DE69214942T2

DE69214942T2 - Verfahren für spezifische bindungsassays unter verwendung eines freisetzbaren liganden

Info

Publication number: DE69214942T2
Application number: DE69214942T
Authority: DE
Inventors: David Obzansky; Donald Simons; Susan Tseng
Original assignee: Dade Chemistry Systems Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1991-03-12
Filing date: 1992-03-12
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2012-03-13
Also published as: WO1992016841A1; US5332679A; CA2106003A1; JPH06505802A; IE920778A1; EP0579676A1; DE69214942D1; EP0579676B1

Description

TECHNISCHER BEREICH

Diese Erfindung betrifft spezifische Bindungsassays und insbesondere Immunoassays und DNA-Sonden-Assays, wobei ein nichtimmunes, reversibles Bindungs-Verdrängungs-System verwendet wird, wobei ein freisetzbarer Ligand, ein Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden, ein Analyt von Interesse, ein analytisch nachweisbarer Reporter und wenigstens ein Bindungspartner für den Analyten zuerst an einer unlöslichen Phase gebunden werden, wodurch ein an die unlösliche Phase gebundener, durch den Reporter markierter Komplex gebildet wird, gefolgt von der Zugabe eines Verdrängungsliganden, der den freisetzbaren Liganden zusammen mit einen Teil des durch den Reporter markierten Komplexes verdrängt, so daß der freigesetzte Reporter in einem freien, flüssigen Medium analytisch nachweisbar ist und mit der Konzentration des Analyten in der Probe verbunden werden kann.

Stand der Technik

In den letzten Jahren wurde die Verwendung des Avidin-Biotin- Komplexes als extrem vielseitiges System wohlbekannt, das für eine große Anzahl bioanalytischer Anwendungen einschließlich der Affinitätschromatographie, der Affinitäts-Cytochemie, der Zell-Cytometrie, der Blotting-Technologie, der Diagnostik, einschließlich von Immunoassays und Gen-Sonden-Assays, der Hybridom-Technologie, der Medikamentenverabreichung und der vernetzenden Immobilisierungs-Technologie [Wilchek et al., Analytical Biochemistry 171:1-31 (1988)] nützlich ist.
Die Brauchbarkeit des Biotin-Avidin-Systems wird durch die hohe Affinität (10¹&sup5; M&supmin;¹) der Biotin-Avidin-Wechselwirkung gekennzeichnet, was die außergewöhnliche Stabilität dieser nichtkovalenten Wechselwirkung ausmacht. Freies Biotin oder Biotin in derivatisierter Form (das eine beliebige Anzahl von Reporter-Gruppen einschließlich fluoreszierender, Radioisotopen-, elektronendichter Marker-, Enzym- oder immobilisierender Matrizes enthält) oder an Moleküle mit entweder einer niedrigen oder hohen Molmasse gebundenes Biotin wird nach wie vor durch Avidin oder Streptavidin erkannt.
Für das Biotin-Avidin-System gibt es mehrere wohlbekannte Anwendungen, einschließlich seiner Verwendung in enzymmarkierten Immunoassays. Bei all diesen wird das Nachweissignal entweder durch die Verwendung von Avidin oder Streptavidin, das durch einen Reporter markiert ist, oder durch die Verwendung von nativen Avidin oder Streptavidin und einen biotinylierten Reporter bewerkstelligt.
Im U.S.-Patent Nr. 4 298 686, am 3. November 1981 an Parikh et al. ausgegeben, wird ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von biologischen Substanzen offenbart. Es wird insbesondere ein Enzyn-Immunoassay offenbart, bei dem ein löslicher, mit Biotin markierter Komplex kovalent an ein Antikörper-Molekül gebunden wird und ein Trennverfahren unter Verwendung von Avidin, das an einer festen Phase immobilisiert wird, durchgeführt wird.
Im U.S.-Patent Nr. 4 228 237, am 14. Oktober 1980 an Hevey et al. ausgegeben, wird die Verwendung eines Biotin-Avidin-Systems zur Bestimmung eines Liganden von Interesse bei nicht- kompetitiven und kompetitiven Bindungsverfahren offenbart. Insbesondere offenbaren Hevey et al. ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden von Interesse, wobei durch Enzym markiertes Avidin und ein durch Biotin markiertes Reagens in einem speziellen Bindungsverfahren verwendet wird, wobei der zu bestimmtende Ligand mit einer unlöslichen Phase, die eine spezifische Bindungssubstanz für den Liganden enthält, in Berührung gebracht wird. Im Anschluß an die spezifische Bindungsreaktion wird die Enzymaktivität entweder der unlöslichen Phase oder der flüssigen Phase untersucht und dadurch mit der Menge des Liganden im Medium in Beziehung gebracht.
Im U.S.-Patent Nr. 4 271 140, an 2. Juni 1981 an Bunting ausgegeben, wird die Verwendung von nichtkovalenten Bindungssystemen für spezifische Doppelrezeptor-Bindungsassays offenbart, wobei ein erster Rezeptor durch einen zweiten Rezeptor gebunden wird, wobei der erste Rezeptor in der Lage ist, reversibel entweder an einen Liganden oder einen anderen Rezeptor zu binden.
Im U.S.-Patent Nr. 4 659 678, am 21. April 1987 an Forrest et al. ausgegeben, wird ein Immunoassay für den Nachweis eines Antigens in einer flüssigen Probe offenbart, wobei zwischen einem in der Probe enthaltenem Antigen und zwei oder mehr Antikörper-Reagenzien ein Komplex gebildet wird, der Komplex durch eine nichtkovalente Bindung an einen festen Träger gebunden ist, so daß die Menge des an den Träger gebundenen Komplexes bestimmt wird, und beim Verfahren wird wenigstens ein monoklonaler Antikörper verwendet. Das Biotin-Avidin- System wird als ein Beispiel für ein in der Erfindung nützliches Bindungssystem mit einer hohen Affinität beschrieben.
Für das Avidin-Biotin-System in Diagnose-Assays gibt es eine Reihe von Einschränkungen. Eine Einschränkung beruht auf den Auftreten eines unspezifischen Bindens, was im allgemeinen der Basizität des durch Reporter markierten Avidins oder Streptavidins zugeordnet wird. Normalerweise können unspezifisch gebundene Komponenten aus den Systemen mit festen Trägern, die Polystyrol, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran auf Nitrocellulose-Papier, Glaskügelchen, Kunststoffrohren oder Mikro-Titerplatten umfassen können, nicht herausgewaschen werden. Das Rauschen des resultierenden Signals ist besonders dann unangenehm, wenn die zu untersuchende Komponente in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist. Normalerweise wird Streptavidin statt Avidin verwendet, um das unspezifische Binden zu minimieren.
Eine andere Einschränkung eines Avidin-Biotin-Systems besteht darin, daß seine Verwendung im allgemeinen auf die Messung des Analyten von Interesse beschränkt ist, während dieser an einen festen Träger gebunden ist. In den Fällen, in denen der Reporter ein Enzym ist, können praktische Schwierigkeiten auftreten, die mit der Messung verbunden sind, während der Komplex an die feste Phase gebunden bleibt. Der Vorteil des Messens eines durch Enzym markierten Immuno-Komplexes in freier Lösung besteht darin, daß er in freier Lösung viel leichter mit einem Substrat reagiert, als wenn er an einen festen Träger gebunden ist, da die Reaktion in freier Lösung weniger durch Diffusion eingeschränkt und sterisch weniger gehindert ist. Dieser Umstand bietet einen großen Vorteil, wenn Immunoassays in automatisierten Diagnosesystemen durchgeführt werden. Weiterhin können Immunoassays, die die Messung einer analytisch nachweisbaren, an eine feste Phase gebundene Gruppe erfordern, dahingehend eingeschränkt sein, daß sie die Verwendung eines speziellen Typs fester Träger wie derjenigen, die farblos und transparent sind, erforderlich machen.
Die mit dem Messen eines durch Reporter markierten, an einen festen Träger gebundenen Immuno-Komplexes verbundenen Probleme, wie sie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben sind, haben Bemühungen stimuliert, die auf die Freisetzung des markierten Immuno-Komplexes aus dem Träger in die freie Lösung abzielen. Ein Versuch besteht darin, die Chemie so zu entwikkeln, daß der Immuno-Komplex durch eine chemische Struktur, die durch eine chemische Reaktion wie eine Reduktion, Oxidation oder Hydrolyse gespalten werden kann, am festen Träger gebunden wird. Zum Beispiel wird im U.S.-Patent 4 231 999, am 4. November 1980 an Carlsson et al. ausgegeben, ein Reagens zur Verwendung mit einem immunochemischen Assay offenbart, das eine verbesserte, auf einem Thiol-Disulfid-Austausch basierende Konjugierungstechnik erfordert. Das Reagens ist durch die Tatsache gekennzeichnet, daß es ein lösliches Konjugat eines oder mehrerer Immunoglobulin-Moleküle und eine oder mehrere Einheiten aus einer analytisch nachweisbaren Gruppe umfaßt, in der Moleküle und Einheiten über Brücken, die die spaltbare -S-S--Gruppe enthalten, miteinander verbunden sind.
Die Verwendung der chemisch spaltbaren Brücken zur Bindung von Immuno-Komplexen und dergleichen an feste Träger stellt ein elegantes Konzept dar, hat sich aber nur in Spezialfällen als wertvoll erwiesen, da die rauhen Bedingungen, die zum Brechen der Brücke verwendet werden, auch anderswo eine Beschädigung verursachen können und somit die im freigesetzten Komplex erforderliche Bioaktivität vermindern oder zerstören. Aus diesem Grund bestände in der Verwendung eines gewissen nichtkovalenten Systems, das einen Liganden und seinen Bindungspartner als Brücke zur Bindung an Komponenten eines Assaysystems umfaßt, und eines Mittels zur schnellen und schonenden Verdrängung des Liganden von seinem Bindungspartner zur anschließenden Trennung der Komponenten des Assaysystems eine weiter anwendbare Technik.
Die meisten Anwendungen der zuvor beschriebenen Biotin-Avidin- Systeme betreffen nur eine feste und wirksame Bindung. Hofmann et al. [Biochemistry 21: 978-984 (1982) offenbaren jedoch, daß Biotinyl-Insulin und einige seiner Analoge nichtkovalent an an AH-Sepharose immobilisiertes Succinoylavidin binden können und durch das Einwirken von Puffern, die einen Biotin-Überschuß enthalten, auf das geladene Harz biospezifisch freigesetzt werden können. Es wird hier festgestellt, daß es sich bei Succinoylavidin um ein chemisch modifiziertes Avidin handelt, das einen niedrigeren isoelektrischen Punkt als Avidin selbst aufweist. Es ist somit weniger wahrscheinlich, das es Probleme mit einer unspezifischen Bindung verursacht.
Darüber hinaus wird im U.S.-Patent 4 971 904 ein heterogener Immunoassay offenbart, bei dem Materialien verwendet werden, die zur reversiblen Immobilisierung (d.h. zur Absorption) von proteinhaltigen Bindungspartnern biologischen Materials von Interesse sind, und das Entfernen markierter Komplexe von diesen Trägern durch die Verwendung von Freisetzungs-Reagenzien, wodurch die anschließende Bestimmung der Menge des Markers in der Flüssigkeitsphase möglich wird.
Lichstein et al. [Biochemical and Biophysical Research Communications 20 (1): 41-45 (1965)] offenbaren jedoch die Verwendung von Avidin und Streptavidin zur Kennzeichnung von Biotin- Analoga. Es wurde bestimmt, daß Streptavidin, im Gegensatz zu Avidin, nicht in der Lage ist, das zu Biotin analoge Dethiobiotin zu binden.
Finn et al. [Biochemistry, 23:2554-2558, (1984)] offenbaren eine Serie biotinylierten und dethiobiotinylierten Insulins, das dazu in der Lage ist, mit Succinoylavidinen Komplexe zu bilden, wobei der Abstand zwischen der Carboxylgruppe des Biotins und dem Insulin um 7 - 20 Atome variiert. Im Gegensatz dazu offenbaren Finn et al. weiterhin, daß es nicht gelang, Dethiobiotin und dessen Amid an Streptavidin zu binden, wodurch der Befund von Lichstein et al. bestätigt wird.
Ikariyama et al. [Analytical Chem. Symp. Series, 17 (Chem. Sensors):693-698 (1983)] offenbaren einen Bioaffinitätssensor für Biotin, bei dem ein mit einem membrangebundenen Azofarbstoff-Enzym markierter Avidin-Komplex verwendet wird. Bei der Einwirkung einer Biotin enthaltenden Lösung wird das durch das Enzym markierte Avidin aus der Membran freigesetzt, wodurch ein stabiler Avidin-Biotin-Komplex in Lösung gebildet wird.
Es besteht eine Notwendigkeit für einen spezifischen Bindungsassay, bei dem ein freisetzbarer Ligand in einem reversiblen Bindungs-Verdrängungssystem verwendet wird, wobei ein freisetzbarer Ligand schnell durch einen Verdrängungsliganden verdrängt wird, so daß ein Teil eines immobilisierten Komplexes, der einen Reporter oder eine analytisch nachweisbare Gruppe oder mindestens den Reporter oder die analytisch nachweisbare Gruppe selbst enthält, in ein freies, flüssiges Medium freigesetzt wird und anschließend quantitativ gemessen wird. Weiterhin besteht eine Notwendigkeit für einen spezifischen Bindungsassay, durch den eine Interferenz, die aus der unspezifischen Bindung der Reporter-Komponente an einer unlöslichen Phase resultieren könnte, vermindert oder eliminiert wird.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei einem ersten Assay dieser Erfindung handelt es sich um einen nicht-kompetitiven, spezifischen Bindungsassay für einen Analyten, umfassend die Schritte des:
A. Herstellens einer immobilisierten Sandwich-Struktur, bestehend im wesentlichen aus:
1. einem festen Träger, an den ein erster Bindungspartner durch einen Linker gebunden ist, wobei der erste Bindungspartner aus der aus Streptavidin, Avidin, succinyliertem Avidin, Nucleinsäure und Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
2. einem Analyten oder einem zweiten Bindungspartner:Analyt-Komplex und
3. einem freisetzbaren Liganden, wobei der freisetzbare Ligand:
a. durch eine temporäre Bindung an den ersten Bindungspartner und durch eine kovalente Bindung an den zweiten Bindungspartner des zweiten Bindungspartner:Analyt-Komplexes, wobei der Analyt des zweiten Bindungspartner: Analyt-Komplexes an einen dritten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran gebunden ist; oder
b. durch eine temporäre Bindung an einen dritten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran und durch eine kovalente Bindung am zweiten Bindungspartner des zweiten Bindungspartner:Analyt-Komplexes oder
c. durch eine temporäre Bindung an einen zweiten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran und durch eine kovalente Bindung am Analyten;
gebunden wird, indem der feste Träger mit einem daran gebundenen ersten Bindungspartner mit:
1. einer flüssigen Probe, die vermutlich den Analyten enthält;
2. einem freisetzbaren Liganden, entweder allein oder durch eine kovalente Bindung am zweiten Bindungspartner gebunden; und
3. dem zweiten oder dritten Bindungspartner, an dem sich der nachweisbare Reporter befindet;
in Berührung gebracht wird;
B. Trennens der immobilisierten Sandwich-Struktur von den löslichen Komponenten;
C. Brechens der temporären Bindung durch das:
1. Zugeben eines Überschusses eines Verdrängungsliganden in bezug auf den freisetzbaren Liganden; oder das
2. Zugeben eines Verdrängungsliganden, wobei die Affinität des Verdrängungsliganden zu entweder dem ersten, zweiten oder dritten Bindungspartner größer als die Affinität des freisetzbaren Liganden zum ersten, zweiten oder dritten Bindungspartner ist; und
D. Messens des nachweisbaren Reporters in Lösung.
Bei einem zweiten Assay dieser Erfindung handelt es sich um einen kompetitiven, spezifischen Bindungsassay für einen Analyten, umfassend die Schritte des:
A. Immobilisierens eines Analyten oder eines ersten Bindungspartners, der dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung einen freisetzbaren Liganden zu binden, auf einem festen Träger;
B. Bildens eines durch einen immobilisierten Reporter markierten Komplexes, indem das Produkt von Schritt A mit einer Mischung in Berührung gebracht wird, die den durch einen immobilisierten Reporter markierten Komplex enthält, indem:
1. eine flüssige, den Analyten enthaltende Probe;
2. eine bekannte Menge eines ersten Bindungspartners, der durch eine kovalente Bindung an einen freisetzbaren Ligand gebunden ist, wobei der erste Bindungspartner zur Bindung an den Analyten fähig ist, oder eine bekannte Menge eines freisetzbaren Liganden:Analyt-Komplexes, wobei der freisetzbare Ligand dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung an den ersten Bindungspartner auf dem festen Träger gebunden zu sein; und
3. ein zweiter Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran, wobei der zweite Bindungspartner dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung an den freisetzbaren Liganden oder eine bekannte Menge eines zweiten Bindungspartners gebunden zu sein, der dazu fähig ist, mit einem nachweisbaren Reporter daran an den Analyten gebunden zu sein;
kombiniert wird;
C. Trennens des durch den immobilisierten Reporter markierten Komplexes von den löslichen Komponenten;
D. Brechens der temporären Bindung durch das:
1. Zugeben eines Überschusses eines Verdrängungsliganden in bezug auf den freisetzbaren Liganden oder das
2. Zugeben eines Verdrängungsliganden, wobei die Affinität des Verdrängungsliganden zu entweder dem ersten oder dem zweiten Bindungspartner größer als die Affinität des freisetzbaren Liganden zum ersten oder zweiten Bindungspartner ist; und
E. Messens des Reporters in Lösung.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen spezifischen Bindungsassay, bei dem ein nichtimmunes, reversibles Bindungs- Verdrängungssystem verwendet wird, in dem ein freisetzbarer Ligand, ein Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden, ein Analyt von Interesse, eine Reportergruppe und wenigstens ein Bindungspartner für den Analyten an eine unlösliche Phase gebunden sind, so daß ein durch den Reporter markierter, an eine unlösliche Phase gebundener Komplex gebildet wird. Der Herstellung des gebundenen Komplexes folgt die Zugabe eines Verdrängungsliganden, der den freisetzbaren Liganden zusammen mit einem bestimmten Teil des durch den Reporter markierten Komplexes verdrängt, so daß der Reporter in einem freien, flüssigen Medium analytisch nachweisbar ist und in Beziehung zur Konzentration des Analyten in der Probe gesetzt werden kann.
Bei dem freisetzbaren Liganden handelt es sich um eine beliebige Substanz, die dazu in der Lage ist, durch einen Verdrängungsliganden freigesetzt zu werden, indem ein Überschuß des Verdrängungsliganden zu einer unlöslichen Phase, an die ein freisetzbarer Ligand gebunden ist, gegeben wird, indem der Verdrängungsligand, dessen Affinität für einen Bindungspartner größer als die des freisetzbaren Liganden für den Bindungspartner ist, zugegeben wird, oder indem eine Kombination von beidem verwendet wird. Der freisetzbare Ligand kann mit dem Verdrängungsliganden strukturell identisch sein; so daß ein Überschuß des Verdrängungsliganden ausreichend ist, um den freisetzbaren Liganden freizusetzen; der freisetzbare Ligand kann ein strukturelles Analogon des Verdrängungsliganden sein; oder der freisetzbare Ligand kann vom Verdrängungsliganden strukturell verschieden sein.
Das nichtimmune, reversible System dieser Erfindung, wobei ein freisetzbarer Ligand und ein Verdrängungsligand zur Freisetzung wenigstens eines Teils eines durch einen Reporter markierten Komplexes aus einer unlöslichen Phase verwendet wird, um einen Analyten von Interesse in einem freien, flüssigen Medium nachzuweisen, kann auf jeden spezifischen Bindungsassay einschließlich kompetitiver und nicht-kompetitiver Immunoassays und DNA-Sonden-Assays angewandt werden.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein nicht-kompetitiver Sandwich-Immunoassay, wobei eine feste Phase, auf der ein erster Bindungspartner immobilisiert wird, der dazu in der Lage ist, den Analyten von Interesse zu binden, ein zweiter Bindungspartner, der kovalent an Dethiobiotin (DTB) gebunden ist, wobei DTB als freisetzbarer Ligand dient, durch einen Reporter markiertes Streptavidin, wobei das Streptavidin als dritter Bindungspartner dient und dazu in der Lage ist, durch eine temporäre Bindung am freisetzbaren Liganden zu binden, verwendet wird. Biotin dient als Verdrängungsligand. Alternativ kann Streptavidin am zweiten Bindungspartner kovalent gebunden sein und durch eine temporäre Bindung an DTB, das durch einen Reporter markiert ist, gebunden sein. In Figur 1 stellt Sandwichstruktur 1 diese bevorzugte Ausführungsform dar.
Die Bindung eines Bindungspartners an eine unlösliche Phase kann unter Verwendung bekannter Verfahren wie derjenigen hergestellt werden, die im U.S.-Patent Nr. 4 661 408, am 28. April 1987 an Lau et al. ausgegeben, offenbart werden. Ein Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden oder ein Bindungspartner für den Analyten kann durch Vernetzen, durch nichtkovalente Bindung oder vorzugsweise durch kovalente Bindung an einen festen Träger gebunden sein. Es kann jeder beliebige feste Träger verwendet werden, an den ein spezifischer Bindungspartner gebunden werden kann; beispielsweise können feste Träger, ohne darauf beschränkt zu sein, Chromdioxidteilchen, Siliciumdioxid, Eisenoxid, Säulen mit Harz auf der Grundlage von Sepharose, Polystyrol, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran auf Nitrocellulose-Papier, Glaskügelchen, Leuchtstoff-Teilchen, Faserglas, Kunststoffrohre oder Mikrotiterplatten umfassen. Chromdioxidteilchen sind bevorzugt.
Bei einem Bindungspartner für einen Analyten kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die dazu in der Lage ist, kovalent an einen festen Träger zu binden oder kovalent an einen freisetzbaren Liganden, Verdrängungsliganden oder einen anderen Bindungspartner zu binden, während sie ihre Fähigkeit zur spezifischen Bindung des Analyten von Interesse oder des freisetzbaren Liganden beibehält. Beispiele für Bindungspartner für einen Analyten umfassen Antikörper, Antigene, Rezeptoren und Nucleinsäuren.
Bei einem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die dazu in der Lage ist, reversibel an den freisetzbaren Liganden und an den Verdrängungsliganden zu binden, so daß eine temporäre Bindung gebildet wird. Eine temporäre Bindung ist eine Bindung zwischen einem freisetzbaren Liganden und einem Bindungspartner, die bei der Zugabe eines Verdrängungsliganden, der den freisetzbaren Liganden verdrängt, gebrochen werden kann. Beispiele für geeignete Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden umfassen Avidin, Streptavidin, succinyliertes Avidin, Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und einen funktionalisierten Azofarbstoff. Streptavidin ist bevorzugt.
Bei einem Verdrängungsliganden kann es sich um eine beliebige Substanz handeln, die dazu in der Lage ist, einen freisetzbaren Liganden zu verdrängen, der durch eine temporäre Bindung reversibel an einen Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebunden ist. Beispiele für geeignete Verdrängungsliganden umfassen Biotin, Dethiobiotin, Streptavidin oder Avidin. Biotin ist ein bevorzugter Verdrängungsligand.
Bei einem freisetzbaren Liganden handelt es sich um eine beliebige Substanz, die dazu in der Lage ist, durch einen Verdrängungsliganden verdrängt zu werden. Mit Verdrängung ist das Brechen einer temporären Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und einem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden bei der Zugabe eines Verdrängungsliganden gemeint. Der freisetzbare Ligand kann mit dem Verdrängungsliganden strukturell identisch sein; der freisetzbare Ligand kann ein strukturelles Analogon des Verdrängungsliganden sein; oder der freisetzbare Ligand kann vom Verdrängungsliganden strukturell verschieden sein. Beispiele für geeignete freisetzbare Liganden umfassen Dethiobiotin, Iminobiotin, 2-[4-(Hydroxy-1- naphthalinyl)azo]benzoesäure (NABA), 2-[8-Hydroxy-5-chinolinyl)azo]benzoesäure (QABA), 2-[2,6-Dimethyl-4-hydroxyphenyl)azo]benzoesäure (Dimethyl-HABA), Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin. Dethiobiotin ist bevorzugt. Es ist bevorzugt, daß die Affinität des freisetzbaren Liganden zu dem Bindungspartner größer als 10&sup7; M&supmin;¹ ist.
Das Verdrängen des freisetzbaren Liganden durch den Verdrängungsliganden kann durch mehrere Mittel bewerkstelligt werden. Wenn der freisetzbare Ligand und der Verdrängerligand strukturell identisch sind, kann ein Überschuß des Verdrängungsliganden in bezug auf den freisetzbaren Liganden zugegeben werden, um die temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und seinem Bindungspartner zu brechen. Wenn es sich beispielsweise bei dem freisetzbaren Liganden um Biotin handelt, das durch eine temporäre Bindung an einen Bindungspartner wie ein Protein gebunden ist, kann ein Überschuß freien Biotins in bezug auf das an das Protein gebundene Biotin als Verdrängungsligand zugegeben werden, um die temporäre Bindung zu brechen. Die Verdrängung des freisetzbaren Liganden kann auch durch die Zugabe eines Verdrängungsliganden bewerkstelligt werden, der eine höhere Affinitätskonstante für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweist als der freisetzbare Ligand. Wenn zum Beispiel Dethiobiotin der freisetzbare Ligand ist und Streptavidin der Bindungspartner ist, kann Biotin, das eine höhere Affinitätskonstante für Streptavidin als Dethiobiotin aufweist, als der Verdrängungsligand verwendet werden. Eine Kombination der beiden oben beschriebenen Verfahren zur Verdrängung des freisetzbaren Liganden kann ebenfalls verwendet werden.
Es wird erwogen, daß andere freisetzbare Liganden, Verdrängungsliganden und Bindungspartner für die freisetzbaren Liganden zur Verwendung mit dieser Erfindung geeignet sein können, vorausgesetzt, die oben vorgeschriebenen Bedingungen werden erfüllt.
Die Verfahren dieser Erfindung können unter Verwendung verschiedener kompetitiver und nicht-kompetitiver spezifischer Bindungsassays praktiziert werden. Die folgenden Beispiele veranschaulichen mehrere Variationen von nicht-kompetitiven, spezifischen Bindungsassays, die unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung praktiziert werden können.
Bei einem ersten Beispiel handelt es sich um einen spezifischen Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit, umfassend das:
(a) Verfügbarmachen einer unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden;
(b) In-Berührung-Bringen der unlöslichen Phase mit den folgenden Komponenten:
1. einem flüssigen Medium, das vermutlich den Analyten enthält;
2. einem zweiten Bindungspartner, der dazu in der Lage ist, den kovalent an einen freisetzbaren Liganden gebundenen Analyten zu binden;
3. einen dritten Bindungspartner, der dazu in der Lage ist, an den freisetzbaren Liganden gebunden zu sein und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
wodurch eine immobilisierte Sandwich-Struktur gebildet wird, so daß der freisetzbare Ligand durch eine temporäre Bindung am dritten Bindungspartner gebunden ist;
(c) Abtrennen nicht umgesetzter Komponenten von der immobilisierten Sandwich-Struktur;
(d) In-Berührung-Bringen der immobilisierten Sandwich-Struktur mit einem Verdrängungsliganden, so daß die temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem dritten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil der den Reporter enthaltenden Sandwich-Struktur von der immobilisierten Sandwich-Struktur getrennt wird; und das
(e) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 1 werden in Sandwich-Struktur 1 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im ersten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten beiden Komponenten, umfassend das flüssige, vermutlich den Analyten enthaltenden Medium, und der zweite Bindungspartner, der dazu in der Lage ist, an den kovalent an einen freisetzbaren Liganden gebundenen Analyten zu binden, zuerst mit der unlöslichen Phase in Berührung gebracht, an der ein erster Bindungspartner, der zur Bindung an den Analyten in der Lage ist, gebunden ist. Diesem Schritt folgt das Waschen zur Entfernung nicht umgesetzter Komponenten, und dem Waschschritt folgt das In-Berührung-Bringen mit der dritten Komponente, die einen dritten Bindungspartner umfaßt, der dazu in der Lage ist, an den freisetzbaren Liganden gebunden zu werden, und an den ein nachweisbarer Reporter gebunden ist.
Der erste Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden kann kovalent direkt an der unlöslichen Phase gebunden werden, wobei bekannte Kopplungsverbindungen verwendet werden, oder er kann unter Verwendung von Bindungspartnern wie Biotin gebunden werden, das seinerseits kovalent an der unlöslichen Phase gebunden sein kann.
Ein zweites Beispiel ist ein spezifischer Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium, umfassend das:
(a) Verfügbarmachen einer unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen freisetzbaren Liganden zu binden;
(b) In-Berührung-Bringen der unlöslichen Phase mit den folgenden Komponenten:
1. einem flüssigen Medium, das vermutlich den Analyten enthält;
2. einem zweiten Bindungspartner, der kovalent an einen freisetzbaren Liganden gebunden ist und der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden; und
3. einen dritten Bindungspartner, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
wodurch eine immobilisierte, durch einen Reporter markierte Sandwich-Struktur gebildet wird, bei der der freisetzbare Ligand durch eine temporäre Bindung am ersten Bindungspartner gebunden ist;
(c) Abtrennen nicht umgesetzter Komponenten von der immobilisierten, durch einen Reporter markierten Sandwich-Struktur;
(d) In-Berührung-Bringen der immobilisierten, durch einen Reporter markierten Sandwich-Struktur mit einem Verdrängungsliganden, so daß die temporäre Bindung zwischen den freisetzbaren Liganden und dem ersten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil der den Reporter enthaltenden Sandwich-Struktur freigesetzt wird; und das
(e) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 1 werden in Sandwich-Struktur 2 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im zweiten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.
Ein drittes Beispiel ist ein spezifischer Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium, umfassend das:
(a) Verfügbarmachen einer unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen Analyten zu binden;
(b) In-Berührung-Bringen der unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen Analyten zu binden, mit:
1. einem flüssigen Medium, das vermutlich den Analyten enthält;
2. einem freisetzbaren Liganden, der aktiviert wurde, so daß er dazu in der Lage ist, kovalent am Analyten zu binden;
wodurch eine immobilisierte Sandwich-Struktur gebildet wird, bei der der freisetzbare Ligand kovalent am Analyten gebunden ist;
(c) Abtrennen nicht umgesetzter Komponenten von der immobilisierten Sandwich-Struktur;
(d) In-Berührung-Bringen der immobilisierten Sandwich-Struktur mit einem zweiten Bindungspartner, der in der Lage ist, an den freisetzbaren Liganden zu binden, und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
wodurch eine immobilisierte, durch einen Reporter markierte Sandwich-Struktur gebildet wird;
(e) In-Berührung-Bringen der immobilisierten, durch einen Reporter markierten Sandwich-Struktur mit einem Verdrängungsliganden, so daß die temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem zweiten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil der den Reporter enthaltenden Sandwich-Struktur freigesetzt wird; und das
(f) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
Der freisetzbare Ligand kann mit dem flüssigen, vermutlich den Analyten enthaltenden Medium umgesetzt werden, so daß der freisetzbare Ligand vor oder gleichzeitig mit dem Kontakt mit der unlöslichen Phase kovalent an den Analyten gebunden wird. Es ist bevorzugt, den Analyten vor dem Kontakt mit der unlöslichen Phase mit dem freisetzbaren Liganden umzusetzen. Der freisetzbare Ligand kann aktiviert sein, damit die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem Analyten ermöglicht wird. Die Aktivierung des freisetzbaren Liganden kann durch die Anwendung bekannter Verfahren zur Herstellung biotinylierter Analyten, wie Ishikawa et al., Clinic. Biochem., 23:445-453 (1990), bewerkstelligt werden.
In Figur 1 werden in Sandwich-Struktur 3 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im dritten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.
Ein viertes Beispiel ist ein spezifischer Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium, umfassend das:
(a) Verfügbarmachen einer unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen Analyten zu binden;
(b) Inkubieren der folgenden Komponenten:
1. eines flüssigen Mediums, das vermutlich den Analyten enthält;
2. eines zweiten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden und der kovalent an einen ersten freisetzbaren Liganden gebunden ist;
3. eines dritten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, an den ersten freisetzbaren Liganden zu binden; und
4. eines zweiten freisetzbaren Ligandens, der dazu in der Lage ist, an den dritten Bindungspartner zu binden und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
wodurch eine Mischung gebildet wird, die einen durch einen Reporter markierten Komplex enthält;
(c) In-Berührung-Bringen der unlöslichen Phase mit der Mischung, die den durch einen Reporter markierten Komplex enthält, wodurch eine immobilisierte, durch einen Reporter markierte Sandwich-Struktur gebildet wird;
(d) In-Berührung-Bringen der immobilisierten, durch einen Reporter markierten Sandwich-Struktur mit einem Verdrängungsliganden, so daß die temporären Bindungen zwischen dem ersten und zweiten freisetzbaren Liganden und dem dritten Bindungspartner gebrochen werden und ein Teil des den Reporter enthaltenden Komplexes freigesetzt wird; und das
(e) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 1 werden in Sandwich-Struktur 4 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im vierten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.
Bei den oben aufgeführten Beispielen kann die unlösliche Phase gleichzeitig mit allen aufgeführten Komponenten in Berührung gebracht werden, gefolgt vom Waschen zum Entfernen nicht umgesetzter Komponenten, oder die Komponenten werden nacheinander in der angegebenen Reihenfolge zugegeben, wobei nach dem Kontakt mit jeder Komponente gewaschen wird, oder die Komponenten werden in irgendeiner anderen erwünschten Abfolge zugegeben. Bei der bevorzugten Ausführungsform (Figur 1, Sandwich-Struktur 1) ist es bevorzugt, daß die Komponenten wie oben beschrieben nacheinander zugegeben werden. Darüber hinaus kann bei allen der oben aufgeführten Beispiele der freisetzbare Ligand strukturell mit dem Verdrängungsliganden identisch sein, ein Analogon des Verdrängungsliganden sein oder strukturell vom Verdrängungsliganden verschieden sein. Falls der freisetzbare Ligand mit dem Verdrängungsligand strukturell identisch ist, muß der Verdrängungsligand im Überschuß zum freisetzbaren Liganden vorhanden sein, damit dieser erfolgreich verdrängt wird.

Figur 1

IMMOBILISIERTE SANDWICH-STRUKTUREN UND VERDRÄNGUNGSLIGANDEN - NICHT-KOMPETITIVE, SPEZIFISCHE BINDUNGSASSAYS

SANDWICH-STRUKTUR 1:

UNLÖSLICHE PHASE-BP1:ANALYT:BP2-RL BP3-*
Dritter Bindungspartner (BP3) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin, wobei der freisetzbare Ligand Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff ist; Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und ein funktionalisierter Azofarbstoff, wobei der freisetzbare Ligand Streptavidin, succinyliertes Avidin oder Avidin ist
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin, funktionalisierter Azofarbstoff, Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 1 (Fortsetzung):

Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Erster Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 2:

UNLÖSLICHE PHASE-BP1 RL-BP2:ANALYT:BP3-*
Erster Bindungspartner (BP1) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin.
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 2 (Fortsetzung):

Dritter Bindungspartner (BP3) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 3:

UNLÖSLICHE PHASE-BP1:ANALYT-RL BP2-*
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Erster Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 4:

UNLÖSLICHE PHASE-BP1:ANALYT:PB2-RL BP3 RL-*
Dritter Bindungspartner (BP3) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)

Figur 1 (Fortsetzung)

SANDWICH-STRUKTUR 4 (Fortsetzung):

Erster Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung
Das folgende sind Beispiele für kompetitive, spezifische Bindungsassays, die unter Anwendung des Verfahrens dieser Erfindung praktiziert werden können.
Ein fünftes Beispiel für einen spezifischen Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium umfaßt das:
(a) Bereitstellen einer unlöslichen Phase, an die ein Analyt von Interesse gebunden ist;
(b) Bilden einer Mischung eines durch einen Reporter markierten Komplexes durch das Kombinieren der folgenden Komponenten:
1. einer gemessenen Menge eines flüssigen, vermutlich den Analyten enthaltenden Mediums;
2. einer bekannten Menge eines ersten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden, und der kovalent an einen freisetzbaren Liganden gebunden ist;
3. einem zweiten Bindungspartner, der dazu in der Lage ist, an den freisetzbaren Liganden zu binden, und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
(c) In-Berührung-Bringen der Mischung, die den durch den Reporter markierten Komplex enthält, mit der unlöslichen Phase, wodurch ein immobilisierter, durch einen Reporter markierter Komplex gebildet wird;
(d) Abtrennen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes von löslichen Komponenten;
(e) In-Berührung-Bringen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes mit einem Verdrängungsliganden, so daß eine temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem zweiten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil des den Reporter enthaltenden Komplexes freigesetzt wird; und das
(f) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 2 werden in Struktur 1 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im fünften Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.
Ein sechstes Beispiel für einen spezifischen Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium umfaßt das:
(a) Bereitstellen einer unlöslichen Phase, an die ein Analyt von Interesse gebunden ist;
(b) Bilden einer Mischung eines durch einen Reporter markierten Komplexes durch das Kombinieren der folgenden Komponenten:
1. einer gemessenen Menge eines flüssigen, vermutlich den Analyten enthaltenden Mediums;
2. einer bekannten Menge eines ersten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden, und der kovalent an einen zweiten Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen freisetzbaren Liganden zu binden; und
3. einem freisetzbaren Liganden, an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
(c) In-Berührung-Bringen der unlöslichen Phase mit der Mischung aus dem durch den Reporter markierten Komplex, wodurch ein immobilisierter, durch einen Reporter markierter Komplex gebildet wird;
(d) Abtrennen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes von löslichen Komponenten;
(e) In-Berührung-Bringen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes mit einem Verdrängungsliganden, so daß eine temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem zweiten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil des den Reporter enthaltenden Komplexes freigesetzt wird; und das
(f) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 2 werden in Struktur 2 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im sechsten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.
Ein siebtes Beispiel für einen spezifischen Bindungsassay zur Bestimmung eines Analyten in einem flüssigen Medium umfaßt das:
(a) Bereitstellen einer unlöslichen Phase, an die ein erster Bindungspartner gebunden ist, der dazu in der Lage ist, an einen daran gebundenen, freisetzbaren Liganden zu binden;
(b) Bilden einer Mischung eines durch einen Reporter markierten Komplexes durch das Kombinieren der folgenden Komponenten:
1. einer gemessenen Menge eines flüssigen, vermutlich den Analyten enthaltenden Mediums;
2. einer bekannten Menge eines freisetzbaren, kovalent an den Analyten gebundenen Liganden; und
3. einer bekannten Menge eines zweiten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, an den Analyten zu binden und an dem sich ein nachweisbarer Reporter befindet;
(c) In-Berührung-Bringen der Mischung, die den durch den Reporter markierten Komplex enthält, mit der unlöslichen Phase, wodurch ein immobilisierter, durch einen Reporter markierter Komplex gebildet wird;
(d) Abtrennen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes von löslichen Komponenten;
(e) In-Berührung-Bringen des immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplexes mit einem Verdrängungsliganden, so daß eine temporäre Bindung zwischen dem freisetzbaren Liganden und dem ersten Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden gebrochen wird und ein Teil des den Reporter enthaltenden Komplexes freigesetzt wird; und das
(f) Messen des freigesetzten Reporters in freier Lösung.
In Figur 2 werden in Struktur 3 mehrere Kombinationen aus dem freisetzbaren Liganden, dem Verdrängungsliganden und dem Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden dargestellt, die zur Verwendung im siebten Beispiel eines spezifischen Bindungsassays, bei dem das Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, geeignet sind.

Figur 2

IMMOBILISIERTE STRUKTUREN UND VERDRÄNGUNGSLIGANDEN - KOMPETITIVE, SPEZIFISCHE BINDUNGSASSAYS

STRUKTUR 1:

UNLÖSLICHE PHASE-ANALYT:BP1-RL BP2-*
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Erster Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung

Figur 2 (Fortsetzung)

STRUKTUR 2:

UNLÖSLICHE PHASE-ANALYT:BP1-BP2 RL-*
Zweiter Bindungspartner (BP2) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Erster Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung

Figur 2 (Fortsetzung)

STRUKTUR 3:

UNLÖSLICHE PHASE-BP1 RL-ANALYT:BP2-*
Erster Bindungspartner (BP1) = Streptavidin, succinyliertes Avidin und Avidin
Freisetzbarer Ligand (RL) = Biotin, Dethiobiotin, Iminobiotin und funktionalisierter Azofarbstoff
Verdrängungsligand (DL) = Biotin, Dethiobiotin (kann verwendet werden, um freisetzbare Liganden zu verdrängen, die eine niedrigere Affinität für den Bindungspartner des freisetzbaren Liganden aufweisen, wie Iminobiotin oder funktionalisierter Azofarbstoff, oder er kann im Komplex enthaltenes Dethiobiotin verdrängen, falls überschüssiges oder freies Dethiobiotin zugegeben wird), und Streptavidin (kann Streptavidin im Komplex verdrängen, falls überschüssiges freies Streptavidin zugegeben wird)
Zweiter Bindungspartner (BP1) = Beliebiger spezifischer Bindungspartner für den Analyten einschließlich Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren und Rezeptoren
* = nachweisbare Reportergruppe
= temporäre Bindung
: = Bindung zwischen dem Bindungspartner für den Analyten und dem Analyten
- = kovalente Bindung
Immer dann, wenn der Verdrängungsligand vom freisetzbaren Liganden strukturell verschieden ist, muß die Affinität des Verdrängungsliganden für den Bindungspartner größer als die Affinität des freisetzbaren Liganden zum Bindungspartner sein. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Affinität des Verdrängungsliganden für den Bindungspartner zur Affinität des freisetzbaren Liganden zum Bindungspartner 10².
Es kann eine beliebige Reportergruppe verwendet werden, die bei der Freisetzung des durch einen Reporter markierten Teils des Komplexes in die freie Lösung als Folge der Verdrängung des freisetzbaren Liganden durch den Verdrängungsliganden analytisch nachweisbar ist. Beispiele für solche Reportergruppen umfassen, sind aber nicht begrenzt auf: Enzyme, Fluoreszenz-Farbstoffe, Phosphoreszenz-Farbstoffe, Radioisotope und elektronendichte Marker. Enzyme sind bevorzugte Reporter. Die Reportergruppe kann abhängig von der jeweiligen Assay-Konfiguration an einen beliebigen Teil des letzten Endes in die freie Lösung freigesetzten Komplexes gebunden sein. Zum Beispiel kann die Reportergruppe an den freisetzbaren Liganden, an den Bindungspartner für den freisetzbaren Liganden oder den Bindungspartner für den Analyten gebunden sein. Die Reportergruppe kann unter Verwendung bekannter Verfahren [Kitagawa, Enzyme Immunoassays, S. 81-89, Igaku-Shoah, Tokyo, N.Y. (1981)] gebunden sein.
Gemäß der oben beschriebenen Beispiele dieser Erfindung, die sich speziell auf spezifische Bindungsassays beziehen, bei denen ein Bindungspartner an eine unlösliche Phase gebunden ist, handelt es sich beim bevorzugten freisetzbaren Liganden um Dethiobiotin. Es ist besonders bevorzugt, daß Dethiobiotin durch ein hydrophiles Spacer-Molekül an einen Bindungspartner gebunden ist. Der freisetzbare Ligand kann über einen hydrophilen Spacer am Träger konjugiert sein, der von einer sehr wasserlöslichen Verbindung abstammt, die an einem Ende durch eine Amingruppe und am anderen Ende durch eine Carboxylgruppe funktionalisiert ist und somit richtig als α,ω-Aminosäure entworfen ist.
Die bevorzugten, in dieser Erfindung nützlichen Spacer-Moleküle weisen die allgemeine Formel:
H&sub2;N- H-(CH&sub2;)a-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)b-(CH&sub2;)a- H-NH- -(CH&sub2;)c- O-H
auf, wobei R = H oder CH&sub3;
a = 1 oder 2
b = 1 - 10
c = 2 - 4.
Das hydrophile Spacer-Molekül der folgenden Formel (AA-16) ist besonders bevorzugt:
H&sub2;N-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-NH- -CH&sub2;-CH&sub2;- -OH (AA-16)
Verbindungen dieser Klasse können synthetisiert werden, indem ein Mol eines geeigneten Diamins, wie ein Bis(aminoalkyl)ether von Ethylenglycol, Diethylenglycol, Triethylenglycol und Polyethylenglycol, mit einem Mol eines cyclischen Dicarbonsäureanhydrids, wie Bernsteinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid und Adipinsäureanhydrid, umgesetzt wird. Es ist vorteilhaft, ein organisches Lösungsmittelsystem zu verwenden, bei dem sowohl das Diamin als auch das Anhydrid löslich sind, in dem aber das erwünschte Reaktionsprodukt unlöslich ist. Im allgemeinen sind Acetonitril, Tetrahydrofuran, Diethylether und deren Mischungen geeignet.
Es ist zu erwarten, daß andere hydrophile Spacer, die von wasserlöslichen α,ω-Aminosäuren abstammen, in dieser Erfindung nützlich sein können, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf diejenigen der allgemeinen Formel H(NHCH&sub2; )nOH, wobei n = 2 - 6. Solche Verbindungen sind kommerziell erhältlich.
Wir schätzen, daß die Bindung zwischen freiem (unkonjugierten) Dethiobiotin und Streptavidin eine Bindungskonstante von etwa 10¹¹ M&supmin;¹ aufweist. Dies ist eine ziemlich große Bindungskonstante, und jedes Merkmal, das die Rate, mit der ein Dethiobiotin-Streptavidin-Komplex dissoziiert, vergrößert oder alternativ vermindert, vermindert die Rate, mit der ein Dethiobiotin-Konjugatkomplex aus Streptavidin, das an eine freie Phase gebunden ist, durch die Zugabe von freiem Biotin freigesetzt werden kann. Die schnelle Freisetzung von Dethiobiotin- Konjugatkomplexen ist ein wesentliches Merkmal unserer Erfindung.
Garlick et al. [J. Biol. Chem. 263: 210-215 (1988)] haben gezeigt, daß die Konjugation von Biotin und Biotin-Analoga direkt an hydrophobe Reste die Dissoziationsrate des Konjugats von Avidin vermindert. Die Verwendung eines hydrophilen Linkers bietet ein Mittel zur Vermeidung des hydrophoben Effekts und zur Sicherstellung einer ausreichenden Freisetzungsrate von mit Dethiobiotin markierten Komplexen aus Streptavidin.

Beispiel 1

Bestimmung von TSH durch die Messung eines durch ein Enzym markierten Komplexes, der aus einem festen Träger in einem nicht-kompetitiven Immunoassay freigesetzt wird, wobei Dethiobiotin als freisetzbarer Ligand und Biotin als Verdrängungsligand verwendet wird

1. Synthese eines kovalent an Dethiobiotin gebundenen Anti- TSH-Antikörpers (DTB; anti-TSH IgG1-DTB)

In diesem Beispiel wird die Verwendung und die Wirkung eines hydrophilen Spacers, der zwischen DTB, das als freisetzbarer Ligand wirken kann, und dem anti-TSH IgG1-Antikörper, der als Bindungspartner für den Analyten verwendet wird, insertiert wird, auf die Bindung des DTB-AA-16-anti-TSH-IgG1-Komplexes an Streptavidin, das durch ein Enzym markiert ist, veranschaulicht.
Eine Ampulle, die 51,00 mg Disuccinimidylcarbonat (DSC; Aldrich Co.) und ausreichend trockenes Dimethylsulfoxid (DMSO; Aldrich Co.), um ein Gesamtgewicht von 3,400 g zu ergeben, enthielt, wurde gerührt, um das DSC zu lösen. Durch das Wiegen einer Probe mit einem bekannten Volumen wurde die Dichte zu 1,104 bestimmt. Die DSC-Konzentration wurde wie folgt berechnet:
DSC-Konzentration = (51,00 mg x 1,104)/(256,2 x 3400 mg) = 6,693 x 10&supmin;&sup5; (mmol/µl)
Eine Ampulle, die 12,50 mg (5,834 x 10&supmin;&sup5; mol) Dethiobiotin (DTB; Sigma Co.) und 995 µl DSC-Vorratslösung (5,647 x 10&supmin;&sup5; mol DSC) enthielt, wurde gerührt, um das DTB zu lösen. Es wurden 20 µl Triethylamin (TEA; Aldrich Co.) zugegeben, und die Mischung wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Konzentration der resultierenden Lösung, die hiernach als aktivierte DTB-Lösung bezeichnet wird, wurde wie folgt berechnet:
Konzentration des aktivierten DTBs (12,50 mg x 1,104)/(214,3 x 995 µl) = 6,472 x 10&supmin;&sup5; (mmol/µl)
Ein monoklonaler Anti-TSH-IgG1-Antikörper wurde unter Anwendung bekannter Verfahren aus der Hybridom-Zellinie 4/46.2.2.1, erhalten von E.I. du Pont de Nemours and Co., hergestellt. IgG1 wurde durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose-CL-4B-Säule (Pharmacia Co.) aus Aszites-Flüssigkeit isoliert, die aus der obigen Zellinie stammte. Das IgG wurde unter Verwendung eines Natriumacetat- Puffers, pH-Wert 5,0, aus der Säule eluiert und dann gegen 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,4, über Nacht in einem kalten Raum bei 4 - 8 ºC dialysiert. Ein 2-ml-Teil dieser Lösung, der 2,64 mg/ml Anti-TSH-IgG1-Antikörper enthielt, wurde mit einem 20fachen molaren Überschuß aktiviertem DTB in Dimethylsulfoxid vermischt. Die Reaktionsmischung wurde für einen Zeitraum von 60 min bei Raumtemperatur sanft geschüttelt, auf eine Sephadex G-25-Säule (1,0 x 30 cm; Pharmacia Co.) aufgetragen, und das Anti-TSH-IgG1-Antikörper-DTB mit 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,0, eluiert. Die Fraktionen aus Anti-TSH-IgG1-Antikörper-DTB wurden aufgefangen und gesammelt.

2. Synthese von Anti-TSH-IgG2-β-Galactosidase

Der monoklonale Antikörper Anti-TSH-IgG2 wurde aus der von der Hybritech Co. erhaltenen Zellinie 972,3 erzeugt. Das Isolierungsverfahren war dasselbe, wie es oben für die Isolation des Anti-TSH-IgG1-Antikörpers beschrieben ist. Sechs Milliliter einer Lösung, die 11,2 mg/ml Anti-TSH-IgG2 enthielt, wurden über Nacht bei 4 - 8 ºC gegen Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4, dialysiert. Die Konzentration der Anti-TSH-IgG2- Lösung wurde mit Phosphat-Kochsalzlösung auf 5 mg/ml eingestellt, und eine Lösung, die 68,4 mg Anti-TSH-IgG2 enthielt, wurde mit einem 30fachen molaren Überschuß N-Succinimidyl-4- (N-maleinsäureimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC; Pierce Chemical Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO; Pierce Chemical Co.) vereinigt und 30 min lang bei Raumtemperatur schonend gerührt. Dann wurde eine Sephadex G-25-Säule (1,0 x 30 cm; Pharmacia Co.) mit der Lösung beladen und das Anti-TSH IgG2 mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, pH-Wert 6,5, eluiert. Die resultierenden Fraktionen des durch Maleinsäureimid aktivierten Anti-TSH IgG2 wurden aufgefangen und gesammelt.
Insgesamt 401 mg β-Galactosidase (Boehringer-Mannheim Biochemicals; 22,4 Gew.-% Protein) wurde mit 88 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, pH-Wert 6,5, zur ursprünglichen Konzentration verdünnt. Das durch Maleinsäureimid aktivierte Anti- TSH IgG2 wurde dann mit Thiol, das β-Galactosidase enthielt, in einem Stoffmengenverhältnis von 3 : 1 (3 mol Antikörper und 1 mol β-Galactosidase) kombiniert, und die Reaktion wurde 60 min lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 1 mM N-Ethylmaleinsäureimid (NEM; Sigma Chemical Co.) gequencht und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierende rohe Anti-TSH IgG2-β- Galactosidase wurde durch HPLC isoliert, wobei eine GF-450XL- Größenausschluß-Säule (22,5 mm x 25 cm; Rockland Co.) verwendet wurde, und dann mit 0,2 M Natriumphosphatlösung, die 0,1 % Natriumazidpuffer, pH-Wert 7,0, enthielt, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen mit Anti- TSH-IgG2-β-Galactosidase, die sowohl Immunoaktivität als auch enzymatische Aktivität aufweisen (bestimmt durch Anwendung bekannter Verfahren wie dem Radioimmunoassay, RIA und der Enzym-Aktivitätsbestimmung) wurden aufgefangen und gesammelt.

3. Quantitativer Thyreoidea-stimulierendes-Hormon- (TSH) Immunoassay

Ein Satz von Teströhrchen, die 650 µg Streptavidin-immoblisierte-Chromdioxidteilchen und 20 µg Anti-TSH-IgG1-DTB enthielten, wurde 15 min lang bei 37 ºC inkübiert. Das Streptavidin wurde zuvor unter Anwendung eines bekannten Verfahrens wie dem, das im U.S.-Patent Nr. 4 661 408 offenbart ist, auf magnetischen Chromdioxidteilchen immobilisiert. Im Anschluß auf die Inkubation wurden die Teilchen gewaschen, indem sie durch die Zugabe von 500 µl Hepes-Puffer, pH-Wert 7,5, zu jedem Teströhrchen gewaschen wurden. Die Teströhrchen, die Anti-TSH-IgG1-DTB Streptavidin-Chromdioxidteilchen enthielten, wurden in zwei Konzentrationsserien aufgeteilt; zu jedem Röhrchen des einen Satzes wurde 500 µl TSH-Analyt mit einer Konzentration von 0 µIU/ml gegeben, und zu jedem Röhrchen des anderen Satzes wurde 500 µl TSH mit einer Konzentration von 55 µIU/ml (E.I. du Pont de Nemours and Co.) gegeben. Beide Sätze wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert und dreimal mit 500 µl Hepes-Puffer gewaschen. Im Anschluß daran wurde zu allen Röhrchen 500 µl Anti-TSH-IgG2-β-Galactosidase gegeben, die Mischungen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert und die Teilchen viermal mit 500 µl Hepes-Puffer, pH-Wert 7,5, gewaschen.
Die Teströhrchen wurden dann in zwei Sätze aufgeteilt, wobei jeder Satz Röhrchen umfaßte, die TSH mit den Konzentrationen von sowohl 0 als auch 55 µIU/ml enthielten. Zum ersten Satz Teströhrchen (hiernach als SATZ A1 bezeichnet) wurden 250 µl Hepes-Puffer und 250 µl Chlorphenolrot-β-D-Galactopyranosid(CPRG; Boehringer-Mannheim Biochemical) Substrat gegeben. Die Reaktion wurde 30 min lang bei 37 ºC ablaufen gelassen und dann durch die Zugabe von 5 mg o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG; Boehringer-Mannheim Biochemical) gequencht. Die Absorption des gefärbten Produkts wurde, bezogen auf die Messung des durch das Enzym markierten Komplexes, während dieser noch an die feste Phase gebunden war, unter Verwendung eines klinischen aca -Einzelanalysators (E.I. du Pont de Nenours and Co.) bei 577 nm gemessen.
In den zweiten Satz Teströhrchen (hiernach als SATZ B1-1 bezeichnet) wurde 300 µl 0,68 mg/ml Biotin (Sigma Chemical Co.) als Verdrängungsligand gegeben, um das Dethiobiotin zu verdrängen und den durch das Enzym markierten Komplex freizusetzen. Die Teströhrchen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert, und 250 µl des Überstands jedes Teströhrchens wurde dann herausgenommen und in ein sauberes Teströhrchen überführt. In diese Teströhrchen, die freigesetzten, durch ein Enzym markierten Komplex (hiernach als SATZ B1-2 bezeichnet) enthielten, wurde 250 µl CPRG gegeben. Nach einer 30minütigen Inkubation bei 37 ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 5 mg ONPG gequencht, und die Absorption des gefärbten Produkts wurde mit dem klinischen aca -Einzelanalysator (E.I. du Pont de Nemours and Co.) bei 577 nm überwacht.
Die oben für die Messung des durch ein Enzym markierten, freigesetzten Komplexes beschriebenen Schritte wurden wiederholt (hiernach als SATZ B1-3 bezeichnet). Proben mit CPRG und anti-TSH-IgG1-DTB wurden als Negativproben mit einen klinischen aca -Einzelanalysator bei 577 nm gemessen. In Tabelle 1 ist die bei 0 µIU/ml und 55 µIU/ml TSH für den gebundenen und den freigesetzten, durch ein Enzym markierten Komplex gemessene Absorption dargestellt. Tabelle 1

Beispiel 2

Auswirkung der Gegenwart eines hydrophilen Spacers in einem durch ein Enzym markierten Komplex auf die Bindung des Komplexes an einen durch einen Reporter markierten Bindungspartner für einen freisetzbaren Liganden

In diesem Beispiel wird die Verwendung und die Wirkung eines zwischen DTB, das als freisetzbarer Ligand dient, und dem als Bindungspartner für den Analyten verwendeten Anti-TSH-IgG2- Antikörper insertierten, hydrophilen Spacers bei der Bindung des Komplexes DTB-AA-16-anti-TSH-IgG2 an durch ein Enzym markiertes Streptavidin veranschaulicht. Bei dem gebildeten immobilisierten, durch einen Reporter markierten Komplex handelt es sich um Chromdioxidteilchen-anti-TSH-IgG1:TSH:anti- TSH-IgG2-AA-16-DTB Streptavidin-alkalische-Phosphatase.

1. Synthese von Anti-TSH-IgG2-DTB

Anti-TSH-IgG2-monoklonaler Antikörper wurde aus der von Hybritech Co. erhaltenen Hybridom-Zellinie 972,3 unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt. Anti-TSH-IgG2-DTB wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt.

2. Synthese von Anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB

Bei dem verwendeten hydrophilen Spacer handelte es sich um AA- 16 der Formel:
H&sub2;N-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-NH- -CH&sub2;-CH&sub2;- -OH (AA-16; Molmasse = 276,3)
AA-16 wurde hergestellt, indem 1 mol Bernsteinsäureanhydrid mit 1 mol Ethylenglycolbis(3-aminopropyl)ether (American Tokyo Kasel, Inc.) umgesetzt wurde. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel durchgeführt, da beide Reaktanden in Acetonitril sehr löslich sind, während AA-16 in Acetonitril sehr unlöslich ist.
Ethylenglycolbis(3-aminopropyl)ether mit einem Gewicht von 50,03 g (0,284 mol) und 200 ml Acetonitril wurden in einen 1 l Rundkolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Tropftrichter und einer Stickstoff-Spülvorrichtung ausgestattet war. Die Lösung wurde heftig gerührt, und eine Lösung aus Bernsteinsäureanhydrid (0,284 mol) (Aldrich Co.) in 200 ml Acetonitril wurde tropfenweise in einem Zeitraum von 2 h zugegeben. In diesem Zeitraum fiel AA-16 aus der Reaktionslösung als viskoses "Öl" aus, das sich teilweise verfestigte. Nach Zugabe der gesamten Bernsteinsäureanhydrid-Lösung wurde das Acetonitril durch Dekantieren entfernt, und der Rückstand wurde mit drei 100-ml-Teilen frischem Acetonitril gewaschen. Im Anschluß an dieses Waschen wurde eine Lösung aus 400 ml wasserfreiem Ether zum Reaktionskolben gegeben, und die Reaktionsmischung wurde anschließend mehrere Stunden lang kontinuierlich gerührt. Es wurde beobachtet, daß die Konsistenz des verfestigten AA-16 sich allmählich zu der eines feinen Pulvers änderte. Die Reaktionsmischung wurde in einer trockenen Stickstoff-Atmosphäre durch einen offenen Faltenfilter filtriert, und der größte Teil des Ethers wurde durch Spülen mit trockenem Stickstoff entfernt. Das resultierende AA-16-Reaktionsprodukt wurde dann getrocknet, indem man es mehrere Stunden lang in einem Vakuum-Exsikkator absitzen ließ.
Auf der Grundlage von analytischen Säure- und Base-Titrationen wurde bestimmt, daß das Produkt eine Reinheit von 95 % aufwies. Es wurde bestimmt, daß AA-16 sehr wasserlöslich und sehr hygroskopisch, aber in den meisten organischen Lösungsmitteln unlöslich war. Es wurde gefunden, daß AA-16 sich in warmem DMSO, das Triethylamin (TEA) enthielt (16,5 µl DMSO plus 0,825 µl TEA pro mg AA-16), löste.
Eine Ampulle, die 50,29 mg Disuccinimidylcarbonat (DSC) und 3,358 mg trockenes DMSO enthielt, wurde gerührt, wodurch das DSC bis zu einer endgültigen DSC-Konzentration von 6,359 x 10&supmin;&sup5; mmol/µl verdünnt wurde. Eine Lösung aus 895 µl DSC-Lösung (5,69 x 10&supmin;&sup5; mol) wurde dann mit 11,08 mg (5,170 x 10&supmin;&sup5; mol) DTB kombiniert und die Mischung gerührt, um das DTB zu lösen. Im Anschluß daran wurde 20 µl TEA zugegeben und die Lösung 60 min lang bei Raumtemperatur schonend gerührt.
Ein konisches 500 µl Reacti-Vial , das 16,54 mg AA-16 (5,687 x 10&supmin;&sup5; mol, hergestellt unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens), 271 µl trockenes DMSO und 13,5 µl TEA enthielt, wurde mit einem konischen Magnetrührer ausgestattet, fest verschlossen und in einen auf 40 - 50 ºC gehaltenen Aluminium- Heizblock gestellt und gerührt, bis eine frei fließende Lösung erhalten wurde. Die Lösung aus AA-16 in DMSO wurde zu einer Lösung aus aktiviertem DTB gegeben, und das Reacti-Vial wurde dreimal mit 100 µl DMSO gerührt. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Im Anschluß daran wurde 894 µl der DSC-Lösung (5,687 x 10&supmin;&sup5; mol DSC) wenigstens 60 min lang bei Raumtemperatur schonend gemischt. Die Dichte der resultierenden Lösung, hiernach als aktivierte DTB-AA-16-Lösung bezeichnet, wurde dann durch das Wiegen einer Probe mit bekanntem Volumen bestimmt.
Ein 2 ml Teil einer Lösung aus 5 mg/ml Anti-TSH-IgG2-Antikörper in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 8,0, der aus der Hybritech-Zellinie 972,3 abstammte und unter Anwendung desselben Verfahrens hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde mit einem 20fachen molaren Überschuß einer aktivierten DTB-AA-16-Lösung in DMSO vereinigt. Man ließ die Reaktionsmischung sich etwa 60 min lang bei Raumtemperatur schonend vermischen. Die resultierende Lösung, die den Anti- TSH-IgG2-AA-16-DTB-Komplex enthielt, wurde auf eine Sephadex- G-25-Säule (1,5 x 30 cm; Pharmacia Co.) gegeben, und dann mit einem 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,0, eluiert. Die resultierenden, Anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen und gesammelt.
Streptavidin-alkalische-Phosphatase (mit einem Enzym markiertes Streptavidin) wurde von der Chemicon Company erhalten.

3. Quantitativer TSH-Immunoassay

Es wurden zwei Serien Teströhrchen angefertigt; wobei eine Serie 500 µl TSH mit einer Konzentration von 0 µIU/ml und die andere 500 µl TSH mit einer Konzentration von 50 µIU/ml enthielt. Die Teströhrchen wurden dann in zwei Sätze aufgeteilt, wobei jeder Satz Röhrchen umfaßte, die TSH mit Konzentrationen von sowohl 0 als auch 55 µIU/ml enthielten. Eine Lösung von 500 µl von 10 µg Anti-TSH-IgG2-DTB wurde zu einem Satz Teströhrchen gegeben (hiernach als Satz A2 bezeichnet), und eine Lösung von 500 µl von 10 µg Anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB wurde zum anderen Satz gegeben (hiernach als Satz B2 bezeichnet). Die Reaktionsmischungen in den beiden Teströhrchen-Sätzen wurde dann auf die folgende, identische Weise behandelt. Die Reaktionsmischungen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert; 250 µg Chromdioxidteilchen, auf denen zuvor anti-TSH-IgG1- Antikörper immobilisiert worden war, wurden zugegeben; die Reaktionsmischungen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert und anschließend mit 500 µl eines aus 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, pH-Wert 7,8, bestehenden Puffers gewaschen. Im Anschluß daran wurde 500 µl von 0,2 µg Streptavidin-alkalische-Phospatase-Konjugat zugegeben, die Reaktionsmischungen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert und anschließend mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, pH-Wert 7,8, gewaschen.
Aliquote Teile von 250 µl Biotinlösung, die 6,8 mg/ml Biotin und 300 µl fluorometrisches Substrat, 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP; Boehringer-Mannheim Biochemical) in 2,5 mM DEA enthielt, wurden zu jedem Teströhrchen der Sätze A2 und B2 gegeben, und die Reaktionsmischungen wurden 5 min lang bei 37 ºC inkubiert, wonach die Reaktion durch Zugabe von 300 µl einer 0,5 M EDTA-Lösung gequencht wurde. Die Fluoreszenz- Intensität des durch den gebundenen Teils des resultierenden Chromdioxidteilchen-anti-TSH-IgG1:TSH:anti-TSH-IgG2-AA-16- DTB Streptavidin-alkalische-Phosphatase-Komplex erzeugten Methylumbelliferons (MU) wurde mit einem SLM-Aminco-Fluorometer (SLM Instrument, Inc.) gemessen. Tabelle 2 Vergleich der Messung des gebundenen Komplexes mit und ohne hydrophilen Spacer
F.I.U. = Fluoreszenz-Intensitätseinheit
F.I.U., bestimmt durch Verwendung des SLM-Aminco-Fluorometers SPF 500C (SLM Instrument, Inc.) mit der folgenden Geräteparameter-Konfiguration:
Ex/Em = 375/475 nm, res Es/Em = 4/10 nm, Int. Zeitdauer 0,1 s, Verstärkung = 10, HV = 715 V.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß bei Satz A2 der DTB-anti-TSH-IgG2-Komplex ohne hydrophilen Spacer in der Lage war, weniger durch alkalische Phosphatase markiertes Streptavidin zu binden als der Satz B2-2, der den DTB-AA-16- anti-TSH-IgG-Komplex enthielt. Dieser Unterschied in bezug auf die Bindungsfähigkeit kann durch die Auswirkung der sterischen Hinderung erklärt werden.

Beispiel 3

Bestimmung von TSH durch die Freisetzung und Messung von Streptavidin, das durch alkalische Phosphatase markiert ist, aus einem Chromdioxidteilchen- anti-TSH-IgG1:TSH:anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB Streptavidin- alkalische-Phosphatase-Komplex

Es wurden zwei Sätze Teströhrchen angefertigt; jedes Röhrchen enthielt 250 µg Chromdioxidteilchen, auf denen zuvor anti-TSH- IgG1; 500 µl von 0,5 µg Anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB und 500 µl TSH immobilisiert worden war, wobei die Teströhrchen jedes Satzes TSH-Konzentrationen wie folgt enthielten: 0, 0,1, 0,5, 5,0, 25 und 50 µIU/ml. Nach einer 30minütigen Inkubation bei 37 ºC wurden die Chromdioxidteilchen dreimal mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat, einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,8 gewaschen. Zu jedem Teströhrchen wurde 500 µl einer Lösung von 0,5 µg/ml Streptavidin-alkalischer-Phosphatase gegeben, die Teströhrchen wurden 15 min lang bei 37 ºC inkubiert, und die Teilchen wurden viermal mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumhydrogensulfit-Puffer, pH-Wert 7,5, gewaschen. Zu jedem Teströhrchen wurden aliquote Teile von 300 µl einer Lösung von 6,8 mg/ml Biotin gegeben, und die Röhrchen wurden 10 min lang bei 37 ºC inkubiert. Die Teilchen wurden magnetisch abgetrennt, und 250 µl des Überstandes von jedem Teströhrchen wurde in einen klaren Satz Teströhrchen überführt (hiernach als Satz A3 bezeichnet). Eine Lösung von 2,25 mM MUP in 2,5 M DEA-Puffer, der vorgewärmt worden war, wurde zu jedem Teströhrchen gegeben und die Fluoreszenz-Intensitäten durch einen Geschwindigkeitsmodus bestimmt, wobei ein SLM-Aminco-Photonenzähler 8000 C-Spektrofluorometer (SLM Instrument, Inc.) verwendet wurde. Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren dieser Erfindung erfolgreich in einem Simultanassay-Format verwendet werden kann, wodurch ein Mittel zur quantitativen Bestimmung von Analyten verfügbar gemacht wird. Tabelle 3 Satz 3: Simultan-TSH-Assay-Format
Parameter des AMINCO-8000C-Instruments:
Em: 484 nM; Ex: 375 nm; Auflösung Ex: 16 nm, Auflösung Em: 16 nm

Beispiel 4

Bestimmung von TSH durch das Freisetzen und Messen von DTB- AA-16, das durch alkalische Phosphatase markiert ist, aus einem Chromdioxidteilchen-anti-TSH-IgG1:TSH-anti-TSH-IgG2- Streptavidin DTB-AA-16-alkalische-Phosphatase-Komplex

1. Synthese von DTB-AA-16-alkalische Phosphatase und DTB- alkalische Phosphatase

Es wurde dasselbe Verfahren verwendet, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

2. Synthese von Anti-TSH-IgG2-Streptavidin

Ein Präparat von 5 mg Streptavidin (Boehringer-Mannheim Biochemicals) wurde mit 0,65 ml eines 0,2 M Natriumphosphat- Puffers, pH-Wert 8,0, zur ursprünglichen Konzentration verdünnt. Die Lösung wurde mit einem 10fachen molaren Überschuß N-Succinimidyl-4-(N-maleinsäureimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC; Pierce Co.) vereinigt und die Reaktionsmischung 30 min lang bei Raumtemperatur schonend gerührt. Die Lösung wurde auf eine Sephadex-G-25-Säule (1,0 x 30 cm) aufgegeben und dann mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5, eluiert. Die resultierenden, das durch Maleinsäureimid aktivierte Streptavidin enthaltende Fraktionen wurden aufgefangen und gesammelt.
Ein aliquoter Teil einer 10 mg/ml-Lösung von Anti-TSH-IgG2 (wie in Beispiel 2-1 beschrieben hergestellt) wurde gegen 1000 ml eines 0,2 M Natriumphosphat-Puffers, pH-Wert 8,0, dialysiert, und über Nacht unter konstantem Rühren bei 4 - 8 ºC gehalten. Die Lösung wurde in eine dunkle Ampulle übertragen und die Protein-Konzentration auf 5 mg/ml eingestellt. Die Lösung wurde dann mit einem 15fachen molaren Überschuß N- Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA; Calbiochemical Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO) kombiniert. Die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur schonend gerührt. Die Lösung wurde auf eine Sephadex-G-25-Säule (1,0 x 30 cm) aufgegeben und dann mit 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 6,5, eluiert. Die resultierenden, Acetylthioiertes-anti-TSH-IgG2 enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen und gesammelt.
Aliquote Teile von 2,2 ml einer 1,0 mg/ml Lösung des Acetylthioiertes-anti-TSH-IgG2-Antikörpers, 1,2 ml einer 1,0 mg/ml Lösung von mit Maleinsäureimid aktiviertem Streptavidin und 75 µl von 1 M Hydroxylamin, pH-Wert 7,0, wurden gleichzeitig in einer dunklen Ampulle zusammengemischt. Die Reaktionsmischung wurde 60 min lang bei Raumtemperatur schonend gerührt, während die Reaktion mit Hilfe eines HPLC, das mit einer GF-250-Größenausschluß-HPLC-Säule (9,4 mm x 25 mm; Rockland Co.) ausgestattet war, überwacht wurde. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durch die Zugabe von 10 µl von 0,1 M N-Ethylmaleinsäureimid (NEM; Aldrich Chemical Co.) gequencht. Nachdem die gequenchte Lösung sich 30 min lang absetzen konnte, wurde die Lösung durch HPLC gereinigt, wobei eine GF- 450XL-Größenausschlußsäule (22,5 mm x 25 cm; E.I. du Pont de Nemours and Co.) verwendet wurde. Das Anti-TSH-IgG2-Streptavidin wurde dann mit 0,2 M Phosphatpuffer mit 0,1 % Natriumazidpuffer, pH-Wert 7,0, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Die resultierenden Fraktionen, die sowohl Biotinbindung als auch Immunoreaktivität aufwiesen, wurden gesammelt.
Die Anti-TSH-IgG2-Chromdioxidteilchen waren dieselben, die in Beispiel 2 verwendet wurden.

3. Quantitativer TSH-Immunoassay

Es wurden zwei Sätze Teströhrchen angefertigt; jedes Röhrchen enthielt 250 µg Chromdioxidteilchen, auf denen zuvor Anti-TSH- IgG1 immobilisiert worden war; 500 µl von 2 µg/ml Anti-TSH- IgG2-Streptavidin und 500 µl TSH. Teströhrchen eines jeden Satzes wiesen die folgenden TSH-Konzentrationen auf: 0, 25 und 50 µIU/ml. Nach einer 30minütigen Inkubation bei 37 ºC wurden die Chromdioxidteilchen dreimal mit Hepes-Puffer, pH-Wert 7,5, gewaschen. Im Anschluß daran wurden 500 µl von 2 µg/ml DTB-AA- 16-alkalische-Phosphatase zu einem Satz Teströhrchen gegeben (hiernach als Satz A4 bezeichnet), und 500 µl von 2 µg/ml DTB- alkalische-Phosphatase wurde zum anderen Satz Teströhrchen gegeben (hiernach als Satz B4-1 bezeichnet). Beide Sätze wurden 15 min lang bei 37 ºC inkubiert und dann viermal mit 500 µl Hepes-Puffer, pH-Wert 7,5, gewaschen.
Die Teströhrchen von Satz A4 wurden in zwei identische Untersätze aufgeteilt. In jedes Teströhrchen eines der Untersätze wurde 250 µl einer Lösung aus 6,8 mg/ml Biotin und 250 µl des Fluorometrie-Substrats 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP; Boehringer-Mannheim Biochemicals) in 2,5 M DEA gegeben, um den insgesamt gebundenen TSH-Komplex zu messen. Die Reaktionsmischung wurde anschließend bei 37 ºC durch die Zugabe von 500 µl einer 0,5 M EDTA-Quenchlösung inkubiert. Die Teilchen wurden dann magnetisch abgetrennt, und 100 µl des Überstands eines jeden Teströhrchens wurde in einen sauberen Satz Teströhrchen überführt (hiernach als Satz A4-1 bezeichnet). Zu jedem Teströhrchen wurde dann 2,5 ml Quenchlösung gegeben, und das durch den Reporter erzeugte Signal durch ein Aminco- Fluorometer gemessen.
Um die freigesetzte DTB-AA-16-alkalische-Phosphatase zu messen, wurden 300 µl Biotin (6,8 mg/ml Biotin-Konzentration) zum anderen Untersatz von Satz A4 gegeben und zehn Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Die Teilchen wurden dann magnetisch abgetrennt, und 250 µl des Überstands von jedem Teströhrchen wurde in einen sauberen Satz Teströhrchen überführt (hiernach als Satz A4-2 bezeichnet). In Anschluß daran wurde 250 µl MUP zu jedem Röhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden 5 min lang bei 37 ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer 0,5 M EDTA-Quenchlösung gequenscht. Zu aliquoten Teilen von 100 µl wurden zusätzliche 2 ml Quenchlösung gegeben, und das vom Reporter erzeugte Signal mit einem Aminco-Fluorometer gemessen.
Die Teströhrchen von Satz B4, die die DTB-alkalische-Phosphatase ohne den hydrophilen Spacer enthielten, wurden unter Anwendung desselben Verfahrens behandelt, wie es oben für den Satz A4 beschrieben ist, um sowohl den gebundenen TSH-Komplex (Satz B4-1) als auch den freigesetzten Reporter (Satz B4-2) zu messen. Die Ergebnisse der Sätze A4 und B4 sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 SATZ A4 (DTB-AA-16-alkalische-Phosphatase enthaltend) Tabelle 4, Fortsetzung Satz B4 (DTB-alkalische Phosphatase enthaltend)
F.I.U. = Fluoreszenz-Intensitätseinheit
SLM-Aminco-Photonenzähler 8000C (SLM Instrument, Inc.) Konfiguration der Geräteparameter wie folgt: Ex/Em = 375/450 nm, res Ex/Em = 2/2 nm, HV = 850 V, Verstärkung = 100, Int. Zeitdauer 1 s.
Die Ergebnisse in Tabelle 4 deuten darauf hin, daß, wenn DTB direkt, ohne die Verwendung des hydrophilen Spacers AA-16, an alkalische Phosphatase gebunden ist, der resultierende Komplex weniger Streptavidin-Antikörper-Komplex bindet, als wenn DTB über den hydrophilen Spacer AA-16 an alkalische Phosphatase gebunden ist.

Beispiel 5

Bestimmung von TSH durch die Freisetzung und Messung eines durch ein Enzym markierten Komplexes, der aus einem festen Träger in einem Immunoassay freigesetzt wird, wobei DTB als freisetzbarer, an einen hydrophilen Spacer (AA-16) und Streptavidin als Freisetzungsliganden gebundener Ligand verwendet wird

Es wurden zwei Sätze Teströhrchen angefertigt; wobei ein Satz 500 µl TSH-Analyt mit einer Konzentration von 0 µIU/ml enthielt und der andere Satz 500 µl TSH-Analyt mit 25 µIU/ml enthielt. In jedes Teströhrchen der beiden Serien wurde 50 µl einer Lösung gegeben, die 125 µg Chromdioxidteilchen enthielt, gefolgt von 500 µl einer Lösung, die 0,5 µg Anti-TSH-IgG2-AA- 16-DTB enthielt, das wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war. Alle Teströhrchen wurden 30 min lang bei 37 ºC bei periodischem Mischen inkubiert.
Die Chromdioxidteilchen wurden dann abgetrennt und dreimal mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumhydrogensulfit-Waschpuffer gewaschen. In jedes Teströhrchen der beiden Serien wurde 500 µl einer Lösung gegeben, die 0,001 mg/ml Streptavidin-alkalische-Phosphatase (Chemicon Co.) enthielt. Die Röhrchen wurden dann 15 min lang bei 37 ºC inkubiert, die Teilchen magnetisch abgetrennt und viermal mit 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat-Waschpuffer gewaschen. Zu einem Satz Teströhrchen wurde 300 µl Biotin (3,0 mg/ml in 250 mM Tris, 50 mM Natriumboratpuffer) gegeben, und zum anderen wurde 300 µl Streptavidin (1 mg/ml in Vista-Waschpuffer) gegeben. Die Röhrchen wurden dann 10 min lang bei 37 ºC inkubiert, gefolgt von der Abtrennung der Chromdioxidteilchen.
Eine Lösung von 2,4 ml MUP/DEA-Mischung wurde in Küvetten auf 37 ºC vorgewärmt. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 100 µl des Überstands der Reaktionsröhrchen initiiert. RFU- Werte wurden mit einem Aminco-Fluorometer bei 0 und 30 s genommen. Die Werte wurden subtrahiert und die Differenz mit 2 multipliziert, wodurch der RFU/min erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
Der Blindwert des Substrates betrug 0,01 RFU/min
Die Ergebnisse in Tabelle 5 deuten darauf hin, daß Streptavidin als Verdrängungsligand zum Freisetzen des Reporters verwendet werden kann, wodurch die Notwendigkeit der Verwendung von Biotin in diesem Assay-Format eliminiert wird.

Beispiel 6

Auswirkung einer veränderlichen Oberfläche auf die feste Phase und die freigesetzte, unspezifische Bindung

Um die Auswirkung einer veränderlichen Oberfläche auf die unspezifische Bindung zu bestimmen, wurden zwei Sätze Teströhrchen in dreifacher Ausfertigung hergestellt, die 500 µl TSH-Probe mit Konzentrationen von 0, 0,05, 0,1 und 50 µIU/ml enthielten. Zu den Replikaten der TSH-Konzentration wurden 50 µl von Lösungen von 125 µg, 200 µg und 250 µg Chromdioxidteilchen, auf denen Anti-TSH-IgG1 immobilisiert war, gegeben. Zu jedem der Teströhrchen wurde 500 µl einer Lösung, die 0,5 µg Anti-TSH-IgG2-AA-16-DTB enthielt, gegeben. Alle Proben wurden 30 min lang mit periodischem Mischen bei 37 ºC inkubiert. Im Anschluß daran wurden die Chromdioxidteilchen abgetrennt und dreimal mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumboratpuffer, pH-Wert 7,5, gewaschen. Im Anschluß an den dritten Waschvorgang wurde 500 µl einer 0,001 mg/ml Lösung aus Streptavidin-alkalischer-Phosphatase (Chemicon Co.) zugegeben, und die Reaktionsmischungen wurden bei 37 ºC 15 min lang inkubieren gelassen. Alle Röhrchen wurden dann viermal mit 500 µl von 250 mM Tris, 50 mM Natriumborat-Waschlösung gewaschen.
Einer der Röhrchensätze wurde verwendet, um den freigesetzten Reporter zu messen. Zu diesem Satz wurde 300 µl einer 6,8 mg/ml Biotin-Lösung in 150 mM Carbonatpuffer gegeben und die Reaktionsmischung 10 min lang bei 37 ºC inkubieren gelassen. Die Chromdioxidteilchen wurden dann abgetrennt, und 250 µl des Überstands eines jeden Teströhrchens wurde herausgenommen und in einen sauberen Satz Röhrchen überführt (hiernach als Satz A5 bezeichnet).
Zum anderen Satz (hiernach als Satz B5 bezeichnet), der zum Messen des festen, gebundenen Reporters verwendet wurde, wurde 250 µl Biotinlösung zu den Chromdioxidteilchen gegeben, und die Röhrchen wurden ohne Inkubation oder Abtrennung des Überstands verwendet. In jedes der Röhrchen (SATZ A5 und SATZ B5) wurde 250 µl MUP/DEA-Lösung gegeben und die Reaktionsmischungen 5 min lang bei 37 ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 M EDTA-Lösung gequencht. Chromdioxidteilchen wurden von Satz B5 abgetrennt, und 100 µl aus allen Röhrchen wurden in saubere Küvetten überführt. Im Anschluß daran wurde 2,5 ml Quenchlösung zu allen Küvetten gegeben, um die Lösungen in einen Bereich zu bringen, der durch das Aminco-Fluorometer meßbar war; Messungen wurden bei einer Ansteuerung von 375 nm und einer Emission von 475 nm genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6
Die Blindprobe der Substanz beträgt 0,03.
Die Ergebnisse in Tabelle 6 deuten darauf hin, daß die unspezifische Bindung am festen, gebundenen, durch einen Reporter markierten Komplex (Satz B5) mit abnehmender Oberfläche abnimmt. Dies ist bekannt und ist in der Vergangenheit bei Chromdioxidteilchen demonstriert worden. Die unspezifische Bindung zum freigesetzten, durch den Reporter markierten Komplex (Satz A5) ist von der Oberfläche unabhängig. Dieses Ergebnis demonstriert einen Schlüsselvorteil, der durch die Verwendung des Verfahrens des freisetzbaren Liganden dieser Erfindung erhalten wird.

Claims

1. Nicht-kompetitiver, spezifischer Bindungsassay für einen Analyten, umfassend die Schritte des:

A. Herstellens einer immobilisierten Sandwich-Struktur, bestehend im wesentlichen aus:

1. einem festen Träger, an den ein erster Bindungspartner durch einen Linker gebunden ist, wobei der erste Bindungspartner aus der aus Streptavidin, Avidin, succinyliertem Avidin, Nucleinsäure und Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

2. einen Analyten oder einem zweiten Bindungspartner:Analyt-Komplex und

3. einem freisetzbaren Liganden, wobei der freisetzbare Ligand:

a. durch eine temporäre Bindung an den ersten Bindungspartner und durch eine kovalente Bindung an den zweiten Bindungspartner des zweiten Bindungspartner: Analyt-Komplexes, wobei der Analyt des zweiten Bindungspartner:Analyt-Komplexes an einen dritten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran gebunden ist; oder

b. durch eine temporäre Bindung an einen dritten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran und durch eine kovalente Bindung am zweiten Bindungspartner des zweiten Bindungspartner: Analyt-Komplexes oder

c. durch eine temporäre Bindung an einen zweiten Bindungspartner mit einem nachweisbaren Reporter daran und durch eine kovalente Bindung am Analyten;

gebunden wird, indem der feste Träger mit einem daran gebundenen ersten Bindungspartner mit:

1. einer flüssigen Probe, die vermutlich den Analyten enthält;

2. einem freisetzbaren Liganden, entweder allein oder durch eine kovalente Bindung am zweiten Bindungspartner gebunden; und

3. dem zweiten oder dritten Bindungspartner, an dem sich der nachweisbare Reporter befindet;

in Berührung gebracht wird;

B. Trennens der immobilisierten Sandwich-Struktur von den löslichen Komponenten;

C. Brechens der temporären Bindung durch das:

1. Zugeben eines Überschusses eines Verdrängungsliganden in bezug auf den freisetzbaren Liganden; oder das

2. Zugeben eines Verdrängungsliganden, wobei die Affinität des Verdrängungsliganden zu entweder dem ersten, zweiten oder dritten Bindungspartner größer als die Affinität des freisetzbaren Liganden zum ersten, zweiten oder dritten Bindungspartner ist; und

D. Messens des nachweisbaren Reporters in Lösung.

2. Kompetitiver spezifischer Bindungsassay für einen Analyten, umfassend die Schritte des:

A. Immobilisierens eines Analyten oder eines ersten Bindungspartners, der dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung einen freisetzbaren Liganden zu binden, auf einem festen Träger;

B. Bildens eines durch einen immobilisierten Reporter markierten Komplexes, indem das Produkt von Schritt A mit einer Mischung in Berührung gebracht wird, die den durch einen immobilisierten Reporter markierten Komplex enthält, indem:

1. eine flüssige, den Analyten enthaltende Probe;

2. eine bekannte Menge eines ersten Bindungspartners, der durch eine kovalente Bindung an einen freisetzbaren Ligand gebunden ist, wobei der erste Bindungspartner zur Bindung an den Analyten fähig ist, oder eine bekannte Menge eines freisetzbaren Liganden:Analyt-Komplexes, wobei der freisetzbare Ligand dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung an den ersten Bindungspartner auf dem festen Träger gebunden zu sein; und

3. ein zweiter Bindungspartner mit einen nachweisbaren Reporter daran, wobei der zweite Bindungspartner dazu fähig ist, durch eine temporäre Bindung an den freisetzbaren Liganden oder eine bekannte Menge eines zweiten Bindungspartners gebunden zu sein, der dazu fähig ist, mit einem nachweisbaren Reporter daran an den Analyten gebunden zu sein;

kombiniert wird;

C. Trennens des durch den immobilisierten Reporter markierten Komplexes von den löslichen Komponenten;

D. Brechens der temporären Bindung durch das:

1. Zugeben eines Überschusses eines Verdrängungsliganden in bezug auf den freisetzbaren Liganden oder das

2. Zugeben eines Verdrängungsliganden, wobei die Affinität des Verdrängungsliganden zu entweder dem ersten oder dem zweiten Bindungspartner größer als die Affinität des freisetzbaren Liganden zum ersten oder zweiten Bindungspartner ist; und

E. Messens des Reporters in Lösung.