Flüssigkeiten oder amorphe Materialien bereitgestellt. Wenn sie nicht als Flüssigkeiten bereitgestellt werden, werden sie üblicherweise als amorphe Materialien bereitgestellt, da die bekannten Verfahren zur Kristallisation von Enzymen üblicherweise als zu teuer angesehen werden, um in einem industriellen Maßstab verwendet zu werden.
Es ist eine Fülle an Literatur vorhanden, welche die Kristallisation von Enzymen betrifft. Im Hinblick auf das Ergebnis von speziellen Kristallisationsvorgehensweisen ist es schwierig zu verallgemeinern, da die Technik der Enzymkristallisation stark empirisch ist.
Kennzeichnende Merkmale der meisten bislang bekannten Proteinkristallisationsverfahren sind: Reine und konzentrierte Ausgangslösungen, sehr lange Kristallisationszeit, hoher Verbrauch an Chemikalien, wie Salzen, als Referenz siehe z. B. Biotechnolog and Bioengineering 48, 1995, S. 316–323.
Es sind ebenfalls industrielle Enzymkristallisationsverfahren beschrieben worden, bei denen Polyethylenglykol verwendet wird, als Referenz siehe WO 95/01989.
Es ist ebenfalls beschrieben worden, dass es möglich ist, Enzyme zu kristallisieren, indem Salze aus der Lösung extrahiert („leaching out") werden, gefolgt von der Einstellung des pH der Lösung auf einen Level um den pI des Enzyms herum, als Referenz siehe WO 94/22903.
US-A-3,795,586 beschreibt die Präzipitation eines Enzyms (bakterielle Protease oder Amylase) durch Verwenden von Na₂S₂O₃. Das Thiosulfatsalz wurde in solchen Konzentrationen verwendet, dass lediglich ein amorphes Präzipitat, jedoch kein kristallines Protein, erhalten werden konnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Mit dieser Erfindung ist überraschenderweise gefunden worden, dass oxidierbare Schwefelsalze sehr effektiv als Kristallisationssalze sind: Sie können in geringen Mengen bei unreinen Lösungen verwendet werden, ergeben kurze Kristallisationszeiten und hohe Ausbeuten in einem einfachen, kostengünstigen und umweltfreundlichen Verfahren.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kristallisation (zum Kristallisieren) eines aus einer Proteinlösung erhaltenen Proteins bereit, umfassend:

(a) Behandlung (Behandeln) der Proteinlösung mit einem Salz, das ein Schwefelatom enthält, das eine niedrigere Oxidationsstufe als 6 aufweist;
(b) Gewinnen des Proteins in kristalliner Form.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch Bezugnahme auf die begleitende Zeichnung dargestellt, in welcher
1 den Temperaturanstieg zeigt: die Beziehung zwischen Temperatur und Zeit, die verwendet wird, um die Geschwindigkeit der Bildung der primären Kristallisationskeime („primary nucleation rate") zu steuern, wie in Beispiel 1 beschrieben.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Kristallisieren eines Proteins oder eines Polypeptids aus einer Proteinlösung, insbesondere aus einer Fermentations- (Kultur-) Brühe, bereit.
Eine Fermentationsbrühe enthält neben dem interessierenden Protein zahlreiche andere Verbindungen, wie Substratverbindungen, z. B. Kohlenhydrate und Salze, Zellen und andere Metabolite, wie Nukleinsäuren und andere Proteine, als das eine interessierende (Protein).
Bevorzugt wird das Verfahren der Erfindung auf eine Fermentationsbrühe angewendet, die zuerst gereinigt worden ist, beispielsweise durch Flockung, Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Diafiltration, Elektrodialyse, Adsorption, Präzipitation (Fällung), Evaporation oder einer beliebigen Kombination davon.
Da das Verfahren der Erfindung sehr gut bei relativ unreinen Lösungen funktioniert (siehe Beispiel 1), ist es normalerweise nicht erforderlich, die Proteinlösung, welche aus der Fermentationsbrühe erhalten wird, vor der Kristallisation unter Verwendung von chromatographischen Verfahren zu reinigen.
In einer spezielleren Ausführungsform, umfasst das Verfahren der Erfindung die Konzentrierung der Protein-enthaltenden Lösung durch Verfahren, die per se bekannt sind. Solche Verfahren schließen die Konzentrierung durch Ultrafiltration, durch Diafiltration, durch Dialyse oder durch Evaporation ein.
Obwohl die Konzentrierung der Protein-enthaltenden Lösung nicht erforderlich ist, um die Kristallisation durchzuführen, ist sie aus Sicht der Handhabung und der Ausbeute zweckmäßig. Aus praktischen Gründen kann die Protein-enthaltende Lösung bis zu einem Gehalt an Proteinen von 0,1 bis 25 % w/w (% Gew./Gew.), bevorzugt von 0,5 bis 20 % w/w, stärker bevorzugt von 1 bis 15 % w/w, noch stärker bevorzugt von 5 bis 12 % w/w konzentriert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung auf die Kristallisation eines Enzyms angewendet, insbesondere eines Enzyms, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Peptidasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen, Xylanasen, Isomerasen und Oxidoreduktasen.
Proteasen
Geeignete, gemäß der vorliegenden Erfindung zu kristallisierende Proteasen schließen jede beliebige Protease ein, welche ein Fermentationsprodukt einer Zelle, wie eines Mikroorganismus, sein kann. Herkunft von Bakterien oder Pilzen ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease, bevorzugt eine mikrobielle alkalische Protease oder eine Trypsin-ähnliche Protease, sein. Beispiele von alkalischen Proteasen sind Subtilisine, besonders solche, die von Bacillus abgeleitet sind, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 165 (beschrieben in WO 59/06279). Beispiele von Trypsin-ähnlichen Proteasen sind Trypsin (z. B. Herkunft vom Schwein oder Rind) und die Protease von Fusarium, beschrieben in WO 59/06270.
Bevorzugte kommerziell erhältliche Proteaseenzyme schließen solche, die unter den Handelsnamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Maxatase, Maxacal, Maxapem und Properase von Gist-Brocades verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauft werden und solche, die unter den Handelsnamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauft werden, ein.
Lipasen
Geeignete, gemäß der vorliegenden Erfindung zu kristallisierende Lipasen schließen jede beliebige Lipase ein, welche ein Fermentationsprodukt einer Zelle, wie eines Mikroorganismus, sein kann. Herkunft von Bakterien oder Pilzen ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Beispiele von verwendbaren Lipasen schließen eine Lipase von Humicola lanuginosa, z. B. wie in EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben, eine Lipase von Rhizomucor miehei, z. B. wie in EP 238 023 beschrieben, eine Lipase von Candida, wie eine Lipase von C. antarctica, z. B. die Lipase A oder B von C. antarctica, beschrieben in EP 214 761 , eine Lipase von Pseudomonas, wie eine Lipase von P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes, z. B. wie in EP 218 272 beschrieben, eine Lipase von P. cepacia, z. B. wie in EP 331 376 beschrieben, eine Lipase von P. stutzeri, z. B. wie in BP 1,372,034 offenbart, eine Lipase von P. fluorescens, eine Lipase von Bacillus, z. B. eine Lipase von B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260), eine Lipase von B. stearothermophilus (JP 64/744992) und eine Lipase von B. pumilus (WO 91/16422), ein.
Weiterhin kann eine Anzahl klonierter Lipasen verwendbar sein, einschließlich der Lipase von Penicillum camembertii, beschrieben von Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67, der Lipase von Geotricum candidum (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388), und verschiedene Lipase von Rhizopus, wie eine Lipase von R. delemar (Hass, M. J. et al., (1991), Gene 109, 117–113), eine Lipase von R. niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) und eine Lipase von R. oryzae.
Andere Arten von lipolytischen Enzymen, wie Cutinasen, können ebenfalls kristallisiert werden, z. B. eine Cutinase, die von Pseudomonas mendocina abgeleitet ist, wie in WO 88/09367 beschrieben, oder eine Cutinase, die von Fusarium solani pisi abgeleitet ist (z. B. beschrieben in WO 90/09446).
Besonders geeignete Lipasen sind Lipasen, wie M1 Lipase^TM, Luma fast^TM und Lipomax^TM (Gist-Brocades), Lipolase^TM und Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S) und Lipase P „Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Amylasen
Geeignete, gemäß der vorliegenden Erfindung zu kristallisierende Amylasen (α oder β) schließen jede beliebige Amylase ein, welche ein Fermentationsprodukt einer Zelle, wie eines Mikroorganismus, sein kann. Herkunft von Bakterien oder Pilzen ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Amylasen schließen zum Beispiel α-Amylasen ein, die von Bacillus erhalten werden, insbesondere einem speziellen Stamm von B. licheniformis, welche detaillierter in der Britischen Patentbeschreibung Nr. 1,296,39 beschrieben wird. Kommerziell erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und Rapidase^TM und Maxamyl P^TM (erhältlich von Gist-Brocades).
Andere verwendbare Enzyme sind die CGTasen (Cyclodextringlucanotransferasen, EC 2.4.1.19), die von z. B. Bacillus, Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobacterium erhältlich sind.
Cellulasen
In dem vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Cellulase" auf ein Enzym, welches den Abbau von Cellulose in Glucose, Cellobiose, Triose und andere Cello-Oligosaccharide katalysiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die zu kristallisierende Cellulase eine Endoglucanase (EC 3.2.1.4.), bevorzugt eine (rekombinante) einkomponentige Endoglucanase.
Bevorzugt ist die Cellulase eine mikrobielle Cellulase, stärker bevorzugt eine Cellulase von Bakterien oder Pilzen.
Verwendbare Beispiele von Cellulasen von Bakterien sind Cellulasen, die von Bakterien abgeleitet sind oder von diesen produzierbar sind, aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Clostridium, Microspora, Thermotoga, Caldocellum und Actinomycetes, wie Streptomyces, Thermomonospora und Acidothemus, insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas cellulolyticus, Bacillus lautus, Cellulomonas fimi, Microspora bispora, Thermomonospora fusca, Thermomonospora cellulolyticum und Acidothemus cellulolyticus.
Eine verwendbare, zu kristallisierende Cellulase ist eine saure Cellulase, welche von Pilzen abgeleitet ist oder von diesen produzierbar ist, aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Phanaerochaete, Neurospora, Neocallimastix und Botrytis, insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Myrothecium verrucaria, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Phanaerochaete chrysosporium, Neurospora crassa, Neocallimastix partriciarum und Botrytis cinerea.
Eine andere verwendbare, zu kristallisierende Cellulase ist eine neutrale oder alkalische Cellulase, bevorzugt eine neutrale oder alkalische Cellulase von Pilzen, welche von Pilzen abgeleitet ist oder von diesen produzierbar ist, aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Aspergillus, Penicillium, Myceliophthora, Humicola, Irpex, Fusarium, Stachybotrys, Scopulariopsis, Chaetomium, Mycogone, Verticillium, Myrothecium, Papulospora, Gliocladium, Cephalosporium und Acremonium, insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus Humicola insolens, Fusarium oxyporum, Myceliothora thermophila, Penicillium janthinellum und Cephalosporium sp., bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus den Arten Humicola insolens, DSM 1800, Fusarium oxysporum, DSM 2672, Myceliopthora thermophila, CBS 117.65, und Cephalosporium sp., RYM-202.
Andere Beispiele von verwendbaren, zu kristallisierenden Cellulasen sind Varianten, die als eine Elterncellulase eine Cellulase mit Herkunft von Bakterien oder Pilzen besitzen, z. B. eine Cellulase, die von einem Stamm der Pilzgattung Humicola, Trichoderma oder Fusarium ableitbar ist.
Oxidoreduktasen
Oxidoreduktasen, welche gemäß der Erfindung kristallisiert werden können, schließen Peroxidasen und Oxidasen, wie Laccasen, ein.
Peroxidasen Ein Enzym, welches Peroxidaseaktivität aufweist, kann jedes beliebige Peroxidaseenzym sein, welches von der Enzymklassifizierung (EC 1.11.1.7) umfasst ist, oder jedes beliebige hiervon abgeleitete Fragment, welches Peroxidaseaktivität aufweist.
Bevorzugt ist die Peroxidase, die in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt wird, von Mikroorganismen, wie Pilzen oder Bakterien, produzierbar. Einige bevorzugte Pilze schließen Stämme ein, die der Untereinteilung Deuteromycotina, Klasse Hyphomycetes angehören, z. B. Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium oder Dreschlera insbesondere Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma reesi, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alli oder Dreschlera halodes.
Andere bevorzugte Pilze schließen Stämme ein, die der Untereinteilung Basidiomycotina, Klasse Basidiomycetes angehören, z. B. Coprinus, Phanaerochaete, Coriolus oder Trametes, insbesondere Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanaerochaete chrysosporium (z. B. NA-12) oder Trametes (früher Polyporus genannt), z. B. T. versicolor (z. B. PR4 28-A).
Weitere bevorzugte Pilze schließen Stämme ein, die der Untereinteilung Zygomycotina, Klasse Mycoraceae angehören, z. B. Rhizopus oder Mucor, insbesondere Mucor hiemalis.
Einige bevorzugte Bakterien schließen Stämme der Ordnung Actinomycetales ein, z. B. Streptomyces spheroides (ATCC 23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) oder Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium.
Andere bevorzugte Bakterien schließen Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) oder Pseudomonas fluorescens (NRRL B-11) ein.
Weitere bevorzugte Bakterien schließen Stämme ein, die Myxococcus angehören, z. B. M. virescens.
Insbesondere ist eine rekombinant hergestellte Peroxidase bevorzugt, z. B. eine Peroxidase, die von Coprinus sp., abgeleitet ist, insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus, gemäß WO 92/16634 oder eine Variante hiervon, z. B. eine Variante, wie in WO 93/24618 und WO 95/10602 beschrieben.
Laccasen und Laccase-verwandte Enzyme
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung, umfassen Laccasen und Laccase-verwandte Enzyme jedes beliebige Laccaseenzym, welches von der Enzymklassifizierung (EC 1.10.3.2) umfasst ist, jedes beliebige Chatecholoxidaseenzym, welches von der Enzymklassifizierung (EC 1.10.3.1) umfasst ist, jedes beliebige Bilirubinoxidaseenzym, welches von der Enzymklassifizierung (EC 1.3.3.5) umfasst ist, oder jedes beliebige Monophenolmonooxygenaseenzym, welches von der Enzymklassifizierung (EC 1.14.18.1) umfasst ist.
Das mikrobielle Laccaseenzym kann von Bakterien oder Pilzen (einschließlich filamentösen Pilzen und Hefen) abgeleitet sein, und geeignete Beispiele schließen eine Laccase ein, die von einem Stamm von Aspergillus, Neurospora, z. B. N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, z. B. T. villosa und T. versicolor, Rhizoctonia, z. B. R. solani, Coprinus, z. B. C. plicatilis und C. cinereus, Psatyrella, Myceliophthora, z. B. M. thermophila, Schytalidium, Polyporus, z. B. P. insitus, Phlebia, z. B. P. radita (WO 92/01046) oder Coriolus, z. B. C. hirsutus (JP 2-238885) abgeleitet ist, insbesondere Laccasen, die von Trametes, Mycelionhthora, Schytalidium oder Polyporus erhältlich sind.
Salze
Wir haben überraschenderweise gefunden, dass geringe Konzentrationen eines oxidierbaren Schwefelsalzes, d.h. eines Salzes, welches mindestens ein Schwefelatom enthält, das eine niedrigere Oxidationsstufe als 6 aufweist, insbesondere eines Salzes, welches mindestens ein Schwefelatom enthält, das eine Oxidationsstufe von 2 bis 4 aufweist, Enzymkristalle aus unreinen Lösungen herstellen kann, wobei die Reinheit der Kristalle und die Ausbeute an Kristallen außerordentlich gut sind. Weiterhin kann die Gestalt der Kristalle im Vergleich zu einer Kristallisation mit anderen Salzen verbessert werden, da die Kristalle relativ groß sind (siehe Beispiel 1).
Das Kristallisationsverfahren gemäß der Erfindung verläuft so schnell, dass es normalerweise nicht erforderlich ist, stabilisierende Mittel oder Inhibitoren zu der Proteinlösung hinzuzufügen.
Bevorzugte Schwefelsalze gemäß der Erfindung sind Alkali- oder Ammoniumsalze, da diese Salze normalerweise leicht in Wasser löslich sind, z. B.:
Na₂S₂O₃, Na₂SO₃, NaHSO₃, Na₂S₂O₄, Na₂S₂O₆ × 2H₂O, Na₂S₃O₆, Na₂S₄O₆, Na₂S₂O₅, HSCH₂COONa, K₂S₂O₃ × 1/3H₂O, K₂SO₃ × 2H₂O, KHSO₂, K₂S₂O₆, K₂S₃O₆, K₂S₃O₆, K₂S₄O₆, K₂S₂O₄, Li₂SO₃ × H₂O, Li₂S₂O₆ × 2H₂O, (NH₄)₂SO₃, LiHSO₃, KHSO₃, (NH₄)HSO₃, NaSCN oder KSCN.
Insbesondere ist ein Sulfitsalz oder ein Thiosulfatsalz bevorzugt.
Das Schwefelsalz gemäß der Erfindung kann das einzige zugegebene Salz sein oder es kann Teil einer Mischung sein, welche neben dem Schwefelsalz ebenfalls andere Salze umfasst, Beispiele von solchen Mischungen sind:

1) Eine Mischung aus einem Schwefelsalz gemäß der Erfindung und einem Sulfatsalz;
2) eine Mischung aus einem Schwefelsalz gemäß der Erfindung und einem Acetatsalz;
3) eine Mischung aus einem Schwefelsalz gemäß der Erfindung und einem Carbonatsalz;
4) eine Mischung aus einem Sulfitsalz und einem Hydrogensulfitsalz;
5) eine Mischung aus einem Sulfitsalz, einem Hydrogensulfitsalz und einem Acetatsalz; oder
6) eine Mischung aus einem Sulfitsalz, einem Hydrogensulfitsalz und einem Carbonatsalz.

Ein Salz, welches ein Halogen, wie ein Chlorid, enthält, kann ebenfalls in die oben offenbarten Salzmischungen eingeschlossen sein.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Salz gemäß der Erfindung zu der Proteinlösung bei einer Konzentration von 0,02 bis 1,2 Mol pro Liter, bevorzugt bei einer Konzentration von 0,04 bis 1,0 Mol pro Liter, stärker bevorzugt bei einer Konzentration von 0,04 bis 0,7 Mol pro Liter, am stärksten bevorzugt bei einer Konzentration von 0,04 bis 0,5 Mol pro Liter hinzugegeben werden.
Das Salz gemäß der Erfindung kann in einem Schritt hinzugegeben werden oder es kann in mehr als einem Schritt hinzugegeben werden; normalerweise erfolgt die Kristallisation zufriedenstellend, wenn das Salz in einem Schritt hinzugegeben wird.
Bei Kristallisationen kann es häufig vorteilhaft sein, das Rühren nach der Zugabe des Salzes und jeder anderen Einstellung zu reduzieren, um einem Brechen der gebildeten Kristalle vorzubeugen, dies erleichtert die nachfolgende Kristallernte.
Einstellung des pH
Der pH der Proteinlösung, zu welcher das Salz gemäß der Erfindung hinzugegeben worden ist, kann eingestellt werden, um das Optimum zu finden, bei dem die Kristallisation maximiert wird und das Protein gleichzeitig stabil ist. Ein Weg, um dieses Optimum herauszufinden, ist es, einen Versuch ablaufen zu lassen, typischerweise bei pH 10 startend, dann die Kristallisation bei pH 9 durchführen, dann bei pH 8, dann bei pH 7 usw. herunter bis pH 3, und dann, wenn gefunden wurde, z. B. dass das Optimum zwischen pH 4 und pH 5 liegt, dann einen Versuch innerhalb dieses Bereiches durchführen, wodurch das pH-Optimum gefunden wird; das Optimum liegt normalerweise in dem Bereich zwischen pH 4 und pH 9.
In einigen Fällen kann es ebenfalls vorteilhaft sein, das Kristallisationsverfahren by ansteigendem („ramping") pH durchzuführen, d.h. das Kristallisationsverfahren bei verschiedenen pH durchzuführen.
Für die Einstellung des pH kann praktisch jede beliebige Säure oder Base verwendet werden. Die Säure kann anorganisch oder organisch sein. Einige Beispiele sind Salzsäure, Schwefelsäure, schwefelige Säure, salpetrige Säure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure und Ameisensäure. Bevorzugte Säuren sind Phosphorsäure, Ameisensäure, Zitronensäure und Essigsäure. Bevorzugte Basen sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid, insbesondere Natriumhydroxid.
Kristallisation
Bei Verwenden des Verfahrens der Erfindung kann es möglich sein, die Kristallisation bei einer Kristallisationszeit von weniger als 48 Stunden erfolgen zu lassen, insbesondere, die Kristallisation bei einer Kristallisationszeit von weniger als 36 Stunden erfolgen zu lassen, bevorzugt, die Kristallisation bei einer Kristallisationszeit von weniger als 24 Stunden erfolgen zu lassen, stärker bevorzugt, die Kristallisation bei einer Kristallisationszeit von weniger als 12 Stunden erfolgen zu lassen, am stärksten bevorzugt, die Kristallisation bei einer Kristallisationszeit von weniger als 6 Stunden erfolgen zu lassen, ohne Hinzugeben von irgendwelchen Keimkristallen um die Kristallisation zu starten.
Die Temperatur der zu kristallisierenden Proteinlösung liegt bevorzugt bei 5°C bis 40°C, insbesondere bei 10°C bis 30°C; bevorzugt wird die Temperatur schrittweise erhöht, wie in Beispiel 1 demonstriert, d.h. der Anstieg kann bei z. B. 10°C gestartet werden, dann auf z. B. 20°C für 1 Stunde erhöht werden, dann auf z. B. 23°C für 1 Stunde, dann auf z. B. 25°C für 1 Stunde und bei 28°C beendet werden, bei welcher Temperatur sie für ungefähr 24 Stunden belassen wird.
Gewinnung nach der Kristallisation
Das Verfahren der Erfindung bewirkt, dass das Protein, insbesondere das Enzym, kristallisiert wird. Die Gewinnung des kristallinen Proteins kann durch herkömmliche Verfahren erreicht werden, z. B. durch Zentrifugation und/oder Filtration und optionalem Trocknen. Bei Verwenden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können die Ernteeigenschaften der Kristalle im Vergleich zu der Verwendung von anderen Salzen, wie KAc, verbessert werden (siehe Beispiel 1); weil die Kristalle größer sind, macht diese Eigenschaft die Zentrifugation und/oder Filtration, die der Kristallisation folgt, viel einfacher.
Sofern kristalline Produkte von sehr hoher Reinheit wünschenswert sind, kann das Verfahren der Erfindung wiederholt werden, d.h. das kristalline Endprodukt des Verfahrens der Erfindung wird wieder gelöst und einem oder mehreren zusätzlichen Kristallisationsverfahren unterworfen.
Das Endprodukt kann ein Kristallprodukt sein oder die Kristalle können wieder gelöst werden, um z. B. ein flüssiges Proteinprodukt herzustellen.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass das Endprodukt ein oxidierbares Schwefelsalz enthält, was bedeutet, dass das Protein, z. B. das Enzym, gegenüber Oxidationen stabilisiert wird.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispiele dargestellt, welche nicht dazu gedacht sind, in irgendeiner Weise den Schutzumfang (Schutzbereich) der Erfindung, wie beansprucht, zu beschränken.
BEISPIEL 1
Kristallisation einer Protease unter Verwenden von Sulfaten
200 kg Kulturbrühe, welche eine Protease von Bacillus lentus enthielt, fermentiert z. B. wie in US 3,723,250 beschrieben, wurde in zwei Fraktionen von jeweils 100 kg aufgeteilt, die Fraktion A und Fraktion B genannt wurden.
Jede Fraktion wurde, wie der nachstehenden Tabelle 1 beschrieben, vorbehandelt:
Tabelle 1. Vorbehandlung und Flockung der Brühe von Fraktion A und Fraktion B.
Al-Verbindungen reduzieren das Ergebnis der OD_440nm Pro Aktivitätseinheit signifikant, daher ist Fraktion A reiner als Fraktion B.
Aus jeder Fraktion wurde der Produktionsstamm durch Zentrifugation entfernt, was zwei Überstände ergab, welche danach unter Verwenden von Seitz K900-Kissen filtriert wurden. Die resultierenden Filtrate wurden über Asahi (6 kD) Membranen konzentriert. Fraktion A wurde unter Verwenden von 2 Volumen Wasser weiter diafiltriert.
Auf diese Weise enthielt das Konzentrat B verhältnismäßig mehr niedermolekulare Fermentationsverbindungen (Kohlehydrate, Salze, Nukleinsäuren, anderen Proteine usw.) als das Konzentrat A. Dieses wird anhand von Messungen des Verhältnisses (OD_280nm/Gramm aktive Protease), des (OD_440nm/Gramm aktives Enzym) als auch (g aktive Protease/Gramm Mettler Trockenmasse) veranschaulicht, wie in nachfolgender Tabelle 2 gezeigt:
Tabelle 2. Reinheit von Konzentrat A und Konzentrat B.
Die Konzentrate wurden verschiedenen Mengen an Na₂SO₃ oder KAc ausgesetzt und auf pH = 4,9 unter Verwenden von Phosphorsäure mit 20 w/w % (Gew./Gew.-%) eingestellt. Es wurde ein diskreter Temperaturanstieg verwendet, um die Geschwindigkeit der Bildung der primären Kristallisationskeime zu steuern. Der Anstieg startete bei 10°C, wurde dann auf 20°C für 1 Stunde erhöht, dann auf 23°C für 1 Stunde, dann auf 25°C für 1 Stunde und endete bei 28°C, bei welcher Temperatur es für 24 Stunden gehalten wurde, wie in 1 dargestellt. Die Kristallsuspensionen wurden zentrifugiert und die Kristalle unter Verwenden einer 5,5 % CaCl₂ (pH = 4,9)-Lösung gewaschen. Die Kristalle wurden mittels Zentrifugation geerntet und in 10-fach 100 % MPG gelöst und die resultierenden Produkte wurde hinsichtlich OD_440nm und Proteaseaktivität analysiert.
Die Kristallisationsausbeuten und Reinheiten der Endprodukte A und B sind in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 3. Konzentrat A, kristallisiert unter Verwenden von ansteigenden Mengen an Na₂SO₃ und KAc.
Wir stellen fest, dass Ausbeute und Reinheit unter Verwenden von Na₂SO₃ anstelle von KAc erhöht werden. Zusätzlich stellen wir eine ansteigende Dicke der hergestellten Kristalle (Stäbchen anstelle von Nadeln) fest. Dies ist wichtig, wenn für die Ernte eine Filtrationsausrüstung verwendet wird, um die Penetration der feineren Nadeln durch die Filterplättchen zu verhindern.
Tabelle 4. Konzentrat B, kristallisiert unter Verwenden von ansteigenden Mengen an Na₂SO₃ und KAc.
Bei diesem viel unreineren Konzentrat stellen wir fest, dass Ausbeute und Reinheit in der Tat erhöht sind, wenn Na₂SO₃ anstelle von KAc verwendet wird. Wir benötigen so hohe Mengen wie 10 % KAc, um zu kristallisieren, jedoch nur 4 % Na₂SO₃. Ebenfalls stellen wir eine erhöhte Ricke der Kristalle fest.
Der Kostenunterschied beim Verwenden von KAc oder Na₂SO₃ ist vernachlässigbar in Bezug auf den Preis pro kg Rohmaterial, jedoch, da in dem Fall von Na₂SO₃ weniger Salz benötigt wird als in dem Fall von KAc, begünstigt dies Na₂SO₃.
BEISPIEL 2
Kristallisation einer Amylase unter Verwenden von Thiosulfat
100 kg Kulturbrühe, die eine Amylase von Bacillus licheniformis enthielt, fermentiert, wie z. B. in GB 1,296,39 beschrieben, wurde der folgenden Behandlung unterzogen:
Tabelle 5. Vorbehandlung der Bacillus licheniformis Brühe
Der Produktionsstamm wurde durch Trommelfiltration entfernt, was ein Filtrat ergab, welches sukzessiv unter Verwenden von Seitz EK1-Filterkissen keimfiltriert wurde. Das resultierende Filtrat wurde mittels Evaporation zu einem Trockenmassegehalt von 15 % konzentriert (gemessen als Brechungsindex).
Die Reinheit des resultierenden Konzentrats wird durch das Verhältnis von (OD_440nm/g aktive Amylase) und das Verhältnis von aktivem Enzym/Trockenmasse (g Enz/g Trockenmasse) dargestellt.
Tabelle 6. Reinheit des Konzentrats bevor die Kristallisation beginnt.
Das Konzentrat wurde weiter verschiedenen Mengen an Kaliumacetat, Natriumthiosulfat und Natriumsulfat ausgesetzt und auf pH = 7,3 unter Verwenden einer 13 w/w % NaOH-Lösung eingestellt und für 24 Stunden Kristallisationszeit bei 28°C belassen.
Die Kristallsuspensionen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Kristallkuchen wurden gelöst und 10-fach pro Gewicht („10 fold by weight") einer 50 % MPG-Lösung, formuliert. Die resultierenden formulierten Produkte wurden hinsichtlich OD_440nm und Amylaseaktivität analysiert.
Die Analyse der Amylaseaktivität basiert auf der Verdauung von p-Nitrophenyl-alfa-D-Maltoheptaosid (pNP-G₇) durch die α-Amylase. Das Substrat, pNP-G₇ wird durch die Amylase zu pNP-G₃ und pNP-G₄ abgebaut. pNP-G₃ wird weiter durch eine überschüssige Menge an α-Glucosidase zu Glucose und dem gelben p-Nitrophenol abgebaut. Die Reaktion wird in situ verfolgt, wodurch die Veränderung des Absorbtionsmaßes pro Zeiteinheit berechnet werden kann. Diese Zahl ist ein Maß der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymaktivität. Um eine Interferenz mit der Protease zu vermeiden, wird PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) zu der Testlösung hinzugegeben.
Die Ausbeuten und Reinheiten der Endprodukte sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7. Konzentrat, welches ansteigenden Mengen der drei unterschiedlichen Salze ausgesetzt wurde und bei pH = 7,3 und 28°C kristallisiert wurde, gezeigt sind Ausbeute und Reinheit.
Wir stellen überraschenderweise fest, dass die Ausbeute bei Verwenden von Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) als Kristallisationsmittel erhöht ist. Mit anderen Worten, wir können unter Verwenden von Thiosulfat, die Ausbeute wesentlich erhöhen und sogar eine verbesserte Reinheit gewinnen.
Der Kostenunterschied beim Verwenden von entweder KAc oder Na₂S₂O₃ ist vernachlässigbar in Bezug auf den Preis pro kg Rohmaterial, jedoch, da in dem Fall von Na₂S₂O₃ weniger Salz als in dem Fall von KAc verwendet wird, begünstigt dies Na₂S₂O₃ für die Kristallisation dieser Amylase.
BEISPIEL 3
Kristallisation einer Protease unter Verwenden von Natriumthiosulfat
100 kg Kulturbrühe, welche eine Protease von Bacillus lentus enthielt, fermentiert, wie z. B. in US 3,723,250 beschrieben, wurde der folgenden Behandlung unterzogen:
Der Produktionsstamm wurde durch Trommelfiltration entfernt, was ein Filtrat ergab, welches weiter unter Verwenden von Seitz K900-Filterplatten filtriert wurde und nachfolgend unter Verwenden von Seitz EK1-Filterkissen keimfiltriert wurde. Das resultierende Filtrat wurde über Asahi (6 kD) Membranen konzentriert.
Die Reinheit des resultierenden Konzentrats wird durch das Verhältnis von (OD_440nm/g aktive Protease) und das Verhältnis von OD_280nm/g aktive Protease) in der nachfolgenden Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8. Reinheit des Konzentrats bevor die Kristallisation beginnt.
Das Konzentrat wurde weiter verschiedenen Mengen an Kaliumacetat und Natriumthiosulfat ausgesetzt und wurde auf pH = 4,9 unter Verwenden einer 20 w/w % HCOOH-Lösung eingestellt und für 24 Stunden Kristallisationszeit bei 28°C belassen.
Die Kristallsuspensionen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Kristallkuchen wurden unter Verwenden von 1-fach pro Gewicht einer 5,5 % CaCl₂-Lösung gewaschen. Die resultierenden Kristallkuchen wurden gelöst und in 10-fach pro Gewicht einer 70 % MPG-Lösung formuliert.
Die resultierenden, formulierten Produkte wurden auf die Proteaseaktivität hin analysiert. Die Proteaseaktivität wurde unter Verwenden eines kinetischen Dimethyl-Casein-Tests gemessen. Die Ausbeuten der Endprodukte sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9. Ausbeute und Gestalt des Konzentrats, das ansteigenden Mengen von zwei verschiedenen Salzen ausgesetzt wurde und bei pH = 4,9, bei 28°C kristallisiert wurde.
Wir stellen überraschenderweise fest, dass die Ausbeute bei Verwenden von Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃) als Kristallisationsmittel, bei geringen Salzkonzentrationen, signifikant erhöht wird. Weiterhin gewinnen wir eine verbesserte Kristallgestalt, wie aus Tabelle 9 gesehen werden kann.

Claims

Verfahren zum Kristallisieren eines aus einer Protein-enthaltenden Lösung erhaltenen Proteins, umfassend: (a) Behandeln der Protein-enthaltenden Lösung mit einem Salz, das ein Schwefelatom enthält, das eine niedrigere Oxidationsstufe als 6 aufweist; (b) Gewinnen des Proteins in kristalliner Form.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Schwefelatom eine Oxidationsstufe von 2 bis 4 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Salz ein Sulfitsalz oder ein Thiosulfatsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Na₂S₂O₃, Na₂SO₃, NaHSO₃, Na₂S₂O₄, Na₂S₂O₆ × 2H₂O, Na₂S₃O₆, Na₂S₄O₆, Na₂S₂O₅, HSCH₂COONa, K₂S₂O₃ × 1/3H₂O, K₂SO₃ × 2H₂O, KHSO₂, K₂S₂O₆, K₂S₃O₆, K₂S₄O₆, K₂S₂O₄, Li₂SO₃ × H₂O, Li₂S₂O₆ × 2H₂O, (NH₄)₂SO₃, LiHSO₃, KHSO₃ und (NH₄)HSO₃.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung mehr als ein Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung aus einer Fermentationsbrühe erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Fermentationsbrühe vor der Salzbehandlung durch Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Diafiltration, Elektrodialyse, Fällung, Evaporieren oder eine Kombination davon gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein oder mehrere Flockungsmittel vor der Salzbehandlung zu der Fermentationsbrühe zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Salz in einer Konzentration von 0,02–1,2 mol pro Liter Proteinlösung zu der Proteinlösung zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung bis zu einem Gehalt an Proteinen von 0,1 bis 25 % gew/gew konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Enzym eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase, eine Amylase oder eine Oxidoreduktase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH der Proteinlösung zwischen 4 und 9 beträgt.