DE69418501T2

DE69418501T2 - Immunologische Bestimmung eines Antigens oder eines Haptens

Info

Publication number: DE69418501T2
Application number: DE69418501T
Authority: DE
Inventors: Philippe Pradelles
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1993-01-28
Filing date: 1994-01-26
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2014-01-27
Also published as: EP0609144A1; CA2113383A1; FR2700855A1; ES2133503T3; JPH06273416A; US5476770A; JP3310090B2; EP0609144B1; CA2113383C; FR2700855B1; DE69418501D1

Description

Immunometrische Bestimmung eines Antigens oder eines Haptens

Die vorliegende Erfindung hat ein Verfahren zur immunometrischen Bestimmung einer aus einem Antigen oder einem Hapten bestehenden Substanz zum Gegenstand.
Sie findet insbesondere Anwendung auf die Bestimmung der Haptene, d. h. kleiner Moleküle, die, für sich selbst betrachtet, sehr oft nur ein einziges Zentrum zur Fixierung von Antikörpern besitzen(monoepitopische Haptene). In der Tat ist ein Hapten ein kleines Molekül, das durch sich selbst die Synthese von Antikörpern nicht anregen kann, das aber, wenn man es mit einem Protein, das als Antigen-Träger dient, koppelt, die Bildung von Antikörpern induzieren kann.
Im Fall der Haptene, deren Größe nicht ausreichend ist, um gleichzeitig an zwei Antikörper gebunden zu werden, führt man die immunologischen Bestimmungen somit gewöhnlich auf kompetitivem Wege durch Verdrängung zwischen dem zu bestimmenden Hapten und dem gleichen, aber markierten Hapten um in begrenzter Anzahl vorhandene Antikörperzentren aus, die auf einer festen Phase fixiert sind, gegebenenfalls über einen anderen Antikörper, wie es im Fall der Substanz P beschrieben wird von Pradelles et al. in: Anal. Chem. 57, 1985, S. 1170, und von Renzi et al. in: Trends in Cluster Headache, hrsg. von F. Sicuteri et al. Elsevier, N.Y., 1987, S. 125-134.
Andere immunologische Bestimmungen wie die immunometrischen Bestimmungen vom Typ "Sandwich" oder mit zwei Zentren, in denen das Antigen über einen ersten Antikörper auf einer festen Phase fixiert wird, dann mit einem zweiten, markierten und im Überschuß eingesetzten Antikörper nachgewiesen wird, erlauben die Erzielung einer viel größeren Empfindlichkeit, sind aber leider auf monoepitopische Haptene nicht anwendbar.
Die vorliegende Erfindung hat genau ein insbesondere für die Bestimmung dieser Haptene verwendbares immunometrisches Bestimmungsverfahren zum Gegenstand, das erlaubt, eine deutlich bessere Empfindlichkeit zu erzielen als die kompetitiven Bestimmungen.
Nach der Erfindung umfaßt das Verfahren zur immunometrischen Bestimmung einer Substanz, die aus einem Antigen oder einem Hapten besteht, die folgenden Schritte:
1º) eine Probe, welche die zu bestimmende Substanz enthält, mit einer festen Phase in Kontakt zu bringen, auf welcher eine Sättigungssubstanz und ein Fang-Antikörper, erster Antikörper genannt, der für ein Epitop der zu bestimmenden Substanz spezifisch ist, fixiert sind, um die zu bestimmende Substanz immunologisch mit dem fixierten Antikörper zu verbinden,
2º) die feste Phase, auf welcher die Sättigungssubstanz, der Antikörper und die zu bestimmende Substanz fixiert sind, einer Behandlung mit Hilfe mindestens eines Reagens zu unterziehen, um die zu bestimmende Substanz durch Bildung kovalenter Bindungen auf der festen Phase zu immobilisieren und um die vorher zwischen der zu bestimmenden Substanz und dem ersten Antikörper erhaltene immunologische Bindung zu denaturieren, um ein Epitop der zu bestimmenden Substanz zum Zweck einer neuen immunologischen Reaktion zugänglich zu machen,
3º) die so behandelte feste Phase mit einem markierten Antikörper, zweiter Antikörper genannt, der spezifisch ist für die zu bestimmende Substanz, in Kontakt zu bringen,
4º) die auf der festen Phase fixierte Menge des zweiten Antikörpers zu messen,
5º) auf einer Eichkurve aus der im vierten Schritt gemessenen Menge des zweiten Antikörpers die in der Probe vorhandene Menge der zu bestimmenden Substanz zu ermitteln.
In diesem Verfahren ist die im zweiten Schritt ausgeführte Behandlung sehr wichtig, da sie zu einer vollständigen Immobilisierung der zu bestimmenden Substanz auf der festen Phase durch kovalente chemische Bindungen und zu einer Wiederherstellung der immunologischen Eigenschaften der zu bestimmenden Substanz führt, damit sie erneut immunologisch mit einem Antikörper reagieren kann.
Im allgemeinen umfaßt diese Behandlung:
- eine erste Stufe, in welcher man die zu bestimmende, immunologisch an den ersten Antikörper gebundene Substanz mit einem mindestens bifunktionellen Reagens reagieren läßt, das imstande ist, kovalente Bindungen einerseits mit der zu bestimmenden Substanz, andererseits mit der festen, mit dem ersten Antikörper und mit der Sättigungssubstanz überzogenen Phase zu bilden, um die zu bestimmende Substanz mit Hilfe dieses Reagens auf der festen Phase zu immobilisieren, und
- eine zweite Stufe, in welcher man die zu bestimmende, auf der festen Phase immobilisierte Substanz einer Behandlung zur Denaturierung ihrer immunologischen Bindung mit dem ersten Antikörper unterzieht.
Das in der ersten Stufe verwendete bifunktionelle Reagens ist ein Reagens, das eine erste funktionelle Gruppe, die chemisch mit der festen Phase, der Sättigungssubstanz und/oder dem ersten auf der festen Phase fixierten Antikörper reagieren kann, und eine zweite funktionelle Gruppe, die mit der ersten identisch oder von ihr verschieden ist und mit der zu bestimmenden Substanz reagieren kann, enthält. Diese funktionellen Gruppen können beispielsweise Amingruppen, Säuregruppen, Aldehydgruppen, Thyrosylgruppen, Histidylgrupen oder Thiolgruppen sein.
Wenn diese funktionellen Gruppen identisch sind, hat man ein homo-bifunktionelles oder ein homo-polyfunktionelles Reagens.
Als Beispiel für derartige Reagenzien kann man Glutaraldehyd, Difluordinitrobenzol, Disuccinimidylsuberat, Bis(maleinimido)hexan und Bis(β-[4-azido-salicylamido)ethyl]disulfid nennen.
Wenn die funktionellen Gruppen verschieden sind, hat man ein hetero-bifunktionelles oder hetero-polyfunktionelles Reagens.
Als Beispiel für derartige Reagenzien kann man N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat und Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat nennen.
Die Wahl des verwendeten Reagens hängt nicht nur ab von der zu bestimmenden Substanz, sondern ebenso von der verwendeten festen Phase und von dem verwendeten Antikörper.
Die feste Phase kann aus den im allgemeinen in den immunologischen Bestimmungen verwendeten festen Phasen bestehen, beispielsweise aus Mikrotitrationsplatten, Röhren, Membranen aus Plastikmaterial, beispielsweise Polystyrol, Nitrocellulose oder Polyester, Glaskugeln, oder aus jeder beliebigen Substanz, die imstande ist, in kovalenter oder nicht kovalenter Weise direkt oder nicht direkt den ersten Antikörper zu fixieren. Die Fixierung kann durch Adsorption, durch kovalente chemische Bindung oder über bindende Moleküle wie Antikörper und das System Avidin-Biotin erfolgen. Man kann auch feste Phasen aus anorganischen Stoffen wie Hydroxylapatit, Mullit, Tonerde, ZrO&sub2; und Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2; verwenden.
Die Fixierung des ersten Antikörpers auf der Oberfläche der festen Phase kann passiv oder aktiv sein. Sie kann durch direkte Adsorption oder mittels geeigneter Reagenzien erhalten werden.
In dem Verfahren der Erfindung sind der erste und der zweite verwendete Antikörper beide für die zu bestimmende Substanz spezifische Antikörper.
Dieser erste und dieser zweite Antikörper können von der gleichen Quelle oder von verschiedenen Quellen stammen. Darüber hinaus können diese Antikörper polyklonale oder monoklonale Antikörper sein.
In dem Fall, daß die zu bestimmende Substanz ein monoepitopisches Hapten ist, sind der erste und der zweite Antikörper identisch und vorzugsweise monoklonal.
In dem Fall, daß die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist, kann man zwei verschiedene Antikörper verwenden, doch ist es vorteilhaft, zwei identische Antikörper zu verwenden und vorzugsweise ebenfalls monoklonale Antikörper. Was den zweiten, markierten Antikörper betrifft, so kann die Markierung mit Hilfe verschiedener Techniken ausgeführt werden, beispielsweise mit einem radioaktiven Element, einem Enzym, einem fluoreszierenden Marker, einem lumineszierenden Marker oder mit Molekülen, die, wie Biotin und seine Strukturanaloga, imstande sind, mit Avidin oder Streptavidin zu reagieren.
Wenn der zweite Antikörper mit einem solchen Molekül wie einem Enzym, einem fluoreszierenden Marker, einem lumineszierenden Marker oder einem Molekül markiert ist, das imstande ist, mit Avidin oder Streptavidin zu reagieren, kann die Kopplung des Markers mit dem Antikörper durch die in dieser Art von Bestimmung üblicherweise verwendeten klassischen Techniken ausgeführt werden.
Das Verfahren der Erfindung findet vorteilhaft Anwendung auf die Bestimmung der Antigene, denn in diesem Fall kann man die gleiche Empfindlichkeit wie mit den Bestimmungen vom "Sandwich"-Typ erreichen, wobei man einen einzigen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, verwendet.
Allerdings bietet das Verfahren der Erfindung einen noch größeren Vorteil für die Bestimmung der monoepitopischen Haptene, denn es erlaubt, in diesem Fall viel größere Empfindlichkeiten als in den kompetitiven Bestimmungen zu erhalten, wobei man einen einzigen Antikörper verwendet, indem man die Verwendung von Reagenzien im Überschuß (Fang-Antikörper und markierte Antikörper) ausnutzt, wie dies in den immunometrischen Bestimmungen mit zwei Zentren geschieht.
Als Beispiel für Haptene, die mit dem Verfahren der Erfindung bestimmt werden können, kann man ACTH, Angiotensin, ANF, Bradykinin, Enkephalin, LHRH, Ocytocin, Vasopressin, die Neurokinine, Endothelin, die Substanz P, Thyroxin und Leukotrien E&sub4; nennen.
Die entsprechenden Formeln dieser Haptene sind nachfolgend angegeben:
ACTH(18-39): Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala- Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe
Angiotensin II: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
ANF(1-28): Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly- Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser- Phe-Arg-Tyr
Bradykinin: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg
Enkephalin: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
LHRH: Tyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro- Gly-NH&sub2;
Ocytocin: Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH&sub2;
Vasopressin: Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Cys-Pro-Arg- Gly-NH&sub2;
Neurokinin A: His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu- Met-NH&sub2;
Neurokinin B: Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu- Met-NH&sub2;
Endothelin: cis-Ser-cis-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu- cis-Val-Tyr-Phe-cis-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp
Substanz P: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu- Met-NH&sub2; Thyroxin:
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden besser bei der Lektüre der folgenden Beschreibung hervortreten, die selbstverständlich zur Erläuterung, nicht begrenzend gegeben wird. Dabei wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen. In diesen:
- sind die Fig. 1A bis 1E schematische Darstellungen der verschiedenen Schritte des Verfahrens der Erfindung zur immunometrischen Bestimmung,
- Fig. 2 ist eine Eichkurve, erhalten für die immunometrische Bestimmung der Substanz P mit dem Verfahren der Erfindung,
- Fig. 3 ist eine Eichkurve, erhalten für die Bestimmung der Substanz P auf kompetitivem Wege mit einem Verfahren in Übereinstimmung mit der bisherigen Technik,
- Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Präzisionsprofile darstellt, die mit der immunometrischen Bestimmung der Erfindung und mit der kompetitiven Bestimmung der bisherigen Technik für die Substanz P erhalten werden,
- Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Empfindlichkeit der Bestimmungen der Substanz P mit dem Verfahren der Erfindung bzw. mit dem Verfahren der bisherigen Technik darstellt,
- Fig. 6 ist ein Diagramm, das den Einfluß der Konzentration von Glutaraldehyd auf die Bestimmung der Substanz P entsprechend dem Verfahren der Erfindung darstellt,
- Fig. 7 ist ein Diagramm, das den Einfluß des pH des Immobilisierungsschritts auf die Bestimmung der Substanz P entsprechend dem Verfahren der Erfindung darstellt,
- Fig. 8 ist ein Diagramm, das den Einfluß der verschiedenen Schritte des Verfahrens der Erfindung auf die Bestimmung der Substanz P darstellt,
- Fig. 9 ist eine Eichkurve, erhalten für die Bestimmung des Thyroxins entsprechend dem Verfahren der Erfindung,
- Fig. 10 stellt die für Bestimmungen des Thyroxins gemäß dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Eichkurven dar, und
- Fig. 11 ist ein Diagramm, das den Einfluß der verschiedenen Schritte des Verfahrens der Erfindung auf die Bestimmung des Thyroxins darstellt.
In den Fig. 1A bis 1E sind die verschiedenen Schritte des Verfahrens der Erfindung zur immunometrischen Bestimmung dargestellt.
So sieht man in Fig. 1A, die den ersten Schritt darstellt, eine feste Phase (1), auf welcher ein für die zu bestimmende Substanz (3) spezifischer Fang-Antikörper (2) und die im allgemeinen aus Proteinen wie Rinder-Serumalbumin bestehende Sättigungssubstanz (6) fixiert sind. Um diesen Schritt auszuführen, wurde der mit den Fang-Antikörpern (2) und mit der Sättigungssubstanz (6) versehene Träger (1) in Kontakt mit der zu bestimmenden Substanz (3) gebracht, um diese Substanz (3) immunologisch mit dem fixierten Antikörper (2) zu verbinden. Die auf der festen Phase fixierte Antikörpermenge entspricht einem Überschuß gegenüber der in der Probe vorhandenen Menge der zu bestimmenden Substanz.
In dem zweiten Schritt, dessen zwei Stufen in den Fig. 1B und 1C dargestellt sind, unterzieht man die feste Phase mit Hilfe eines zumindest bifunktionellen Reagens einer Behandlung, um die zu bestimmende Substanz (3) durch Ausbildung einer kovalenten Bindung (4) auf der festen Phase (1) zu fixieren (Fig. 1B). Diese kovalente Bindung kann direkt mit der festen Phase, mit dem ersten Fang-Antikörper und/oder mit der Sättigungssubstanz ausgebildet werden.
In der zweiten Stufe macht man das Epitop der zu bestimmenden Substanz (3) mit dem Ziel einer neuen immunologischen Reaktion zugänglich, indem man ihre immunologische Bindung mit dem Antikörper (2) denaturiert.
Um die erste Stufe der Immobilisierung auszuführen, bringt man die feste Phase (1), auf welcher die Sättigungssubstanz, der Fang-Antikörper (2) und die zu bestimmende, an diesen Antikörper immunologisch gebundene Substanz (3) fixiert sind, bei einem geeigneten pH während einer ausreichenden Zeitdauer unter Rühren in Kontakt mit einer Lösung eines zumindest bifunktionellen Reagens.
Der pH hängt insbesondere ab von dem verwendeten polyfunktionellen Reagens. So bevorzugt man im Fall von Glutaraldehyd einen pH von 5 bis 9, während man im Fall von Disuccinimidylsuberat (DSS) einen pH von 7 bis 9 bevorzugt. Diese pH- Werte werden mit Hilfe geeigneter Puffer erhalten.
Um die Reaktion zu unterbrechen, kann man anschließend eine Abbruchlösung hinzufügen, die die Aufgabe hat, entweder die existierenden funktionellen Gruppen, die mit dem bifunktionellen Reagens reagieren können, zu zerstören, oder mit den freien funktionellen Gruppen des bifunktionellen Reagens zu reagieren. So kann die Abbruchlösung, wenn man als bifunktionelles Reagens Glutaraldehyd verwendet, ein Reduktionsmittel wie NaBH&sub4; enthalten, um die überschüssigen Aldehydfunktionen des Glutaraldehyds zu zerstören, oder ein Amin wie Ethanolamin, um die verbleibenden Gruppen des Glutaraldehyds zu benutzen, die mit den Aminfunktionen reagieren können.
In der zweiten Stufe (Fig. 1C) führt man eine Denaturierungsbehandlung der immunologischen Bindung der zu bestimmenden Substanz mit dem ersten Antikörper aus.
Diese Denaturierungsbehandlung kann in klassischer Weise mit Hilfe geeigneter Reagenzien oder auch unter der Einwirkung von Ultraschall oder Hitze ausgeführt werden.
Diese Reagenzien können gewählt werden beispielsweise unter den Säuren wie HCl, den Basen wie NaOH, den organischen Lösungsmitteln, beispielsweise den Alkoholen wie Methanol, den grenzflächenaktiven Mitteln und den Mineralsalzen. Das verwendete Reagens wird in Abhängigkeit von dem Antigen-Antikörper- Paar und der Natur der Bindung zwischen dem ersten Antikörper und der festen Phase gewählt.
In gewissen Fällen ist es nicht nötig, diese zweite Stufe der Denaturierung auszuführen, denn die Denaturierung kann aufgrund der verwendeten Reaktionsbedingungen gleichzeitig in der ersten Stufe der Immobilisierung erhalten werden.
In dem dritten, in Fig. 1D dargestellten Schritt bringt man die feste Phase (1), auf welcher die zu bestimmende Substanz (3) durch eine kovalente Bindung (4) immobilisiert ist, in Kontakt mit einem zweiten, markierten Antikörper (5), der für die Substanz (3) spezifisch ist. Dies erfolgt mit Hilfe einer Lösung, die eine Menge von markiertem Antikörper enthält, die einem Überschuß gegenüber der Menge der zu bestimmenden immobilisierten Substanz entspricht.
In dem vierten Schritt (Fig. 1E) mißt man die Menge von markiertem Antikörper (5), die durch immunologische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz (3) auf der festen Phase fixiert ist. Diese Messung wird durch solche klassischen Methoden ausgeführt, wie sie üblicherweise je nach dem verwendeten Marker für diese Art Bestimmung eingesetzt werden.
Um die Eichkurve zu verhalten, führt man mehrere Bestimmungen an Standardlösungen aus, die bekannte Konzentrationen der zu bestimmenden Substanz haben, wobei man unter den gleichen Bedingungen arbeitet, was die Gehalte fixierter Antikörper ergibt, die den verschiedenen Konzentrationen entsprechen, mit dem Ziel, diese Kurve aufzustellen.
Man führt anschließend die Bestimmung einer Probe unbekannter Konzentration unter den gleichen Bedingungen aus, und unter Bezug auf die Eichkurve erhält man aus der Messung der fixierten Menge des zweiten Antikörpers die Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe.
Man betont, daß jedem Schritt dieses Verfahrens eine klassische Waschungsoperation vorausgeht, ausgeführt mit Waschpuffern.
Nachfolgend werden Bestimmungen beschrieben, die in Übereinstimmung mit diesem Verfahren ausgeführt wurden.

Beispiel 1: Bestimmung der Substanz P

In diesem Beispiel verwendet man als feste Phase eine Mikrotitrationsplatte aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen, auf der man einen aus dem Antikörper SP14 bestehenden, von Coraud et al. in J. of Neurochemistry, Bd. 49, Nr. 6, 1987, S. 1708- 1718, beschriebenen monoklonalen Antikörper Anti-Substanz P fixiert, wobei man in folgender Weise vorgeht.
Man gibt in jede Vertiefung 200 ul 5.10&supmin;² m Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 10 ug/ml Antikörper Anti-Substanz P (SP14), und läßt 18 h lang bei 22ºC inkubieren. Anschließend wäscht man jede Vertiefung mit einem aus dem vorher verwendeten Phosphatpuffer bestehenden Waschpuffer, der zusätzlich 0,05% Tween 20 enthält, dann gibt man in jede Vertiefung 300 ul EIA-Puffer, der ein 0,1m Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) ist, enthaltend 0,1 mol/l NaCl, 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1% Rinder-Serumalbumin (BSA) und 0,01% Natriumazid, um die feste Phase mit einer Sättigungssubstanz (BSA) zu sättigen, und hält die Platten vor der ersten Verwendung für mindestens 24 h auf 4ºC.
Man führt anschließend den ersten Schritt der Bestimmung aus, indem man nach dem Waschen mit dem Waschpuffer in jede Vertiefung eine Standardlösung der Substanz P oder die Probe in einer Menge von 100 ul im EIA-Puffer gibt, man läßt für 18 h bei +4ºC inkubieren und nimmt dann mit Hilfe des Waschpuffers eine Waschung vor.
Man führt anschließend in zwei Stufen den zweiten Schritt aus. In der ersten Stufe gibt man in jede Vertiefung 100 ul 0,1m Boratpuffer (pH 9), der 2,5% Glutaraldehyd enthält, und läßt unter mäßigem Rühren 1 h lang reagieren. Nach dem Waschen gibt man in jede Vertiefung 250 ul einer Abbruchlösung, die aus einer Natriumborhydrid-Lösung mit 4 mg/ml besteht, und läßt für 1 h reagieren; dann nimmt man eine Waschung mit dem Waschpuffer vor.
In der zweiten Stufe gibt man 250 ul 0,1n HCl hinzu und läßt 10 min lang bei 22ºC reagieren, was zur Denaturierung der immunologischen Bindung zwischen der Substanz P (3) und dem ersten Antikörper (2) führt, um das Epitop der Substanz P zum Zweck einer neuen immunologischen Reaktion zugänglich zu machen.
Nach dem Waschen führt man den dritten Schritt aus, indem man in jede Vertiefung 200 ul des in dem ersten Schritt verwendeten monoklonalen Antikörpers Anti-Substanz P gibt, mit Acetylcholinesterase (AChE) (5 EE/ml) markiert und in dem EIA- Puffer verdünnt, und läßt 18 h lang bei 4ºC inkubieren. Dann nimmt man eine Waschung vor.
Um den vierten Schritt auszuführen, d. h. die Menge des auf der festen Phase fixierten zweiten Antikörpers (5) zu messen, mißt man die enzymatische Aktivität, indem man in jede Vertiefung 200 ul Ellman-Reagens hinzugibt, das aus einer Mischung von Acetyl-thiocholin und DTNB besteht, wie von Pradelles et al. in Anal. Chem. 57, 1985, S. 1170, beschrieben, wobei man die enzymatische Reaktion 1 h lang ausführt und anschließend die Extinktion bei 414 nm bestimmt. Aus den für die Standardlösungen erhaltenen Extinktionsmessungen zeichnet man die in Fig. 2 dargestellte Eichkurve, die die Konzentration der Substanz P (in pg/ml) in Abhängigkeit von der Extinktion bei 414 nm liefert.
Aus der in der Vertiefung, die die Probe enthält, erhaltenen Extinktion kann man die Konzentration der Substanz P in der Probe bestimmen, indem man sich auf die Eichkurve der Fig. 2 bezieht.
So erlaubt das Verfahren der Erfindung eine präzise und empfindliche Bestimmung der Substanz P, wobei die nachweisbare Konzentration 6 pg/ml ist.

Vergleichsbeispiel 1: Bestimmung der Substanz P

In diesem Beispiel verwendet man die Technik der kompetitiven Bestimmung und den gleichen monoklonalen Antikörper SP14 wie in Beispiel 1, um die Substanz P zu bestimmen.
In diesem Fall verwendet man eine Mikrotitrationsplatte und benutzt den monoklonalen Antikörper SP14, wobei man vorgeht, wie von Coraud et al. in J. of Neurochemistry, Bd. 49, Nr. 6, 1987, S. 1708-1718, beschrieben, gibt dann in jede Vertiefung 50 ul Standard- oder Probelösung und 50 ul des Konjugats aus Substanz P und Acetylcholinesterase, die als enzymatischer Tracer dient. Nach Inkubation während einer Nacht bei 4ºC wäscht man die Platten und bestimmt die immobilisierte enzymatische Aktivität, wobei man wie in Beispiel 1 vorgeht.
Man erhält so die in Fig. 3 dargestellte Eichkurve, auf der man als Ordinate das Verhältnis B/B&sub0; (in %) in Abhängigkeit von der Konzentration der Substanz P (in ng/ml) aufgetra gen hat. Man betont, daß B die in Gegenwart von Substanz P gemessene Extinktion und B&sub0; die in Abwesenheit von Substanz P gemessene Extinktion darstellt.
In Fig. 4 sind die in der Bestimmung des Beispiels 1 (Kurve 1) und in der Bestimmung des Vergleichsbeispiels 1 (Kurve 2) erhaltenen Präzisionsprofile dargestellt.
Diese Präzisionsprofile stellen die Veränderungen des Präzisionskoeffizienten CV (in %) in Abhängigkeit von der Menge von Substanz P (in pg/ml) in logarithmischer Koordinate dar.
Um diese Kurven zu zeichnen, führt man für jede Konzentration von Substanz P in der Standardlösung 8 Messungen aus, um zu jeder Konzentration die Standardabweichung d und den Mittelwert vm zu bestimmen. Der Präzisionskoeffizient CV (in %) wird aus diesen Messungen durch die Formel:
CV = d/vm · 100
ermittelt.
In Fig. 4 bemerkt man so, daß der Präzisionskoeffizient und die Empfindlichkeit im Fall der Kurve 1 besser sind und daß der Präzisionskoeffizient insbesondere in dem Konzentrationsbereich sehr gut ist, der von 30 bis 1000 pg/ml geht.
In Fig. 5 ist die Extinktion in Abhängigkeit von der Konzentration der Substanz P im Fall der Bestimmung des Beispiels 1 (Kurve 1) und im Fall der Bestimmung des Vergleichsbeispiels 1 (Kurve 2) dargestellt.
Bei Betrachtung dieser Ergebnisse bemerkt man, daß die Nachweisgrenze (LDD) im Fall der Bestimmung der Erfindung von der Größenordnung 10 pg/ml ist, während sie im Fall der kompetitiven Bestimmung gemäß der bisherigen Technik von der Größenordnung 900 pg/ml ist.
So erlaubt das Verfahren der immunometrischen Bestimmung der Erfindung eine präzise und empfindliche Bestimmung der Substanz P. Es erlaubt insbesondere, eine größere Präzision zu erreichen und deutlich kleinere Mengen von Substanz P zu bestimmen.

Beispiel 2: Bestimmung der Substanz P

In diesem Beispiel untersucht man den Einfluß der Konzentration des im zweiten Schritt der Immobilisierung der Substanz P verwendeten Glutaraldehyds auf die Bestimmungsergebnisse. In diesem Fall führt man wie in Beispiel 1 Bestimmungen an einer Standardlösung aus, die 500 pg/ml Substanz P enthält, wobei man Glutaraldehydkonzentrationen verwendet, die von 0 bis 2,5% variieren, und mißt in jedem Fall die Extinktion bei 414 nm.
Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 6 wiedergegeben, welche die Extinktion bei 414 nm in Abhängigkeit von der Glutaraldehydkonzentration darstellt.
Man stellt so fest, daß die Extinktion mit der Glutaraldehydkonzentration zunimmt und daß gute Ergebnisse in dem Konzentrationsbereich erhalten werden, der von 0,5 bis 2,5% geht.

Beispiel 3: Bestimmung der Substanz P

In diesem Beispiel untersucht man den Einfluß des bei dem Schritt der Immobilisierung verwendeten pH-Werts, d. h. des pH- Werts der Glutaraldehyd-Lösung, auf die Bestimmung.
In diesem Fall befolgt man an einer Standardlösung mit 500 pg/ml Substanz P die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 1, wobei man bei dem Immobilisierungsschritt pH-Werte verwenden, die von 3 bis 10 gehen.
Fig. 7 stellt die Veränderung der Extinktion in Abhängigkeit vom verwendeten pH dar. Man stellt so fest, daß die Extinktion in dem pH-Bereich besser ist, der von 5 bis 9 geht.

Beispiele 4 bis 7: Bestimmung der Substanz P

In diesen Beispielen untersucht man den Einfluß der zwei Stufen des zweiten Schritts des Verfahrens der Erfindung auf die Bestimmung.
In allen Beispielen befolgt man die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 1, abgesehen von den folgenden Modifikationen des zweiten Schritts.
In Beispiel 4 unterdrückt man den Gebrauch von NaBH&sub4;, d. h. man verwendet keine Lösung zum Abbruch der Immobilisierungsreaktion.
In Beispiel 5 verwendet man keine Glutaraldehyd-Lösung, führt aber den Reduktionsschritt mit NaBH&sub4; aus.
In Beispiel 6 läßt man die Stufe der Immobilisierung, d. h. die Reaktion mit der Glutaraldehyd-Lösung und den Zusatz der Abbruchlösung, vollständig aus.
In Beispiel 7 führt man die Stufe der Immobilisierung aus, nicht die Stufe der Freisetzung des Epitops durch die Salzsäure-Lösung.
Diese Modifikationen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Tabelle 1
Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 8 wiedergegeben, welche die in jedem Fall erhaltenen Eichkurven darstellt, d. h. die Veränderung der Extinktion bei 414 nm in Abhängigkeit von der Konzentration der Substanz P (pg/ml).
In dieser Figur bezieht sich Kurve 1 auf Beispiel 1, Kurve 4 bezieht sich auf Beispiel 4, Kurve 5 bezieht sich auf Beispiel 5, Kurve 6 bezieht sich auf Beispiel 6 und Kurve 7 bezieht sich auf Beispiel 7.
Bei Betrachtung dieser Figur bemerkt man, daß die Ausführung der Stufen der Immobilisierung der Substanz P auf den Mikrotitrationsplatten und der Freisetzung ihres Epitops wesentlich ist, um die Bestimmung der Substanz P zu ermöglichen.

Beispiel 8: Bestimmung des Thyroxins

Für diese Bestimmung verwendet man eine mit der von Beispiel 1 identische Mikrotitrationsplatte mit 96 Vertiefungen, und man fixiert in den Vertiefungen einen Antikörper Anti-Thyroxin, bestehend aus einem monoklonalen Antikörper des Institut Pasteur, wobei man unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 arbeitet.
Man gibt dann in jede Vertiefung in einer Menge von 100 ul eine Thyroxin-Standardlösung in einem 0,05 m Barbitalpuffer (pH 8,6), enthaltend 0,1% BSA, danach läßt man für 1 h bei 22ºC inkubieren. Anschließend wäscht man mit dem im Beispiel 1 verwendetem Waschpuffer.
Im zweiten Schritt fügt man in jede Vertiefung 100 ul 0,1m Phosphatpuffer (pH 7) und 10 ul Disuccinimidylsuberat (DSS) in der Konzentration von 1 mg/ml in einer Mischung von Dimethylformamid und n-Propanol (Volumenverhältnis 1/9) hinzu und läßt für 15 min bei der Temperatur von 22ºC reagieren, dann wäscht man mit dem Waschpuffer und unterbricht die Reaktion mit 0,1m Ethanolamin in dem 0,1m Boratpuffer (pH 9). Nach dem Waschen gibt man in jede Vertiefung 250 ul 0,1n Natronlauge, um das Epitop des Thyroxins freizusetzen.
Nach dem Waschen fügt man 100 ul des gleichen monoklonalen Antikörpers Anti-Thyroxin hinzu, markiert mit Acetylcholinesterase (AChE) (5 EE/ml) und verdünnt in dem Barbitalpuffer, und läßt für 1 h bei 22ºC inkubieren.
Nach dem Waschen gibt man das Ellman-Reagens hinzu (200 ul), läßt die enzymatische Reaktion 10 min lang ablaufen und mißt dann die Extinktion bei 414 nm.
Die erhaltenen Resultate, d. h. die Eichkurve, sind in Fig. 9 wiedergegeben, die die Veränderung der Extinktion bei 414 nm in Abhängigkeit von der Thyroxinkonzentration (ng/ml) darstellt.
Die Nachweisgrenze ist 61 pg/ml.
Man erhält also eine hohe Empfindlichkeit, wenn man einen einzigen Antikörper verwendet und die Spezifizität der Bestimmung durch Gebrauch eines monoklonalen Antikörpers verbessert.
Zum Vergleich wird betont, daß die gleiche Bestimmung, mit dem gleichen Antikörper auf kompetitivem Wege ausgeführt, eine Nachweisgrenze von 1 ng/ml ergibt.

Beispiel 9 bis 11: Bestimmungen des Thyroxins

Für diese Bestimmungen befolgt man die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 8, wobei man verschiedene Reagenzien verwendet, um die Wirkung der bindenden Proteine wie der TBG zu inhibieren, und indem man 10 ul Standard- oder Probenplasma entweder zu 100 ul Barbitalpuffer (Beispiel 9) oder zu 100 ul Barbitalpuffer, enthaltend 1 mg/ml ANS (8-Anilino-2-naphtalinsulfonsäure) (Beispiel 10), oder zu 100 ul Barbitalpuffer, enthaltend 0,4% Thymerosal (Beispiel 11), hinzufügt.
Man führt anschließend den Schritt der Immobilisierung des Thyroxins in den Vertiefungen aus, indem man eine Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in dem Boratpuffer verwendet, die man 30 min lang unter mäßigem Rühren reagieren läßt, dann unterbricht man die Reaktion mit Hilfe von NaBH&sub4;, das man für 30 min reagieren läßt.
Für die Freisetzung des Epitops und die weiteren Bestimmungsschritte geht man wie in Beispiel 8 vor.
Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 10 wiedergegeben, welche die erhaltenen Eichkurven darstellt, d. h. die Extinktion bei 414 nm in Abhängigkeit von der Thyroxinkonzentration (in nmol/l).
In dieser Figur bezieht sich Kurve 9 auf Beispiel 9, Kurve 10 bezieht sich auf Beispiel 10, und Kurve 11 bezieht sich auf Beispiel 11.
Bei Betrachtung dieser Figur stellt man fest, daß die besten Resultate erhalten werden, wenn man den Barbitalpuffer mit Thymerosal verwendet.

Beispiele 12 bis 14: Bestimmungen des Thyroxins

In diesen Beispielen untersucht man den Einfluß der verschiedenen Schritte des Verfahrens der Erfindung auf die Bestimmung.
In allen Beispielen befolgt man die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 8, abgesehen von den folgenden Modifikationen.
In Beispiel 12 verwendet man DSS als Immobilisierungsreagens, Ethanolamin als Abbruchlösung, aber 0,1n Salzsäure als Reagens für die Freisetzung des Epitops.
In Beispiel 13 führt man nur den Schritt der Immobilisierung des Thyroxins durch DSS und Ethanolamin aus, aber ohne Freisetzung des Epitops durch HCl.
In Beispiel 14 führt man weder den Schritt der Immobilisierung des Thyroxins noch den Schritt der Freisetzung des Epitops aus.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt, welche die erhaltenen Eichkurven wiedergibt. In dieser Figur beziehen sich die Kurven 12, 13 und 14 auf die Beispiele 12, 13 bzw. 14.
Bei Betrachtung dieser Figur bemerkt man, daß die beiden Schritte der Immobilisierung und der Freisetzung des Epitops wesentlich sind, um die Bestimmung des Thyroxins zu ermöglichen, da man im Fall der Beispiele 13 und 14 keine Veränderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Thyroxinkonzentration bemerkt.
Das Verfahren der Erfindung ist somit sehr interessant, denn es erlaubt, eine erhöhte Empfindlichkeit zu erzielen, wobei man einen einzigen Antikörper verwendet. Außerdem zeigten die nachfolgend in der Tab. 2 angegebenen Ergebnisse von Korrelationsstudien, die an Substanzen P, die von verschiedenen Quellen herstammen, ausgeführt wurden, daß man mit dem Verfahren der Erfindung gleiche Ergebnisse erhält wie bei einer kompetitiven Bestimmung mit Hilfe des gleichen Antikörpers, was die Zuverlässigkeit des Verfahrens der Erfindung bestätigt. Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Substanz, die aus einem Antigen oder einem Hapten besteht, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Schritte umfaßt:

1º) eine Probe, welche die zu bestimmende Substanz enthält, mit einer festen Phase in Kontakt zu bringen, auf welcher eine Sättigungssubstanz und ein Fang-Antikörper, erster Antikörper genannt, der für ein Epitop der zu bestimmenden Substanz spezifisch ist, fixiert sind, um die zu bestimmende Substanz immunologisch mit dem fixierten Antikörper zu verbinden,

2º) die feste Phase, auf welcher die Sättigungssubstanz, der Antikörper und die zu bestimmende Substanz fixiert sind, einer Behandlung durch zumindest ein Reagens zu unterziehen, um die zu bestimmende Substanz durch Bildung von kovalenten Bindungen auf der festen Phase zu immobilisieren und um die vorher erhaltene immunologische Bindung zwischen der zu bestimmenden Substanz und dem ersten Antikörper zu denaturieren, damit ein Epitop der zu bestimmenden Substanz im Hinblick auf eine neue immunologische Reaktion zugänglich gemacht wird,

3º) die so behandelte feste Phase mit einem markierten Antikörper, zweiter Antikörper genannt, der spezifisch ist für die zu bestimmende Substanz, in Kontakt zu bringen,

4º) die auf der festen Phase fixierte Menge des zweiten Antikörpers zu messen,

5º) aus der im vierten Schritt gemessenen Menge des zweiten Antikörpers auf einer Eichkurve die in der Probe vorhandene Menge der zu bestimmenden Substanz zu ermitteln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende, immunologisch an den ersten Antikörper gebundene Substanz in dem zweiten Schritt mit einem zumindest bifunktionellen Reagens reagieren läßt, das imstande ist, einerseits mit der zu bestimmenden Substanz, andererseits mit der festen, von dem ersten Antikörper und der Sättigungssubstanz überzogenen Phase kovalente Bindungen zu bilden, um mit Hilfe dieses Reagens die zu bestimmende Substanz auf der festen Phase zu immobilisieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens Glutaraldehyd oder Disuccinimidylsuberat ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Schritt eine Denaturierungsbehandlung umfaßt, die mit einem Reagens ausgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens unter den Säuren, den Basen, den organischen Lösungsmitteln, den Detergentien und den mineralischen Salzen gewählt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Schritt eine Denaturierungsbehandlung umfaßt, die durch Einwirkung von Ultraschall oder durch Einwirkung von Wärme ausgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Antikörper identisch sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Antikörper monoklonale Antikörper sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper mit einem radioaktiven Element, einem Enzym, einem fluoreszierenden Marker, einem lumineszierenden Marker oder einem Molekül, das imstande ist, mit Avidin oder Streptavidin zu reagieren, markiert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz die Substanz P oder Thyroxin ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Hapten ist, das in der Gruppe enthaltend ACTH, Angiotensin, ANF, Bradykinin, Enkephalin, LHRH, Ocytocine, Vasopressin, den Neurokininen, Endothelin und Leukotrien E&sub4; gewählt wird.