DE69632357T2

DE69632357T2 - Polypeptid und Verfahren zum Messen von Lebendkörperkomponenten unter Verwendung derselben

Info

Publication number: DE69632357T2
Application number: DE69632357T
Authority: DE
Inventors: Nobuko Imajo; Yukari Yamagata; Hideo Katoh; Shinji Satomura; Kenji Nakamura
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2016-07-18
Also published as: DE69627942D1; ES2215956T3; EP0755941B1; EP1273591A1; CA2181109A1; EP0755941A2; DE69627942T2; ES2194080T3; US6828417B2; US6300079B1; DE69632357D1; US20020045189A1; EP0755941A3; EP1273591B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen von Analyten in Proben, die von Lebendkörpern abgenommen werden, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten (z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin, usw.), Lymphocyten, Hämocyten und verschiedene Zellen, welches Verfahren die Verwendung von Polypeptid einschließt, das über Säurereste verfügt, die von einer starken Säure deriviert sind.
Es ist bekannt, dass spezielle Substanzen stark untereinander unter Erzeugung eines stabilen Komplexes wechselwirken (insofern sie nämlich eine hohe Affinität zueinander haben). Die speziellen Substanzen schließen beispielsweise die folgenden Kombinationen ein: Antigen und Antikörper; Protease und ihr Inhibitor; Zuckerkette und Lektin; Enzym und Substrat dafür oder Coenzym; physiologisch wirksame Substanz, wie beispielsweise Hormon, und Rezeptor- oder Transportprotein für diese wirksame Substanz; und ein , Paar von Polynucleotidketten, doppelsträngige DNA.
Als eine Methode zum Messen eines Analyten in einer Probe unter Nutzung der vorgenannten Wechselwirkung lassen sich die folgenden exemplifizieren: eine Methode zur Erzeugung eines Komplexes auf einer festen Phase mit Hilfe der Reaktion von Substanzen in der vorstehend exemplifizierten Kombination und anschließende Ausführung einer sogenannten Bound/Free (B/F-Trennung) unter Verwendung der festen Phase, wie beispielsweise ein Enzymimmunoassay (EIA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluoroimmunoassay (FIA) (beispielsweise die Verfahren, die in der JP-A-1-22706 (EP-A-326 100), JP-A-3-44399 offenbart wurden); und eine Methode, die von einigen Erfindern der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, z.B. eine Methode zur Ausführung der Trennung eines Komplexes von einem zu messenden freien Analyten, d.h. die sogenannte B/F-Trennung. Mit Hilfe einer Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) (beispielsweise die Verfahren, die offenbart wurden in der JP-A-2-28557 (EP-A-357 869), JP-A-3-206 964, JP-A-3 221 865, JP-A-6-66800.
In einer solchen Messmethode werden die Genauigkeit der Messung und die für die Analyse erforderliche Zeitdauer bis zu einem bestimmten Umfang von dem Wirkungsgrad der B/F-Trennung beeinflusst. Daher sind über die B/F-Trennung zahlreiche Forschungsarbeiten ausgeführt worden.
Beispielsweise wird in den in der JP-A-1-227 061 (EP-A-326 100), JP-A-3-44399 offenbarten Prozessen, in denen die B/F-Trennung unter Verwendung einer festen Phase ausgeführt wurde, und in den in der JP-A-6-66800 offenbarten Prozessen, in denen die B/F-Trennung unter Anwendung der HPLC ausgeführt wurde, die B/F-Trennung wie folgt ausgeführt: eine anionische Substanz wurde zunächst beispielsweise in eine Antikörper zu einem in einer Probe zu messenden Analyten eingeführt, die von einem Lebendkörper abgenommen wurde, und die sogenannte B/F-Trennung unter Nutzung der anionischen Eigenschaften der anionischen Substanz in einem Komplex des Analyten und des Antikörpers ausgeführt.
Durch eine solche Methode wird es möglich, die B/F-Trennung wirksamer als zuvor auszuführen. In all den Prozessen handelte es sich jedoch bei der anionischen Substanz, die zur Anwendung gelangte, um eine solche, die von einer Polyaminosäure abgeleitet wurde und die B/F-Trennung unter Nutzung der anionischen Eigenschaften ausgeführt wurde, die von den Carboxyl-Gruppen der Polyaminosäure vermittelt werden, so dass die vorstehend erwähnten Nachteile in den Fällen festgestellt wurden, wo die B/F-Trennung unter Anwendung der HPLC ausgeführt wurde.
Allerdings sollten in der Methode unter Anwendung der HPLC beispielsweise in der Probe vorhandene freie Antikörper und Substanzen gleichzeitig mit der B/F-Trennung von dem Komplex abgetrennt werden, die die Messung beeinflussen. Bei der zufriedenstellenden Ausführung einer solchen Trennung unter Nutzung der anionischen Eigenschaften der von der Polyaminosäure abgeleiteten Carboxyl-Gruppen sollten mindestens etwa 200 Carboxyl-Gruppen (etwa 200 Aminosäure-Reste) in das Molekül der anionischen Substanz eingeführt werden. Dementsprechend ist es zu den folgenden Problemen gekommen. Erstens, erfordert die Vorbereitung der anionischen Substanz sehr viel Arbeit. Darüber hinaus ist die Vorbereitung der anionischen Substanz im großen Maßstab mit einer gleichbleibenden relativen Molekülmasse schwierig, so dass bei der Ausführung der B/F-Trennung mit Hilfe der HPLC unter Nutzung einer solchen anionischen Substanz eine Schwanzbildung oder Kopfbildung eines Peaks auftreten, um die Genauigkeit der Messung in einigen Fällen zu verringern. Wenn darüber hinaus zur Trennung eine Polyaminosäure mit Carboxyl-Gruppen verwendet wird, wie beispielsweise Polyglutaminsäure, findet eine nichtspezifische Reaktion statt und führt zu einem Phänomen, wie beispielsweise der Erhöhung eines Blindwertes und in einigen Fällen der Messwerte. Um ein solches Phänomen zu vermeiden, ist es notwendig, ein geeignetes anionisches Polymer zuzusetzen, wie beispielsweise y-Polyglutaminsäure.
Daher besteht der Wunsch, nach weiteren Verbesserungen zu suchen.
In den Chem. Abstr., Bd. 121, Nr. 11, 1994, Referat Nr. 134778 ist die Synthese des trisulfatierten Peptids H-Tyr(SO₃H)-Ala-Glu-Glu-Tyr(SO₃H)-Glu-Tyr(SO₃H)-Thr-Ser-OH mit Hilfe der Festphasenmethode offenbart worden.
Die WO-A-92/17194 offenbart ein Polypeptid für die Hemmung der Mineralabscheidung, das 3 bis 6 Phosphoserin-Reste aufweist.
Die WO-A-87/07615 offenbart Phosphopeptide, die über 5 bis 30 Aminosäuren verfügen, einschließlich die Sequenz A-B-C-D-E, worin A, B, C, D und E unabhängig Phosphoserin sind, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, Phosphohistidin, Glutamat und Aspartat. Die Phosphopeptide werden für die topische Aufbringung auf Zähne oder die Mundschleimhaut verwendet.
Die Synthese von mehrfachen O-Phosphosery enthaltendem Peptid Ac-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-NHMe (P=Phosphat) wurde beschrieben in Australian Journal of Chemistry (1992), 45(2), 385–394.
Zusammenfassung der Erfindung
Angesichts einer solchen Ausgangssituation kam es zu der vorliegenden Erfindung und wird ein Verfahren zum Messen eines Analyten in einer Probe gewährt, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, welches Verfahren umfasst: Umsetzen einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe mit einem Reagens, wobei das Reagens ein kombiniertes Produkt eines Polypeptids mit 3 bis 30 Resten aufweist, deriviert von einer starken Säure, die einen pKa-Wert von 3 oder weniger hat, und einer Substanz, die über Affinität zu dem Analyten verfügt; Abtrennen des resultierenden Komplexes und Bestimmen der Menge des Analyten in der Probe auf der Basis der Menge des Komplexes. Wenn ein Komplex erzeugt wird durch die Wechselwirkung zwischen einem Analyten, der in einer Probe gemessen werden soll, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, und einer Substanz mit Affinität zu dem Analyten (nachfolgend bezeichnet als "Affinitätssubstanz"), abgetrennt wird von der freien Affinitätssubstanz, d.h. nichtumgesetzte Affinitätssubstanz, und anderen in der Probe vorhandenen Substanzen, die den Nachweis des Komplexes beeinflussen würden, und zwar mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung, z.B. eine Methode unter Verwendung eines Anionenaustauschers, so kann dieses Polypeptid zur Trennung des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz wirksamer eingesetzt werden.
Hierin wird ein kombiniertes Produkt aus dem Polypeptid und einer Affinitätssubstanz zu einem in einer Probe zu messenden Analyten beschrieben, die von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Ebenfalls wird hierin eine Verbindung beschrieben, in der eine Maleinimido-Gruppe über einen Spacer an dem N-Ende des Polypeptids gebunden ist, sowie ein kombiniertes Produkt der Verbindung und einer Substanz, die über eine SH-Gruppe verfügt sowie Affinität zu einem in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird.
Ebenfalls wird hierin ein Reagens zum Messen eines in einer Probe zu messenden Analyten beschrieben, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, das ein kombiniertes Produkt des Polypeptids und einer Affinitätssubstanz zu dem Analyten aufweist oder dem vorgenannten kombinierten Produkt, das über eine Maleinimido-Gruppe-Spacer-Polypeptidbindung verfügt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 Elutionspositionen anionischer Polypeptide mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule, erhalten in Beispiel 8;
2 Elutionspositionen kombinierter Produkte von Fab'-Fragment als Antikörper und eines anionischen Polypeptids mit Hilfe der HPLC unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule, erhalten in Beispiel 11;
3 Daten über die Lagerbeständigkeit eines Polypeptids, das über sulfatierte Serin-Reste verfügt, in Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert, erhalten in Beispiel 12;
4 Daten über die Lagerbeständigkeit eines Polypeptids, das über sulfatierte Tyrosin-Reste verfügt, in Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert, erhalten in Beispiel 12;
5 Elutionspositionen verschiedener Antigen-Antikörper-Komplexe anhand der HPLC unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule, erhalten in Beispiel 14;
6 Elutionsmuster für die Analyse von Proben mit Hilfe der HPLC, erhalten in Beispiel 15;
7 Elutionspositionen verschiedener Antigen-Antikörper-Komplexe anhand der HPLC unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule, erhalten in Beispiel 16.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfinder haben eine Methode zum Abtrennen eines durch die Wechselwirkung zwischen einem in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wurde, und einer Affinitätssubstanz erzeugten Komplexes von Substanzen untersucht, die zusammen mit dem Komplex vorliegen und dazu neigen, die Detektion des Komplexes zu beeinflussen, beispielsweise freie Affinitätssubstanz (oder freier Analyt, wobei der Analyt markiert sein kann mit einer mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbaren Substanz (nachfolgend abgekürzt als "detektierbare Substanz")) wobei die Abtrennung mit Hilfe eines Anionenaustauschers erfolgt. Das bedeutet, die Erfinder haben eingehend die Entwicklung einer Methode untersucht, die eine sicherere Abtrennung des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen ermöglicht. Im Verlaufe der Untersuchung haben die Erfinder festgestellt, dass, wenn eine Substanz, die über eine geeignete Fähigkeit zur Veränderung der Eigenschaften des Komplexes (nachfolgend abgekürzt als "die Trennung verbessernde Substanz") verfügt, in den Komplex eingeführt wird und der Komplex von den Substanzen abgetrennt wird, die zusammen mit dem Komplex vorliegen und die Neigung haben, die Detektion des Komplexes zu beeinflussen, beispielsweise die freie Affinitätssubstanz (oder der freie Analyt), und zwar auf der Grundlage der Fähigkeit der die Trennung verbessernden Substanz, dann die Elutionsposition des Komplexes frei eingestellt werden kann, indem die geeignete die Trennung verbessernde Substanz gewählt wird. Mit anderen Worten haben die Erfinder entdeckt, dass die Einführung einer geeigneten die Trennung verbessernden Substanz in den Komplex eine sicherere Abtrennung des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen erlaubt. Diese Entdeckung wurde als eine Patentanmeldung (JP-A-6-66800) eingereicht. Wenn jedoch der Komplex mit Hilfe dieser Methode durch Einführen einer die anionische Trennung verbessernden Substanz in den Komplex abgetrennt wird, dann werden in einigen Fällen die vorstehend erwähnten Probleme hervorgerufen. Um eine anionische, die Trennung verbessernde Substanz zu finden, die derartige Probleme nicht hervorruft, haben die Erfinder ferner eingehende Untersuchungen ausgeführt und dementsprechend entdeckt, dass die vorgenannten Probleme gelöst. werden können, indem als anionische, die Trennung verbessernde Substanz ein Polypeptid verwendet wird, der über 3 bis 30 Säurereste verfügt, die von einer starken Säure deriviert sind.
Das Polypeptid kann jedes beliebige Polypeptid sein, so lange es über mindestens 3 bis zu 30 Säurereste verfügt, die von einer starken Säure deriviert sind. Die Art und die Zahl der Aminosäure-Reste, die das Polypeptid aufbauen, sind nicht speziell beschränkt. Unter Berücksichtigung der leichten Ausführbarkeit der Synthese und dergleichen wird die Gesamtzahl der Aminosäure-Reste geeigneterweise im Bereich von 3 bis 30, bevorzugt 5 bis 15, gewählt. Als von einer starken Säure derivierte Säurereste werden solche Reste definiert, die von einer starken Säure deriviert sind, die über einen pKa-Wert von 3 oder weniger verfügt, wie beispielsweise anorganische starke Säuren, z.B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, usw.
Der Begriff "Säurerest" bedeutet einen zurückgehaltenen Teil einer Säure nach Entfernung eines Wasserstoffatoms, z.B. HSO₄.
Ferner bedeutet der Begriff "Aminosäure-Rest" einen zurückgehaltenen Teil einer Aminosäure nach Entfernung eines Wasserstoffatoms von dem N-Ende (-NH₂) und einer Hydroxyl-Gruppe von dem C-Ende (-COOH).
Das Polypeptid verfügt über eines der beliebigen, vorstehend exemplifizierten starken Säurereste, die normalerweise in die reaktionsfähigen Gruppen der Aminosäure-Reste eingeführt werden, die das Polypeptid aufbauen. Als die reaktionsfähige Gruppe können eine freie Hydroxyl-Gruppe, Amino-Gruppe, Imino-Gruppe, Thiol-Gruppe, und dergleichen in dem Polypeptid exemplifiziert werden. Die Amino-Gruppe der Hauptkette des Polypeptids, d.h. die N-terminale Amino-Gruppe des Polypeptids, kann außerdem als die reaktionsfähige Gruppe verwendet werden. Bevorzugt wird jedoch der Säurerest in die anderen reaktiven Gruppen als der N-terminalen Amino-Gruppe eingeführt, weil die freie N-terminale Amino-Gruppe des Polypeptids so wirken kann, dass das Polypeptid mit einer Affinitätssubstanz verbunden wird und bis zu einem bestimmten Umfang einen definiten Mode der Verbindung des Polypeptids und der Affinitätssubstanz ergeben kann, was dazu führt, dass die Genauigkeit der Messung eines Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe erhöht wird.
Das Polypeptid kann allgemein mit Hilfe der Formel dargestellt werden: A-(R)_m-B (I)worin m eine ganze Zahl von 3 oder mehr ist; mindestens 3 und bis zu 30 R's sind gleich oder verschieden und unabhängig ein Aminosäure-Rest, indem ein starker Säurerest darin über eine reaktionsfähige Gruppe des Aminosäure-Restes eingeführt wird, wobei die Reste von R's gleich oder verschieden sind, ein Aminosäure-Rest, der keinen starken Säurerest hat, jede reaktionsfähige Gruppe in jeder Seitenkette des Aminosäure-Restes, die geschützt werden kann; A ist ein Wasserstoffatom, eine Schutzgruppe vom N-Terminus oder ein Säurerest, deriviert von einer starken Säure; und B ist eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Schutzgruppe vom C-Terminus.
In der vorgenannten Formel (I) ist m eine ganze Zahl von mindestens 3 und im Allgemeinen 3 bis 30 und vorzugsweise 3 bis 20 und mehr bevorzugt 4 bis 20 und am meisten bevorzugt 5 bis 15. Unter einer Vielzahl von R's in der Zahl von m mit mindestens 3 bis 30 sollten R's unabhängig ein Aminosäure-Rest sein, der über einen Säurerest verfügt, der von einer starken Säure deriviert ist. Der Säurerest wird in den Aminosäure-Rest eingeführt, indem er zum Binden an der reaktionsfähigen Gruppe des Aminosäure-Restes gebracht wird. Wenn keines der R's in der Zahl von m über einen starken Säurerest verfügt, so sind die R's unabhängig ein Aminosäure-Rest, der über keinen starken Säurerest verfügt, wobei in diesem Fall die reaktionsfähige Gruppe der Seitenkette des Aminosäure-Restes mit Hilfe einer konventionellen Schutzgruppe für die N-terminale Amino-Gruppe geschützt werden kann. "A" ist ein Wasserstoffatom in der N-terminalen Amino-Gruppe, wobei dieses Wasserstoffatom auch durch eine konventionelle Schutzgruppe für die N-terminale Amino-Gruppe ersetzt werden kann und wobei ferner der Säurerest, deriviert von einer starken Säure, auch anstelle dieses Wasserstoffatoms eingeführt werden kann, wenn er nicht geschützt ist. "B" ist eine Hydroxyl-Gruppe an der C-terminalen Carboxyl-Gruppe, wobei diese Hydroxyl-Gruppe ersetzt werden kann durch eine konventionelle Schutzgruppe für die C-terminale Carboxyl-Gruppe. Die vorstehend ausgeführte Art und Reihenfolge der m R's Aminosäure-Reste können willkürlich sein.
Das mit der vorgenannten Formel (I) dargestellt Polypeptid lässt sich beispielsweise in die folgenden zwei Gruppen einteilen:
(1) Polypeptid, das durch die folgende Formel dargestellt wird: A-(R¹)_m'-B (II)worin R¹'s gleich oder verschieden sind und unabhängig ein Aminosäure-Rest sind, der darin über eine reaktionsfähige Gruppe des Aminosäure-Restes einen starken Säurerest einführt; m' ist eine ganze Zahl von 3 bis 30; und A und B sind wie vorstehend festgelegt.
In der vorgenannten Formel (II) ist m' eine ganze Zahl von 3 bis 30, bevorzugt 3 bis 20, mehr bevorzugt 4 bis 20 und am meisten bevorzugt 5 bis 15; R¹ ist ein Aminosäure-Rest, der über einen von einer starken Säure derivierten Säurerest verfügt. Damit verfügen sämtliche Aminosäure-Reste unabhängig über einen von einer starken Säure derivierten Säurerest. A und B sind wie vorstehend festgelegt.
In der vorgenannten Ausführung können Art und Reihenfolge der R¹'s-Aminosäure-Reste in der Zahl von m willkürlich sein
(2) Polypeptid, das durch die folgende Formel dargestellt wird: A-(R¹)_m'-(R²)_n-B (III)worin m' eine ganze Zahl von 3 bis 30 ist; die R¹'s sind gleich oder verschieden und unabhängig ein Aminosäure-Rest, der darin über eine reaktions fähige Gruppe des Aminosäure-Restes einen starken Säurerest einführt; jedes R² ist ein Aminosäure-Rest, der über einen starken Säurerest verfügt, wobei jede reaktionsfähige Gruppe in jeder Seitenkette des Aminosäure-Restes in der Lage ist, geschützt zu werden; n ist eine ganze Zahl von 1 oder mehr; und A und B sind wie vorstehend festgelegt.
In der vorgenannten Formel (III) ist R² ein Aminosäure-Rest, der über einen von einer starken Säure derivierten Säurerest verfügt; (m'+n) ist eine ganze Zahl von mindestens 4 und im Allgemeinen 4 bis 30, bevorzugt 4 bis 20, mehr bevorzugt 5 bis 20, am meisten bevorzugt 6 bis 15; n ist eine ganze Zahl von mindestens 1 und im Allgemeinen 1 bis 27, bevorzugt 1 bis 17, mehr bevorzugt 1 bis 16, am meisten bevorzugt 1 bis 10; und alle anderen Symbole haben die gleiche Bedeutung, wie vorstehend festgelegt wurde. Die Art und die Reihenfolge der R¹-Aminosäure-Reste in der Zahl von m' und die R²-Aminosäure-Reste in der Zahl von n können willkürlich sein. In diesem Fall gibt es ein Polypeptid, das sich aus einem Block zusammensetzt, der Aminosäure-Reste enthält, die alle einen Säurerest aufweisen, der von einer starken Säure deriviert ist, sowie einen Block, der keinen derartigen starken Säurerest enthält, wie vorstehend erwähnt wurde.
Die von einer starken Säure in dem Polypeptid derivierten Säurereste sind bevorzugt Säurereste, die von einer mehrwertigen starken Säure deriviert sind, wie beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure oder dergleichen. Von diesen Säureresten ist der Schwefelsäure-Rest bevorzugt und speziell dann, wenn das Polypeptid als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, da Phosphatasen dazu neigen in dem in einer Probe zu messenden Analyten vorzuliegen, die von einem Lebendkörper abgenommen werden. Es ist ausreichend, dass die starken Säurereste in dem Polypeptid in einer Zahl von mindestens 3 bis zu 30 vorliegen. Wenn die Zahl der Säurereste zu groß ist, ist das Polypeptid schwierig als die Trennung verbessernde Substanz zu verwenden, wie beispielsweise die Trennung mit Hilfe eines Anionenaustauschers, die Trennung und die Elution aus einer Säule oder dergleichen schwierig sind. Wenn daher das Polypeptid als die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, wird die Zahl der Säurereste geeigneterweise im Bereich von in der Regel 3 bis 30 ausgewählt, vorzugsweise 3 bis 20, mehr bevorzugt 4 bis 20 und am meisten bevorzugt 5 bis 15. Unter Berücksichtigung der leichten Ausführung der Synthese und dergleichen wird die Gesamtzahl der Aminosäure-Reste geeigneterweise im Bereich von üblicherweise 3 bis 30, bevorzugt 3 bis 20, mehr bevorzugt 4 bis 20 und am meisten bevorzugt 5 bis 15 gewählt. Wenn die Zahl der Säurereste kleiner ist als 3 überlappen sich ein Peak der Trennung mit Hilfe der die Trennung verbessernden Substanz und ein Elutionspeak aufgrund einer Serumkomponente miteinander, so dass die Genauigkeit der Messung (Analyse) herabgesetzt ist. Um das Überlappen des Peaks der Trennung mit Hilfe der die Trennung verbessernden Substanz und des Elutionspeaks aufgrund einer Komponente in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, wie beispielsweise einem Serum, zu vermeiden und die Genauigkeit der Messung weiter zu erhöhen, beträgt die Zahl der Säurereste bevorzugt 4 oder mehr und mehr bevorzugt 5 oder mehr. Wenn darüber hinaus die Schwefelsäure-Reste als die Säurereste eingeführt werden, die von einer starken Säure deriviert sind, wird die Einführung bevorzugt unter Nutzung der phenolischen Hydroxyl-Gruppen von Tyrosin-Resten vorgenommen, zumindest vom Standpunkt der Stabilität der Schwefelsäure-Reste in einer wässrigen Lösung nach ihrer Einführung.
In dem Polypeptid sind die Aminosäure-Reste, die über einen von einer starken Säure derivierten Säurerest verfügen, so lange nicht speziell beschränkt, wie es sich um solche handelt, die erhalten werden durch Einführen eines von einer starken Säure derivierten Säurerestes in jede der freien reaktionsfähigen Gruppen von Aminosäure-Resten handelt, z.B. Hydroxyl-Gruppe, Amino-Gruppe, Imino-Gruppe, Thiol-Gruppe, usw. In diese Aminosäure-Reste einbezogen sind beispielsweise Aminosäure-Reste, die über eine freie Hydroxyl-Gruppe verfügen, wie beispielsweise Tyrosin, Serin, Threonin, usw.; Aminosäure-Reste, die über eine freie Amino-Gruppe verfügen, wie beispielsweise Lysin, Arginin, usw.; Aminosäure-Reste, die über eine freie Imino-Gruppe verfügen, wie beispielsweise Histidin, Tryptophan, Prolin, Oxyprolin, usw.; sowie Aminosäure-Reste, die über eine freie Thiol-Gruppe verfügen, wie beispielsweise Cystein, usw. Zieht man die leichte Ausführung der Einführung des von einer starken Säure derivierten Säurerestes in Betracht, so sind bevorzugte Beispiele für den Aminosäure-Rest Serin, Threonin und Tyrosin. Die Aminosäure-Reste in dem Polypeptid sind so lange nicht speziell beschränkt, wie es sich um solche handelt, die von konventionellen Aminosäuren auf dem Gebiet der Peptid-Chemie deriviert sind. Bevorzugte Beispiele dafür sind Reste von Aminosäuren, wie beispielsweise Alanin, Glycin, β-Alanin, usw.
Das Polypeptid lässt sich nach einer der folgenden Methoden oder dergleichen synthetisch darstellen; (i) eine Methode zum Einführen eines von einer starken Säure derivierten Säurerestes in jede von mindestens drei freien reaktionsfähigen Gruppen eines Polypeptids, das über eine geeignete Zahl von freien reaktionsfähigen Gruppen verfügt (J. Chem. Soc. Perkin Trans I, (1990), 1739–1744, usw.); (ii) eine Methode zum synthetischen Darstellen eines gewünschten Polypeptids, ausgehend als Synthesematerial von Aminosäuren, die über den von der starken Säure derivierten Säurerest verfügen (Chem. Pharm. Bull., 41(2), (1993), 376–380, usw.). Unter Berücksichtigung der Ausbeute des gewünschten Polypeptids, usw., ist die Methode (i) gegenüber der Methode (ii) bevorzugt (und speziell dann, wenn die Zahl der Aminosäure-Reste groß ist). Die vorgenannte Methode (ii) hat jedoch den folgenden Vorteil: da eine Sulfatierung nicht erforderlich ist, kann eine funktionelle Gruppe, die zum Binden an einer Affinitätssubstanz in der Lage ist (z.B. Antikörper), wie beispielsweise ein Maleinimidocapronsäure-Rest, direkt in den N-Terminus des resultierenden Polypeptids eingeführt werden, so dass das Polypeptid sofort mit der Affinitätssubstanz verbunden werden kann.
Eine Methode zum Einführen eines von einer starken Säure derivierten Säurerestes in jede der freien reaktionsfähigen Gruppen eines Polypeptids oder der freien reaktionsfähigen Gruppe einer Aminosäure ist so lange nicht beschränkt, wie sie die Einführung des von einer starken Säure derivierten Säurerestes in die freie reaktionsfähige Gruppe erlaubt, wie beispielsweise Hydroxyl-Gruppe, Amino-Gruppe, Imino-Gruppe, Thiol-Gruppe oder dergleichen.
Speziellere Beispiele der Methode werden nachfolgend angegeben. Eine Methode, die das Umsetzen eines Sulfatierungsmittels (z.B. HSO₃·Cl, HSO₃·Dimethylformamid oder HSO₃·Pyridin) oder eines Phosphorylierungsmittels (z.B. ein Phosphorylhalogenid, wie beispielsweise Phosphorylchlorid, oder ein Phosphorhalogenid, wie beispielsweise Phosphortrichlorid) mit einer Aminosäure umfasst, die über eine freie Hydroxyl-Gruppe verfügt (z.B. Tyrosin, Serin oder Threonin) (oder einem Polypeptid, das über Reste verfügt, wie beispielsweise Aminosäure) in einer Mengen von 1 bis 20 val pro val der freien Hydroxyl-Gruppe der Aminosäure (oder der freien Hydroxyl-Gruppen der Aminosäure-Reste) bei 0° bis 40°C für 1 bis 24 Stunden in einem wasserfreien Lösemittel (z.B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)), und zwar mit Hilfe einer alkalischen Substanz (z.B. Pyridin, Triethylamin oder NaH) als ein Katalysator, und dadurch Einführen eines von einer starken Säure derivierten Säurerestes in die Hydroxyl-Gruppe des Aminosäure-Restes (oder jede der Hydroxyl-Gruppen der Aminosäure-Reste). Eine Methode, die das Umsetzen eines Sulfatierungsmittels (z.B. HSO₃·Cl, HSO₃·Dimethylformamid oder HSO₃·Pyridin) oder eines Phosphorylierungsmittels (z.B. ein Phosphorylhalogenid, wie beispielsweise Phosphorylchlorid, oder ein Phosphorhalogenid, wie beispielsweise Phosphortrichlorid) mit einer Aminosäure umfasst, die über eine freie Amino-Gruppe verfügt (z.B. Lysin oder Arginin) (oder einem Polypeptid, das über einen oder mehrere Reste einer solchen Aminosäure verfügt) oder einer Aminosäure, die über eine freie Imino-Gruppe verfügt (z.B. Histidin, Tryptophan, Prolin oder Oxyprolin) (oder einem Polypeptid, das über einen oder mehrere Reste einer solchen Aminosäure verfügt) in einer Menge von 1 bis 20 val pro val der freien Amino- oder Imino-Gruppe der Aminosäure (oder der freien Amino-Gruppe(n) und/oder Iminio- Gruppe(n) der Aminosäure-Reste) bei 0° bis 40°C für 1 bis 24 Stunden in einem Lösemittel (wasserfrei) (z.B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)), und zwar unter Verwendung einer alkalischen Substanz (z.B. Pyridin, Triethylamin oder NaH) als einen Katalysator, und dadurch Einführen eines von der starken Säure derivierten Säurerestes in die Amino- und/oder Imino-Gruppe des Aminosäure-Restes (oder jeder/jeden Amino-Gruppe(n) und/oder Imino-Gruppe(n) der Aminosäure-Reste). Unter Berücksichtigung der leichten Ausführung der Synthese, der Stabilität des eingefügten Säurerestes in einer wässrigen Lösung, seiner Stabilität gegenüber Enzymen, die in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe vorliegen (z.B. Phosphatase), usw., ist der Schwefelsäure-Rest als der von einer starken Säure als derivierte Säurerest bevorzugt.
Als das Polypeptid, das über freie reaktionsfähige Gruppen verfügt, wie beispielsweise Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen, Imino-Gruppen, Thiol-Gruppen, usw., das als ein Ausgangsmaterial für das Polypeptid verwendet werden kann, das über 3 bis 30 starke Säurereste verfügt, kann entweder ein kommerziell verfügbares Polypeptid oder ein Polypeptid verwendet werden, das mit Hilfe einer konventionellen Methode synthetisch dargestellt wird, die allgemein auf dem Gebiet der Peptid-Chemie zur Anwendung gelangt, wie beispielsweise die Methode mit aktivem Ester, die Methode mit gemischtem Säureanhydrid oder die Methode mit Azid (Nobuo Izumiya et al., "Peptid Gosei no Kiso to Jikken" (Basis and Practice of Peptide Synthesis), S. 89–142, 20. Jan., 1985, Maruzen Co., Ltd.). Zum synthetischen Darstellen eines solchen Polypeptids ist eine Schutzgruppe, die in dem nachfolgenden Sulfatierungsschritt stabil ist, als Schutzgruppe für die N-terminale Amino-Gruppe bevorzugt. Bevorzugte Beispiele für die Schutzgruppe sind Schutzgruppen vom Urethan-Typ, wie beispielsweise 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe, die unter alkalischen Bedingungen entfernbar ist. Schutzgruppen für die reaktionsfähigen Gruppen der Seitenketten von Aminosäuren oder Aminosäure-Resten lassen sich geeigneterweise unter Berücksichtigung beispielsweise der Synthesebedingungen des Polypeptids und der Einführungsbedingungen der Säurereste auswählen, die von einer starken Säure deriviert sind. Bevorzugte Beispiele dieser Schutzgruppen sind die tert-Butyl-Gruppe und Benzyl-Gruppe.
Als die Affinitätssubstanz kann jede beliebige Substanz ohne spezielle Einschränkung so lange gewählt werden, wie sie über eine Affinität zu einem in einer Probe zu messenden Analyten verfügt, die von einem Lebendkörper abgenommen wird. Spezielle Beispiele der Affinitätssubstanz sind Antikörper, Antigene und Lektine (z.B. Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin, Triticum vulgaris lectin, usw.), die über eine Affinität zum Analyten verfügen; sowie Inhibitoren für Enzyme (z.B. Amylase, Creatinkinase (CK), Glutaminoxalessigsäure-Transaminase (GOT)); Polynucleotidketten komplementär zu einsträngigen Polynucleotiden von Nucleinsäuren, bei denen es sich um zu messende Analyten handelt; sowie Rezeptoren für Thyroid-stimulierende Hormone, Acetylcholin, Glutaminsäure, usw.
Als eine Methode zum Darstellen eines kombinierten Produktes der Affiniätssubstanz und des Polypeptids (nachfolgend abgekürzt als "das kombinierte Produkt"), kann eine Methode zum Verknüpfen der spezifischen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz mit der spezifischen reaktionsfähigen Gruppe des Polypeptids exemplifiziert werden; eine Methode zum Ersetzen der spezifischen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz durch das Polypeptid; sowie eine Methode zum Kombinieren der Affinitätssubstanz und des Polypeptids durch eine Substanz, die über eine Affinität zu der Affinitätssubstanz verfügt (z.B. Antikörper, Lektin, Antigen, Inhibitor, DNA, usw.). Insbesondere lassen sich alle die folgenden Methoden exemplifizieren, wobei die Darstellung nach jeder beliebigen von ihnen ausgeführt werden kann: 1) konventionelle Methoden zum Anheften einer markierenden Substanz an einen Antikörper, die im Allgemeinen beispielsweise im konventionellen Enzymimmunoassay (EIA) eingesetzt wird, Radioimmunoassay (RIA) und Fluoroimmunoassay (FIA) (z.B. Yuichi Yamamura "Igaku Jikken Koza Bd. 8" 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971; Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai" 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983; und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai und Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki Sokuteiho" 2. Ausg., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). 2) Konventionelle Methoden zur Modifikation und Einführung von Substanzen (z.B. Ikuzo Uritani, Kensuke Shimura, Michinori Nakamura und Masaru Funazu "Tanpakushitsu-no Kagakushushoku <Jo> <Ge>" 1. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981; Yuji Inada et al. "Poly (ethylenglykol) Shushoku Tanpakushitsu" Seikagaku Bd. 62, Nr. 11, S. 1351–1362, Japanese Biochemical Association, 1990; und George H. K. und Mark M. M. "DNA PROBES" STOCKTON PRESS, 1989).
Spezielle Beispiele für die Methode zum Verknüpfen der spezifischen reaktionsfähigen Gruppe der Affinitätssubstanz mit der spezifischen reaktionsfähigen Gruppe des Polypeptids sind nachfolgend gegeben. Es kann eine Methode exemplifiziert werden, die das Umsetzen einer Verbindung umfasst, in der eine Maleinimid-Gruppe über einen Spacer an dem N-Ende des Polypeptids gebunden ist (die Verbindung wird nachfolgend abgekürzt als "die Maleinimid-Verbindung"), mit der SH-Gruppe eines Antikörpers Fab', hergestellt mit Hilfe einer konventionellen Methode, womit ein kombiniertes Produkt des Polypeptids und der Affinitätssubstanz (Antikörper) hergestellt wird.
Die Maleinimid-Verbindung, d.h. eine Verbindung, die eine Maleinimido-Gruppe aufweist, die über einen Spacer an dem N-Ende des Polypeptids der Formel (I) gebunden ist, kann allgemein dargestellt werden durch die Formel: D-E-(R)_m-B (IV)worin D eine Maleinimido-Gruppe ist; E ist ein Spacer und R, m und B sind wie vorstehend festgelegt worden.
Die Maleinimid-Verbindung der Formel (IV) kann beispielsweise in die folgenden Gruppen eingeteilt werden:
(1) Maleinimid-Verbindung, dargestellt durch die Formel: D-E-(R¹)_m'-B (V)worin D, E, R¹, m' und B wie vorstehend festgelegt sind;
(2) Maleinimid-Verbindung, dargestellt durch die Formel: D-E-(R¹)_m'-(R²)_n-B (VI)worin D, E, R¹, R², m', n und B wie vorstehen festgelegt sind.
Der durch E in diesen Formeln dargestellte Spacer ist nicht speziell beschränkt. Es kann jeder beliebige Spacer zur Anwendung gelangen, solange er die Anbringung an dem N-Ende des Polypeptids bzw. einer Maleinimid-Gruppe an den Enden des Spacers erlaubt und die Einführung (oder das Binden) der Maleinimid-Verbindung in die Affinitätssubstanz, wie beispielsweise ein Antikörper, erlaubt. Beispiele für die Spacer sind Gruppen, die dargestellt sind durch -R⁴CO-, worin R⁴ eine zweiwertige Kohlenwasserstoff-Gruppe ist. Speziellere Beispiele sind Gruppen, die durch die folgenden Formeln (VII) bis (IX) dargestellt werden: -(CH₂)_p-CO- (VII)worin p eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
worin jedes q und r Null ist oder eine ganze Zahl von 1 bis 5;
worin q und r wie vorstehend festgelegt sind.
Die Alkylen-Gruppen, die Phenylen-Gruppe und die Cyclohexylen-Gruppe in den Formeln (VII) bis (IX) können einen oder mehrere Substituenten aufweisen. In die Substituenten einbezogen sind beispielsweise geradkettige oder verzweigte niedere Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, usw. sowie hydrophile Gruppen, wie beispielsweise Hydroxyl, Carboxyl, Sulfo, Amino, usw.
Die Maleinimid-Verbindung kann leicht erhalten werden, wie beispielsweise mit Hilfe der folgenden Methode.
Das Polypeptid, das vorstehend beschrieben wurde, ein zweiwertiges Vernetzungsmittel, einschließlich eine Verbindung mit einer Maleinimido-Gruppe an dem einen Ende und einer mit einer Amino-Gruppe reaktionsfähigen Gruppe an dem anderen Ende wird in einer Menge von 1 bis 100 und bevorzugt 1 bis 50 und mehr bevorzugt 1,2 bis 10 Mol pro Mol der N-terminalen Amino-Gruppe des Polypeptids und wahlweise ein Reaktionsbeschleuniger in einer Menge von 2 bis 5 Mol pro Mol der Amino-Gruppe bei 4° bis 37°C für 0,2 bis 10 Stunden in einer geeigneten Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 9 oder einem geeigneten organischen Lösemittel umgesetzt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit Hilfe einer geeigneten Säulenchromatographie gereinigt, wodurch die Maleinimido-Verbindung erhalten werden kann.
Das zweiwertige Vernetzungsmittel, das in der vorgenannten Reaktion zur Anwendung gelangt, ist nicht speziell beschränkt, so lange es die Maleinimid-Gruppe in das N-Ende des Polypeptids einführen kann. Beispiele dafür sind vernetzende Mittel, die eine Maleinimid-Gruppe und eine Succinimid-Gruppe haben. Speziellere Beispiele sind Succinimidyl-N-4-maleinimidobutyrat, Succinimidyl-N-6-maleinimidocaproylat, Succinimidyl-N-8-maleinimidocaprylat, Succinimidyl-N-11-maleinimidoundecanoat, Succinimidyl-N-4-(2-maleinimidoethoxy)-succinylat, Sulfosuccinimidyl-N-4-maleinimidobutyrat, Sulfosuccinimidyl-N-6-maleinimidocaproylat, Sulfosuccinimidyl-N-8-maleinimidocaprylat, Succinimidyl-N-11-maleinimidoundecanoat, Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan- 1-carboxylat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, Succinimidyl-m-maleinimidobenzoat, Sulfosuccinimidyl-m-maleinimidobenzoat, Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat, usw.
Als der Reaktionsbeschleuniger können Basen exemplifiziert werden, wie beispielsweise Triethylamin, Pyridin, usw.
Als die Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 9, die als ein Lösemittel für die Reaktion verwendet wird, kann Phosphatpuffer exemplifiziert werden, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, Good's Puffer (z.B. N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin (Bicine)-Puffer, 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES)-Puffer, 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)-Puffer, usw.). Das organische Lösemittel schließt beispielsweise Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) ein.
Die zum Reinigen der Maleinimid-Verbindung nach Beendigung der Reaktion angewendete Chromatographie schließt beispielsweise die Gel-Säulenchromatographie ein, Silicagel-Säulenchromatographie und Octadecyl-Silicagel (ODS)-Säulenflüssigchromatographie.
Das organische Lösemittel ist vorzugsweise ein Lösemittel für die Reaktion. Der Grund dafür ist, dass die Zersetzung der Maleinimid-Gruppe leichter in dem organischen Lösemittel erfolgt, so dass die Maleinimid-Verbindung in hoher Ausbeute erhalten werden kann.
Die Reinigung wird mit Hilfe der ODS-Säulenflüssigchromatographie ausgeführt, weil das überschüssige zweiwertige Vernetzungsmittel und die Maleinimid-Verbindung voneinander sicherer getrennt werden können.
Die auf diese Weise entsprechend der vorstehenden Beschreibung erhaltene Maleinimid-Verbindung lässt sich durch Behandlung stabil aufbewahren, wie beispielsweise Einengen bis zur Trockene, Gefriertrocknen, usw., womit sie als ein Intermediat für das Anheften des Polypeptids entsprechend der vorstehenden Beschreibung an der geeigneten Affinitätssubstanz, wie beispielsweise ein Antikörper, sehr nützlich.
Eine Methode zum Vereinigen der Maleinimid-Verbindung und der Affinitätssubstanz, um das kombinierte Produkt des Polypeptids entsprechend der vorstehenden Beschreibung zu erhalten läuft beispielsweise wie folgt ab:
Die Maleinimid-Verbindung wird umgesetzt mit der SH-Gruppe eines Antikörpers Fab', hergestellt mit Hilfe einer konventionellen Methode bei 4° bis 37°C für 1 bis 16 Stunden in einer Lösung, die dem Antikörper nicht seine Eigenschaften entzieht (z.B. eine Pufferlösung, die normalerweise auf dem Gebiet des Immunoassays verwendet wird), wodurch das kombinierte Produkt des Polypeptids entsprechend der vorstehenden Beschreibung und der Affinitätssubstanz (Antikörper) hergestellt werden kann.
Als eine Methode zum Verknüpfen der Amino-Gruppe des vorstehend beschriebenen Polypeptids mit der Amino-Gruppe der Affinitätssubstanz kann eine konventionelle Methode mit Glutaraldehyd exemplifiziert werden. Als eine Methode zum Verknüpfen der Amino-Gruppe des Polypeptids mit der Zuckerkette der Affinitätssubstanz, kann eine konventionelle Methode mit Periodsäure exemplifiziert werden, die das Behandeln der Zuckerkette mit Periodsäure unter Erzeugung einer Aldehyd-Gruppe umfasst und das Verknüpfen der Aldehyd-Gruppe mit der Amino-Gruppe des Polypeptids.
Obgleich das Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben wurde, in die Affinitätssubstanz unter Nutzung der reaktionsfähigen Gruppe in der Seitenkette des Polypeptids eingeführt werden kann, wird es bevorzugt daran gebunden (oder darin eingeführt), indem dessen N-terminale Amino-Gruppe genutzt wird.
Der Grund dafür ist der Folgende. Da die N-terminale Amino-Gruppe in der Regel eine einzelne ist, führt die Anbringung der Affinitätssubstanz unter Verwendung der N-terminalen Amino-Gruppe zu einer Vereinigung des Polypeptids und der Affinitätssubstanz in einem Molverhältnis von 1:1. Wenn daher ein zu messender Analyt unter Verwendung des resultierenden kombinierten Produktes abgetrennt wird, wird der Analyt als ein einzelnes Peak abgetrennt, so dass die Genauigkeit einer gewünschten Messung weiter erhöht werden kann. Die Maleinimid-Verbindung ist eine nützliche Substanz zum Herstellen eines solchen kombinierten Produktes.
Wenn das kombinierte Produkt hergestellt wird unter Nutzung der N-terminalen Amino-Gruppe, geschieht dies bevorzugt so, dass kein von einer starken Säure derivierter Säurerest in den N-terminalen Aminosäure-Rest des Polypeptids eingeführt wird. Der Grund dafür ist die Ausbeute des gewünschten kombinierten Produkts, die höher ist, wenn das Polypeptid, das über keinen in den N-terminalen Aminosäure-Rest eingeführten Säurerest verfügt, kombiniert ist mit der Affinitätssubstanz.
Ein Verfahren zum Messen einer Lebendkörperkomponente unter Verwendung des kombinierten Produktes (nachfolgend abgekürzt als "der Messprozess der vorliegenden Erfindung") ist nicht speziell beschränkt, so lange der Prozess die Ausführung einer gewünschten Messung unter Anwendung des kombinierten Produktes möglich macht. Spezielle Beispiele dafür sind die folgenden Prozesse:
(1) Ein Prozess zum Messen der Menge eines zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, bei dem eine nicht-kompetitive Reaktion genutzt wird (Messprozess (1))
Erstens wird eine von einem Lebendkörper abgenommene Probe, die einen zu messenden Analyten enthält, eine Affinitätssubstanz, die mit einer detektierbaren Substanz markiert ist (nachfolgend abgekürzt als "markierte Affinitätssubstanz") und das kombinierte Produkt (die Bindungsstellen für die markierte Affinitätssubstanz bzw. das kombinierte Produkt in dem Analyten sind verschieden) durch Mischen umgesetzt und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung, um einen Komplex durch Verbinden des Analyten, der markierten Affinitätssubstanz und des kombinierten Produkts zu erzeugen. Anschließend wird der Komplex von der freien markierten Affinitätssubstanz mit Hilfe einer Methode unter Aufbringung einer negativen Ladung abgetrennt, beispielsweise eine Maschine oder ein Instrument, die über Anionenaustauschwirkung verfügen, einschließlich ein HPLC-Apparat, der ausgestattet ist mit einer Säule, die mit einem Packungsmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Anschließend wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex enthalten ist, mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, indem Proben verwendet werden, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, und eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex darstellt. Unter Anwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem Komplex entspricht, bestimmt, wodurch die Menge des Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorgenannten Reaktion werden die Konzentrationen der markierten Affinitätssubstanz und des kombinierten Produktes, die zur Erzeugung des Komplexes verwendet werden, in Abhängigkeit von einem Wert variiert, bei dem die Grenze der Messung des Analyten in der Probe eingesetzt ist. Gewöhnlich liegen die markierte Affinitätssubstanz und das kombinierte Produkt in der Reaktionslösung in Konzentrationen vor, die nicht kleiner sind als die Konzentration, bei der sie an dem gesamten Analyten einer Konzentration binden können die der Messgrenze entspricht, vorzugsweise das 2-fache oder mehr und mehr bevorzugt das 5-fache oder mehr und am meisten bevorzugt das 10-fache oder mehr der Konzentration.
Wenn der Analyt selbst eine Substanz ist, die mit irgendeiner Methode gemessen oder detektiert werden kann, kann die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise gemessen werden, indem die vorgenannte Reaktion ohne die markierte Affinitätssubstanz ausgeführt und die Menge des Analyten in dem resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften des Analyten geeignet ist.
(2) Ein Prozess zum Messen der Menge eines in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, bei dem eine kompetitive Reaktion genutzt wird (Messprozess (2))
Erstens, werden eine Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird und einen zu messenden Analyten enthält, ein mit einer detektierbaren Substanz markierter Analyt (nachfolgend abgekürzt als "markierter Analyt") und das kombinierte Produkt umgesetzt durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung, um einen Komplex des Analyten und des kombinierten Produktes und einen Komplex des markierten Analyten und des kombinierten Produktes (nachfolgend abgekürzt als "markierter Komplex") zu erzeugen. Anschließend wird der markierte Komplex von dem freien markierten Analyten mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung abgetrennt, beispielsweise eine Maschine oder Instrument, die über Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packungsmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Anschließend wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem markierten Komplex enthalten ist und auf diese Weise abgetrennt wurde, mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Separat davon wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, indem Proben verwendet werden, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, womit eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz in dem markierten Komplex darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem markierten Komplex entspricht, bestimmt, wodurch die Menge des Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorgenannten Reaktion sind die Konzentrationen des kombinierten Produkts und des markierten Analyten, die für die Erzeugung des markierten Komplexes verwendet werden, nicht speziell beschränkt und können in geeig neter Weise in Abhängigkeit von den Werten festgelegt werden, bei denen die Messgrenze des Analyten bzw. die Messempfindlichkeit für den Analyten eingestellt sind. Die Konzentration des verwendeten markierten Analyten sollte jedoch nicht kleiner sein als die Konzentration, bei der der markierte Analyt an dem gesamten kombinierten Produkt binden kann, das in der Reaktionslösung vorhanden ist.
(3) Ein Messprozess, worin die in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, zwei oder mehrere Substanzen mit der gleichen Wirkung sind und mit den gleichen detektierbaren chemischen Merkmalen (Messprozess (3))
Erstens, werden eine Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird und zu messende Analyten enthält, umgesetzt mit einer Substanz, die spezifisch an mindestens einem der Analyten bindet, die jedoch mindestens nicht an einem der anderen Analyten bindet und die daran das Polypeptid entsprechend der vorstehenden Beschreibung gebunden hat (oder darin eingeführt hat) (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt A"), und zwar durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung. Damit wird ein Komplex von spezifischem Analyten) in der Probe und das kombinierte Produkt A erzeugt. Sodann wird der Komplex von dem/den freien Analyten mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung beispielsweise einer Maschine oder einem Instrument abgetrennt, die über Ionenaustauschwirkung verfügen, einschließlich einen HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, einer Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach wird die Menge des/der Analyten, die in dem abgetrennten Komplex enthalten ist, oder die Menge an freiem/freien Analyten oder Beide mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der Analyten geeignet ist. Davon separat wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, womit eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und dem Messwert der tatsächlich erhaltenen Eigenschaften des Analyten in dem Komplex darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die dem gemessenen Wert entspricht, bestimmt, wodurch die Menge jedes beliebigen Analyten in der Probe gemessen werden kann.
In der vorgenannten Reaktion ist die Konzentration des kombinierten Produkts A, die für die Erzeugung des Komplexes verwendet wird, nicht speziell beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Werten festgelegt werden, bei denen die Messgrenze des Analyten bzw. die Messempfindlichkeit für den Analyten festgesetzt sind.
(4) Ein Messprozess, worin die in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, zwei oder mehrere Substanzen sind, die über die gleiche Wirkung verfügen oder unterschiedliche Wirkungen trotz ihrer ähnlichen Strukturen haben (Messprozess (4))
Erstens, wird eine von einem Lebendkörper abgenommene Proben, die zu messende Analyten enthält, umgesetzt mit einer Substanz, die über Affinität zu all den Analyten verfügt (nachfolgend abgekürzt als "Affinitätssubstanz A"), die mit einer detektierbaren Substanz markiert worden sind (nachfolgend abgekürzt als "markierte Aftinitätssubstanz A") und mit einer Substanz umgesetzt, die über Affinität zu mindestens einem unter den Analyten speziellen Analyten verfügt und das vorstehend beschriebene Polypeptid darin eingeführt hat (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt B"), und zwar durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung. Auf diese Weise werden ein Komplex von Analyt(en) und der markierten Affinitätssubstanz A (nachfolgend abgekürzt als "Komplex A") und ein Komplex des/der spezifischen Analyten, der markierten Aftinitätssubstanz A und des kombinierten Produktes B erzeugt (nachfolgend abgekürzt als "Komplex B"). Sodann werden der Komplex A, der Komplex B und die freie Affinitätssubstanz A voneinander mit Hilfe einer Methode zum Aufbringen einer negativen Ladung voneinander getrennt, beispielsweise eine Maschine oder ein Instrument, das über Anionenaustauschwirkung verfügt, einschließlich ein Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packungsmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Danach werden die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex A enthalten ist, oder die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex B enthalten ist oder Beide mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Davon separat wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, wodurch eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex A enthalten ist, und/oder der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex B enthalten ist, erhalten. Unter Verwendung der Eichkurve kann die Menge des Analyten, der der Menge der detektierbaren Substanz in dem/den Komplexen) entspricht, bestimmt werden, wodurch die Menge jedes beliebigen Analyten in der Probe gemessen werden kann.
Wenn die Affinitätssubstanz A selbst mit Hilfe irgendeiner Methode messbar oder detektierbar ist, kann die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise durch Ausführung der vorgenannten Reaktion gemessen werden, indem die Affinitätssubstanz A nicht markiert mit der detektierbaren Substanz verwendet und die Menge der Affinitätssubstanz A in dem resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften der Affinitätssubstanz A geeignet ist.
(5) Ein Messprozess, worin die in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, zwei Substanzen sind, die über die gleiche Wirkung verfügen oder unterschiedliche Wirkungen trotz ihrer ähnlichen Strukturen haben (Messprozess (5))
Erstens, wird eine von einem Lebendkörper abgenommene Probe, die zu messende Analyten enthält, umgesetzt mit einer markierten Affinitätssubstanz A, einer Substanz, die über Affinität zum Analyten 1 in der Probe verfügt und darin ein Polypeptid 1, wie es vorstehend beschrieben wurde, eingeführt aufweist (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt C") und eine Substanz umgesetzt, die über Affinität zum Analyten 2 in der Probe verfügt und darin ein Polypeptid 2, wie es vorstehend beschrieben wurde, eingeführt aufweist (die Substanz wird nachfolgend abgekürzt als "kombiniertes Produkt D"), und zwar durch Mischen und nach Erfordernis in einer geeigneten Pufferlösung. Dadurch werden ein Komplex des Analyten 1, das kombinierte Produkt C und die markierte Affinitätssubstanz A (nachfolgend abgekürzt als "Komplex C") und ein Komplex des Analyten 2, das kombinierte Produkt D und die markierte Affinitätssubstanz A (nachfolgend abgekürzt als "Komplex D") erzeugt. Sodann werden der Komplex C, der Komplex D und die freie markierte Affinitätssubstanz A voneinander auf der Grundlage der Unterschiede in den Eigenschaften zwischen den Polypeptiden 1 und 2 mit Hilfe einer Methode zur Aufbringung einer negativen Ladung getrennt, beispielsweise eine Maschine oder ein Instrument, die über eine Anionenaustauschwirkung verfügen, einschließlich ein HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packungsmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Anschließend wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abge trennten Komplex C enthalten ist, oder die Menge der detektierbaren Substanz, die in dem abgetrennten Komplex D enthalten ist, oder Beide mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Davon separat wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, wodurch eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Analyten 1 (oder 2) und der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex C enthalten ist, und/oder der Menge der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex D enthalten ist, darstellt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem/den Komplexen) bestimmt, wodurch die Menge beider Analyten in der Probe gemessen werden kann.
Wenn die Aftinitätssubstanz A selbst mit irgendeiner Methode messbar oder detektierbar ist, kann die Menge des Analyten in der Probe in ähnlicher Weise gemessen werden, indem die vorstehend erwähnte Reaktion unter Verwendung der Affinitätssubstanz A nicht markiert mit der detektierbaren Substanz verwendet wird und die Menge der Affinitätssubstanz A in dem resultierenden Komplex mit Hilfe einer Methode gemessen wird, die für die Eigenschaften der Affinitätssubstanz A geeignet ist.
(6) Ein Messprozess, worin die in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, zwei oder mehrere Formen von Glykoproteinen sind, die in ihrer Zuckerkettenstruktur unterschiedlich sind und jedoch weitgehend die gleiche Proteinstruktur haben (Messprozess (6))
Erstens, wird eine von einem Lebendkörper abgenommene Probe, die zwei oder mehrere Formen von zu messenden Glykoproteinen enthält, umgesetzt mit einem Lectin, das zum Erkennen der Zuckerkettenstruktur von mindestens einem dieser zu messenden Glykoprotein-Analyten in der Lage ist, und mit einem kombinierten Produkt des Polypeptids, wie es vorstehend beschrieben wurde, und eines Antikörpers, das über eine Eigenschaft zum Binden an allen Glykoprotein-Analyten hat, jedoch vom Binden an Glykoprotein-Analyten) abgehalten wird, die das darin eingeführte Lektin haben (das kombinierte Produkt wird nachfolgend abgekürzt als "Polypeptid-kombinierter Antikörper"), sowie ein Antikörper, der an all den Glykoprotein-Analyten binden kann, einschließlich der/die Glykoprotein-Analyt(en), der darin das eingeführte Lektin aufweist und darin eingeführt eine detektierbare Substanz aufweist (dieser Antikörper wird nachfolgend abgekürzt als "markierter Antiglykoprotein-Antikörper"). Auf diese Weise werden ein Komplex von Glykoprotein(en) erzeugt, das Lektin und der markierte Antiglykoprotein-Antikörper und ein Komplex von Glykoprotein(en), der Polypeptid-kombinierte Antikörper und der markierte Antiglykoprotein-Antikörper. Sodann werden diese Komplexe von dem freien markierten Antiglykoprotein-Antikörper mit Hilfe einer Methode der Aufbringung einer negativen Ladung getrennt, beispielsweise eine Maschine oder ein Instrument, die über eine Anionenaustauschwirkung verfügen, einschließlich ein HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packungsmaterial für Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, einer Anionenaustauschmembran oder ein Reaktionsrohr, das über Anionenaustauschwirkung verfügt. Anschließend wird die Menge der detektierbaren Substanz, die in jedem oder einem der abgetrennten Komplexe enthalten ist, mit Hilfe einer Messmethode bestimmt, die für die Eigenschaften der detektierbaren Substanz geeignet ist. Davon separat wird eine Messung in der gleichen Weise ausgeführt, wie sie vorstehend beschrieben wurde, beispielsweise unter Verwendung von Proben, die bekannte Konzentrationen des Glykoprotein-Analyten enthalten, wodurch eine Eichkurve erhalten wird, die die Beziehung zwischen der Menge des Glykoprotein-Analyten und der Menge der detektierbaren Substanz, die in jedem oder einem der Komplexe enthalten ist, zeigt. Unter Verwendung der Eichkurve wird die Menge des Glykoprotein-Analyten, die der Menge der detektierbaren Substanz in dem/den Komplexen) bestimmt, wodurch die Menge jedes beliebige Glykoprotein-Analyten in der Probe gemessen werden kann.
Wenn der Glykoprotein-Analyt selbst mit Hilfe irgendeiner Methode messbar (detektierbar) ist, kann die vorgenannte Messung selbstverständlich ohne den markierten Antiglykoprotein-Antikörper ausgeführt werden.
Ein Analyt in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, der mit Hilfe irgendeiner der Messprozesse (1) und (2) gemessen werden kann, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie er der folgenden Bedingung i) oder ii) genügt.

i) Es existiert eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit dem Analyten in Folge einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten bilden kann und die Substanz kann selbst mit irgendeiner Methode gemessen (detektiert) werden oder kann mit irgendeiner detektierbaren Substanz markiert werden.
ii) Der Analyt selbst kann mit irgendeiner detektierbaren Substanz markiert sein und es existiert eine Substanz, die einen stabilen markierten Komplex mit dem Analyten aufgrund einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten bilden kann.

Typische Beispiele für den Analyten sind Proteine, Peptide, Nucleinsäuren, Zuckerketten, Lipide, Hormone, Medikamente, usw., die in Proben enthalten sind, die von Lebendkörpern abgenommen werden, beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen, Lymphocyten, Hämocyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele des Analyten sind Tumormarker, wie beispielsweise α-Fetoprotein (AFP), CA19-9, prostataspezifisches Antigen (PSA), carcinoembryogenes Antigen (CEA), Substanzen, die über spezielle Zuckerketten verfügen und die von cancerogenen Zellen erzeugt werden und dergleichen; Serumproteine, wie beispielsweise Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin E (IgE), Immunoglobulin G (IgG), β₂-Mikroglobulin, Albumin, Ferritin und dergleichen; Peptide, wie beispielsweise C-Peptid, Angiotensin I, und dergleichen; Enzyme, wie beispielsweise Amylasen, alkalische Phosphatasen, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP) und dergleichen; antivirale Antikörper gegen klinisch bekannte Viren, wie beispielsweise Rubella-Virus, Herpesvirus, Hepatitis-Virus, ATL-Virus, AIDS-Virus und dergleichen; Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA) von Pathogenen, wie beispielsweise Viren und dergleichen, oder einsträngige Polynucleotide, die die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren aufbauen; antigene Substanzen, die von Pathogenen deriviert sind, wie beispielsweise Virus und dergleichen; Antikörper, die mit Allergenen reaktionsfähig sind, wie beispielsweise Pollen von Bäumen und Pflanzen (z.B. Cryptomeria), Hausstaub und dergleichen; Lipide, wie beispielsweise Lipoproteine und dergleichen; Proteasen, wie beispielsweise Trypsin, Plasmin, Serinprotease und dergleichen; Hormone, wie beispielsweise Insulin, Choriogonadotropin (hCG), Thyroxin (T4), Triiodthyronin (T3), Prolactin, Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und dergleichen; Medikamente, wie beispielsweise Digoxin, Phenytoin, Morphin, Nicotin und dergleichen; sowie Rezeptoren für Thyroid-stimulierendes Hormon, Acetylcholin, Glutaminsäure, usw.
Die Affinitätssubstanz für einen in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, die zum Herstellen der markierten Affinitätssubstanz in dem Messprozess (1) verwendet wird, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie einen stabilen Komplex mit dem Analyten in Folge einer hohen Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem Analyten bildet und nach Erfordernis die Affinitätssubstanz selbst mit Hilfe irgendeiner Methode gemessen oder detektiert oder mit irgendeiner messbaren oder detektierbaren Substanz markiert werden kann. Die Affinitätssubstanz schließt beispielsweise ein: Antikörper gegen Substanzen, die über Antigenwirkung verfügen, einschließlich Haptene; Antigene gegen Antikörper; Lektine, die über Affinität zu Zuckerketten verfügen, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin, Triticum vulgaris lectin, und dergleichen; Inhibitoren für spezielle Enzyme, wie beispielsweise α₁-Antitrypsin für Trypsin, α₂-Makroglobulin für Plasmin, α₂-Makroglobulin und α₁-Antichymotrypsin für Serinprotease und dergleichen; Polynucleotid-Ketten, die komplementär sind zu einsträngigen Polynucleotiden, bei denen es sich um Analyten handelt, die in Proben gemessen werden sollen, die von Lebendkörpern abgenommen werden; sowie Rezeptoren für Hormone.
Die Affinitätssubstanz für einen in einer Probe zu messenden Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, und die zum Herstellen des kombinierten Produktes in den Messprozessen (1) und (2) verwendet wird, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie einen stabilen Komplex mit dem Analyten oder markierten Analyten bildet oder einen Komplex des Analyten und der markierten Affinitätssubstanz in Folge einer hohen Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem Analyten oder dem markierten Analyten oder dem Komplex. Die Affinitätssubstanz schließt beispielsweise ein: Antikörper gegen Substanzen, die über Antigenwirkung verfügen, einschließlich Haptene; Antigene gegen Antikörper; Lektine, die über Zuckerketten verfügen, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium agglutinin, Triticum vulgaris lectin, und dergleichen; Inhibitoren für spezielle Enzyme, wie beispielsweise α₁-Antitrypsin für Trypsin, α₂-Makroglobulin für Plasmin, α₂-Makroglobulin für Serinprotease und dergleichen; sowie Polynucleotid-Ketten, die komplementär sind zu einsträngigen Polynucleotiden, bei denen es sich um in Proben zu messende Analyten handelt, die von Lebendkörper abgenommen werden (die Bindungsstelle für diese Substanzen unterscheidet sich von derjenigen für die Affinitätssubstanz, die zur Herstellung der markierten Affinitätssubstanz verwendet wird).
Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, die mit Hilfe des Messprozesses (3) gemessen werden können, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie von sich aus mit Hilfe irgendeiner Methode messbar oder detektierbar sind und es eine Substanz gibt, die einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten aufgrund einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem/den Analyten) bilden kann, sich jedoch nicht an mindestens einem der anderen Analyten bindet. Typische Beispiele der Analyten sind Enzyme und dergleichen, die in von Lebendkörpern abgenommenen Proben enthalten sind, beispielsweise: Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen; Lymphocyten, Hämocyten und verschiedene Zellen.
Speziellere Beispiele für die Analyten sind Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Creatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinase (PK), Tyrosinkinase, usw.
Die Affinitätssubstanz für den/die speziellen Analyten, der/die in einer Probe gemessen werden soll, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, die zum Herstellen des kombinierten Produktes A in dem Messprozess (3) verwendet wird, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie einen stabilen Komplex mit mindestens einem der zu messenden Analyten in der Probe anhand einer hohen Affinität zwischen der Affinitätssubstanz und dem/den Analyten erzeugen kann, nicht jedoch an mindestens einen der anderen Analyten bindet. In die Aftinitätssubstanz einbezogen sind beispielsweise Antikörper gegen spezielle Teilstrukturen oder antigene Determinanten der Substanzen, die über antigene Wirkung verfügen (einschließlich Haptene); Lektine, die über eine Affinität zu Zuckerketten mit einer speziellen Struktur verfügen, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, und dergleichen; sowie Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Creatinkinase (CK), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), usw.
Die Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, die mit Hilfe des Messprozesses (4) gemessen werden können, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) genügen.

i) Es existiert eine Substanz, die an allen Analyten in der Probe bindet und die selbst über eine mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft vertilgt oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann.
ii) Es existiert eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit mindestens einem der Analyten aufgrund einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem/den Analyten bilden kann, die jedoch nicht an mindestens einem der anderen Analyten bindet.

Typische Beispiele für die Analyten sind Enzyme, physiologisch wirksame Substanzen, tumorassoziierte Antigene, Substanzen mit einer Zuckerkette, usw., die in von Lebendkörpern abgenommenen Proben enthalten sind, beispielsweise Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen; Lymphocyten, Hämocyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele für die Analyten sind vorzugsweise Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen, Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, Human-Choriongonadotropin (hCG), Prolactin, Thyroidstimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; sowie tumorassoziiertes Antigen, wie beispielsweise prostataspezifisches Antigen (PSA), α₂-Makroglobulin, carcinoembryogenes Antigen (CES), α-Fetoprotein, usw.
Die Affinitätssubstanz für in einer Probe zu messende Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird und die zum Herstellen der markierten Affinitätssubstanz A in dem Messprozess (4) verwendet wird, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie an allen Analyten in der Probe binden kann und selbst über eine Eigenschaft verfügt, die mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbar ist oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. Spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz sind Antikörper gegen spezielle Teilstrukturen oder antigene Determinanten von Substanzen, die über antigene Wirkung verfügen, einschließlich Haptene; Lektine, die über Affinitäts-Zuckerketten verfügen, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.; sowie Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Creatinkinase (CK), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), usw.
Die Substanz, die über Affinität zu dem/den spezifischen Analyten verfügt, die in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden sollen und die zum Herstellen des kombinierten Produktes B in dem Messprozess (4) verwendet werden, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) oder iii) genügt.

i) Sie hemmt nicht die Reaktion zur Erzeugung eines Komplexes des/der Analyten und der freien markierten Affinitätssubstanz A und eine Reaktion zum detektieren einer detektierbaren Substanz (oder Affinitätssubstanz A) in dem Komplex.
ii) Sie verfügt über den/die speziellen Analyten in der Probe.
iii) Sofern die markierte Affinitätssubstanz A über eine darin eingeführte detektierbare Substanz verfügt, hat die Affinitätssubstanz für den/die spezifischen Analyten in der Probe eine Affinität für diese detektierbare Substanz.

Bevorzugt sind spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz für den/die speziellen Analyten in der Probe Antikörper und Lektine (z.B. Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.) (die bindende Stelle für diese Substanzen ist von derjenigen für die Affinitätssubstanz A verschieden), die über Affinität für den/die speziellen Analyten verfügen; sowie Antikörper und Lektine (z.B. Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.), die über eine Affinität zur Affinitätssubstanz A oder der detektierbaren Substanz verfügen.
Die Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe, die mit Hilfe des Messprozesses (5) gemessen werden können, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, sind so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) oder iii) genügen.

i) Es existiert eine Substanz, die an sämtlichen Analyten in der Probe bindet und die selbst über eine mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft verfügt oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann;
ii) es existiert eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit einem Analyten 1 in der Probe aufgrund einer hohen Affinität zwischen der Substanz und den Analyten 1 bilden kann, die jedoch nicht an einem Analyten 2 in der Probe bindet;
iii) es existiert eine Substanz, die einen stabilen Komplex mit dem Analyten 2 aufgrund einer hohen Affinität zwischen der Substanz und dem Analyten 2 bilden kann, die jedoch nicht an dem Analyten 1 bindet.

Typische Beispiele für die Analyten sind Enzyme, physiologisch wirksame Substanzen, tumorassoziierte Antigene, Substanzen mit einer Zuckerkette, usw., die in von Lebendkörpern abgenommenen Proben enthalten sind, beispielsweise Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Blut, Plasma, Urin und dergleichen; Lymphocyten, Hämocyten und verschiedene Zellen. Speziellere Beispiele für die Analyten sind vorzugsweise Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen, Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, Human-Choriongonadotropin (hCG), Prolactin, Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; sowie tumorassoziiertes Antigen, wie beispielsweise prostataspezifisches Antigen (PSA), α₂-Makroglobulin, carcinoernbryogenes Antigen (CES), α-Fetoprotein, usw.
Die Affinitätssubstanz für in einer Probe zu messende Analyten, die von einem Lebendkörper abgenommen wird und die zum Herstellen der markierten Affinitätssubstanz A in dem Messprozess (5) verwendet wird, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie an allen Analyten in der Probe binden kann und selbst über eine Eigenschaft verfügt, die mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbar ist oder mit einer detektierbaren Substanz markiert werden kann. Spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz sind Antikörper gegen spezielle Teilstrukturen oder antigene Determinanten von Substanzen, die über antigene Wirkung verfügen (einschließlich Haptene); Lektine mit Affinitäts-Zuckerketten, die eine spezielle Struktur haben, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Aleuria aurantia-Lektin, Ricinus communis-Lektin, Arachis hypogaea-Lektin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.; sowie Inhibitoren für Enzyme, wie beispielsweise Amylase, Creatinkinase (CK), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), usw.
Die Substanz, die über Affinität zu dem zu messenden speziellen Analyten 1 oder 2 in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe verfügt und die zum Herstellen des kombinierten Produktes C bzw. D in dem Messprozess (5) verwendet wird, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie sie den folgenden Bedingungen i) und ii) genügt.

i) Sie hemmt nicht die Reaktion zur Erzeugung eines Komplexes des Analyten 1 oder 2 und der freien markierten Affinitätssubstanz A und eine Reaktion zum detektieren einer detektierbaren Substanz (oder Affinitätssubstanz A) in dem Komplex.
ii) Sie verfügt über Affinität für den speziellen Analyten 1 oder 2.
Bevorzugte spezielle Beispiele für die Affinitätssubstanz für den speziellen Analyten 1 oder 2 sind folgende: Antikörper und Lektine (z.B. Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.) (die bindende Stelle für diese Substanzen ist von derjenigen für die Affinitätssubstanz A verschieden), die über Affinität für den speziellen Analyten 1 oder 2 verfügen; sowie Antikörper und Lektine (z.B. Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.), die über eine Affinität zur Affinitätssubstanz A oder der detektierbaren Substanz verfügen.

Das in dem Messprozess (6), der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, verwendete Lektin ist nicht speziell beschränkt, und es kann ein Lektin, das über eine Fähigkeit zur Erkennung einer objektiven Zuckerkettenstruktur in der Lage ist, in geeigneter Weise ausgewählt werden aus verschiedenen Lektinen, wie beispielsweise Concanavalin A, Lens culinaris lectin, Phaseolus vulgaris lectin, Datura stramonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.
Als die Antikörper, die zum Herstellen des Polypeptid-kombinierten Antikörpers bzw. des markierten Antiglykoprotein-Antikörpers in dem Messprozess (6) verwendet werden, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, können jeder der folgenden polyklonalen Antikörper und monoklonalen Antikörper so lange verwendet werden, wie sie über die vorstehend beschriebenen Eigenschaften verfügen: z.B. polyklonale Antikörper, die durch Immunisieren von Tieren hergestellt werden, wie beispielsweise Pferd, Rind, Schaf, Kaninchen, Ziege, Ratte, Maus, usw., und zwar mit einem/mehreren Analyten, die entsprechend einer konventionellen Methode gemessen werden, wie beispielsweise die Methode, die beschrieben wurde in Tadashi Matsuhashi et al., "Men-ekigaku Jikken Nyumon", 2. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER Ltd., 1981, usw.; sowie monoklonale Antikörper, die mit Hilfe von Hybridomas erzeugt werden, die unter Verschmelzen von Zellen von einer Tumorlinie von Maus mit Maus-Milzzellen erhalten wurden, die zuvor mit dem/den Analyten immunisiert wurden und nach der konventionellen Methode gemessen werden, d.h. die Methode der Zellverschmelzung von G. Kohler und C. Milstein (Nature, 256, 495, 1975). Diese polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper können einzeln oder in geeigneter Kombination von zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Als das Glykoprotein, das mit Hilfe des Messprozesses (6) abgetrennt und gemessen werden kann, der unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt wird, lässt sich jedes Glykoprotein ohne spezielle Einschränkung so lange exemplifizieren, wie es den folgenden Bedingungen genügt: es ist in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe enthalten, beispielsweise Körperflüssigkeit (z.B. Serum, Blut, Plasma oder Urin), Lymphocyt, Hämocyt oder beliebige verschiedene Zellen, wobei sie Formen haben können, die in der Zuckerkettenstruktur unterschiedlich sind, die jedoch weitgehend die gleiche Proteinstruktur haben; und es existiert ein Lektin, das zum Erkennen der speziellen Zuckerkettenstruktur von mindestens einer der Formen des Glykoproteins in der Lage ist, die gemessen werden sollen, sowie von einem Antikörper, von dem der Polypeptid-kombinierte Antikörper hergestellt werden kann. Bevorzugte Beispiele des Glykoproteins sind Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Glutamat-Oxaloacetat-Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Renin, Proteinkinasen, Tyrosinkinase, usw.; physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise Human-Choriongonadotropin (hCG), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), usw.; tumorassoziiertes Antigen, wie beispielsweise prostataspezifisches Antigen (PSA), α₂-Makroglobulin, carcinoembryogenes Antigen (CEA), α-Fetoprotein, usw.; sowie glykogene cancerogene Antigene, wie beispielsweise CA 19–9, CA 125, usw.
Die Konzentrationen der in dem Messprozess (6) nach einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagentien, werden nachfolgend erläutert.
Erstens, hängt die Konzentration des verwendeten Lektins von der Art des verwendeten Lektins ab, von den Eigenschaften der zu messenden Glykoprotein-Analyten, usw. Vorzugsweise liegt das Lektin gemeinsam mit den Glykoprotein-Analyten in einer Konzentration in der Regel von 10-fach oder mehr und bevorzugt 100-fach oder mehr und mehr bevorzugt 1.000-fach oder mehr und bis zur festgelegten Nachweis-Grenzkonzentration der Glykoprotein-Analyten.
Die Konzentration des Polypeptid kombinierten Antikörpers, d.h. ein kombiniertes Produkt, wie es in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz gelangt, hängt ab von einem Wert, bei dem die Nachweisgrenze der Glykoprotein-Analyten, die gemessen werden sollen, festgelegt wird. Die Konzentration wird vorzugsweise aufgrund des Unterschiedes zwischen dem Lektin und dem Polypeptid kombinierten Antikörper im Zusammenhang mit der Konstante für die Glykoprotein-Analyten ermittelt. Obgleich die Konzentration beispielsweise von der Art und den Eigenschaften der Glykoprotein-Analyten abhängig ist sowie von dem Lektin und den Eigenschaften des Polypeptid kombinierten Antikörpers, wird die Konzentration bevorzugt unter Nutzung beispielsweise der folgenden allgemeinen Formel ermittelt: Konzentration des Polypeptid kombinierten Antikörpers ≤ (Assoziationskonstante des Lektins)/(Assoziationskonstante des Polypeptid kombinierten Antikörpers) × (Konzentration des Lektins)
Die Assoziationskonstante in der vorgenannten allgemeinen Formel bezieht sich auf die Assoziationskonstante, die in der Gleichgewichtsreaktion erhalten wird, die mit Hilfe der Formel (1) entsprechend der nachfolgenden Beschreibung dargestellt und mit Hilfe der Gleichung (2) entsprechend der nachfolgenden Beschreibung berechnet wird: [A] + [B] ↔ [A·B] (1) Assoziationskonstante = [A·B] / ([A] × [B]) (2)worin sind:
[A] die Konzentration (M) des Lektins oder des Polypeptid kombinierten Antikörpers in einem Gleichgewichtszustand,
[B] die Konzentration (M) des/der zu messenden freien Glykoprotein-Analyten in Gleichgewichtszustand,
[A·B] die Konzentration (M) eines Komplexes des Lektins (oder des Polypeptid kombinierten Antikörpers) und des/der Glykoprotein-Analyten.
Spezieller beträgt beispielsweise, wenn die Assoziationskonstante des Lektins für die Glykoprotein-Analyten 1×10⁶ M^–1 beträgt und die Assoziationskonstante des Polypeptid kombinierten Antikörpers für die Glykoprotein-Analyten 1×10⁸ M^–1 beträgt, die Konzentration des Polypeptid kombinierten Antikörpers ein Hundertstel oder weniger und vorzugsweise ein Tausendstel oder weniger von der Lektinkonzentration. Obgleich die Konzentration des verwendeten Polypeptid kombinierten Antikörpers vorzugsweise nicht kleiner ist als die Konzentration, bei der der Polypeptid kombinierte Antikörper an den gesamten zu messenden Glykoprotein-Analyten einer Konzentration binden kann, die der vorgegebenen Nachweisgrenze entspricht, kleiner sein (beispielsweise etwa ein Zehntel) als die vorgenannte Konzentration.
Die Konzentration des verwendeten markierten Antiglykoprotein-Antikörper variiert in Abhängigkeit von der Konzentration, bei der die Nachweisgrenze der Glykoprotein-Analyten vorgegeben ist. Vorzugsweise stellt man die Konzentration des markierten Antiglykoprotein-Antikörpers in der Reaktionslösung auf eine Konzentration ein, die nicht kleiner ist als die Konzentration, bei der der markierte Antiglykoprotein-Antikörper an den gesamten Glykoprotein-Analyten in einer Konzentration binden kann, die der Nachweisgrenze entspricht, und vorzugsweise das 2-fache oder mehr und mehr bevorzugt das 5-fache oder mehr und am meisten bevorzugt das 10-fache oder mehr von dieser Konzentration.
Bei der praktischen Ausführung irgendeines der Messprozesse (1) bis (6), die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung entwickelt werden, kann jede beliebige der folgenden Methoden zum Aufbringen einer negativen Ladung anstelle der vorgenannten HPLC zum Trennen des/der Komplexes/Komplexe von der freien Affinitätssubstanz und einschließlich der freien markierten Affinitätssubstanz, des/der Analyten, die gemessen werden sollen, einschließlich des/der markierten Analyten eingesetzt werden, z.B.: Methoden zur elektrischen Trennung von Substanzen auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen elektrischen Aufladung, die auf dem Gebiet gewöhnlich zum Einsatz gelangt, beispielsweise eine elektrokinetische Trennung ohne Verwendung eines Trägers zur Trennung (JP-B-7-111 398), die Elektrophorese unter Verwendung eines Trägers für die Trennung, die Kapillarelektrophorese, eine Methode, die das Beschleunigen der Nucleinsäure-Hybridisierung umfasst, Antigen-Antikörper-Reaktion oder dergleichen, indem die unterschiedliche elektrische Aufladung zum Einsatz gelangt, und anschließend Abtrennen der freien Polynucleotidkette, des freien Antikörpers oder dergleichen (Internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/12808). In der Elektrophorese kann unter Verwendung eines Trägers für die Trennung unter anderen dieser Methoden jeder beliebige Träger ohne spezielle Einschränkung verwendet werden, so lange es sich um einen Träger handelt, der üblicherweise auf dem Gebiet zum Einsatz gelangt, beispielsweise Filterpapier, Gel (z.B. Agar-Gel, Agarose-Gel, Polyarylamid-Gel oder Stärke-Gel) oder eine Celluloseacetat-Membran.
Die detektierbare Substanz, die zum Markieren der Aftinitätssubstanz oder des Analyten in dem Messprozess nach den hierin beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, schließt beispielsweise ein: Enzyme, wie beispielsweise alkalische Phosphatasen; β-Galactosidase, Peroxidase, Mikroperoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Acetylcholinesterase, Maleat-Dehydrogenase, Luciferase, usw., die beispielsweise verwendet werden im Enzymimmunoassay (EIA); Radioisotope, wie beispielsweise ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, usw., die beispielsweise verwendet werden können im Radioimmunoassay (RIA); Substanzen, die Fluoreszens emittieren können, wie beispielsweise Fluorescein, Dansyl-Rest, Fluorescamin, Cumarin, Naphthylamin, Derivate davon, usw., die beispielsweise verwendet werden können im Fluoroimmunoassay (FIA); Lumineszens-Substanzen, wie beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol, Bis(2,4,6-Trifluorphenyl)oxalat, usw.; Substanzen, die ultraviolettes Licht absorbieren können, wie beispielsweise Phenol, Naphthol, Anthracen, Derivate davon, usw.; sowie Substanzen, die über Eigenschaften als Spin-Marker verfügen, die durch Verbindungen dargestellt werden, die eine Oxyl-Gruppe haben, wie beispielsweise 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl, 2,6-Di-tert-butyl-α-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxy, usw. Es muss nicht darauf hingewiesen werden, dass die detektierbare Substanz nicht auf diese Substanzen beschränkt ist.
Als eine Methode zum Markieren der Affinitätssubstanz mit der vorstehend exemplifizierten detektierbaren Substanz können alle konventionelle Methoden zum Markieren exemplifiziert werden, die im Allgemein zum Einsatz gelangen, z.B. in den konventionellen EIA, RIA und FIA (z.B. Yuichi Yamamura, "Ikagaku Jikken Koza", Bd. 8, 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971, Akira Kawan, "Zusetsu Keikokotai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983; und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai und Kiyoshi Miyai, "Koso Men-eki Sokuteiho", 2. Ausg., IGAKU-SHOIN Ltd., 1982). Das Markieren kann entsprechend diesen Methoden ausgeführt werden. Es muss nicht erwähnt werden, dass eine konventionelle Methode unter Nutzung der Reaktion von Avidin (oder Streptoavidin) mit Biotin als eine Methode zum Markieren zum Einsatz gelangen kann.
Als die Affinitätssubstanz an sich, die mit Hilfe irgendeiner Methode gemessen oder detektiert werden kann, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können die folgenden Substanzen exemplifiziert werden, die von sich aus über die vorgenannte Eigenschaft als die detektierbare Substanz verfügen: z.B. Enzyme, Substanzen, die Fluoreszens emittieren können, Lumineszens-Substanzen, Substanzen, die ultraviolettes Licht absorbieren können, usw.
In dem Messprozess der vorliegenden Erfindung kann die Elutionszeit des Komplexes durch Wahl der Art des Polypeptids entsprechend der Beschreibung hierin frei kontrolliert werden (die Art und Zahl der eingeführten Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, die Art der aufbauenden Aminosäure-Reste, usw.). Nutzt man daher den Vorteil dieses Merkmals des Prozesses, lässt sich das Trennen und Messen der zu messenden Analyten erzielen.
Das bedeutet, die gleichzeitige Messung (Trennung und Messung) einer Vielzahl von zu messenden Analyten wird dann möglich, wenn es zwei oder mehr Polypeptide gibt, wie vorstehend beschrieben wurde, die in der Zahl der Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, bzw. die Art der Affinitätssubstanzen in geeigneter Weise ausgewählt wird, in die die Polypeptide eingeführt sind.
Selbst wenn eine Probe, die eine Vielzahl von Serumkomponenten enthält, die die Messung beeinflussen, ist das Größermachen der Ionenstärke des Komplexes als die der Serumkomponenten unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Polypeptids effektiv, um einen Einfluss auf die Messung zu vermeiden, der durch die Serumkomponenten ausgeübt wird. In diesem Fall lässt sich die für die Analyse benötigte Zeit verringern, indem ein stufenweiser Gradient eingesetzt wird.
Da außerdem ein Material für die Chromatographie (z.B. Gelmaterial, Mebranmaterial, Glasmaterial, usw.), das in einer Anionenaustauschmethode verwendet wird, in der Regel über eine hohe Austauschkapazität verfügt (absolute Adsorptionskapazität für ionische Substanz), kann die Gesamtheit des Komplexes, an dem das kombinierte Produkt gebunden ist, auf dem Träger selbst in der Analyse einer Probe adsorbiert werden, die eine große absolute Menge an ionogenen Substanzen zusammen mit den zu messenden Analyten enthält, wie beispielsweise eine von einem Lebendkörper abgenommene Probe, z.B. Serum. Daher lässt sich der Komplex an einer Stelle eluieren, an der der Einfluss der zusammen mit den Analyten vorhandenen Substanzen weitgehend vermieden werden kann. Da das in dem Messprozess der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid außerdem über eine hohe Löslichkeit in Wasser verfügt, ist die Wasserlöslichkeit des Komplexes, an dem das Polypeptid gebunden ist, großer als vor dem Binden. Daher tritt in dem Messprozess der vorliegenden Erfindung eine Denaturation und Desaktivierung der zu messenden Analyten während der Bildung des Komplexes, der darin eine die Trennung verbessernde Substanz aufweist (das Polypeptid), kaum auf.
Als das Material, das in einer Anionenaustauschmethode zum Abtrennen einer Zielsubstanz von anderen zusammen damit vorhandenen Substanzen unter Nutzung der anionischen Eigenschaften des vorstehend beschriebenen Polypeptids verwendet wird, kann jedes beliebige Material ohne spezielle Einschränkung exemplifiziert werden so lange es eine Anionenaustauschkapazität hat. In den Träger einbezogen sind beispielsweise Träger, die eine Anionenaustauschgruppe haben, wie beispielsweise eine Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppe, eine quaternäre Ammonium-Gruppe (z.B. Q-Gruppe, QAE-Gruppe, usw.) oder dergleichen. Speziellere Beispiele für das Material sind Packungen für die Anionenaustauschchromatographie, wie beispielsweise DEAE-MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung, Mitsubishi Kasei Corp.), QAE MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung, Mitsubishi Kasei Corp.), Wakobeads DEAE-Gel (eine Handelsbezeichnung, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) usw.; sowie Materialien unter Verwendung einer Membran, wie beispielsweise MemSep DEAE (eine Handelsbezeichnung, Japan Millipore Ltd.). Es muss nicht erwähnt werden, dass kommerziell verfügbare Materialien für die Chromatographie verwendet werden können und Materialien selbst hergestellt werden können, indem die vorstehend exemplifizierte Anionenaustauschgruppe an der Oberfläche eines Behälters aus Kunstharz oder Glas mit Hilfe einer konventionellen Methode angebracht wird.
Das Verfahren zum Messen einer Lebendkörperkomponente unter Verwendung des kombinierten Produktes entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dann besonders hervorragend geeignet, wenn ein Anionenaustauscher zum Einsatz gelangt.
Beispielsweise sollte zum Ausführen des Messprozesses für eine Lebendkörperkomponente unter Einsatz einer Methode der Gelfiltration eine Säule mit geeigneter Länge verwendet werden. Deshalb ist der Einsatz einer Methode der Gelfiltration insofern von Nachteil, dass sie zu einer längeren Trennzeit führt, als das bei Einsatz eines Ionenaustauschers der Fall ist. Wenn daher eine Verringerung der Trennzeit erforderlich ist, wird vorzugsweise eine Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers eingesetzt, wie beispielsweise ein HPLC-Apparat, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit einem Packmaterial für die Anionenaustauschchromatographie gepackt ist, eine Anionenaustauschmembran und ein Reaktionsrohr, das über eine Anionenaustauschwirkung verfügt. Außerdem sind die Methoden der Gelfiltration insofern von Nachteil, dass sie für das Trennen von zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe nicht geeignet sind, die über ein sehr hohes Molekulargewicht verfügen (Molekülgröße: etwa 1.000 Å oder darüber).
Eine hydrophobe Trennungsmethode ruft in einigen Fällen die folgenden Probleme hervor: Wenn die zu messenden Analyten in einer Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, physiologisch wirksame Substanzen sind, die eine Struktur höherer Ordnung haben, wie beispielsweise Proteine, so geht die Wirksamkeit des/der Analyten in dem Komplex aufgrund der Zerstörung der Struktur höherer Ordnung des/der Analyten durch das in der Trennung verwendete organische Lösemittel verloren.
Andererseits erlaubt die Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers eine wirksamere Trennung der zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe auf der Grundlage der gewissen Differenz in der Ionenstärke. Wenn darüber hinaus die Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers eingesetzt wird, kann das hierin vorstehend beschriebene Polypeptid aus Polypeptiden verschiedener Ionenstärke ausgewählt werden, so dass die zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe bei einem optimalen pH-Wert getrennt werden können. Da das Polypeptid darüber hinaus von sich aus eine höhere Wasserlöslichkeit hat, besteht zumeist keine Besorgnis, dass die Einführung des Polypeptids in die zu messenden Analyten in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe die Analyten ausfällen. Die Trennung lässt sich daher stabil ausführen.
Wenn die in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe zu messenden Analyten mit Hilfe des Messprozesses der vorliegenden Erfindung gemessen werden, lässt sich ein objektives Peak, das auf den/die Analyten zurückgeführt wird, zu einer Position verschieben, bei der es keinen Einfluss von Komponenten des Serums, Harnstoffes, usw. gibt. Darüber hinaus lässt sich auch der folgende Effekt erhalten: Da die Elutionspositionen von Komplexen, die unterschiedliche zu messende Analyten enthalten, gleich gemacht werden können, indem das kombinierte Produkt gewählt wird, das über geeignete Eigenschaften verfügt, was von den Analyten abhängt, können die verschiedenen Analyten unter Anwendung der Methode unter Verwendung eines Anionenaustauschers (z.B. HPLC) unter den gleichen Analysebedingungen gemessen werden.
In dem Messprozess nach der vorliegenden Erfindung wird die Menge der detektierbaren Substanz, der Affinitätssubstanz, der Affinitätssubstanz A oder des/der in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe zu messenden Analyten, der/die in dem Komplex enthalten ist/sind, oder der mit Hilfe der Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers abgetrennte Komplex mit Hilfe einer vorbestimmten Methode auf der Grundlage der Eigenschaft bestimmen, die mit Hilfe irgendeiner Methode der detektierbaren Substanz (die Affinitätssubstanz, die Affinitätssubstanz A oder der/die Analyten) detektierbar ist. Wenn es sich beispielsweise bei der Eigenschaft um eine Enzymaktivität handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der EIA ausgeführt, wie sie beispielsweise beschrieben wurde in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Sonderausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 51–63, KYORITSU-SHUPPAN, Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987. Wenn es sich bei der detektierbaren Substanz um ein Radioisotop handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der RIA ausgeführt, indem ein Messinstrument in geeigneter Weise gewählt und verwendet wird, wie beispielsweise ein GM-Zähler, Flüssigszintillationszähler, Well-Typ-Zähler, HPLC-Zähler oder dergleichen, was von der Art und der Intensität der von dem Radioisotop ausgesandten Strahlung abhängt (siehe beispielsweise Yuichi Yamamura, "Ikagaku Jikken Koza", Bd. 8, 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., 1971). Wenn es sich bei der Eigenschaft um eine Fluoreszens emittierende Eigenschaft handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode der FIA unter Verwendung eines Messinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Fluorometer, z.B. nach der Methode, die beschrieben wurde in Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., 1983. Wenn es sich bei der Eigenschaft um eine Lumineszens emittierende Eigenschaft handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Anwendung eines Messinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Photonenzählrohr, z.B. nach der Methode, die beschrieben wurde in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Sonderausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 252–263, KYORITSU-SHUPPAN, Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987. Wenn es sich bei der Eigenschaft um das Absorbieren von ultraviolettem Licht handelt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Anwendung eines Messinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem Spektrophotometer. Wenn es sich bei der detektier baren Substanz um eine Substanz handelt, die über Eigenschaften als Spinmarker verfügt, wird die Bestimmung nach einer konventionellen Methode unter Anwendung eines Elektronenspinresonanz-Apparates ausgeführt, z.B. nach der Methode, die beschrieben wurde in Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine Sonderausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 264–271, KYORITSU-SHUPPAN, Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987.
In dem Messverfahren nach der vorliegenden Erfindung sind die Reaktionsbedingungen zur Erzeugung eines Komplexes durch Umsetzen eines/mehrerer Analyten, die in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden sollten, mit dem kombinierten Produkt (einschließlich die kombinierten Produkte A, B, C und D, usw.) und gegebenenfalls der markierten oder unmarkierten Affinitätssubstanz (einschließlich die Affinitätssubstanz A), oder sind die Reaktionsbedingungen für die Erzeugung eines markierten Komplexes durch Umsetzen eines/mehrerer Analyten, die in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe gemessen werden sollen, mit dem markierten Analyten und dem kombinierten Produkt so lange nicht speziell beschränkt, wie sie nicht die Erzeugung des Komplexes hemmen (oder des markierten Komplexes). Die Reaktion kann unter Reaktionsbedingungen ausgeführt werden, wie sie zur Erzeugung eines Komplexes in einer konventionellen Methode eingesetzt werden, z.B. EIA, RIA, FIA oder Affinitätschromatographie. Wenn beispielsweise eine Pufferlösung in der Reaktion verwendet wird, können als der Puffer und die anderen Reagentien diejenigen verwendet werden, die in den vorgenannten konventionellen Methoden gewählt wurden. Obgleich der pH-Wert der Reaktion so lange nicht speziell beschränkt ist, wie er die Erzeugung des Komplexes nicht hemmt (oder des markierten Komplexes), beträgt er in der Regel 2 bis 10 und bevorzugt 5 bis 9. Obgleich die Temperatur bei der Reaktion ebenfalls nicht speziell beschränkt ist, so lange sie die Erzeugung des Komplexes (oder des markierten Komplexes) nicht hemmt, beträgt sie in der Regel 0° bis 50°C und bevorzugt 20° bis 40°C. Was die Reaktionsdauer betrifft, so kann die Reaktion, da die für die Erzeugung des Komplexes (oder des markierten Komplexes) erforderliche Zeit in Abhängigkeit von dem Reaktionsvermögen des/der Analyten mit dem kombinierten Produkt und der Affinitätssubstanz oder dergleichen oder mit dem kombinierten Produkt und dem markierten Analyten variiert, in geeigneter Weise über mehrere Sekunden bis zu mehreren Stunden ausgeführt werden, was von den Eigenschaften dieser Komponenten abhängt.
In der HPLC, die zur Ausführung des Messprozesses der vorliegenden Erfindung unter Anwendung eines Anionenaustauschers ausgeführt wird, kann jeder beliebige Apparat ohne irgendwelche speziellen Probleme so lange angewendet werden, wie er üblicherweise auf dem Analysegebiet eingesetzt wird und eine konstante Laufgeschwindigkeit hat. In dem Messprozess der vorliegenden Erfindung unter Anwendung der HPLC wird zur Bestimmung der Menge des/der Analyten die Peakfläche oder Peakhöhe verwendet.
Ein Lösemittel (ein Eluierungsmittel), das zum Trennen des Komplexes (oder des markierten Komplexes) von der freien Affinitätssubstanz, usw. mit Hilfe der Methode unter Anwendung eines Anionenaustauschers und spezieller unter Anwendung der HPLC getrennt wird, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie es weder den gebildeten Komplex (oder den gebildeten markierten Komplex) zu dem/den Analyten, der markierten Affinitätssubstanz, usw. zersetzt, noch die mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft von der Affinitätssubstanz, der detektierbaren Substanz, die in dem Komplex (oder dem markierten Komplex) enthalten ist, wegnimmt. Normalerweise wird als das Lösemittel bevorzugt jede beliebige Pufferlösung verwendet, die in konventionellen Methoden zur Anwendung gelangt, wie beispielsweise EIA, RIA FIA, Affinitätschromatographie, usw. Bevorzugte spezielle Beispiele für das Lösemittel sind Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 2 bis 10, die durch Auswahl der nachfolgend beschriebenen Materialien in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes (oder des markierten Komplexes), der freien markierten Affinitätssubstanz angesetzt wird, gefolgt von einer Zugabe und einem Mischen von beispielsweise: Puffern, wie beispielsweise Phosphate, Acetate, Citrate, Good's-Puffer, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, usw.; Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, usw.; polare organische Lösemittel, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran, usw.; sowie Tenside.
Eine zweckmäßige Zugabe eines geeigneten Tensids zu dem Eluierungsmittel erlaubt die Verhinderung der Schwanzbildung eines Peaks, der von dem Komplex kommt (oder dem markierten Komplex) und die freiere Einstellung der Elutionspositionen des Komplexes (oder des markierten Komplexes), der freien markierten Affinitätssubstanz und dergleichen. Das für diese Aufgaben verwendbare Tensid ist nicht speziell beschränkt und kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Komplexes (oder des markierten Komplexes), der freien markierten Affinitätssubstanz und dergleichen gewählt werden. Bevorzugte Beispiele für das Tensid sind Kationtenside, wie beispielsweise n-Dodecyltrimethylammoniumbromid, 1-Laurylpyrimidiumchlorid, usw.; sowie Amphotenside, wie beispielsweise Laurylbetain, Lauramid-propylbetain, Kokosnussfettsäure-Amidpropylbetain, 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolium-Betain, 2-Undecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolium-Betain, N- Lauroyl-N-methyl-β-alanin-Natrium, usw. Wenn das Tensid dem Eluierungsmittel für die vorgenannten Aufgaben zugesetzt wird, ist die Konzentration des zugesetzten Tensids nicht speziell beschränkt, so lange es die gewünschte Wirkung zustande bringt. Obgleich die Konzentration in Abhängigkeit von der Art des Tensides etwas variiert, wird sie zweckmäßig in der Regel im Bereich von 0,01 bis 2% und bevorzugt 0,05 bis 1 % gewählt.
In dem Messprozess der vorliegenden Erfindung wird als Messmethode nach der Trennung mit Hilfe der HPLC bevorzugt die Methode eingesetzt, die das Einführen eines Ablaufs aus einer HPLC-Säule in unveränderter Form in die Detektionssektion umfasst und das direkte Messen der Menge der detektierbaren Substanz (oder der Affinitätssubstanz oder des/der zu messenden Analyten), die in dem Komplex (oder dem markierten Komplex) in dem Ablauf enthalten sind und bei der es sich um eine Methode handelt, die beispielsweise beschrieben wurde in Shoji Hara und Akio Tsuji "Newest Liquid Chromatography", 1. Ausg., S. 92–104, NANZANDO Ltd., veröffentlicht am 1. Februar, 1978. Der Grund dafür besteht darin, dass diese Methode eine rasche Messung erlaubt. Wenn es sich in diesem Fall beispielsweise um die mit Hilfe irgendeiner Methode detektierbare Eigenschaft der Affinitätssubtanz (oder des/der Analyten) handelt oder die der detektierbaren Substanz in der markierten Affinitätssubstanz (oder dem/den markierten Analyten) sollte selbstverständlich eine Reaktionssektion der sogenannten Säule nachgeschalteten Methode, bei der ein Reagens zum Messen der Enzymaktivität dem Ablauf zu dessen Reaktion damit zugesetzt wird, zwischen der Säule der HPLC und der Detektionssektion vorgesehen werden. Als das Reagens zum Messen der Enzymaktivität, das in der Reaktionssektion verwendet wird, wenn es sich bei der Eigenschaft der detektierbaren Substanz (oder der Affinitätssubstanz oder dem/den Analyten) um die Enzymaktivität handelt, kann ein Reagens verwendet werden, das mit Hilfe einer konventionellen Methode hergestellt wird, beispielsweise einer Methode, die auf den Ausführungen von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", Sonderausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S. 51–63, KYORITSU-SHUPPAN, Ltd., veröffentlicht am 10. September, 1987, basiert. Alternativ kann ein Reagens eines kommerziell verfügbaren Satzes für die klinische Untersuchung gewählt und verwendet werden. Auch wenn die Eigenschaft der detektierbaren Substanz, der Affinitätssubstanz oder des/der Analyten eine andere als die Enzymaktivität ist, kann zwischen der Säule der HPLC und der Detektionssektion eine geeignete Reaktionssektion vorgesehen werden, um ein vorbestimmtes Reagens für die Aufgabe der Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit zuzusetzen und zur Reaktion zu bringen.
Wenn in der HPLC, die in dem Messprozess der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangt, eine Vielzahl in den Komponenten verschiedener Eluierungsmittel verwendet wird, kann die Elution entweder mit Hilfe der Methode des Konzentrationsgradienten (eine lineare Gradientenmethode) oder mit Hilfe einer schrittweisen Methode ausgeführt werden. Die schrittweise Methode ist jedoch bevorzugt, weil sie beispielsweise insofern von Vorteil ist, dass sie mit Hilfe leichter Arbeiten praktiziert werden kann, die tatsächliche Analysendauer herabgesetzt werden kann und einen scharfen objektiven Peak ergibt.
Ein Reagens zum Messen eines Analyten, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden könnte, weist ein kombiniertes Produkt des vorstehend beschriebenen Polypeptids auf und eine Substanz, die über Affinität zu dem Analyten oder einem kombinierten Produkt der Maleinimid-Verbindung und einer Substanz mit einer SH-Gruppe verfügt sowie über Affinität zu dem Analyten als die entscheidende Komponente. Nach Erfordernis kann das Reagens beispielsweise einen markierten Analyten enthalten, eine markierte Affinitätssubstanz, einen Puffer, ein Tensid, usw., und zwar zusätzlich zu dem kombinierten Produkt. Bevorzugte Eigenschaften und spezielle Beispiele für diese Komponenten sind vorstehend beschrieben worden.
Die vorliegende Erfindung wird eingehender unter Bezugnahme auf die "Beispiele" nachfolgend erläutert, die in keiner Weise einschränkend sind sondern zur Veranschaulichung gegeben werden und die außerdem die Herstellung von Polypeptiden und kombinierten Produkten veranschaulichen, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können.
Die in den "Beispielen" verwendeten Abkürzungen stehen für die Folgenden:
Ala: Alanin; βAla: β-Alanin; Ser: Serin; Tyr: Tyrosin; Asp: Asparaginsäure; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe; Alko: p-Alkoxybenzylalkohol; tBu: tert-Butyl-Gruppe; TFA: Trifluoressigsäure; BOP: Benzothiazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat; HOBt: 1-Hydroxy-1H-benzotriazol; DMF: N,N-Dimethylformamid; DIEA: N,N-Diisopropylethylamin.
Beispiel 1
Synthese von Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 3)
(1) Synthese von Fmoc-Ala-(Se)₅-βAla
Unter Verwendung von 2,3 g (1,5 mM als βAla) von Fmoc-βAla-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) als Ausgangsmaterial wurde Fmoc-Ala-(Ser)₅-βAla synthetisch mit Hilfe der Festphasenmethode nach der Methode (BOP/HOBt-Methode) hergestellt, die in der Fundstelle J. Org. Chem., 53, 617–624, (1988) beschrieben wurde.
Im Einzelnen wurde Fmoc-βAla-Alko-Harz zuerst mit Piperidin behandelt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Zu dem auf diese Weise behandelten Harz wurde eine DMF-Lösung zugesetzt, die eine vorbestimmte Aminosäure in einer Menge von 3 val pro val βAla auf dem Harz enthielt sowie BOP, HOBt und DIEA in Mengen von 3 val, 3 val bzw. 5,3 val pro val βAla auf dem Harz. Die vorbestimmte Aminosäure wurde durch Kopplungsreaktion (2 Mal) bei Raumtemperatur für 2 Stunden eingeführt. Aminosäuren wurden eine nach der anderen durch Wiederholen des vorgenannten Prozesses eingeführt. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Ser (tBu) (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (t-Bu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ala (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Nach der Einführung sämtlicher Aminosäuren wurde das Harz mit MeOH gewaschen, gefolgt von einem Zusatz von 20 ml eines TFA-Anisols (95:5) in gemischter Lösung, wonach die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt wurde, um das gewünschte Polypeptid von dem Harz zu lösen und die tBu-Gruppen (Schutzgruppen für die Hydroxyl-Gruppe von Ser) zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Ether zugesetzt, um die gewünschte Verbindung auszufällen. Der Niederschlag wurde aufgenommen und anschließend in einem Exsikkator getrocknet, um 0,84 g Fmoc-Ala-(Ser)₅-βAla zu erhalten.
(2) Synthese von Ala-(Ser(SO₃H₅-βAla (Polypeptid 3)
Es wurden in 40 ml DMF 547 mg (0,67 mM) des Fmoc-Ala-(Ser)₅-βAla aufgelöst, die in (1) synthetisch dargestellt wurden, gefolgt von einem Zusatz von 30 ml einer DMF·SO₃-Lösung dazu (eine Lösung von 2,57 g DMF·SO₃ (hergestellt von Fluka Chemika-Biochemica) in 30 ml einer gemischten Lösung von DMF-Pyridin (4:1), wonach die Reaktion über Nacht bei 4°C ausgeführt wurde. Zu der Reaktionslösung wurden 30 ml einer DMF·SO₃-Lösung zugesetzt und die resultierende Lösung über Nacht bei 4°C einer Reaktion unterworfen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung zu 400 ml Aceton gegeben und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen und in 40 ml DMF aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 8 ml Piperidin gegeben und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 40 min ausgeführt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Die Reaktionslösung wurde zu 500 ml Aceton gegeben und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen, mit Aceton und Ether gewaschen und anschließend, in einem Exsikkator getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen und anschließend einer Gelfiltration, um 210 mg Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 3) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionen-Chromatographie dieser gewünschten Verbindung.
Die Aminosäure-Analyse wurde mit Hilfe eines Wako PTC-Aminosäure-Analysesystems (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ausgeführt (gilt auch für das Nachfolgende).
Beispiel 2
Synthese von Ala-Tyr(SO₃H₃-βAla (Polypeptid 11)
Unter Verwendung von 0,77 g (0,5 mM) Fmoc-βAla-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden vorbestimmte Aminosäuren mit den gleichen Reagentien und mit Hilfe der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurde. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(SO₃Na) (hergestellt von Bachem Feinchemikalien AG), Fmoc-Tyr(SO₃Na), Fmoc-Tyr(SO₃Na), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit MeOH gewaschen, gefolgt von einem Zusatz von 50 ml einer gemischten Lösung DMF-Piperidin (4:1) dazu, wonach die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt wurde, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Das Lösemittel wurde durch Filtration entfernt, wonach das Harz mit MeOH gewaschen wurde und eine Mischung von TFA, H₂O und m-Kresol (45:5:2) zugesetzt wurde. Danach wurde unter einem Stickstoffgasstrom die Reaktion bei 4°C für 16 Stunden ausgeführt, um das gewünschte Polypeptid von dem Harz zu lösen. Das Harz wurde aus der Reaktionslösung durch Filtration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, wonach die gewünschte Verbindung mit Ether ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie unterworfen und anschließend einer Gelfiltration, um 180 mg Ala-Tyr(SO₃H)₃-βAla (Polypeptid 11) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt außerdem die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der gewünschten Verbindung.
Beispiel 3
Synthese von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14)
(1) Synthese von Fmoc-Ala-(Tyr)₅-βAla
Unter Verwendung von 2,3 g (1,5 mM) von Fmoc-βAla-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden vorbestimmte Aminosäuren mit den gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurden. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(tBu) (hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit MeOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe einer gemischten Lösung von TFA, Thioanisol und 1,2-Ethandiol (95:5:1) dazu und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt, um das Polypeptid von dem Harz zu lösen und die tBu-Gruppen (Schutzgruppen für die Hydroxyl-Gruppe von Tyr) zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Ether zugesetzt, um die gewünschte Verbindung auszufällen. Der Niederschlag wurde aufgenommen und anschließend in einem Exsikkator getrocknet, um 1,71 g Fmoc-Ala-(Tyr)₅-βAla zu erhalten.
(2) Synthese von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14)
Zu einer Mischung von 0,5 g des Fmoc-Ala-(Tyr)₅-βAla, das in (1) erhalten wurde, und 3 ml DMF wurden 15 ml einer DMF·SO₃-Lösung zugesetzt (eine Lösung von 3,2 g DMF·SO₃ in 15 ml DMF-Pyridin (4:1) als gemischte Lösung) und die Reaktion über Nacht bei 4°C ausgeführt, wonach zur Reaktionslösung Ether zugegeben wurde, um das Reaktionsprodukt auszufällen. Der Niederschlag wurde in 10 ml DMF aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 2,5 ml Piperidin, wonach die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt wurde. Zu der Reaktionslösung wurden 150 ml Ether gegeben und der gebildete Niederschlag durch Filtration aufgenommen. Der Niederschlag wurde in 4 ml Wasser aufgelöst und die gewünschte Verbindung mit Hilfe einer ODS-Säulen-Flüssigchromatographie (Säule: Wakosil ₁₀C₁₈ (2,0 Durchmesser × 25 cm) (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) abgetrennt; Elutionsbedingungen: 10 mM AcONa (pH 6,0), 2 bis 60% Acetonitril). Die so erhaltene Fraktion enthielt die gewünschte Verbindung und wurde mit Hilfe der Gelfiltration behandelt, um 203 mg Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt außerdem die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der gewünschten Verbindung.
Beispiel 4
Synthese von sulfatierten Polypeptiden (Polypeptide 1, 2, 4 bis 9, 18 und 20 bis 22)
Die Polypeptide 1, 2, 4 bis 9, 18 und 20 bis 22, die in Tabelle 1 angegeben sind, wurden synthetisch mit Hilfe der gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur dargestellt, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Das in Tabelle 1 angegebene Polypeptid 10 wurde mit den gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur synthetisch dargestellt, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurden.
Als Ausgangsmaterial zur synthetischen Darstellung des Polypeptids 6 wurde Fmoc-Ser(tBu)-O-Polymer (hergestellt von Kokusan Chemical Works, Ltd.) verwendet und Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 21 und 22 verwendet.
Tabelle 1 zeigt außerdem die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der auf diese Weise erhaltenen verschiedenen Polypeptide.
Beispiel 5
Synthese von sulfatierten Polypeptiden (Polypeptide 12, 13, 15 bis 17 und 19)
Die Polypeptide 12, 13, 15 bis 17 und 19, die in Tabelle 1 angegeben sind, wurden mit den gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur synthetisch dargestellt, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurde. Fmoc-βAla-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) wurde als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 12 und 16 verwendet und Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-Harz (100 bis 200 Mesh, hergestellt von Watanabe Chemical Industries, Ltd.) wurde als Ausgangsmaterial für die synthetische Darstellung der Polypeptide 13, 15, 17 und 19 verwendet.
Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der gewünschten Verbindungen.
Beispiel 6
Synthese von Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅βAla (Polypeptid 23)
Unter Verwendung von 780 mg (0,5 mM) von Fmoc-βAla-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden vorbestimmte Aminosäuren mit den gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurden. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(PO₃H₂) (hergestellt von Novabiochem Corp.), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Ala.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit MeOH gewaschen, gefolgt von einer Zugabe von 50 ml einer DMF-Piperidin (4:1) gemischten Lösung dazu und die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz durch Filtration aufgenommen und mit MeOH gewaschen und anschließend 20 ml einer gemischten Lösung von TFA, Phenol, H₂O, Thioanisol und Ethandiol (33:2:2:2:1) zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde einer Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde unterworfen, um das Polypeptid vom Harz zu lösen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Harz abfiltriert und Ether zu dem Filtrat zugesetzt, um die gewünschte Verbindung auszufällen. Der so erhaltene Niederschlag wurde einer Anionenaustauschchromatographie und anschließend einer Gelfiltration unterzogen, um 760 mg Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-βAla (Polypeptid 23) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der gewünschten Verbindungen.
Beispiel 7
Synthese von 4-Maleinimidobutyryl-Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-βAla Polypeptid 24
Unter Verwendung von 780 mg (0,5 mM) von Fmoc-βAla-Alko-Harz als Ausgangsmaterial wurden vorbestimmte Aminosäuren mit den gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur eingeführt, wie sie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurden. Die Reihenfolge der eingeführten Aminosäuren war folgende: Fmoc-Tyr(PO₃H₂) (hergestellt von Novabiochem Corp.), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Tyr(PO₃H₂), Fmoc-Ala, Maleinimidobutansäure.
Nach der Einführung aller Aminosäuren wurde das Harz mit MeOH gewaschen und mit einer gemischten Lösung von TFA-Anisol (95:5) behandelt, um das Polypeptid von dem Harz zu lösen. Das Harz wurde abfiltriert und dem Filtrat Ether zugegeben, um einen Niederschlag zu erzeugen. Der Niederschlag wurde einer ODS-Säulenflüssigchromatographie unterworfen (Säule: Wakosil ₅C₁₈ (2,0 Durchmesser × 25 cm) (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); Elutionsbedingungen: 0,1 % TFA, 0 → 10% Acetonitril) und anschließend eine Gelfiltration ausgeführt, um 820 mg 4-Maleinimidobutyryl-Ala-(Tyr(PO₃H₂))₅-βAla (Polypeptid 24) zu erhalten.
Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und der Ionenchromatographie der gewünschten Verbindung.
Beispiel 8
Untersuchung der Elutionspositionen von anionischen Polypeptiden im Fall einer Ionenaustauschsäule
Proben
Es wurden wässrige Lösungen mit einem Gehalt von 5 mg/ml der Polypeptide 1 bis 24, die in den Beispielen 1 bis 7 erhalten wurden, als Proben verwendet.

Außerdem wurden als Proben wässrige Lösungen hergestellt, die als Vergleichs-Standardverbindung 5 mg/ml (Asp)₉-βAla (nachfolgend abgekürzt als "Asp 9", selbst hergestellt mit Hilfe der BOP/HOBt-Methode) enthielten, eine Polyasparaginsäure mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 6.000 (nachfolgend abgekürzt als "Asp6K", hergestellt von Sigma Chemical Co.) oder eine Polyasparaginsäure mit einer mittleren Molekülmasse von 50.000 (nachfolgend abgekürzt als "pAsp", hergestellt von Sigma Chemical Co.). Analysebedingungen

Säule:	OROS-DEAE (4,6 Durchmesser × 10 mm, hergestellt von Perseptive Biosystems).
Eluierungsmittel A:	50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,6).
Eluierungsmittel B:	50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,6, mit einem Gehalt von 5 M NaCl).
Durchflussrate:	1 ml/min.
Detektion:	für die Polypeptide, die einen oder mehrere sulfatierte Serin-Reste enthielten: UV 220 nm, für die Polypeptide, die einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthielten: UV 260 nm, für die Polypeptide, die phosphatierte Tyrosin-Reste enthielten: UV 260 nm.

Messprozedur
Es wurden 20 Mikroliter jeder Probe mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen analysiert.
Ergebnisse
1 zeigt die Salzkonzentrationen, die für die Elution der einzelnen Polypeptide erforderlich sind (nachfolgend abgekürzt als "eluierende Salzkonzentration"). In 1 zeigt • eine Salzkonzentration oberhalb des Elutionspeaks, I–I zeigt eines Salzkonzentration im Bereich zwischen dar Ausgangs- und End-Elution, d.h. eine Peakbreite. Die Nummern und Markierungen auf der Abszisse zeigt die Art der Polypeptide (Polypeptid Nr. und Abkürzungen in Tabelle 1).
Aus den in 1 gezeigten Ergebnissen lässt sich das Folgende entnehmen:

(1) Die Erhöhung der Zahl der Säurereste (Sulfon-Gruppen oder Phosphon-Gruppen) führt zu einer erhöhten eluierenden Salzkonzentration;
(ii) Polypeptid 3 (Zahl der Sulfonsäure-Reste: 5) und Polypeptid 11 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3) sind gleich Asp 9 in der eluierenden Salzkonzentration. Polypeptid 6 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 10), Polypeptid 8 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 9), Polypeptid 9 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 10), Polypeptide 12 und 13 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 4) und Polypeptide 14 und 15 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 5) sind gleich Asp6K und pAsp in der eluierenden Salzkonzentration. Mit anderen Worten bringen die hierin beschriebenen Polypeptide eine gleiche Wirkung zustande wie die konventionellen Polypeptide, die über Carbonsäure-Reste verfügen (sie sind den konventionellen Polypeptiden in der Stärke des Haltens durch die Anionenaustauschsäule gleich), und zwar selbst dann, wenn sie kürzere Kettenlängen haben (eine kleinere Zahl von Aminosäure-Resten), als das bei den konventionellen Polypeptiden der Fall ist;
(iii) Die Stärke des Haltens durch eine Ionenaustauschsäule variiert in Abhängigkeit von der Art der Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, von der Art der Aminosäure-Reste in die die Säurereste eingeführt wurden, von den Eigenschaften der Packung einer Säule, usw. Beispielsweise zeigt ein Vergleich zwischen den Ergebnissen für die Polypeptide 2 bis 9, die sulfatierte Serin-Reste enthalten und den Ergebnissen für die Polypeptide 10 bis 20, die einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, dass, wenn die Zahl der Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, die gleiche ist wie in den ersteren und den letzteren Polypeptiden, die Polypeptide, die ein oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, eine höhere eluierende Salzkonzentration haben. Der Grund dafür wird wie folgt vermutet: da ein Ausgangsmaterial für die Packung, die in diesem Beispiel verwendet wird, etwas hydrophob ist, werden die Polypeptide, die Tyrosin-Reste enthalten und einen Benzolring haben, leichter von der Säule gehalten, so dass ihre scheinbare eluierende Salzkonzentration höher ist. Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen für die Polypeptide 3 und 14, die 5 Schwefelsäure-Reste enthalten, und den Ergebnissen für die Polypeptide 23 und 24, die 5 Phosphorsäure-Reste enthalten, zeigt, dass die Polypeptide, die Schwefelsäure-Reste enthalten, eine höhere eluierende Salzkonzentration haben. Aus den vorgenannten Ergebnissen lässt sich entnehmen, dass ein Polypeptid, das eine willkürliche eluierende Salzkonzentration hat, in geeigneter Weise durch richtige Wahl der Art und Zahl der einzuführenden Säurereste, der Art der Bestandteile der Aminosäure-Reste, der Art der Packung der Säule, usw. gewählt werden kann;
(iv) Selbst wenn die Art und die Zahl der Aminosäure-Reste, in die die Säurereste, die von einer starken Säure deriviert wurden, eingeführt wurden, gleich sind und die Art und die Zahl der Säurereste gleich ist, variiert die Stärke des Haltens solcher Polypeptide durch eine Anionenaustauschsäule in Abhängigkeit von dem Vorhandensein anderer Aminosäure-Rest in den Polypeptiden. Beispielsweise lässt sich aus den Ergebnissen für die Polypeptide 12 bis 19, die sulfatierte Tyrosin-Reste enthalten, entnehmen, dass die eluierende Salzkonzentration in Abhängigkeit von dem Vorhandensein eines β-Alanin-Restes (die Einführung eines β-Alanin-Restes verringert die eluierende Salzkonzentration) selbst dann variiert, wenn die Zahl der sulfatierten Tyrosin-Reste gleich, ist. Damit lässt sich entnehmen, dass ein Polypeptid, das eine willkürliche eluierende Salzkonzentration hat, hergestellt werden kann durch Einführen eines geeigneten Aminosäure-Restes zusätzlich zu den Aminosäure-Resten, die darin Säurereste eingeführt haben.
(v) Aus den Ergebnissen für pAsp-1 und pAsp-2 (die pAsp's in unterschiedlichen Herstellungschargen) als Vergleichsbeispiele lässt sich folgendes entnehmen: in Abhängigkeit von der Herstellungscharge variieren die konventionellen Polypeptide, die über Carbonsäure-Reste verfügen, hinsichtlich der eluierenden Salzkonzentration, was mit anderen Worten bedeutet, dass die Schwanzbildung eines Zielpeaks variiert, d.h. es ist schwierig, ein Polypeptid zu erhalten, das über ein gleichförmiges Molekulargewicht verfügt. Im Gegensatz dazu besteht bei dem hierin beschriebenen Polypeptid ein solches Problem in pAsp nicht, da es leicht als ein Polypeptid mit einem gleichförmigen Molekulargewicht mit Hilfe der Peptidsynthese erhalten werden kann.

Beispiel 9
Herstellung eines Antikörper-sulfatierten Polytyrosin-kombinierten Produktes
(1) Herstellung von 4-(p-Maleinmidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa
In 500 μl 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) wurden 1 mg des Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAla, hergestellt in Beispiel 4 aufgelöst, gefolgt von einem Zusatz von 1,2 mg Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat (hergestellt von Pierce Chemical Co.), wonach die Reaktion für 3 Stunden bei 37°C ausgeführt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit einer Superdex-Peptid-Säule (Innendurchmesser 16 mm × 30 cm, hergestellt von Pharmacia AB) behandelt, um die überschüssigen Reagentien zu entfernen, womit eine wässrige Lösung von 0,84 mg 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa erhalten wurde (Ausbeute: 75%).
(2) Herstellung von Fab'-Fragment
Mit Hilfe einer konventionellen Methode wurden 10 mg Anti-AFP-monoklonaler Antikörper A4-4 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in ein F(ab')₂-Fragment (5 mg, Ausbeute 80%) eingearbeitet. Anschließend wurde das F(ab')₂-Fragment in ein Fab'-Fragment eingearbeitet (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4·Fab"') (3,1 mg, Ausbeute 62%), und zwar mit Hilfe einer konventionellen Methode.
(3) Herstellung eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab'
In einem 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), wurden 3,1 mg des vorstehend unter (1) erhaltenen 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und 3,1 mg des vorstehend erhaltenen AFP-A4-4·Fab' für 16 Stunden bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde in eine Superdex 200 pg-Säule (Innendurchmesser 26 mm × 60 cm, hergestellt von Pharmacia AB) geladen, um den Überschuss an 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa zu entfernen. Anschließend wurde der Rest mit einer DEAE TOYOPEARL-Säule (Innendurchmesser 10 mm × 2 cm, hergestellt von Tosoh Ltd.) behandelt und die adsorbierte Fraktion gewonnen, um 1 mg eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' (Ausbeute: 15%) zu erhalten.
Beispiel 10
Herstellung eines Antikörper-sulfatierten Polytyrosin-kombinierten Produktes
(1) Herstellung von 4-(p-Maleinimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ In 3 ml DMF wurden 25 mg des in Beispiel 4 hergestellten Ala-(Tyr(SO₃H))₈ (Polypeptid 19) aufgelöst, gefolgt von einem Zusatz von 10 mg Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat (hergestellt von Pierce Chemical Co.) und die Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde ausgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer ODS-Säule (Säule: Wakosil 5C18 (2,0 Durchmesser × 25 cm) (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) behandelt; Elutionsbedingungen: 50 mM Ammoniumacetat, pH 6, 2 → 60% Acetonitril). Die so erhaltene Fraktion enthielt die gewünschte Verbindung und wurde bis zur Trockene eingeengt, um 26,5 mg 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ (Ausbeute: 95%) zu erhalten.
Nachfolgend sind die NMR-Daten des erhaltenen 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ gezeigt:
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆) δppm: 7,16 (s, 2H, Maleinimido-Proton).
Der Vergleich mit dem Ergebnis, das in Beispiel 9 (1) erhalten wurde, zeigt, dass nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren ein Polypeptid mit einer in das N-Ende eingeführten Maleinimid-Gruppe in höherer Ausbeute erhalten werden kann.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass bei Aufbewahrung bei 15°C oder darunter das mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Methode erhaltene 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ stabil ohne Abbau aufbewahrt werden kann. Damit zeigte sich, dass diese Verbindung leichter zu verwenden war, als die Verbindung, die mit Hilfe des in Beispiel 9 (1) beschriebenen Verfahrens erhalten wurde, die in Form einer wässrigen Lösung vorlag und innerhalb von etwa 24 Stunden fast vollständig abgebaut war.
(2) Herstellung von Fab'-Fragment
Mit Hilfe einer konventionellen Methode wurden 30 mg Anti-AFPmonoklonaler Antikörper A4-4 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4"; verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in F(ab')₂-Fragment (16 mg, Ausbeute 80% eingearbeitet). Anschließend wurde das F(ab')₂-Fragment in das Fab'-Fragment eingearbeitet (nachfolgend abgekürzt als "AFP-A4-4·Fab"') (11,1 mg, Ausbeute 70%), und zwar mit Hilfe einer konventionellen Methode.
(3) Herstellung eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr)SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab'
In 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) wurden 1 mg des vorstehend in (1) erhaltenen 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und 11,1 mg des vorstehend in (2) erhaltenen AFP-A4-4·Fab' für 16 Stunden bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung einer POROS DEAE-Säule (Innendurchmesser 6 mm × 1 cm, hergestellt von Perseptive Biosystems) fraktioniert, um 6 mg eines kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab' zu erhalten (Ausbeute: 60%).
Aus einem Vergleich zwischen diesem Ergebnis mit dem in Beispiel 9 (3) erhaltenen Ergebnis lässt sich entnehmen, dass unter Verwendung des Polypeptids, das über eine in das N-Ende eingeführte Maleinimido-Gruppe verfügt, das in Beispiel 10 (1) erhalten wurde, ein kombiniertes Produkt des Polypeptids und des Fab' auf wirksame Weise erhalten werden kann.
Obgleich nicht offensichtlich, ist der dafür angenommene Grund der folgende: in Beispiel 9 (1) wurde freies Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat unter Verwendung der Superdex-Peptid-Säule entfernt, während in Beispiel 10 (1) die Entfernung unter Verwendung der ODS-Säule vorgenommen wurde. Im Einzelnen kann man wie folgt vermuten: da der Unterschied im Molekulargewicht zwischen dem Polypeptid, das eine darin eingeführte Maleinimid-Gruppe aufweist, und dem freien Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat klein ist, konnten sie nicht in zufriedenstellender Weise voneinander unter Verwendung der Superdex-Peptid-Säule getrennt werden, so dass das freie Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat mit Fab' reagierte und dieses zu einer geringen Ausbeute des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' führte.
Beispiel 11
Untersuchung der Elutionspositionen von kombinierten Produkten eines anionischen Polypeptids und eines Antikörpers in der Anionenaustauschchromatographie
Proben
Es wurden kombinierte Produkte von jedem der verschiedenen anionischen Polypeptide, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, und AFP-A4-4·Fab' mit Hilfe der gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur hergestellt, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Es wurden wässrige Lösungen mit einem Gehalt von 1 mg/ml jedes kombinierten Produktes als Proben verwendet. Da das Polypeptid 24 über eine an dem N-Ende angebrachte Maleinimido-Gruppe verfügte, wurde es mit AFP-A4-4·Fab' ohne Modifikation mit 4-(p-Maleinimidophenyl)-butyrat kombiniert.
Als eine Vergleichs-Standardverbindung wurde jede der kommerziell verfügbaren pAsp' (in zwei Chargen) zu einem kombinierten Produkt mit AFP-A4-4·Fab' unter Anwendung der gleichen Reagentien und der gleichen Prozedur angesetzt, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Als Proben wurden wässrige Lösungen angesetzt, die 1 mg/ml der auf diese Weise erhaltenen jeweiligen kombinierten Produkte enthielten.
Das gewünschte kombinierte Produkt von Polypeptid 22 und AFP-A4-4·Fab' konnte nicht erhalten werden. Der Grund dafür ist vermutlich der Folgende: Wenn ein anionischer Aminosäure-Rest an dem N-Ende eines Polypeptids vorhanden ist, wird die Wirksamkeit der Kombination des Polypeptids mit einem Antikörper (genauer die Kombination des Polypeptids mit einem vernetzenden Mittel) durch eine Ursache herabgesetzt, die mit der elektrischen Ladung in Verbindung steht.
Analysebedingungen und Messprozedur
Die Analyse und Messung wurden in der gleichen Weise wie in dem vorstehend beschriebenen Beispiel 8 mit der Ausnahme ausgeführt, dass die Detektion in allen Fällen bei OF 280 nM ausgeführt wurde.
Ergebnisse
2 zeigt die eluierende Salzkonzentration und die Peakbreiten der kombinierten Produkte jedes der verschiedenen Polypeptide und AFP-A4-4·Fab'. In 2 zeigt • eine Salzkonzentration oberhalb des Elutionspeaks, ????? zeigt eine Salzkonzentration im Bereich zwischen der Anfangs- und End-Elution, d.h. eine Peakbreite. Die Nummern und Markierungen auf der Abszisse zeigen die Art der Polypeptide (die Polypeptid Nr. und Abkürzungen entsprechend Tabelle 1).
Aus den in 2 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen:

(i) Aufgrund der Kombination mit dem Antikörper ist die eluierende Salzkonzentration etwas geringer als die des Polypeptids allein, jedoch ist der Zusammenhang unter den eluierenden Salzkonzentrationen der verschiedenen Polypeptide und zwischen den eluierenden Salzkonzentrationen der Polypeptide und solcher der pAsp' gleich den in Beispiel 8 ermittelten Zusammenhängen;
(ii) Sofern die Analyse für eine Serumkomponente unter den in Beispiel 8 beschriebenen Analysebedingungen und unter Verwendung einer POROS-DEAE (4,6 Durchmesser × 10 mm)-Anionenaustauschsäule ausgeführt wurden, betrug die Salzkonzentration an der Spitze eines Elutionspeaks in Folge einer in dem Serum zusammen mit der Serumkomponente vorhandenen Substanz nahezu 0,3 M (in 2 nicht gezeigt). Aus dieser Tatsache lässt sich entnehmen, dass , wenn das kombinierte Produkt von Polypeptid 1 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 1) und des Antikörpers als die Trennung verbessernde Substanz verwendet wurde, ein Zielpeak mit dem Peak überlappt wird, der auf die in dem Serum vorhandene Substanz zurückzuführen ist, was zu einer Abnahme der Genauigkeit der Messung (Analyse) führt. Die in 2 gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass auch, wenn das kombinierte Produkt des Antikörpers und Polypeptids 2 (die Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3), Polypeptid 10 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 1) oder Polypeptid 11 (Zahl der Schwefelsäure-Reste: 3) als die Trennung verbessernde Substanz verwendet werden, die Genauigkeit der Messung (Analyse) durch den Einfluss der in dem Serum vorhandenen Substanz etwas abnimmt, obgleich die Abnahme nicht so groß ist, wie sie im Fall des Polypeptid 1 hervorgerufen wird.

Da das Basismaterial für POROS-DEAE, d.h. die in dem vorliegenden Beispiel verwendete Packung, etwas hydrophob ist, verfügen die kombinierten Produkte des Antikörpers und jedes der Polypeptide 10 bis 20, die einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste haben, über eine höhere scheinbare eluierende Salzkonzentration, als das bei den kombinierten Produkten des Antikörpers und jedem der Polypeptide der Fall ist, die über einen oder mehrere sulfatierte Serin-Reste verfügen. Dementsprechend ist die scheinbare eluierende Salzkonzentration des kombinierten Produktes des Antikörpers und Polypeptids 10, das lediglich den Schwefelsäure-Rest enthält, das aber einen Tyrosin-Rest enthält, im Wesentlichen die gleiche wie die des kombinierten Produktes des Antikörpers und Polypeptids 2, das über 3 sulfatierte Serin-Reste verfügt.
Wenn jedoch der gleiche Versuch wie vorstehend mit Ausnahme der Verwendung einer Packung ausgeführt wird, die aus einem hydrophilen Basismaterial erhalten wird anstelle der in dem vorgenannten Versuch verwendeten Packung, so ist das Folgende zu erwarten: die scheinbare eluierende Salzkonzentration des kombinierten Produktes des Antikörpers und des Polypeptids 10, das lediglich einen sulfatierten Tyrosin-Rest enthält, ist weitgehend die gleiche wie die des kombinierten Produktes des Antikörpers und des Polypeptids 1, das lediglich einen sulfatierten Serin-Rest enthält, so dass ein Zielpeak mit einem Peak überlappt wird, der auf die im Serum vorhandene Substanz zurückzuführen ist, was zu einer Abnahme der Messgenauigkeit (Analyse) führt.
Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen lässt sich entnehmen, dass ein Polypeptid, das mindestens 3 und vorzugsweise 4 oder mehr und mehr bevorzugt 5 oder mehr Säurereste, die von einer starken Säure deriviert sind, aufweist, eine bevorzugte, die Trennung verbessernde Substanz ist.
Beispiel 12
Untersuchung der Stabilität eines Polypeptids das sulfatierte Serin-Reste enthält und eines Polypeptids das sulfatierte Tyrosin-Reste in einer wässrigen Lösung enthält
Es wurden jedes Ala-(Ser(SO₃H))₈-βAla (Polypeptid 4) und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14) in einer Pufferlösung mit einem pH 6 bis 10 bei 40°C aufbewahrt, wonach deren Stabilität untersucht wurde.
Proben

Als Proben wurden Lösungen verwendet, die unter Auflösung jedes der Polypeptide 4 und 14 in jeweils den folgenden Pufferlösungen bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml eingesetzt wurden: Pufferlösungen

pH 6,0	2-Morpholinoethansulfonsäure (MES);
pH 7,0	3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS);
pH 8,0	N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure (TAPS);
pH 9,0	TAPS;
pH 10,0	N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropansulfonsäure (CAPSO=.

Die Konzentrationen aller Pufferlösungen wurden auf 50 mM eingestellt.
Aufbewahrungsmethode
Jede Probe wurde für eine vorbestimmte Zahl von Tagen bei 40°C aufbewahrt.
Ergebnisse
Der Anteil von zurückbleibendem Polypeptid (%) in jeder Probe wurde am 6. und 19. Tag der Aufbewahrung auf der Grundlage des Peakflächenwertes des Polypeptids in der Probe unmittelbar nach der Herstellung und der nach der vorbestimmten Zahl von Tagen der Aufbewahrung ermittelt, die unter den in Beispiel 8 beschriebenen Analysebedingungen und unter der hierin beschriebenen Prozedur ermittelt wurden.
3 und 4 zeigen die Messergebnisse, die für Polypeptid 4 erhalten wurden bzw. solche für Polypeptid 14. In jedem der 3 und 4 zeigen dunkle Balken und die hellen Balken die von jeder Probe am 6. Tag bzw. 19. Tag der Aufbewahrung erhaltenen Ergebnisse.
Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Abbau von Polypeptid 4 mit Zunahme des pH-Werts bei der Aufbewahrung beschleunigt wurde und dass 10% oder mehr des Polypeptids 4 nach 16 Tagen der Aufbewahrung selbst bei einem pH 6 abgebaut waren, wobei Polypeptid das stabilste ist.
Andererseits zeigen die in 4 dargestellten Ergebnisse, dass Polypeptid 14 bei sämtlichen pH-Werten stabil ist.
Aus den vorgenannten Ergebnissen lässt sich ersehen, dass die in die Tyrosin-Reste eingeführten Sulfon-Gruppen gegenüber dem Einfluss des pH-Wertes weniger empfindlich sind und damit stabiler sind als die in die Serin-Reste eingeführten Sulfon-Gruppen, so dass die ersteren eine gegenüber derjenigen der letzteren bevorzugte Eigenschaft verfügen, wenn sie in einer die Trennung verbessernden Substanz verwendet werden.
Beispiel 13
Messung von Thyroid-stimulierendem Hormon (TSH)
Herstellung von Peroxidase-markiertem Anti-TSH-Antikörper-Fab'-Fragment
Es wurde Anti-TSH-Antikörper (hierin abgekürzt als "TSH-1 ", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in ein Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingearbeitet. Die Peroxidase (verfügbar bei TOYOBO, Co., Ltd.) wurde in das Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingeführt, um Peroxidase-markiertes Anti-TSH-Antikörper-Fab'-Fragment (nachfolgend abgekürzt als "TSH-1·Fab'-POD") herzustellen.
Antikörperlösung 1
Als Antikörperlösung 1 wurde ein 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt von 5 nM TSH-1·Fab'-POD hergestellt.
Antikörperlösungen 2
Der Anti-TSH-monoklonale Antikörper, von dem bestätigt wurde, dass er hinsichtlich des Epitops gegenüber TSH-1 verschieden ist (nachfolgend abgekürzt als "TSH-2", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurde in ein Fab'-Fragment eingearbeitet (nachfolgend abgekürzt als "TSH-2·Fab"').
Es wurden kombinierte Produkte von TSH-2·Fab' und jeweils Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14) und Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 3) nach der gleichen Prozedur hergestellt, wie in Beispiel 9 (3) beschrieben wurde.
Als Antikörperlösungen 2 wurden 50 mM MOPS-Pufferlösungen mit einem Gehalt von 50 nM jeweils jedes der kombinierten Produkte hergestellt.
Probe

Als eine Probe wurde eine Lösung verwendet, die hergestellt wurde durch Zusetzen von kommerziell verfügbarem TSH (verfügbar bei Genzyme Diagnostics) zu 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5 mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin), und zwar bis zu einer Konzentration von 70 pM. Anwendungsbedingungen der HPLC

Säule:	0,46 Durchmesser × 1,0 cm.
Packung:	POROS-DEAE-Gel (Handelsbezeichnung, Perseptive Biosystems).
Eluierungsmittel A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5).
Eluierungsmittel B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl).
Substratlösung:	eine 25 mM wässrige Lösung von 4-N-Acetylaminophenol (hergestellt von DOJINDO LABORATORIES).
Laufgeschw.:	Eluierungsmittel A + Eluierungsmittel B: 1,0 ml/min, Substratlösung: 0,1 ml/min.
Reaktionssektion:	0,025 Durchmesser × 1,000 cm (gehalten bei 60°C).
Detektion:	Fluoreszens wurde gemessen bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm.
Gradient:	0 → 10 min. B=0 → 100%.

Messprozedur
Mit 100 Mikroliter Antikörperlösung 1 wurden 50 Mikroliter der Probe und 50 Mikroliter jeder Antikörperlösung 2 gemischt und die resultierende Mischung bei 25°C für 30 min stehen gelassen, wonach 10 Mikroliter der Mischung der Messung (Analyse) mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen zugeführt wurde.
Ergebnisse
Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurden die Salzkonzentrationen (Natriumchloridkonzentrationen) für die Elution verschiedener Substanzen wie folgt ermittelt:

– TSH-1·Fab'-POD und ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD und TSH: Null bis 0,1 M.
– Ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD, TSH und das kombinierte Produkt von TSH-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 14): 0,5 bis 1,2 M.
– Ein Komplex von TSH-1·Fab'-POD, TSH und das kombinierte Produkt von TSH-2·Fab' und Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 3): 0,25 bis 0,45 M.

Aus den vorgenannten Ergebnissen kann entnommen werden, dass die Komplexe, die den zu messenden Analyten enthalten, sicherer von dem damit vorhandenen freien POD-markierten Antikörper unter Verwendung eines der beliebigen kombinierten Produkte des sulfatierten Polypeptids und des Antikörpers abgetrennt werden können und dass die Elutionsposition eines Zielkomplexes durch geeignete Auswahl der Art des sulfatierten Polypeptids frei eingestellt werden kann.
Ebenfalls wurde festgestellt, dass unter Nutzung eines Peaks, der auf den Komplex zurückzuführen ist, der über das daran angebrachte sulfatierte Polypeptid verfügt, eine zufriedenstellende Eichkurve für TSH in der Probe erhalten werden kann, womit die Menge an TSH bestimmt werden kann.
Beispiel 14
Messung von AFP unter Verwendung eines kombinierten Produktes von Fab' und eines anionischen Polypeptids
Herstellung von Peroxidase-markiertem Anti-AFP-Antikörper-Fab'-Fragment
Es wurde Anti-AFP-Antikörper WA-1 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-WA-1", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), das hinsichtlich des Epitops von AFP-A4-4 verschieden ist, in Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode eingearbeitet. Es wurde an dem Fab'-Fragment mit Hilfe einer konventionellen Methode Peroxidase (verfügbar bei TOYOBO Co., Ltd.) angebracht, um Peroxidase-markiertes Anti-AFP-Antikörper-Fab'-Fragment (nachfolgend abgekürzt als "AFP-WA-1·Fab'-POD") herzustellen.
Reagentien
Als Reagentien wurden MOPS-Pufferlösungen (pH 7,5) mit einem Gehalt von 200 nM eines vorbestimmten kombinierten Produktes unter den kombinierten Produkten hergestellt, wie sie in Beispiel 11 hergestellt wurden, d.h. die kombinierten Produkte von AFP-A4-4·Fab' und jedes der in Tabelle 1 aufgeführten anionischen Polypeptide, 100 nM von AFP-WA-1·Fab'-POD und 0,2 (Gewicht/Volumen) eines Polyvinylalkohols (hergestellt von Aldrich Chemical Co.).
Probe

Als eine Probe wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen von kommerziell verfügbarem AFP in 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,2% (Gewicht/Volumen) Polyvinylalkohol) bis zu einer Konzentration von 100 ng/ml hergestellt. HPLC-Bedingungen

Säule:	POROS-DEAE (4,6 Durchmesser × 10 mm).
Eluierungsmittel A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5).
Eluierungsmittel B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl).
Substratlösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂.
Laufgeschw.:	Eluierungsmittel A + Eluierungsmittel B: 1 ml/min Substratlösung: 0,1 ml/min.
Reaktionssektion:	0,025 Durchmesser × 1,000 cm.
Temperatur:	60°C.
Detektion:	Fluoreszens, gemessen bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm.
Gradient:	der gleiche wie in Beispiel B.

Messprozedur
Mit 100 jedes Reagens wurden 10 μl der Probe gemischt und die Reaktion bei 8°C für 10 min ausgeführt, wonach 20 μl der Reaktionsmischung mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen analysiert wurde.
Ergebnisse
5 zeigt die eluierenden Salzkonzentrationen und die Peakbreiten der Komplexe des kombinierten Produktes jedes der verschiedenen Polypeptide und von AFP-A4-4·Fab', AFP-WA-1·Fab'-POD und AFP (Antigen-Antikörper-Komplexe). In 5 zeigt • eine Salzkonzentration oberhalb des Elutionspeaks, I–I zeigt eine Salzkonzentration im Bereich zwischen der Anfangs- und Ende-Eution, d.h. eine Peakbreite. Die Nummern und Markierungen auf der Abszisse zeigen die Art der Polypeptide (die Polypeptid Nr. und Abkürzungen entsprechend Tabelle 1).
Aus den in 5 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen:
(i) Die eluierende Salzkonzentration (die Elutionspositionen) der Antigen-Antikörper-Komplexe variieren in Abhängigkeit von der Art des an AFP-A4-4·Fab' angebrachten Polypeptids. Die Reihenfolge der Elution der Antigen-Antikörper-Komplexe war die gleiche Reihenfolge wie bei der Elution der kombinierten Produkte von AFP-A4-4·Fab' und jedem der Polypeptide (siehe Beispiel 11 und 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die eluierende Salzkonzentration eines Antigen-Antikörper-Zielkomplexes in geeigneter Weise durch richtige Auswahl der Art des Polypeptids ermittelt werden kann;
(ii) Da die eluierende Salzkonzentration von freien AFP-WA-1·Fab'-POD Null bis 0,1 M betrug, ließen sich das freie AFP-WA-1·Fab'-POD und der Antigen-Antikörper-Komplex vollständig voneinander unter Anwendung jedes der beliebigen Polypeptide trennen. Speziell bei Verwendung eines der Polypeptide 4 bis 9 und der Polypeptide 11 bis 21 ließ sich die eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes auf 0,3 M oder darüber einstellen, so dass der Einfluss der in dem Serum zusammen mit dem AFP vorhandenen Substanz mit Sicherheit unter Verwendung eines dieser Polypeptide als eine die Trennung verbessernde Substanz vermieden werden kann.
Wie bereits beschrieben, ist das Basismaterial für POROS-DEAE, das in dem vorliegenden Beispiel als Packung verwendet wurde, etwas hydrophob, so dass die Antigen-Antikörper-Komplexe, die aus den kombinierten Produkten des Antikörpers und jedem der Polypeptide 1 bis 20, die über einen oder mehrere sulfatierte Tyrosin-Reste verfügen, gebildet wurden, eine höhere scheinbare eluierende Salzkonzentration haben als solche, die aus den kombinierten Produkten des Antikörpers und jedem der Polypeptide gebildet werden, die über einen oder mehrere sulfatierte Serin-Reste verfügen. Dementsprechend ist die scheinbare eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und Polypeptid 10 gebildet wird, das lediglich einen Schwefelsäure-Rest hat, jedoch über einen Tyrosin-Rest verfügt, im Wesentlichen die gleiche wie die des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und dem Polypeptid 2 gebildet wird, das über 3 sulfatierte Serin-Reste verfügt.
Wenn jedoch der gleiche Versuch wie vorstehend mit Ausnahme der Verwendung einer Packung ausgeführt wird, die aus einem hydrophilen Basismaterial erhalten wurde anstelle der in dem vorangegangenen Versuch verwendeten Packung, so ist das Folgende zu erwarten: die scheinbare eluierende Salzkonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und des Polypeptids 10 gebildet wird, das lediglich einen sulfatierten Tyrosin-Rest aufweist, ist weitgehend die gleiche wie die des Antigen-Antikörper-Komplexes, der aus dem kombinierten Produkt des Antikörpers und dem Polypeptid 1 gebildet wird, das lediglich einen sulfatierten Serin-Rest enthält, so dass ein Zielpeak mit einem Peak überlappt, das auf die im Serum zusammen mit AFP vorhandene Substanz zurückzuführen ist, was zu einer verringerten Messgenauigkeit (Analyse) führt;
(iii) Aus den vorgenannten Ergebnissen ist zu bemerken, dass, wenn ein Polypeptid als eine die Trennung verbessernde Substanz verwendet wird, die Zahl der von einer starken Säure derivierten Säurereste in dem Polypeptid 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 30 und mehr bevorzugt 5 bis 15 beträgt (das Vorhandensein einer großen Zahl der Säurereste ist für die Messung deshalb nicht bevorzugt, weil die eluierende Salzkonzentration in der Elution aus einer Säule zu hoch wird);
(iv) Es können zwei oder mehrere Substanzen mit ähnlichen Strukturen (z.B. zwei oder mehrere Substanzen, die sich lediglich in einem Teil einer Struktur unterscheiden, wie beispielsweise eine Zuckerkettenstruktur, Isozyme, zwei oder mehrere Antikörper, die verschiedene Epitope eines Antigens erkennen können) getrennt und gemessen werden, indem eine Kombination von zwei oder mehreren Polypeptiden mit unterschiedlicher eluierender Salzkonzentration ausgewählt werden (z.B. eine Kombination eines beliebigen Polypeptids 4 bis 7, 8, 9, 11 bis 14 und eines beliebigen Polypeptids 7 und 16 bis 21) gewählt wird und kombinierte Produkte verwendet werden, die durch Anbringen jeweils zwei oder mehrerer Polypeptide an einer geeigneten Affinitätssubstanz erhalten werden;
(v) Die Ergebnisse, die unter Verwendung des jeweiligen pAsp-1 und pAsp-2 (pAsp verschiedener Herstellungschargen) als ein Polypeptid erhalten wurden, legen nahe, dass die konventionellen Polypeptide Carbonsäure-Reste haben, bei denen das folgende Problem auftritt: In Abhängigkeit von den Herstellungschargen variieren die konventionellen Polypeptide in ihrer eluierenden Salzkonzentration, so dass die Schwanzbildung eines Zielpeaks variiert, d.h. es ist schwierig, ein Polypeptid zu erhalten, das ein gleichmäßiges Molekulargewicht hat.
Im Gegensatz dazu besteht bei dem hierin beschriebenen Polypeptid ein solches Problem in pAsp nicht, da es leicht als ein Polypeptid mit gleichmäßigem Molekulargewicht mit Hilfe der Peptidsynthese erhalten wird.
Es wurden 100 μl der Antikörperlösung 1, 50 μl der Probe und 50 μl der Antikörperlösung 2 (die ein kombiniertes Produkt von TSH-2·Fab' und Ala-(Ser(SO₃H))₅-βAla (Polypeptid 3) enthielt), die in Beispiel 13 hergestellt wurden. Nach Stehenlassen für 30 min bei 25°C wurden 20 μl der resultierenden Mischung einer Messung (Analyse) mit Hilfe der HPLC unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen unterworfen. Als Ergebnis wurde ein Antigen-Antikörper-Zielkomplex bei der eluierenden Salzkonzentration eines Antigen-Antikörper-Komplexes eluiert, der gebildet wurde, wenn die Messung (Analyse) von AFP unter Verwendung von Polypeptid 3 ausgeführt wurde (die Daten der eluierenden Salzkonzentration sind ebenfalls als eine Position entsprechend der Abkürzung TSH auf der Abszisse in 5 gezeigt). Aus diesem Ergebnis kann man entnehmen, dass selbst in dem Fall eines unterschiedlichen zu messenden Analyten der Einsatz des hierin beschriebenen Polypeptids als eine die Trennung verbessernde Substanz die Ausführung einer gewünschten Messung (Analyse) unter Anwendung der HPLC unter festgelegten Analysebedingungen möglich macht.
Beispiel 15
Prozess zum Trennen und Messen von AFP's, die in der Zuckerkettenstruktur unterschiedlich sind, durch Verwendung des hierin beschriebenen Polypeptids
Flüssiges Reagens 1
Mit Ausnahme der Verwendung von Anit-AFP-monoklonalem Antikörper WA-2 (nachfolgend abgekürzt als "AFP-WA-2", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd., im Epitop von AFP-WA-1 und AFP-A4-4 verschieden) als ein Antikörper und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla als ein Polypeptid wurde ein kombiniertes Produkt von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla mit den gleichen Reagentien hergestellt und mit Hilfe der gleichen Prozedur, wie sie in Beispiel 9 beschrieben wurden. Als flüssiges Reagens 1 wurden 50 mM MES-Puffer (pH 6,5) mit einem Gehalt von 139 nM des kombinierten Produktes, 1 mg/ml Lens culinaris-Lektin (nachfolgend abgekürzt als "LCA", verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Calciumchlorid hergestellt.
Flüssiges Reagens 2
Als flüssiges Reagens 2 wurden 50 nM MES-Puffer (pH 7,5) verwendet, die 147 nM des AFP-WA-1·Fab'-POD, hergestellt in Beispiel 12, enthielten, 156 nM des kombinierten Produktes Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAla und AFP-A4-4·Fab', hergestellt in Beispiel 9, sowie 0,2% (Gewicht/Volumen) eines Polyvinylalkohols.
Proben

Es wurden von Human-Hepatom deriviertes AFP in LAC-ungebundenes und LCA-gebundenes AFP fraktioniert, indem eine Säule verwendet wurde, die mit LCA immobilisiertem Packungsmaterial gepackt war. Jedes von ihnen wurde zu Humanserum gegeben, das kein AFP enthielt, und zwar bis zu einer Konzentration von 100 ng/ml, womit Probe 1 (die das LCA-ungebundene AFP enthielt) und Probe 2 (die das LCA-gebundene AFP enthielt) hergestellt wurde. HPLC-Bedingungen

Säule:	POROS-DEAE (4,6 mm Innendurchmesser × 10 mm).
Pufferlösung A:	50 mM TAPS-Puffer (pH 8,5, mit einem Gehalt von 0,25 M NaCl).
Pufferlösung B:	50 mM TAPS-Puffer (pH 8,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl).
Substratlösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂).
Gradient:	Pufferlösungen A + B, Laufgeschwindigkeit: 2 ml/min.
	0 → 2 min B=0%
	2 → 4,5 min B=13%
	4,5 → 8 min B=100%
	8 → 8,5 min B=0%
nach der Säule:	Zugabe von POD-Substrat (eine
	Substratlösung, 0,1 ml/min),
	Reaktion bei 60°C für 30 s.
Detektion:	Die Fluoreszens wurde bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm gemessen.

Messprozedur
Mit 100 μl des flüssigen Reagens 1 wurden 10 μl der Probe 1 oder der Probe 2 gemischt und die Reaktion bei 8°C für 10 min ausgeführt. Anschließend wurden 10 μl des flüssigen Reagens 1 zu der Reaktionslösung zugegeben und die resultierende Mischung einer weiteren Reaktion für 20 min unterworfen.
Unter den vorgenannten Bedingungen wurde an 80 μl des Reaktionsgemisches mit Hilfe der HPLC die Messung (Analyse) ausgeführt.
Ergebnisse
6 zeigt die Messergebnisse. In 6 zeigt die durchgezogene Linie (–) die Daten, die von Probe 1 erhalten wurden, und die gestrichelte Linie (---) die Daten, die von Probe 2 erhalten wurden.
Aus den in 6 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: es wurde ein Antigen-Antikörper-Komplex (Komplex 1) von AFP, das kombinierte Produkt von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla und AFP-WA-1·Fab'-POD an einer Position von 2,9 min eluiert; ein Antigen-Antikörper-Komplex (Komplex 2), der durch Einführung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' in den Komplex 1 gebildet wurde, an der Position von 5,8 min eluiert und diese Komplexe sicher voneinander getrennt.
Aus den in 6 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: Im Fall der Probe 1, die LCA-ungebundenes AFP enthielt, wurde der Komplex 2, der durch die Anbringung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' gebildet wurde, hauptsächlich als Antigen-Antikörper-Komplex erzeugt; und im Fall von Probe 2, die LCA-bindungsfähiges AFP enthielt, der Komplex 1 hauptsächlich als Antigen-Antikörper-Komplex gebildet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das kombinierte Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' an dem Reagieren mit AFP durch seine Konkurrenz mit LCA gehemmt ist.
Die prozentuale Menge des gebildeten Komplexes 1 bezogen auf die Gesamtmengen der gebildeten 2 Komplexe (Prozentanteil an Komplex 1) wurde berechnet (siehe Tabelle 2), um herauszufinden, dass dieser Prozentanteil den Anteil an LCA-gebundenem AFP in jeder Probe wiederspiegelt, d.h. der Anteil an LCA-gebundenem AFP in jeder Probe kann unter Nutzung dieses Prozentanteils gemessen werden.
Vergleichsbeispiel
Es wurde der gleiche Versuch wie in Beispiel 15 mit der Ausnahme ausgeführt, dass ein kombiniertes Produkt von AFP-WA-2·Fab' und ein Asparaginsäurepolymer mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 6.000 anstelle des kombinierten Produktes von AFP-WA-2·Fab' und Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla verwendet wurde und indem ein kombiniertes Produkt von AFP-A4-4·Fab' und ein Asparaginsäurepolymer mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 28.800 anstelle des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab' verwendet wurde. Sodann wurde der prozentuale Anteil des Komplexes 1 berechnet.
Zusätzlich wurde der gleiche Versuch, wie er vorstehend beschrieben wurde, mit der Ausnahme ausgeführt, dass anstelle des vorstehend verwendeten flüssigen Reagens 1 ein flüssiges Reagens verwendet wurde, das durch Zusetzen einer γ-Poly(glutaminsäure) mit einer mittleren relativen Molekülmasse von 550.000 zu dem flüssigen Reagens 1 bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml hergestellt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen: wenn der Prozess des Vergleichsbeispiels (der Prozess unter Verwendung von Poly(asparaginsäure)) eingesetzt wird, wird der prozentuale Anteil von Komplex 1 unter Umständen im Fall von Probe 1 sehr hoch, d.h. es wird eine nicht kompetitive Reaktion stattfinden, weshalb ein anionisches Additiv, wie beispielsweise γPGA, zum Unterdrücken dieses Phänomens zugesetzt werden sollte.
Im Gegensatz dazu ist ein solches Additiv bei Verwendung des hierin beschriebenen Polypeptids nicht erforderlich. Daher ist der Messprozess unter Verwendung des hierin beschriebenen Polypeptids als eine die Trennung verbessernde Substanz auch in Bezug auf einen Messprozess überlegen, bei dem ein Polymer verwendet wird, das über Carboxyl-Gruppen verfügt (z.B. Poly(asparaginsäure)), das als die Trennung verbessernde Substanz verwendet worden ist.
Obgleich nicht offensichtlich, wird die Ursache für das vorgenannte Phänomen wie folgt vermutet:
da ein anionisches Polymer, wie beispielsweise Poly(asparaginsäure), relativ große Moleküle hat, so dass die Antigen-Antikörper-Reaktion durch elektrische Ladungen, sterischer Hinderungen, usw. gehemmt wird, führt dieses dazu, dass das vorgenannte Phänomen hervorgerufen wird. Andererseits lässt sich vermuten, dass das hierin beschriebene Polypeptid kleine Moleküle hat und damit die Antigen-Antikörper-Reaktion kaum beeinträchtigt.
Beispiel 16
Untersuchung des Einflusses der Zugabe eines Tensids zu einem Eluierungsmittel
Reagens
Als ein Reagens wurden 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt von 200 nM des kombinierten Produktes von Polypeptid 18 und AFP-A4-4·Fab', hergestellt in Beispiel 9, und 100 nM des AFP-WA-1·Fab'-POD verwendet.
Probe

Die gleiche wie in Beispiel 14. HPLC-Bedingungen

Säule:	POROS-DEAE (4,6 mm Innendurchmesser × 10 mm).
Pufferlösung A:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,1 % (Gewicht/Volumen) eines vorbestimmten Tensids).
Pufferlösung B:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 3 M NaCl und 0,1% (Gewicht/Volumen) eines vorbestimmten Tensids).
Substratlösung:	50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5, mit einem Gehalt von 90 mM 4-N-(4-Carbobutyryl)aminophenol und 20 mM H₂O₂).
Gradient:	Pufferlösungen A + B, Laufgeschwindigkeit: 1 ml/min.
	0 → 5 min A=100%
	5 → 30 min B=0 100%
	30 → 35 min B=100%
nach der Säule:	Zugabe von POD-Substrat (eine Substratlösung, 0,1 ml/min), Reaktion bei 60°C für 30 s.
Detektion:	Die Fluoreszens wurde bei einer Anregungswellenlänge von 328 nm und einer Emissionswellenlänge von 432 nm gemessen.

Tabelle 3 zeigt die Tenside, die den Eluierungsmitteln zugesetzt wurden.
Tabelle 3
Messprozedur
Mit 100 μl des Reagens wurden 10 μl der Probe gemischt und die Reaktion für 10 min bei 8°C ausgeführt. Danach wurden 20 μl des Reaktionsgemisches der Messung (Analyse) mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen unterworfen.
Ergebnisse
7 zeigt die eluierende Salzkonzentration und die Peakbreite eines Antigen-Antikörper-Komplexes von AFP, der unter Verwendung des Eluierungsmittels bestimmt wurde, das jedes der verschiedenen Tenside enthielt. In 7 zeigt • eine Salzkonzentration oberhalb des Elutionspeaks, – zeigt eine Salzkonzentration im Bereich zwischen der Ausgangs- und End-Elution, d.h. eine Peakbreite. Die Nummern auf der Achse zeigen die Art der Tenside (die Tensidnummern in Tabelle 3).
Aus den in 7 gezeigten Ergebnissen lässt sich folgendes entnehmen:

(i) Durch Zusatz des Tensids lässt sich die Peakbreite schmaler machen, d.h. mit anderen Worten die Schwanzbildung des Peaks während der Elution kann vermieden werden, so dass die Messgenauigkeit verbessert wird. Dieser Effekt ist in dem Fall der Kationtenside und der Amphotenside ausgeprägt;
(ii) Die eluierende Salzkonzentration (die Elutionsposition) wird durch Zusatz des Tensids variiert, d.h. die eluierende Salzkonzentration eines Antigen-Antikörper-Zielkomplexes lässt sich in geeigneter Weise durch richtige Wahl des Tensids einstellen.

Beispiel 17
Trennung durch Elektrophorese
Proben
Es wurden Proben hergestellt, indem mit 50 mM MOPS-Pufferlösung (pH 7,5) das in Beispiel 10 erzeugte AFP-A4-4·Fab', ein kombiniertes Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₈-βAa und AFP-A4-4·Fab', das in Beispiel 15 erzeugte AFP-WA2·Fab' oder ein kombiniertes Produkt von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla und AFP-WA2·Fab' verdünnt wurden und so der Gehalt auf 1 mg/ml gebracht wurde.
Messprozedur
Es wurde jede Probe in einer Menge von 4 μl in die Probemulden auf die eine Seite von 1 % Agarose-Gel gegeben. Die belegte Seite wurde zur Kathode gemacht und eine Elektrolyse bei einer Spannung von 200 V für 30 min ausgeführt, gefolgt von einem Färben des Proteins unter Verwendung von Quick-CBB (eine Handelsbezeichnung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), um einen Rf-Wert der jeweiligen Probe zu messen.
Ergebnisse
Die R_f-Werte der Proben waren folgende:

Probe Rf-Wert

AFP-A4-4·Fab' 0,38

[Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP=A4-4·Fab'] 0,66

AFP-WA2·Fab' 0,06

[Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla]-[AFP-WA2·Fab'] 0,22
Wie vorstehend gezeigt nimmt durch Vereinigen des sulfatierten Peptids die negative Ladung zu und die Beweglichkeit wird vergrößert. Je größer außerdem die Zahl der Schwefelsäure-Reste in dem sulfatierten Peptid wird, um so größer wird die Beweglichkeit.
Beispiel 18
Trennung von Reaktionsprodukten von sulfatiertem Peptid-kombiniertem Antikörper und Antigen
Proben
Es wurden Proben hergestellt durch Zusetzen von 50 μl AFP-Lösung, eingestellt mit 50 mM MOPS-Pufferlösung (pH 7,5), um den Gehalt an AFP auf 0,5 mg/ml zu bringen, zu 50 μl einer Lösung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und AFP-A4-4·Fab', erhalten in Beispiel 17 (1 mg/ml) in MOPS- Pufferlösung (pH 7,5), 50 μl einer Lösung des kombinierten Produktes von Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla und AFP-WA2·Fab', erhalten in Beispiel 17 (1 mg/ml) in MOPS-Pufferlösung (pH 7,5) oder 50 μl MOPS-Pufferlösung (pH 7,5), gefolgt von einer Reaktion bei 37°C für 30 min.
Messprozedur
Jede Probe in einer Menge von 4 wurde in die Probemulden auf der einen Seite eines 1 % Agarose-Gels gegeben. Die belegte Seite wurde zur Kathode gemacht und eine Elektrolyse bei einer Spannung von 200 V für 30 min ausgeführt, gefolgt von Antikörper-Affinitätsmetastase (Blotting) bei Raumtemperatur für 30 min unter Verwendung einer Anti-AFP-Antikörper-beschichteten Nitrocellulosemembran. Diese Membran wurde mit einer Waschlösung (0,9% NaCl) 2 Mal gewaschen. Nach dem Eintauchen dieser Membran in eine Anti-AFP-Antikörperlösung bei 37°C für 30 min wurde diese Membran 2 Mal unter Verwendung der Waschlösung gewaschen. Danach wurde diese Membran in eine Lösung aus POD-markiertem Anti-IgG-Antikörper für 30 min bei 37°C eingetaucht, gefolgt von einem 2-maligen Waschen mit der Waschlösung.
Danach wurde diese Membran einer Farbentwicklung in einer Farbentwicklungslösung unterworfen (50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5) mit einem Gehalt von 0,37 mM Nitrotetrazolium-Blau, 2,6 mM β-Nicotinamidadenin-Dinucleotid, reduzierte Form, und 0,01 % Wasserstoffperoxid), gefolgt von der Messung des R_f-Wertes des Antigen-Antikörper-Reaktionsproduktes.
Ergebnisse

Die R_f-Werte der Proben waren Folgende:

Probe	R _f -Wert
Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·Fab'] mit AFP	0,63
Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt von [Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla]-[AFP-WA2·Fab' mit AFP	0,20
AFP	0,85

Wie vorstehend gezeigt, ist ersichtlich, dass die Rf-Werte des Antigen-Antikörper-Reaktionsproduktes von [Ala-(Tyr(SO₃H))₈]-[AFP-A4-4·ab'] mit AFP bzw. [Ala-(Tyr(SO₃H))₈5-βAla]-[AFP-WA2·ab'] mit AFP zumeist die gleichen sind wie die von (Ala-(Tyr(SO₃H))₈]–[AFP-A4-4·ab'] und [Ala-(Tyr(SO₃H))₅-βAla]-(AFP-WA2·Fab']. Damit wurde festgestellt, dass die negative Ladung der AFP-Dosis die Rf-Werte des Antigen-Antikörper-Reaktionsproduktes von [Ala- (Tyr(SO₃H))₈]–[AFP-A4-4·Fab'] mit AFP und [Ala–(Tyr(SO₃H))₅–βAla]–[AFP-WA2·Fab'] mit AFP nicht beeinflusst.
Wie vorstehend beschrieben, gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen eines zu messenden Analyten in einer Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, worin ein Polypeptid verwendet wird, das 3 bis 30 Reste aufweist, deriviert von einer starken Säure die einen pKa-Wert von 3 oder weniger hat. Wenn ein Komplex, der erzeugt wird durch die Wechselwirkung zwischen einem zu messenden Analyten in einer Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, und einer Affinitätssubstanz, mit Hilfe einer Anionenaustauschmethode getrennt wird von einer freien Affinitätssubstanz und in der Probe vorhandenen Substanzen, die dazu neigen, die Detektion des Komplexes zu beeinträchtigen, dann kann das Polypeptid zum Abtrennen des Komplexes von der freien Affinitätssubstanz und dergleichen wirksamer verwendet werden. Die vorliegende Erfindung ist ausgesprochen wirksam insofern, dass der Messprozess der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit schafft, eine Spurenkomponente in einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe zu messen, wie beispielsweise Serum, und zwar leichter und in einer sehr viel kürzeren Zeit mit höherer Genauigkeit im Vergleich zu beispielsweise konventionellen Messprozessen nach der EIA, RIA oder dergleichen und Prozessen, die ein Polymer, das über Carboxyl-Gruppen verfügt, als die Trennung verbessernde Substanz verwenden. Daher stellt die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Beitrag zum Fachgebiet dar.

Claims

Verfahren zum Messen eines Analyten in einer Probe, die von einem Lebendkörper abgenommen wird, welches Verfahren umfasst: Umsetzen einer von einem Lebendkörper abgenommenen Probe mit einem Reagens, wobei das Reagens ein kombiniertes Produkt eines Polypeptids mit 3 bis 30 Resten aufweist, deriviert von einer starken Säure, die einen pKa-Wert von 3 oder weniger hat, und einer Substanz, die über Affinität zu dem Analyten verfügt; Abtrennen des resultierenden Komplexes; und Bestimmen der Menge des Analyten in der Probe auf der Basis der Menge des Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die starke Säure Schwefelsäure oder Phosphorsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei welchem das N-Ende des Polypeptids über einen Spacer an einer Maleinimido-Gruppe gebunden ist und die Substanz, die über Affinität zu dem Analyten verfügt, eine SH-Gruppe aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, bei welchem die Abtrennung des resultierenden Komplexes mit Hilfe einer Methode zum Aufbringen einer negativen Ladung unter Verwendung eines Anionenaustauschers ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4, bei welchem bei welchem die Abtrennung des resultierenden Komplexes ausgeführt wird unter Verwendung eines Anionenaustauschers und dem für den Anionenaustauscher verwendeten Eluierungsmittel ein Tensid zugesetzt wird.