DE68925112T2

DE68925112T2 - Haptenderivatisierte aufnahmemembran und diagnostische tests, die eine solche membran verwenden

Info

Publication number: DE68925112T2
Application number: DE68925112T
Authority: DE
Inventors: Richard Armenta; Charles Burke; Viola Kung; John Olson; Edward Sheldon; Robert Zuk
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 1988-10-17
Filing date: 1989-10-10
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2009-10-11
Also published as: CA2000810A1; DE68925112D1; ATE131617T1; EP0390910B1; WO1990004786A1; EP0390910A1; JPH03501777A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf diagnostische Reagenzien, Abfangmembranen, die sich zur Entfernung spezifisch bindender Komplexe aus Lösungen eignen, sowie Assayverfahren, bei denen solche Reagenzien verwendet werden. Zu den spezifisch bindenden Komplexen gehören Antigen/Antikörper-Komplexe, DNA, Anti-DNA (Antikörper gegen DNA) oder DNA-Einzelstrang-bindendes Protein (wie SSB von E. coli), DNA, DNA-Hybride, RNA, RNA-Hybride und ähnliche spezifisch bindende Komplexe.

Stand der Technik

Auf dem Fachgebiet der diagnostischen Assays und Reagenzien, die spezifisch bindende Komplexe beinhalten, gibt es ausgedehnte Lehren. Antigen/Antikörper-Reaktionen finden verbreitet Verwendung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern. Die Markierung von Gliedern dieser Komplexe mit nachweisbaren Markern, wie Enzymen oder Fluoreszenzfarbstoffen, ist wohlbekannt. Die Bindung von Antigenen oder Antikörpern an feste Träger als Mittel zur Entfernung von Komplexen aus Lösungen ist ebenfalls bekannt. Die Verwendung von Haptenen, wie Biotin, und Anti-Haptenen, wie Streptavidin, im diagnostischen Assay wird in einem Übersichtsartikel, der in Analytical Biochemistry 171, 1-32 (1988), erscheint, ausführlich diskutiert.
An einen festen Träger gebundenes Biotin ist in den US-Patenten 4,282,287, 4,478,914 und 4,656,202 beschrieben. Diese Patente beschreiben eine präzise Schichtbildungstechnik, wobei Biotin zuerst an eine feste Oberfläche gebunden wird und die anschließende Auftragung aufeinanderfolgender Schichten von Avidin und Extender zu einer kontrollierten Modifikation der Oberflächeneigenschaften führt.
Das Europäische Patent Nr. 87307850.5 (EP-A-0259186) betrifft ein Verfahren zur routinemäßigen Pflanzenvirusdiagnose, das Biotin beinhaltet, welches an ein Makromolekül gebunden ist, das mit einer Probe einer DNA-Sonde konjugiert ist. Die sondenhaltige Verbindung wird auf eine feste Matrix aufgetragen, auf der eine Testprobe von DNA, die von Pflanzengewebe abgeleitet ist, immobilisiert ist. Die Gegenwart der Zielsequenz wird durch Waschen der Matrix mit enzymgebundenem Avidin und anschließende Bestimmung der mit der Matrix assoziierten Enzymaktivität bestimmt.
Das US-Patent Nr. 4,467,031 beschreibt einen Enzym-Immunoasssay, bei dem das Biotin-Avidin-System als zweckmäßige und stabile Verknüpfungsgruppe zum Verbinden eines Reporterenzyms mit einem Antikörper verwendet wird.
Das US-Patent Nr.4,228,237 beschreibt die Verwendung des Biotin- Avidin-Systems in einem Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Liganden. Eine Oberfläche, an die ein Antikörper für den interessierenden Liganden gebunden ist, wird mit einer Probe des Liganden und anschließend mit einem zweiten ligandenspezifischen Antikörper, der mit Biotin konjugiert ist, umgesetzt. Dieser Komplex wird dann mit einem avidinkonjugierten Enzym umgesetzt, und die Ergebnisse werden durch Messung der Enzymaktivität bestimmt.
Das US-Patent Nr. 4,656,025 beschreibt einen Screening-Assay für Tumorglobulin. Ein Tumorglobulin-Biotin-Konjugat auf ELISA- Platten wird mit avidinkonjugiertem Enzym umgesetzt, und die Menge des an die Platte gebundenen Tumorglobulins wird durch Anwendung eines geeigneten chromogenen Substrats bestimmt.
Das US-Patent Nr. 4,535,057 beschreibt einen Immunoassay, bei dem Elotin über einen Antikörper-Virus-Komplex an einen festen Träger konjugiert ist. Dieser Biotin-Antikörper-Virus-Komplex wird dann mit Avidin umgesetzt, das mit einer Reportergruppe oder einer Markierung konjugiert ist, und die Gegenwart der mit der Oberfläche assoziierten Markierung zeigt die Gegenwart des Virus in der Probe an.
Die US-Patente 4,727,019 und 4,632,901 beschreiben einen Immunoassay, bei dem Avidin an einen festen Träger gebunden ist und einen in der Probe vorhandenen Liganden an den Träger bindet. Das US-Patent Nr. 4,298,685 beschreibt ein diagnostisches Reagenz, das ebenfalls auf einem festen Träger immobilisiertes Avidin beinhaltet. Das US-Patent Nr. 4,582,810 beschreibt ein Nachweissystem, bei dem eine Suspension von Teilchen mit kovalent daran gebundenem Avidin mit einem Biotin-Antikörper-Komplex reagiert, wobei sich ein Komplex bildet, was zu einer flockig erscheinenden Lösung führt.
GB-A-2199327 beschreibt eine poröse Membran, auf der ein Partner eines bindenden Paares mit Hilfe eines chemischen Aktivierungsmittels immobilisiert wird. WO 85/05451 beschreibt eine poröse Membran, an die ein Partner eines bindenden Paares gebunden oder fixiert ist. Beide Membranen können verwendet werden, um den anderen Partner des bindenden Paares einzufangen.
Das US-Patent Nr. 4,550,075 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden, das auf dem Biotin-Avidin-System ohne einen festen Träger beruht. EP-A-201079 beschreibt einen Assay mit Festphasenimmobilisierung, der auf der Biotin-Avidin-Bindung beruht.
Das US-Patent Nr. 4,486,530 beschreibt ein immunometrisches Assayverfahren, das einen ternären Komplex aus einer antigenen Substanz sowie einem an das Antigen gebundenen ersten und zweiten Antikörper umfaßt und bei dem der Komplex durch Filtrieren durch eine Membran aus der Lösung entfernt wird.
Clinical Chemistry 34, Nr. 8, S. 1585 (1988), beschreibt einen nichtkompetitiven Avidin-Biotin-Assay auf der Basis von monoklonalen Antikörpern für luteinisierendes Hormon (LH) in Urin.
Das US-Patent Nr. 4,778,751 beschreibt ein Verfahren zum Messen von Antigenen, umfassend: Bilden eines löslichen Komplexes in einer Flüssigphasenreaktion, wobei ein Antigen (Ag&sub1;), Antikörper (Ab&sub1;) oder Hapten (H) über einen spezifischen Antikörper (Ab), ein Antigen (Ag) bzw. ein Anti-Hapten (Anti-H) an eine Matrix gebunden ist, die in der flüssigen Phase löslich ist und einen Liganden (X) trägt, wobei die Matrix an mehr als einen spezifischen Antikörper (Ab), Antigen (Ag) oder Anti-Hapten (Anti-H) chemisch gebunden sein kann; Bilden eines unlöslich gemachten Komplexes, der einen festen Träger umfaßt, der über einen Anti- Liganden (Y) an den Liganden (X) des löslichen Komplexes gebunden ist, wobei der unlöslich gemachte Komplex eine Markierung (Z) trägt, die über ein Anti-Antigen (Anti-Ag&sub1;) an das Antigen (Ag&sub1;), über einen Anti-Antikörper (Anti-Ab&sub1;) an den Antikörper (Ab&sub1;) oder an das Hapten (H) gebunden ist; Waschen des unlöslich gemachten Komplexes; sowie Beobachten des gewaschenen unlöslich gemachten Komplexes auf die Gegenwart der Markierung (Z) hin, wobei die Gegenwart der Markierung (Z) die Menge des Antigens (Ag&sub1;), Antikörpers (Ab&sub1;) oder Haptens (H) in der Probe anzeigt.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 86111379.3 (EP-A-0212603) beschreibt mehrschichtige Immunoassay-Testvorrichtungen, bei denen markierte Reagenzien verwendet werden, die eine chemische Gruppe umfassen, die eine nachweisbare physikalische Eigenschaft besitzt, wie Fluoreszenz oder Farbe.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 88308164.8 (EP-A-0310251) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung einzelsträngiger DNA auf der Basis der Bindung einer einzelsträngigen DNA an ein DNA- Einzelstrang-bindendes Protein, an das ein fester Träger gebunden ist.
Molecular Immunology, 34: 221-230 (1989), beschreibt ein ELISA- System, das die Immobilisierung biotinylierter CAbs über die Bindung von Streptavidin an biotinylierte Trägerproteine, die auf Polystyrol absorbiert sind, beinhaltet. Die vorliegende Erfindung stellt eine Technik zur Entfernung spezifisch bindender Komplexe aus einer Lösung bereit und unterscheidet sich dadurch vom Stand der Technik, daß das Reagenz dieser Erfindung eine poröse Membran ist, wobei ein Hapten, vorzugsweise Biotin, direkt oder indirekt an die Membran gebunden ist.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Abfangmembran, umfassend eine poröse Filtermembran mit einem Hapten, das über ein an der Membran befestigtes und kovalent an das Hapten gebundenes Makromolekül indirekt an die Membran gebunden ist.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie oben angemerkt, umfaßt die vorliegende Erfindung eine poröse Membran oder ein Filter, woran ein Hapten gebunden ist, wobei diese Membran oder das Filter eine Lösung filtrieren kann, die einen spezifisch bindenden Komplex enthalten kann, wobei ein Anti-Hapten an ein bindendes Glied des spezifisch bindenden Komplexes gebunden ist.
Das Material der Membran oder des Filters wird aus Material ausgewählt, an das Protein oder ein anderes Makromolekül gebunden werden kann. Eine Vielzahl von Materialien kann verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, daß poröse Membranen aus Nylon, Celluloseacetat, Polyolefin, Polyacrylamid, Nitrocellulose oder anderen porösen Materialien in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Andere synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die ein Protein oder ein anderes Makromolekül binden, können ebenfalls verwendet werden. Eine bevorzugte Membran besteht aus Nitrocellulose.
Haptene sind Substanzen, die keine Bildung von Antikörpern hervorrufen, wenn sie nicht an Makromoleküle komplexiert sind, und die in der vorliegenden Erfindung als spezifische organische Stoffe eingesetzt werden können, für die spezifisch bindende Substanzen bereitgestellt werden können. Antikörper gegen Haptene können gebildet werden, indem man das Hapten an ein Protein bindet, so daß eine Antikörperreaktion hervorgerufen wird. Eine spezifisch bindende Substanz ist jede Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifisch bindende Affinität für das Hapten unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt. Das eingesetzte Hapten muß in der Lage sein, direkt oder über eine ausgedehnte Verknüpfungsgruppe an ein Protein oder anderes Makromolekül zu binden. Beispiele für Haptene, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Steroide, wie Östron, Östradiol, Testosteron, Pregnandiol und Progesteron; Vitamine, wie B&sub1;&sub2;, Biotin und Folsäure; Triiodthyronin, Thyroxin, Histamin, Serotonin, Digoxin, Prostaglandine, Adrenalin, Noradrenalin, Morphin, Pflanzenhormone und Antibiotika, wie Penicillin.
Wenn das Hapten eine Substanz ist, die einen natürlich vorkommenden Rezeptor besitzt, kann der Rezeptor als Anti-Hapten verwendet werden, vorausgesetzt, der Rezeptor kann in einer für das Hapten spezifischen Form isoliert werden. Beispielhafte Haptene, die natürlich vorkommende Rezeptoren besitzen, sind Thyroxin, viele Steroide, Polypeptide, wie Insulin, Angiotensin, Biotin und viele andere. Rezeptoren für diese Klasse von Haptenen sind gewöhnlich Proteine oder Nucleinsäuren.
Ausgedehnte Verknüpfungsgruppen sind Gruppen, die das Hapten so an das Protein oder Makromolekül binden, daß das Hapten einen besseren Zugang zu dem Anti-Hapten hat. Zu den ausgedehnten Verknüpfungsgruppen, die sich für die vorliegende Erfindung eignen, sind succinyliertes Polylysin, Dextran, Polyethylenglycol und vorzugsweise eine Polyamidoether-Verlängerungsgruppe. Diese ausgedehnten Verknüpfungsgruppen können getrennt oder in Kombination verwendet werden, wobei man ausgedehnte Verknüpfungsgruppen mit verschiedenen Längen und Bindungseigenschaften erhält. Ausgedehnte Verknüpfungsgruppen werden vorzugsweise mit Serumproben, insbesondere lipämischen Serumproben, verwendet. Offensichtlich gibt es in Serumproben störende Substanzen, deren Störung durch die ausgedehnte Verknüpfungsgruppe überwunden wird. Wenn keine ausgedehnte Verknüpfungsgruppe benötigt wird, wird ein Hapten, wie Biotin, ohne ausgedehnte Bindungsgruppe an eine funktionelle Gruppe an einer Membran oder an eine funktionelle Gruppe an einem Protein, das auf die Membran aufgebracht werden kann, gebunden.
Die ausgedehnte Verknüpfungsgruppe muß in der Lage sein, an das Protein oder Makromolekül zu binden. Vorzugsweise wird die ausgedehnte Verknüpfungsgruppe, an deren eines Ende ein Hapten gebunden ist, mit einer Amidbindung an das Protein oder Makromolekül gebunden, wobei die Aminogruppe der Amidbindung vom Protein stammt und die Carboxygruppe der Amidbindung vom Carboxyterminus der Verlängerungsgruppe stammt. Freie Carboxy- oder Hydroxygruppen auf Proteinen können ähnlich verwendet werden.
Die Proteine und Makromoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen Rinderserumalbumin (BSA), Rinder-γ-Globulin und Fibrinogen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Der durch spezifische Bindung erzeugte Komplex, der aus der Lösung entfernt wird, wenn sie durch das Filter läuft, umfaßt zwei bindende Glieder und ein Antigen, mit der Maßgabe, daß ein bindendes Glied an ein Anti-Hapten gebunden ist und das andere bindende Glied an eine Markierungsgruppe gebunden ist.
Die an die bindenden Glieder der vorliegenden Erfindung gebundenen Anti-Haptene umfassen die oben beschriebenen Moleküle, die als Rezeptoren für die oben genannten Haptene wirken. Antikörper sind bevorzugte bindende Glieder, die zweckmäßigerweise mit Enzymen oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, und auch zweckmäßigerweise an Anti-Haptene, wie Avidin oder Streptavidin, oder Antikörper gegen Haptene gebunden sind.
Diese Ausführungsform der Erfindung kann wie folgt dargestellt werden: Abfangmembran Komplex Membran-Hapten Membran- (Biotin) Anti-Hapten-Ab Ag Ab- (markiert) (Streptavidin)-Ab' Ag' Ab- (Enzym)
Der Fachmann wird erkennen, daß Abfangmembranen auch in sequentiellen Assays eingesetzt werden können. Bei einem solchen Assay wird eine Reihe von Filtrationsschritten verwendet, um eine zu bestimmende Substanz abzufangen und nachzuweisen. Ein solcher Assay kann gegenüber nichtsequentiellen Standardassays viele Vorteile haben.
Zum Beispiel kann eine Lösung eines Anti-Haptens durch eine haptenierte poröse Filtermembran filtriert werden, wodurch das Anti-Hapten auf der Membran abgefangen wird. Eine Lösung, die eine Anti-Hapten-bindende Substanz enthält, wird anschließend durch die Membran filtriert, wodurch die Anti-Hapten-bindende Substanz abgefangen wird. Bei dieser Anti-Hapten-bindenden Substanz kann es sich um ein Hapten oder eine andere Substanz, die an ein Anti-Hapten bindet, handeln. Die Anti-Hapten-bindende Substanz ist vorzugsweise mit Bindungsstellen für eine zu bestimmende Substanz modifiziert. Durch Filtrieren einer Lösung einer zu bestimmenden Substanz durch die Membran wird die zu bestimmende Substanz auf der Membran abgefangen. Die zu bestimmende Substanz kann dann auf der Membran nachgewiesen werden, indem man filtriert und die zu bestimmende Substanz mit einer nachweisbaren Markierung markiert und die Markierung auf der Membran nachweist. Die Markierung kann dann nach verschiedenen Verfahren, die in der Technik bekannt sind, nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Elektrode, bei der es sich um einen Halbleiter handelt, eingesetzt werden.
Der Fachmann wird erkennen, daß viele Kombinationen sequentieller Assays durchgeführt werden können. Komplexe können zwischen Anti- Haptenen, Haptenen, Antigenen, Antikörpern, zu bestimmenden Substanzen und nachweisbaren Markierungen gebildet werden. Diese Komplexe können eine oder mehrere Komponenten besitzen. Assays können also so entworfen werden, daß eine Störung durch spezifische Substanzen vermieden wird.
Diese Ausführungsform der Erfindung kann wie folgt dargestellt werden: Abfangmembran Komplex Membran-Hapten-Anti-Hapten Membran-(Biotin) (Streptavidin) Hapten-Ab Ag Ab- (markiert) Biotin-Ab' Ag' Ab-(Enzym)
Antikörper können in ähnlicher Weise wie ein Antigen bestimmt werden. Komplexe können zwischen einem Anti-Hapten, einem Antikörper, einem an ein Hapten oder Anti-Hapten gebundenen Antigen und einem anderen, an eine Markierungsgruppe gebundenen Antigen gebildet werden.
Die Haptene und Anti-Haptene umfassen die oben als Haptene und Anti-Haptene beschriebenen Moleküle. Antigene können zweckmäßigerweise mit Enzymen oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein und sind auch zweckmäßigerweise an Haptene oder Anti-Haptene gebunden.
Diese Ausführungsformen der Erfindung können wie folgt dargestellt werden: Abfangmembran Komplex Membran-Hapten Membran- (Biotin) (Streptavidin) Anti-Hapten Hapten-Ag Ab Ag- (markiert) (Biotin) -Ag Ab Ag- (Enzym)
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Antikörper können entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper sein und werden als Reaktion auf das Ziel-Antigen des Assays erzeugt. Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen verschiedene biologische Substanzen sind in der Technik wohlbekannt.
Die Antigene, die das Ziel des Assays bilden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antigene wie IgE, Prostatsäure- Phosphatase, prostatspezifisches Antigen, α-Fetoprotein, carcinoembryonisches Antigen, luteinisierendes Hormon, Creatin- Kinase MB, Human-Chorion-Gonadotropin (HCG) sowie andere Antigene in Serum, Plasma, Urin oder anderen flüssigen Medien.
Polydesoxyribonucleotide können durch Reaktionen mit DNA-Einzelstrang-bindendem Protein (SSB) und Anti-DNA-Antikörpern bestimmt werden. Es werden also verschiedene Kombinationen von markiertem SSB oder markierter Anti-DNA und biotinyliertem SSB oder biotinylierter Anti-DNA eingesetzt. In dieser Ausführungsform ist Streptavidin an das biotinylierte SSB oder die biotinylierte Anti-DNA gebunden, so daß der Komplex an die Biotin aufweisende Abfangmembran gebunden werden kann. Anstelle von SSB kann auch eine Oligonucleotidsonde verwendet werden, um DNA nachzuweisen. Der Artikel in Biochemistry, 25: 21 (1986), beschreibt die Erzeugung von Einzelstrang-bindendem Protein (SSB) aus E. coli in großem Maßstab. Monoklonale Antikörper gegen DNA werden verwendet, um DNA in biologischen Flüssigkeiten zu messen, Journal of Immunological Methods, 88 (1986), 185-192.
Diese Ausführungsformen der Erfindung können wie folgt dargestellt werden: Abfangmembran Komplex Membran-Biotin Streptavidin-Biotin-Anti -DNA/DNA/SSB-Enzym Streptavidin-Biotin-SSB/DNA/Anti-DNA-Enzym Streptavidin-Biotin-Oligonucleotidsonde/DNA/Oligonucleotidsonde-Enzym
Zu den Markierungsgruppen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, gehören Enzyme, Fluoreszenzmarkierungen und Radionuklide. Die bevorzugte Markierung ist ein Enzym, das an einer Stelle, die die Bindung des Antikörpers an das Antigen nicht stört, an den Antikörper gebunden ist. Das Enzym sollte also potentiell reaktive Gruppen besitzen, an die der Antikörper gekoppelt werden kann, ohne die Enzymaktivität zu zerstören, und sollte nicht in einem erheblichen Ausmaß natürlicherweise in der Flüssigkeit vorkommen, die auf die spezifische biologische Substanz hin untersucht werden soll. Außerdem sollte das Enzym eine relativ lange Lagerbeständigkeit und eine hohe spezifische Aktivität besitzen und auch leicht bestimmt werden können, zum Beispiel mit einem im sichtbaren Licht arbeitenden Spektrophotometer.
Beispiele für Enzyme, die zweckmäßigerweise im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind Malat- Dehydrogenase, Lipase, Δ&sup5;-Ketosteroid-Isomerase, Hefe-Alkohol- Dehydrogenase, Hefe-Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, α-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Meerrettich- Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucose- Oxidase, β-Galactosidase und vorzugsweise Urease. Normalerweise liegt das Enzym vorzugsweise in reiner Form vor, frei von verunreinigenden Proteinen.
Die Herstellung der enzymmarkierten biologischen Substanzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann auf viele Weisen, die in der Technik bekannt sind, bewerkstelligt werden. Beispiele für die Kopplung biologischer Substanzen an Enzyme sind zum Beispiel in L.A. Steinberger, Immunocytochemistry, Prentice Hall, New Jersey (1974), beschrieben.
Obwohl auch ein Radionuklid, wie ¹²&sup5;I oder ³²P, als Markierung verwendet werden kann, sind nichtradioaktive Markierungen bevorzugt.
Nach dem Filtrieren der Lösung, von der man annimmt, daß sie das Antigen in einem spezifisch bindenden Komplex enthalten könnte, durch die poröse Filtermembran wird die Gegenwart von markiertem Antikörper auf der porösen Membran als Hinweis auf die Gegenwart des Ziel-Antigens in der Probe bestimmt. Im Falle einer Enzymmarkierung kann dies durch Zugabe einer Lösung eines farbbildenden Substrats zu der porösen Membran erfolgen, so daß das Substrat mit dem Enzym reagieren kann. Bestimmungen können zweckmäßigerweise mit der Vorrichtung und den Verfahren erfolgen, die in den US-Patenten 4,591,550, 4,704,353 und EP-A-0255223 der Erfinder beschrieben sind.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die verbesserte Effizienz der Biotinmembran (BXL-BSA, biotinyliertes Rinderserumalbumin) im Vergleich zu der der Avidin(Streptavidin)membran.
Fig. 2 zeigt die Effizienz des Abfangs von Streptavidin bei verschiedenen Biotindichten unter Verwendung zweier verschiedener Membrantypen und zweier verschiedener Fließgeschwindigkeiten.
Fig. 3 zeigt die Abfangeffizienz eines 0,8-µm-Nitrocellulosefilters bei verschiedenen Konzentrationen von BXL-BSA auf der Membran und bei verschiedenen Streptavidin-Fließgeschwindigkeiten.
Fig. 4 zeigt die Bestimmung von TSH.
Fig. 5 ist eine durch den Zweisondenassay erzeugte Standardkurve.
Fig. 6 ist eine halblogarithmische Auftragung, die die mit dem Zweisondenassay bestimmten Mengen an Produkt der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) zeigt.
Fig. 7 ist ein Graph der Effizienz der PCR, die mit dem Zweisondenassay bestimmt wurde.
Fig. 8 zeigt Standardkurven für die Bestimmung von MuIgG durch das sequentielle und das simultane Verfahren.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Eine bevorzugte Abfangmembran wird gemäß dem folgenden Reaktionsschema hergestellt. Rinderserum Albumin Bernsteinsäureanhydrid/DMF Dialyse gegen Reaktionspuffer 2,2'-Oxybis(ethylamin)-Dihydrochlorid 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid Dialyse gegen Phosphatpuffer
eine Verbindung der Formel:
wobei 5-20 Biotineinheiten mit der ausgedehnten Verknüpfungsgruppe an BSA gebunden sind.

Beispiel 1

Herstellung einer Abfangmembran

Ein Reaktionspuffer mit dem pH-Wert 8,2 wurde durch Auflösen von 8,40 g Natriumhydrogencarbonat und 8,76 g Natriumchlorid in einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser gelöst, so daß man 1 l Lösung erhielt.
10,00 g Rinderserumalbumin (BSA) wurden in 250 ml Reaktionspuffer mit dem pH-Wert 8,2 gelöst, und die resultierende BSA-Lösung wurde mit einem Dialysefilter gegen Reaktionspuffer erschöpfend dialysiert. Das Volumen nach der Dialyse war immer noch 250 ml.
Die anhand der Extinktion bei 280 nm bestimmte BSA-Konzentration betrug an diesem Punkt 40 mg/ml. Ein mit dieser BSA-Lösung durchgeführter TNBS-Assay zeigte 18 freie Aminogruppen pro BSA an. TNBS ist ein Assay für freie Aminogruppen in einem Protein, der auf 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure/Sulfit beruht und eine Modifikation des von Palmer et al., Clin. Chem., 15: 891-901 (1969), beschriebenen Verfahrens ist. Ein Aliquot wurde für spätere TNBS- Assays entnommen. Zu der BSA-Lösung gab man dann 6,32 g K&sub2;CO&sub3;, und die resultierende Lösung wurde kräftig gerührt, während eine Lösung von 3,34 g Bernsteinsäureanhydrid in 83,5 ml DMF im Verlaufe von 14 Minuten langsam hinzugefügt wurde. Die resultierende Lösung wurde dann weitere 5 Minuten gerührt, und man ließ sie eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wurde dann gegen Reaktionspuffer erschöpfend dialysiert und mit einem Minitan-Konzentrator auf 250 ml konzentriert.
Anhand der Extinktion wurde die BSA-Konzentration an diesem Punkt zu 40 mg/ml bestimmt. Ein an der Lösung des succinylierten BSA durchgeführter TNBS-Assay zeigte weniger als eine freie Aminogruppe pro succinyliertem BSA an.
An diesem Punkt wurden 25 ml einer 1 M Lösung von 2,2'-Oxybis(ethylamin)-Dihydrochlorid (pH 8,2) in Reaktionspuffer unter Rühren zu der BSA-Lösung gegeben. Dann wurden 6,39 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid unter kräftigem Rühren zu der BSA-Lösung gegeben. Das Rühren wurde beendet, nachdem sich das ganze Carbodiimid aufgelöst hatte, und die resultierende Lösung wurde abgedeckt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Lösung wurde dann gegen Reaktionspuffer erschöpfend dialysiert und mit einem Minitan -Konzentrator (Millipore) auf 250 ml konzentriert.
Wiederum wurde die BSA-Konzentration anhand der Extinktion zu 40 mg/ml bestimmt. Ein an der oben hergestellten BSA-Oxybis(ethylamin)-Lösung durchgeführter TNBS-Assay zeigte die Gegenwart von 15 freien Aminogruppen an. Ein an dem endgültigen Dialysepuffer durchgeführter TNBS-Assay zeigte eine ausreichende Dialyse freier Aminogruppen aus der BSA-Lösung an.
Zu der BSA-Lösung wurden dann 1,51 g Succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat gegeben, und die Lösung wurde 5 Minuten kräftig gerührt; danach wurde sie abgedeckt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Lösung des biotinylierten BSA wurde gegen einen Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 erschöpfend dialysiert. Der Phosphatpuffer wurde wie folgt hergestellt: 4,97 g zweibasiges Natriumphosphat, 2,07 g einbasiges Natriumphosphat und 6,77 g Natriumchlorid wurden in einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser gelöst, so daß man 1 l Lösung erhielt.
Nach der Dialyse wurde die Konzentration an biotinyliertem BSA in der Lösung anhand der Extinktion zu 15 mg/ml bestimmt.
Ein an der Lösung des biotinylierten BSA durchgeführter TNBS- Assay zeigte die Gegenwart von drei freien Aminogruppen an. Der Unterschied zwischen den drei freien Aminogruppen an der biotinylierten BSA und den 15 am BSA-Oxybis(ethylamin) beträgt 12.
Dies ist die Anzahl von Biotinmolekülen in dem biotinylierten BSA.
Eine 0,8-µm-Nitrocellulosemembran oder Immobilon-Membran wurde in Platten von 20 cm mal 30 cm geschnitten. 100 ml biotinimmobilisierende Lösung, die 5 mg biotinyliertes BSA/ml Phosphatpuffer enthielt, wurde in eine Wanne gegeben.
Die Membran wird in die Proteinlösung eingetaucht. Die benetzte Membran wurde auf den Boden einer Glasschale gelegt, die Schale umgedreht und die Membran 45 Minuten inkubiert. 500 ml Phosphatpuffer wurden zu der Schale gegeben, und es wurde 15 Minuten inkubiert. Diese Lösung wurde dann dekantiert.
Eine Fixierlösung mit 0,1% Glutaraldehyd wurde hergestellt, indem man eine ausreichende Menge Phosphatpuffer zu 4 ml einer 25%igen Glutaraldehydlösung gab, so daß man 1 l erhielt. 500 ml dieser Glutaraldehyd-Fixierlösung wurden dann zu der Schale gegeben, die die Nitrocellulosemembran enthielt, und der Inhalt wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Lösung mit 0,1 M Ethanolamin (pH 9,5) wurde zu einer Schale gegeben, die die Immobolin-Membran enthielt, und der Inhalt wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Dekantieren der Fixierlösung oder des Ethanolamins wurden 500 ml Phosphatpuffer hinzugefügt, und der Inhalt wurde 15 Minuten inkubiert. Diese Lösung wurde erneut dekantiert, 500 ml destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, und der Inhalt wurde 15 Minuten inkubiert.
Die Inkubation mit Wasser wurde noch einmal wiederholt. Die Membran wurde dann zwischen zwei Platten Whatman-3MM-Löschpapier gebracht, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und nach dem Entfernen aus dem Löschpapier zwischen Glasfasersiebmaterial gegeben. Das Sieb, das die Membran hielt, wurde 15 Minuten bei 65ºC in einen Konvektionsofen gegeben.
Die Membran wurde aus dem Ofen genommen und zur Lagerung bei Raumtemperatur in einen Vakuumexsiccator gegeben.

Analyse der Abfangeffizienz einer mit Biotin beschichteten Membran

Die Eigenschaften der Bindung von Streptavidin an eine mit Biotin beschichtete Membran (BXL-BSA) und von biotinyliertem BSA an eine mit Streptavidin beschichtete Membran bei verschiedenen Fließgeschwindigkeiten ist in Figur 1 gezeigt. Eine Nitrocellulosemembran wurde entweder mit Streptavidin oder BXL-BSA beschichtet, so daß die Bindung ungefähr äquivalenter Mengen des entsprechenden Bindungspartners ermöglicht wurde. Dreihundert µl radioaktiv markiertes Streptavidin oder BXL-BSA wurden bei verschiedenen Fließgeschwindigkeiten durch die geeignete Membran filtriert. Die auf jeder Membran aufgefangene Radioaktivität bei der kleinsten Fließgeschwindigkeit wurde einem Abfang von 100% zugeordnet. Der Prozentsatz der abgefangenen Zählungen ist als Prozent des maximalen Abfangs gegen den log der Fließgeschwindigkeit aufgetragen.
Es ist möglich, daß die getestete "maximale" Fließgeschwindigkeit noch zu schnell war, als daß die Streptavidinmembran 100% des BXL-BSA hätte abfangen können, da die Abfangkurve nicht begann, sich abzuflachen. Die biotinbeschichtete Membran konnte jedoch bei einer Fließgeschwindigkeit von 75 µl/Minute 95% des Streptavidins abfangen, während bei der Streptavidinmembran eine Fließgeschwindigkeit von 17 µl/Minute erforderlich war, um denselben Prozentsatz an BXL-BSA abzufangen.
Die Wirkung der Biotindichte (bestimmt anhand des als Haptenzahl bezeichneten Biotin/BSA-Verhältnisses) auf das Abfangen von Streptavidin ist in Figur 2 gezeigt. Zwei Membrantypen wurden bei verschiedenen Fließgeschwindigkeiten getestet: 0,45-µm-Nitrocellulose- und 0,65-µm-Immobilon- [IM] -Membran. Die letztere, die von Millipore Laboratories hergestellt wird, ist eine Membran auf Polyvinylidendifluoridbasis, die mit einem hydrophilen Polymer überzogen und so aktiviert ist, daß sie die kovalente Bindung von Protein erlaubt. Die Membranen wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet, das in unterschiedlichem Ausmaß mit Biotin markiert war. Die NC- und die IM-Membran enthielten ungefähr 10 µg/cm² bzw. 2 µg/cm² BSA. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Zeit, die es dauert, bis 300 µl ¹²&sup5;I-Streptavidin durch die Membran geflossen sind. Die Figur zeigt, daß der Abfang von Streptavidin auf der Membran um so besser ist, je höher die Biotindichte auf dem BSA ist. Dies ist bei der IM-Membran besser zu erkennen. Die größere Wirkung auf die IM-Membran ist auf die geringere Menge an Protein auf der Membran zurückzuführen. Dies kann aus der nächsten Figur (Fig. 3) geschlossen werden.
Die Wirkung der Proteinbeladung auf die Fähigkeit einer mit Biotin-BSA beschichteten Nitrocellulosemembran zum Abfangen von Streptavidin ist in Figur 3 gezeigt. Biotin-BSA mit einer Haptenzahl von 10,3 wurde in unterschiedlichen Konzentrationen auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert. Die X-Achse gibt die beim Beschichten der Membran eingesetzte Konzentration an Biotin-BSA an. Die Menge an Biotin-BSA auf der Membran beträgt ungefähr 2,5, 5, 10, 30, 50 µg/cm². Dreihundert µl ¹²&sup5;I-Streptavidin wurden in 1,5 Minuten bzw. 5 Minuten durch die Membran filtriert. Die Y-Achse stellt die von der Membran abgefangenen Zählungen als Prozent der maximalen Zählung dar. Wie man in der Figur erkennt, spielt auch die Menge von Biotin-BSA auf der Membran eine Rolle für die Abfangeffizienz von Streptavidin auf der Membran.
Die obigen Figuren zeigen mehrere Schlüsselaspekte der Erfindung: (1) Bei gleicher Bindungskapazität und bei einer gegebenen Fließgeschwindigkeit fängt die biotinbeschichtete Membran effizienter Streptavidin ab, als die mit Streptavidin beschichtete Membran biotinmarkiertes Protein abfängt. (2) Die Abfangeffizienz der Biotinmembran wird durch die Biotindichte auf der Membran bestimmt. Die Biotindichte wird sowohl von der Haptenzahl auf dem BSA als auch von der Menge von Biotin-BSA auf der Membran bestimmt.

Verwendung einer Biotinmembran in einem Assay für TSH

Ein Waschpuffer (pH 7,0) wurde so hergestellt, daß er 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0,1% Rinder-γ-Globulin und 0,05% eines Tensids, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat enthielt.
Eine Nitrocellulosemembran wurde wie oben beschrieben mit biotinyliertem BSA (BXL-BSA) beschichtet. Ein Quadratzentimeter der biotinylierten Membran wurde mit Transferband über ein Loch mit 6 mm Durchmesser in einem Vinylacetatstab (1 cm x 10 cm) mon tiert.
Der Stab, der die Membran enthielt, wurde in eine Filtereinheit gegeben, bei deren Oberteil es sich um eine trichterförmige Patrone mit einer Öffnung mit 4 mm Durchmesser handelte, die Flüssigkeit dazu zwingt, durch die Membran zu fließen.
Ein Konjugat-Probe-Verdünnungspuffer (pH 7,4) wurde so hergestellt, daß er 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 10 mM Na&sub2;SO&sub3;, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,01% NaN&sub3;, 0,1% Rinder-γ-Globulin, 0,05% eines Tensids, wie Polyoxyethylenmonooleat, 0,25% Octoxynol und 1 mM EDTA enthielt. 2 µg/ml Streptavidin-Anti-thyroidstimulierendes Hormon und 2 µg/ml Urease-Anti-thyroidstimulierendes Hormon wurden unmittelbar vor der Durchführung des Assays zu der Pufferlösung gegeben.
750 µl Konjugat-Probe-Verdünnungspuffer wurden zu 250 µl Serum gegeben, und das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC in einem abgedeckten Kunststoffröhrchen inkubiert.
450 µl dieses Probe-Konjugat-Gemischs wurden unter Vakuum über eine Spritzenpumpe in drei Minuten durch die montierte biotinylierte Membran filtriert.
Die Membran wurde gewaschen, indem man 500 µl des Waschpuffers (pH 7,0) in ungefähr 1 Minute hindurchfiltrierte.
Der Stab wurde dann aus der Filtereinheit entnommen und in eine Sensorbaugruppe mit einem Siliciumwafer eingesetzt. Siehe die Vorrichtung von US-Patent 4,591,550. Der Filtrationsbereich des Stabes war mit dem lichtabgefragten Teil des Siliciumwafers deckungsgleich. Nur eine Stelle der Lesevorrichtung wurde verwendet, und die Taucherposition wurde auf 70 µm von der Oberfläche des Siliciumwafers eingestellt. Die Reaktion wurde 150 Sekunden lang auf niedrige Signale (250 µV/s) und 50 Sekunden lang auf höhere Signale hin überwacht. Figur 4 zeigt die typischen Ergebnisse für die TSH-Bestimmung.

Beispiel 2

Die Wirkung eines Biotin-Bindungsarms auf die Gewinnung von zugesetztem TSH aus gesammelten Seren

Die obige Tabelle zeigt eine Verbesserung der Gewinnung von TSH aus Serum an, wenn die langkettige Form von Biotin-BSA (BXL-BSA) verwendet wird, im Vergleich zur Verwendung von kurzkettiger Biotin-BSA (Biotin-BSA). Die obigen Ergebnisse wurden mit der oben beschriebenen Standard-Assayvorschrift erhalten. Entweder 1 ml gesammelte Seren (Seren) oder Konjugat-Probe-Verdünnungspuffer (Puffer) wurde mit 1 ng TSH versetzt. Die Proben wurden für jeden Membrantyp auf die Raten der Pufferproben (% Ausbeute) normalisiert. Außer der größeren Ausbeute an Serum zeigt das höhere Signal beim Puffer eine größere Gesamtabfangeffizienz des Konjugatkomplexes mit BXL-BSA als mit kurzkettigem Biotin an.

Beispiel 3

DNA-Assay; Dosis-Wirkungs-Beziehung

Membran: mit Biotin-BSA beschichtete Nitrocellulosemembran (0,8 µm Porengröße).
DNA-Probe: 0, 5, 10, 25, 50 pg einzelsträngige Kälberthymus-DNA in 200 µl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
Reagenz: 1 µg/ml Streptavidin, 1 ng/ml SSB-Urease, 10 ng/ml Biotin-Anti-DNA, 1% BSA in 10 mM Tris HCL-Puffer, 1 mM EDTA (pH 7,4).
Assayvorschrift: 200 µl DNA-Probe wurden bei 37ºC 30 Minuten mit 500 µl Reagenz inkubiert. Das Gemisch wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 µl/min durch die mit Biotin-BSA beschichtete Membran filtriert. Die Membran wurde dann mit einer maximalen Fließgeschwindigkeit von etwa 6 ml/min mit 1 cm³ Waschpuffer mit einem pH-Wert von 5 (1 mM Natriumacetat, 0,1 M NaCl, 0,05% Polyoxyethylenmonooleat) gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Membran in pH-Sensor-Kammern (US-Patent 4,591,550) übertragen, die das Substrat (pH 5 Waschlösung plus 100 mM Harnstoff) enthielten, und die pH-Reaktion wurde abgelesen. Ergebnisse DNA (pg/Probe) Signalrate (µV/s)

Beispiel 4

Nachweis von DNA in Proben von Insulin und Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GMCSF)

Membran: mit Biotin-BSA beschichtete Nitrocellulosemembran (0,8 µm Porengröße).
Vorbehandlung von Schweine-Insulin: 10 mg/ml Insulin (in 10 mM Tris-Puffer, 1 mM EDTA, pH 8,5) wurde über Nacht bei 55ºC mit 100 µg/ml Proteinase K abgebaut. 0, 5 und 50 pg Kälberthymus-DNA wurden 1 mg abgebautem Insulin zugesetzt. In einer anderen Gruppe von Experimenten wurden 0, 5 und 50 pg Kälberthymus-DNA PBS- Lösung zugesetzt, die 0,4 mg GMCSF enthielt (Gesamtvolumen 200 µl). Alle Proben wurden 5 Minuten auf 100ºC erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren und DNA zu Einzelsträngen zu denaturieren. Insulinproben wurden auf Eis gekühlt, und GMCSF-Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt.
200 µl Probe wurden mit 500 µl Reagenz (200 ng/ml Streptavidin, 2,5 ng/ml Biotin-SSB, 9 ng/ml Urease-Anti-DNA; in 1% BSA, 0,25% Octoxynol, 10 mM Tris HCl-Puffer, 1 mM EDTA, pH 7,5) gemischt.
Die Proben wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und durch die Membran filtriert. 1 cm³ Waschlösung (5 mM Natriumphosphat, pH 7, 0,1 M NaCl, 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat) wurde zweimal durch die Membran filtriert. Das Signal wurde mit einem pH-Sensor des im US-Patent 4,591,550 beschriebenen Typs abgelesen. Ergebnisse Probe Rate Insulin Insulin + 5 pg DNA Insulin + 50 pg DNA GMCSF GMCSF + 5 pg DNA GMCSF + 50 pg DNA

Beispiel 5

Zweisondenassay

Zweisonden-Assaygemische wurden so hergestellt, daß sie Verdünnungen in einer 1:2-Verdünnungsreihe von HinfI-abgebautem pGEM3 mit einem Anfangswert von 25 ng (7,8 x 10&sup9; Zielmoleküle) pro Assaygemisch, 2 ng 5'-biotinyliertes 20mer (CCAGTTACCTTCGGAAAAAG) und 0,5 ng 5'-fluoresceiniertes 20mer (TAGCTCTTGATCCGGCAAAC) in 100 µl 3X PBSE (eine Lösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 30 mM Natriumphosphat, 450 mM NaCl und 3 mM EDTA enthielt) mit 0,25% eines Tensids, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat, enthielten. Diese Sequenz von jedem 20mer findet man auch auf demselben HinfI-Fragment von pGEM3. Die Proben-DNA wurde dann denaturiert, indem man das Gemisch 5 Minuten auf 100ºC erhitzte.
Das Gemisch wurde anschließend 30 Minuten bei 50 bis 55ºC inkubiert. Zu dem Gemisch wurde dann 1 ml einer Lösung gegeben, die so hergestellt worden war, daß sie 1 µg/ml Streptavidin, 8 µg/ml Anti-Fluorescein-Urease-Konjugat in 3X PBSE, 0,25% Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 1 mg/ml BSA und 80 µM N-Acetylcystein enthielt. Diese resultierende Konjugatlösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die inkubierte Konjugatlösung wurde dann durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Dann wurde 1 ml Schwellenwaschlösung (10 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat und 0,05% NaN&sub3;, pH 6,5) nach der Konjugatlösung durch die Membran filtriert, und die Membran wurde in 50 ml Schwellenwaschlösung eingetaucht. Der Stab wurde dann in eine pH-Sensor-Kammer des im US-Patent Nr. 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Substratlösung (100 mM Harnstoff in Schwellenwaschlösung) enthielt. Dann wurde die pH-Reaktion abgelesen, was zu den in Fig. 5 gezeigten Ergebnissen führte.

Beispiel 6

Anwendung des Zweisondenassays auf die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. Amplifikation eines 0,1-kbp-Bereichs in pGEM3 mit PCR

Ein Gemisch für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde so hergestellt, daß es 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl&sub2;, jeweils 1 mM dNTP, 1 µM Primer 1 (CAAAAAACCACCGGTACCAG), 1 µM Primer 2 (AGTATTTGGTATCTGCGCTCTG), 10 pg pGEM3 (3,15 x 10&sup6; Zielmoleküle), das zuvor mit HinfI abgebaut worden war, enthielt. Der zu amplifizierende Bereich enthält jede der in Beispiel 5 beschriebenen 20mer-Sequenzen. Dieses PCR-Gemisch wurde 5 Minuten bei 100ºC inkubiert.
Unmittelbar nach der Inkubation wurden 2 µl Tag-Polymerase (Perkin Elmer, 5 E/µl) zu dem PCR-Gemisch gegeben, das gründlich gemischt und dann bei 94ºC inkubiert wurde.
Unter Verwendung eines Eppendorf-Thermocyclers wurde die Inkubationstemperatur cyclisch zwischen 94ºC und 55ºC gewechselt. Der Thermocycler wurde so eingestellt, daß jeder Cyclus etwa 3 Minuten dauerte. PCR-Proben wurden in den Cyclen 13, 15 und 17 aus dem Gemisch in dem Cycler entnommen, als die Temperatur 56ºC erreicht hatte. Diese Proben wurden zur späteren Verwendung im Zweisondenassay bei -20ºC aufbewahrt. Blindproben, die keine pGEM3-DNA enthielten, wurden in ähnlicher Weise zur Verwendung als negative Kontrolle hergestellt.

2. Zweisondenassay unter Verwendung einer PCR-Probe

10 µl der oben hergestellten PCR-Probe wurden mit 90 µl des in Beispiel 5 hergestellten Zweisonden-Assaygemischs kombiniert, und das gesamte Gemisch (100 µl) wurde 5 Minuten bei 100ºC denaturiert.
Das Gemisch wurde anschließend 30 Minuten bei 50 bis 55ºC inkubiert. Zu dem Gemisch gab man dann 1 ml einer Lösung, die so hergestellt wurde, daß sie 1 µg/ml Streptavidin, 8 µg/ml Anti- Fluorescein-Urease-Konjugat in 3X PBSE, 0,25% Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 1 mg/ml BSA und 80 µM N-Acetylcystein enthielt. Diese resultierende Konjugatlösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die inkubierte Konjugatlösung wurde dann durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Dann wurde 1 ml Schwellenwaschlösung (10 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat und 0,05% NaN&sub3;, pH 6,5) nachdem der Konjugatlösung durch die Membran filtriert. Die auf dem Stab montierte Membran wurde in 50 ml Schwellenwaschlösung getaucht und dann in eine pH-Sensor-Kammer des im US-Patent Nr. 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Substratlösung (100 mM Harnstoff in Schwellenwaschlösung) enthielt. Dann wurde die pH-Reaktion abgelesen, was zu den in Fig. 6 und 7 gezeigten Ergebnissen führte.
Das spezifische Signal (der Unterschied zwischen den Signalen von den Proben mit und ohne Ziel-DNA) nimmt zwischen Cyclus 13 und Cyclus 17 stärker als linear zu (Fig. 6). Figur 3 zeigt die Stärke des spezifischen Signals in den Cyclen 13, 15 und 17 auf einer halblogarithmischen Auftragung. Dieser Graph läßt vermuten, daß die Stärke des spezifischen Signals und damit die Menge des PCR-Produkts, wie sie durch Vergleich mit der Stärke des von bekannten Mengen Plasmid-DNA erzeugten spezifischen Signals (z.B. Fig. 5) bestimmt wurde, zwischen Cyclus 13 und Cyclus 17 exponentiell zunimmt. Die Zunahme des spezifischen Signals pro Cyclus entspricht einer Geraden, aus der sich ein PCR-Amplifikationsfaktor von 1,54 pro Cyclus ergibt. Da der theoretische PCR-Faktor 2,00 betragt, ist der effektive Wirkungsgrad 77%.
Die Art der in diesem Experiment vorgenommenen Messungen hat wenigstens zwei mögliche Verwendungen. Erstens ist die Bestimmung des Amplifikationsfaktors nützlich bei der experimentellen Optimierung der PCR-Bedingungen. In dem oben beschriebenen Experiment ist zum Beispiel offensichtlich noch Raum für eine weitere Optimierung. Zweitens kann die in Fig. 7 gezeigte exponentielle Auftragung verwendet werden, um die Menge des Ausgangsanalyten durch Extrapolation zu ermitteln. Zum Beispiel könnte die Menge an Nudeinsäure von einem Pathogen, wie HIV, bestimmt werden.Dies wäre bei der Bewertung der Reaktion auf eine therapeutische Behandlung nützlich.

Beispiel 7

A. Simultane und sequentielle Bestimmung von Maus-IgG

1. Simultanes Bestimmungsverfahren

Ein Gemisch wurde so hergestellt, daß es MuIgG (Maus-IgG), biotinyliertes Anti-MuIgG, fluoresceiniertes Anti-MuIgG, Streptavidin und Anti-Fluorescein-Urease enthielt. Dieses resultierende Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
Assaypuffer wurde zu dem inkubierten Gemisch gegeben, das dann im Verlaufe von 15 Minuten durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Die Membran wurde im Verlaufe von 5 Minuten mit Phosphatwaschpuffer (pH 7,0) gewaschen. Der Stab wurde dann in eine pH-Sensor-Kammer des im US-Patent Nr. 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Substratlösung (Harnstoff in Schwellenwaschlösung) enthielt. Dann wurde die pH-Reaktion abgelesen, was zu den in der folgenden Tabelle und in Figur 8 gezeigten Ergebnissen führte.

2. Sequentielles Bestimmungsverfahren

Ein Gemisch von MuIgG, biotinyliertem Anti-MuIgG und fluoresceiniertem Anti-MuIgG wurde hergestellt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Zu diesem inkubierten Gemisch wurde dann Streptavidin hinzugefügt. Das resultierende Gemisch, das Streptavidin enthielt, wurde im Verlaufe von 10 Minuten durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Die Membran wurde dann im Verlaufe von 5 Minuten mit Phosphatwaschpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Dann wurde eine Lösung von Anti-Fluorescein-Urease im Verlaufe von 5 Minuten durch die Membran filtriert, die anschließend im Verlaufe von 5 Minuten mit Phosphatwaschpuffer (pH 7,0) gewaschen wurde. Der Stab wurde dann in eine pH-Sensor-Kammer des im US- Patent 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Substratlösung (Harnstoff in Schwellenwaschlösung) enthielt. Dann wurde die pH-Reaktion abgelesen, was zu den in der folgenden Tabelle und in Figur 8 gezeigten Ergebnissen führte. Bestimmung von Maus-IgG nach dem simultanen und nach dem sequentiellen Verfahren Sequentiell Standardabw. Simultan Standardabw.

Beispiel 8

Simultane und sequentielle Bestimmung von Anti-Human-Chorion-Gonadotrodin

Human-Chorion-Gonadotropin (HCG) wurde mit Biotin markiert, was biotinyliertes HCG ergab. Eine andere Probe von HCG wurde mit Fluorescein markiert, was fluoresceiniertes HCG ergab.

1. Sequentielle Bestimmung von Anti-HCG

400-µl-Proben wurden so hergestellt, daß sie 0, 4, 20 bzw. 100 ng Anti-HCG enthielten. Jede Probe wurde mit 100 µl Lösung kombiniert, die 10 ng biotinyliertes HCG und 10 ng fluoresceiniertes HCG enthielt, und die resultierenden 500-µl-Gemische wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Zu jedem inkubierten Gemisch wurden dann 500 µl einer Streptavidinlösung (4 ng/ml) gegeben, und nach dem Mischen wurde durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Jede Membran wurde dann mit 2 ml Phosphatwaschpuffer (pH 7,0) gewaschen. 500 µl einer Lösung von Urease-Anti-Fluorescein (4 µg/ml) wurden durch die Membran filtriert, die wiederum mit 2 ml des Phosphatwaschpuffers gewaschen wurde.
Die Stäbe wurden dann in eine pH-Sensor-Kammer des im US-Patent 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Substratlösung für Urease enthielt. Die pH-Reaktion wurde abgelesen, was zu den in der Tabelle unten gezeigten Ergebnissen führte.

2. Simultane Bestimmung von Anti-HCG

100-µl-Proben wurden so hergestellt, daß sie 0, 4, 20 bzw. 100 µl Anti-HCG enthielten. Jede Probe wurde mit 100 µl der in Teil 1 dieses Beispiels verwendeten Lösung von biotinyliertem HCG und fluoresceiniertem HCG und mit 100 µl der Urease-Anti-Fluorescein- Lösung (4 µg/ml) gemischt. Das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jeder Probe wurde 1 ml Assaypuffer gegeben, und das resultierende Gemisch wurde durch eine auf einem Kunststoffstab montierte biotinbeschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Die Membran wurde mit 2 ml Waschpuffer gewaschen und wie oben beschrieben in einem pH-Sensor abgelesen. Die Ergebnisse sind unten gezeigt.
Dieser sequentielle Antikörperassay kann verwendet werden, um eine Immunantikörperreaktion auf einen Impfstoff zu messen. Der spezifische Antikörper kann bei Konzentrationen von nur 1% nachgewiesen werden. Sequentielle und simultane Bestimmung von Anti-HCG Rate Anti-HCG sequentiell simultan

Beispiel 9

DNA-Dosis-Wirkungs-Assay - abwechselnde Konfiguration

DNA-Proben wurden so hergestellt, daß sie 0, 5, 10, 25, 50, 100, 150 bzw. 200 pg einzelsträngige DNA in 500 µl phosphatgepufferter Salzlösung enthielten. Ein Dosis-Wirkungs-Reagenz wurde so hergestellt, daß es 5 pg/ml Streptavidin, 2,25 ng/ml biotinyliertes einzelstrangbindendes Protein und 93,8 ng/ml Anti-DNA-Urease in Tris-EDTA-Zubereitungspuffer enthielt. Die 500-µl-DNA-Proben wurden 10 Minuten bei 95ºC hitzedenaturiert und anschließend abgekühlt und mit 1,0 ml Dosis-Wirkungs-Reagenz kombiniert. Diese Gemische wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, und jedes wurde durch eine auf einem Kunststoffstab montierte, mit Biotin-BSA beschichtete Nitrocellulosemembran filtriert. Jede Membran wurde mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen, und der Stab wurde in eine pH-Sensor-Kammer des im US-Patent 4,591,550 beschriebenen Typs eingesetzt, die Urease-Substrat enthielt. Die pH-Reaktion wurde abgelesen, was zu den in der Tabelle unten gezeigten Ergebnissen führte. Ergebnisse Rate (µV/s, Mittelwert aus 8 Tests) Standardabweichung Variationskoeffizient (%)

Claims

1. Abfangmembran, umfassend eine poröse Filtermembran mit einem Hapten, das über ein an der Membran befestigtes und kovalent an das Hapten gebundenes Makromolekül indirekt an die Membran gebunden ist.

2. Abfangmembran gemäß Anspruch 1, wobei das Hapten über eine ausgedehnte Verknüpfungsgruppe kovalent an das Makromolekül gebunden ist.

3. Abfangmembran gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Makromolekül ein Protein ist.

4. Abfangmembran gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hapten Biotin ist und das Antihapten Avidin oder Streptavidin ist.

5. Abfangmembran gemäß Anspruch 3, wobei das Protein Rinderserumalbumin, Rinder-γ-Albumin oder Fibrinogen ist.

6. Abfangmembran gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei an jedes Rinderserumalbumin-Molekül etwa 5 bis 20 Biotinmoleküle gebunden sind.

7. Assay, bei dem ein spezifisch bindender Komplex durch eine Membran, die den spezifisch bindenden Komplex bindet, aus einer Lösung entfernt wird, woraufhin der Komplex an der Membran anhand einer nachweisbaren Markierung, die an den Komplex gebunden ist, nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay die Verwendung der porösen Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zum Abfangen des spezifisch bindenden Komplexes durch Reaktion mit einem an ein Glied des spezifisch bindenden Komplexes gebundenen Antihapten umfaßt.

8. Assay gemäß Anspruch 7, der die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen bindenden Gliedern und der zu bestimmenden Substanz in Lösung, wobei eines der bindenden Glieder ein gebundenes Antihapten aufweist und ein anderes bindendes Glied eine nachweisbare Markierung aufweist;

(b) Filtrieren der Lösung, die den spezifisch bindenden Komplex enthält, durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der spezifisch bindende Komplex durch Binden zwischen dem Hapten und dem Antihapten auf der Membran abgefangen wird; und

(c) Nachweisen der an die Membran gebundenen Markierung.

9. Assay, der die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen der nachzuweisenden Substanz und bindenden Gliedern und einem Antihapten in Lösung, wobei eines der bindenden Glieder eine nachweisbare Markierung aufweist und eines der bindenden Glieder ein gebundenes Hapten aufweist;

(b) Filtrieren der Lösung, die den spezifisch bindenden Komplex enthält, durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wodurch das Hapten den spezifisch bindenden Komplex an die Membran bindet; und

(c) Nachweisen der Markierung an der Membran.

10. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist und das bindende Glied, an das das Antihapten gebunden ist, ein Antikörper ist und das markierte bindende Glied ein Antikörper ist.

11. Assay gemäß Anspruch 9 für einen Antikörper, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen dem nachzuweisenden Antikörper, einem nachweisbar markierten Antigen für den Antikörper, einem mit einem Hapten versehenen Antigen für den Antikörper und einem Antihapten in Lösung;

(b) Filtrieren der Lösung, die den spezifisch bindenden Komplex enthält, durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6; und

(c) Nachweisen der an die Membran gebundenen Markierung.

12. Assay gemäß Anspruch 9 für Gesamt-DNA, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Denaturieren der nachzuweisenden DNA zu einzelsträngiger DNA;

(b) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen der nachzuweisenden einzelsträngigen DNA, markiertem Anti-DNA oder markiertem SSB, das spezifisch an die nachzuweisende einzelsträngige DNA bindet, mit einem Hapten versehenem Anti-DNA oder SSB, das spezifisch an die nachzuweisende einzelsträngige DNA bindet, und einem Antihapten in Lösung;

(c) Filtrieren der Lösung durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6; und

(d) Nachweisen des an die Membran gebundenen markierten Anti-DNA oder markierten SSB.

13. Assay gemäß Anspruch 9 für seltene RNA oder seltene DNA, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Denaturieren der nachzuweisenden seltenen RNA oder DNA zu einzelsträngiger RNA oder DNA;

(b) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen der nachzuweisenden einzelsträngigen RNA oder DNA, einer markierten Oligonucleotid-Sonde, die sequenzspezifisch an die nachzuweisende einzeisträngige RNA oder DNA bindet, mit einem Hapten versehener Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch an die nachzuweisende RNA oder DNA bindet, und einem Antihapten in Lösung;

(d) Nachweisen der an die Membran gebundenen markierten Oligonucleotid-Sonde.

14. Assay, der die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen bindenden Gliedern und der zu bestimmenden Substanz in Lösung, wobei eines der bindenden Glieder ein gebundenes Hapten aufweist und ein anderes bindendes Glied eine nachweisbare Markierung aufweist;

(b) Filtrieren einer Lösung, die ein Antihapten enthält, durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Antihapten durch Binden zwischen dem Hapten und dem Antihapten auf der Membran abgefangen wird;

(c) Filtrieren der Lösung, die den spezifisch bindenden Komplex enthält, durch die Filtermembran mit daran gebundenem Antihapten, wobei der spezifisch bindende Komplex durch Binden zwischen dem Hapten in dem spezifisch bindenden Komplex und dem Antihapten auf der Membran abgefangen wird;

(d) Nachweisen der an die Membran gebundenen Markierung&sub5;

15. Sequentieller Assay, der die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Filtrieren einer Lösung, die ein Antihapten enthält, durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Antihapten durch Binden zwischen dem Hapten und dem Antihapten auf der Membran abgefangen wird;

(b) Filtrieren einer Lösung, die eine antihaptenbindende Substanz enthält, welche mit bindenden Bereichen für eine zu bestimmende Substanz versehen ist, durch die Filtermembran, wodurch die antihaptenbindende Substanz auf der Membran abgefangen wird;

(c) Filtrieren einer Lösung, die eine zu bestimmende Substanz enthält oder von der man dies annimmt, durch die Membran, wodurch die zu bestimmende Substanz auf der Membran abgefangen wird;

(d) Markieren der zu bestimmenden Substanz mit einer nachweisbaren Markierung; und

(e) Nachweisen der Markierung.

16. Assay gemäß Anspruch 13, bei dem es sich um einen quantitativen Polymerase-Kettenreaktion-Assay handelt, dadurch gekennzeichnet, daß er die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Entnehmen einer Mehrzahl von Proben amplifizierter DNA aus einer Polymerase-Kettenreaktion zu verschiedenen Zeiten;

(b) Denaturieren der amplifizierten DNA;

(c) Bilden eines spezifisch bindenden Komplexes zwischen der nachzuweisenden amplifizierten DNA in jeder Probe, einer markierten Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch an die nachzuweisende amplifizierte DNA bindet, mit einem Hapten versehener Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch an die nachzuweisende amplifizierte DNA bindet, und einem Antihapten in Lösung;

(d) Filtrieren der Lösung durch die poröse Filtermembran nach einem der Ansprüche 1 bis 6;

(e) Nachweisen der an die Membran gebundenen markierten Oligonucleotid-Sonde von jeder Probe;

(f) Bestimmen der Menge der durch die Polymerase-Kettenreaktion gebildeten DNA in jeder Probe;

(g) Extrapolieren der Menge der vor der Amplifikation vorhandenen DNA aus den Mengen der DNA in den jeweiligen Proben.

17. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16, wobei das Hapten über eine ausgedehnte Verknüpfungsgruppe kovalent an das Makromolekül gebunden ist.

18. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 17, wobei das Makromolekül ein Protein ist.

19. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 18, wobei das Hapten Biotin ist und das Antihapten Avidin oder Streptavidin ist.

20. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10 und 12 bis 19, wobei die bindenden Glieder Antikörper sind, die an die zu bestimmende Substanz binden.

21. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 20, wobei es sich bei der porösen Membran um Nitrocellulose, Celluloseacetat oder Polyvinylidendifluorid-Polymer, das mit einem hydrophilen Polymer beschichtet ist, handelt.

22. Assay gemäß einem der Ansprüche 7 bis 21, wobei die Markierung ein Enzym ist.

23. Assay gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei dem Enzym um Urease, Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase handelt.

24. Assay gemäß einem der Ansprüche 22 oder 23, wobei das Enzym durch eine Elektrode nachgewiesen wird.

25. Assay gemäß Anspruch 24, wobei es sich bei der Elektrode um einen Halbleiter handelt.

26. Assay gemäß Anspruch 9 oder 11, wobei das Hapten über eine ausgedehnte Verknüpfungsgruppe an das bindende Glied gebunden ist.