DE2751588B2

DE2751588B2 - Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium

Info

Publication number: DE2751588B2
Application number: DE2751588A
Authority: DE
Inventors: Judith Feingers; Anthony Joseph Pick; Daniel Wagner
Original assignee: Ames Yissum Ltd
Current assignee: Biodex Biotechnological and Diagnostic Systems Ltd
Priority date: 1977-01-28
Filing date: 1977-11-18
Publication date: 1980-04-17
Also published as: IL51354A0; FR2379072A1; IL51354A; DE2751588A1; FR2379072B1; BR7800524A; AU3074277A; US4205058A; DE2751588C3; JPS5395697A; SE7714931L; GB1564578A; AU510391B2; IT1203081B; CA1091821A

Description

Ein lebendes System ist imstande, das Vorhandensein von fremden Substanzen (Antigenen), wie Proteinen, Viren, Bakterien usw, innerhalb des Systems nachzuweisen, zu erkennen und darauf zu reagieren. Diese

ι > Reaktion besteht u. a. in der Bildung eines Antikörpers, der zu dem speziellen Antigen spezifisch ist. Daraufhin tritt eine spezifische Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen unter Bildung eines Komplexes ein. Ein einmal gebildeter Antikörper ist auch imstande, ein Hapten, d. h. eine verhältnismäßig kleine und einfache Verbindung zu binden, die die determinierende Gruppe eines bestimmten Antigens sein kann, wobei das Hapten imstande ist, sich mit dem spezifischen Antikörper zu verbinden, aber nicht imstande ist, selbst zur Bildung

r> eines Antikörpers zu führen, solange es nicht an einen antigenen Träger gebunden ist.

Die Bindung zwischen einem Antigen oder einem Hapten und dessen Antikörper ist spezifisch und empfindlich. Andct e Arten von Substanzen, die ähnliche

κι spezifische und empfindliche Bindungsreaktionen eingehen, sind Enzyme und ihre Substrate, Substanzen, wie Hormone, Vitamine, Metaboüten und pharmakologisehe Mittel und deren Rezeptoren und bindende Substanzen sowie andere bekannte Substanzen. Diese

r, spezifischen und empfindlichen Bindungsreaktionen führten zu einer raschen Entwicklung von analytischen Verfahren, die als spezifische Bir.dungsverfahren bekannt sind. Bei einem derartigen BeMirnmungsverfahren tritt die zu bestimmende Substanz oder Gruppe von

in Substanzen (im folgenden als »Ligand« bezeichnet) in einer flüssigen Probe in Konkurrenz mit einer markierten Form des Liganden oder eines Bindungsanalogen davon um die Bindung mit einem bindenden Reagens. Wenn eine radioaktiv markierte Substanz

ii angewandt wird und das bindende Reagens ein Antikörper ist, ist das Verfahren als radioimmunologische Bestimmung (Radioimmunoassay) bekannt. In letzter Zeit wurde über verschiedene alternative Markierungssubstanzen zum Ersatz von Radioisotopen

Vi berichtet, wie Enzyme, Coenzyme, Enzymsubstrate, Eiizymmodulatoren, wie Hemmstoffe und allosterische Effektoren, Fluoreszcnzmoleküle, Lumineszenzmoleküie u. a. Zur Illustration wird im folgenden eine spezielle Art einer spezifischen Bindungsbestimmung, nämlich

Vi eine radioimmunologische Konkurrenzbindung, beschrieben.

Dieses System bestehe aus einem Antigen oder Hapten, das mit einer radioaktiven Substanz markiert ist, nichl markiertem nalivem Antigen (in der zu

wi untersuchenden Probe) und spezifischem Antikörper, wobei eine Konkurrenz zwischen dem nicht markierten Antigen und dem markicricn Antigen um die Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper eintritt. Daher ist, je größer die Konzentration an nicht markiertem

h . Antigen in der zu untersuchenden Probe des Systems ist, die an den Körper gebundene Menge an markiertem Antigen um so geringer. Das kann schematisch folgendermaßen dargestellt werden:

markiertes Antigen + spezifischer Antikörper + nicht markiertes Antigen

*Ag

Ag

markierter und nicht markierter Antigen-Antikörper-Komplex (*Ag—Ak) + (Ag -Ak)

Wenn die Konzentration an markiertem Antigen und Antikörper festliegt und die einzige Variable die Menge an unmarkiertem Antigen ist, wird es möglich, ein Bestimmungssystem aufzustellen zur Messung des unbekannten Gehalts an nicht markiertem Antigen durch physikalische Trennung des Antigen-Aivikörper-Komplexes von dem restlichen freien Antigen (sowohl markiert als auch nicht markiert). Die Radioaktivität des unbekannten Produktes wird verglichen mit einer Standardkurve, bei der die Werte für einen gegebenen Bereich bekannter Mengen eines auf die gleiche Weise behandelten Antigens aufgetragen sind.

Es sind viele Verfahren zur Trennung des freien ungebundenen Antigens oder Haptens von dem Komplex aus Antigen und Antikörper bekannt. Ein als Chromatoelektrophorese bekanntes Verfahren kombiniert das Verfahren der Papierchromatographie mit dem der Papierelektrophorese. Papier mit einer hohen Affinität zu dem freien Antigen (wie Whatman 3MM, Whatman 3MC und DEAE-Papier) werden als Träger verwendet. Während dieses Verfahren unterscheidungskräftig ist und zur Bestimmung von Insulin, Wachstumshormon, Glucagon, Parathyroidhormon, Thyroid-stimulierendem Hormon und anderen Peptidhormonen angewandt worden ist, besitzt es eine Anzahl hervorstechender Nachteile, die seine Anwendung begrenzen. Auf das Absorbens kann nur eine begrenzte Menge Material aufgebracht werden, und die Trennung ist sowohl mühsam als auch zeitraubend.

Bei einem anderen bekannten Verfahren, das angegeben ist zur Bestimmung der obenerwähnten Peptidhormone, wird die aufsteigende Papier-(Docht)-Chromatographie angewandt, z. B. mit Hilfe von Whatman 3MC und DF-Cellulosepapicr oder von Papier, das mit schwachen lonenaustauscherharzen versehen is· (Orskov, Scand J. Clin. Lab. Invest. Bd. 20. S. 297 [1967]). Dieses Verfahren besitzt ebenfalls den Nachteil, daß die Menge der Probe, die auf das untere Ende des Papierdjchles aufgebracht werden kann, verhältnismäßig klein ist. Es ist bei diesem Verfahren ferner notwendig, das Papier zu trocknen (manchmal sogar zweimal) und zu schneiden, bevor die Zählung durchgeführt v/ird, was nachteilig ist, wenn das Bestimmungsverfahren für eine große Anzahl von Proben mechanisch durchgeführt weiden soll. Es ist auch interessant, daß dieses Verfahren in mehr als einem Jahrzehnt nirgends in der Literatur als bedeutend erwähnt ist und daü es nirgends für radioimmunologischc Bestimmungen von verhältnismäßig niedermolekularen Haplenen angewandt worden ist.

Bei einem anderen bekannten Verfahren wird der Antigen-Antikörper-Komplex durch Salze, organische Substanzen oder Lösungsmittel unter Bedingungen ausgefällt, hei denen das f'^ie Antigen nicht angegriffen wird. Zu den Salzen, organischen Substanzen und Lösungsmitteln, die angewandt werden können, gehören u. a. Äthanol, Aceton, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Dioxan, Trichloressigsäure, Polyä'hylenglykol usw. Die Anwendung von Salzen. Löio/igsmitteln oder organischen Substanzen besitzt den Vorteil, daß die Trennung sofort stattfindet und eine zweite Inkubation nicht notwendig ist. Die chemische Ausfällung kann jedoch zu einer Mitausfällung von anderen Proteinen führen, uie häufig eine unvollständige Trennung der beiden Fraktionen verursachen.

Ferner ist das Doppelantikörperverfahren bekannt, das verbreitet zur Trennung von gebundenem und freiem Antigen angewandt wird. Bei diesem Verfahren wird ein zweiter Antikörper, der gegen den ersten Antikörper gebildet worden ist, angewandt, um den primären Antigen-Antikörper-Komplex auszufällen. Wenn z. B. der erste Antikörper im Kaninchen gebildet worden ist, kann der zweite Antikörper ein Antiserum gegen Kaninchen-y-Globulin sein, das von Ziegen gebildet worden ist. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Anwendung eines zweiten Antikörpers eine weitere Inkubation erforderlich macht.

Spezielle Bindungsbestimmungen, bei denen ein Dopnelantikörperverfahren zur Trennung angewandt wird', sind in den US-PS 38 39 153 und 38 72 225 beschrieben.

Ferner sind verschiedene Festphasen-VerTa'iren zur Trennung von freiem und gebunderem Antigen bekannt. Bei diesen Verfahren werden Antikörper angewandt, die gebunden oder physikalisch adsorbiert sind an eine unlösliche Matrix (Immunosorbens), wie Bentonit, Cellulose, Bromacetylcellulose, vernetzte Dextrane (Sephadex), Sepharose, Kunststoffperlen (aus nicht vernetztem Polystyrol oder Polypropylen), Enzacryl AA. Nitro-cellulose-Membranen usw. Der gebildete Antikörper-Antigen-Komplex wird von der festen Ph-se le&tgehalten und der gebundene Anteil kann von dem freien Anteil durch Filtration abgetrennt werden.

Bei einem weiteren Verfahren werden die freien (nicht gebundenen) Antigene an Adsorbentien gebunden, die durch Zentrifugation ausgefällt werden können. Pulverisiertes TalKum (Magnesiumsilicate Kaolin (Aluminiumsilicate QUSO (Mikrokörner von Siliciumdioxid), Ccllnlosepulver usw. sind einige einfache Adsorbentien, die ungewandt werden können. Viele Trennungen werden durchgeführt unter Anwendung von adsorbierender Aktivkohle, die mit Dextran überzogen ist. Das Dextran vcrHlt sich eher wie ein Sieb, das es den kleineren Molekülen des freien Antigens erlaubt, hindurchzugehen, die dann an die Aktivkohle gebunden werden, wobei das gebundene Antigen in Lösung bleibt, nachdem die Aktivkohle durch Zentrifugieren uder filtrieren entfernt worden is!.

27 5\ 588

Es ist ferner bekannt. Ionenaustauscher und andere Harze anzuwenden, um freie Antigene durch elektrostatische Kräfte zu binden, und dieses Verfahren wurde bisher hauptsächlich angewandt zur Bestimmung kleiner Moleküle, wie Thymidhormonen (7.3 _unc| j-4). Beispiele für derartige Verfahren sind in den IJS-PS 36 59 104,37 10 117 und 3*) 61 894 angegeben.

Bei einem derartigen Verfahren, wie es zur Trennung des Antigen-Antikörper-Kornplexes von freiem Antigen angewandt wird, wird eine Säule, die mit einem Material gefüllt ist. das vorzugsweise entweder das freie Antigen oder den Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert, angewandt. Das inkubierte wäßrige Reaktionsgemisch wird von oben auf eine solche Säule aufgebracht und die Säule dann eluiert. Die Radioaktivität entweder der Säule oder des Eluats wird dann bestimmt und der Gehalt an Antigen in der Ausgangslösung aus dieser /.ähiung berechnet.

In der Praxis hat es sich gezeigt, daß dieses Verfahren etwas mühsam ist und nicht geeignet zur schnellen Durchführung einer großen Zahl von radioimmunologischen Bestimmungen mit Hilfe mechanischer Vorrichtungen. Ein Grund hierfür besteht darin, daß es notwendig ist, die nicht adsorbierte Komponente vollständig aus der Säule auszuwaschen, was Zeit und eine verhältnismäßig große Menge Pufferlösung erfordert.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes spezifisches Bindungsverfahren zu entwikkeln, bei dem die Trennung der gebundenen Form der markierten Komponente von der freien Form auf neuartige Weise erreicht wird, die vorteilhafter ist als die bisher bekannten Trennungsverfahren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigem Medium, durch Zusammenbringen des flüssigen Mediums mit Bestimmungsreagentien, enthaltend 1. als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges dazu, der bzw. das mit einer radioaktiven Mark'erung versehen ist, und gegebenenfalls 2. ein Bindungsreagens für den Liganden; Bildung eines Reaktionsgemisches, das eine an das Bindungsreagens gebundene Form der markierten Komponente und eine freie Form derselben, die nicht an das Bindungsreagens gebunden ist. enthält; Trennung der gebundenen von der freien Form durch Zusammenbringen des Reaktionsgemisches mit einem Adsorptionsmittel, das für die gebundene oder die freie Form spezifisch ist, und Messen der Rad^:oaktivität einer der voneinander getrennten Formen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form der markierten Komponente durchführt, indem man mindestens einen Teil des Reaktionsgemisches in eine Säule aus dem Adsorptionsmitte! aufzieht, in der die beiden Formen entlang der Säule voneinander getrennt werden, und die Radioaktivität eines Teils der Säule mißt, in dem eine der beiden Formen enthalten ist.

Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 7. und die bevorzugten Anwendungen sind im Anspruch 8 aufgezählt.

Die Adsorbenssäule besitzt zweckmäßigerweise die Form eines Rohrs, das mit einer ausreichenden Menge eines kapillaren Absorbens gefüllt ist. um eine vollständige Aufnahme des gesamten Reaktionsgemisches nach Berührung des einen Endes des Rohrs mit dem Gemisch zu ermöglichen. Vorzugsweise wird die Adsorbenssaulc senkrcc ht gehalten, während der kapillaren Absorption, was zu einer Trennung durch aufsteigende Chromatographie führt. Um die Trennung der gebundenen von der freien Form über die Säule zu verbessern, kann ein Volumen einer inerten Flüssigkeit, wie eines Puffers nach Absorption des Reaktionsgemisches von der Säule absorbiert werden.

Das Prinzip der Trennung besteht darin, daß das Adsorbens selektiv für die gebundene oder freie Form ist, üblicherweise für die letztere, und damit nicht spezifische Bindungen eingeht, wodurch diese Form im wesentlichen gegen die Bewegung des Reaktionsgemisches durch die Adsorbenssäule immobilisiert wird. Die andere Form wird natürlich durch den Fluß des Reaktionsgemisches vom Anfangsteil der Säule, wo die immobilisierte Form ist. weggetragen, wodurch eine Trennung der gebundenen von der freien Forin stattfindet.

Der i-Toße Vorteil dieses Trennungsverfahrens besteht darin, daß die erforderliche Trennungsstufe reduziert wird auf die einfache Aufgabe, das Reaktionsgemisch mit dem Säulenadsorbens eine ausreichende Zeit lang zusammenzubringen, um die notwendige Absorption der Flüssigkeit in das Adsorbens zu ermöglichen. Die entstehende Säule, in der die getrennte, gebundene und freie Form enthalten ist, ist geeignei tür die anschließenden Messungen, besonders wenn es sich um eine radioaktive Markierung handelt. Ferner sind bei Anwendung des erfindungsgemäßen Säulenchromatographieverfahren die mechanischen Schritte zur Einleitung der Trennung und Entfernung der Trennvorrichtung zur Messung der Lage der einzelnen Komponenten leicht automatisierbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß wenn eine gefährliche Markierung, wie eine radioaktive Markierung verwendet wird, die gesamte zu dem Reaktionsgemisch zugesetzte Markierung in einer einzigen leicht wLgwerfbaren Vorrichtung, nämlich der Adsorptionssäule, sich ansammelt.

Das erfindungsgemäße Trennverfahren ist allgemein anwendbar auf den Nachweis bzw. die Bestimmung von Liganden durch spezifische Bindungsverfahren, wie die radioimmunologische Bestimmung von Antigenen und Haptenen, einschließlich Thyroxin (T-4) und Digoxin. und auf die Bestimmung der Bindungskapazität einer Probe für verschiedene Ligangen. wie der Serumbindungskapazität für Trijodthyronin (T-3).

Im folgenden wird die Erfindung in Form von Beispielen anhand der Zeichnung näher erläutert.

Bei den Figuren der Zeichnung ist

Fig. 1 ein Querschnitt durch die Höhlung bzw. Bohrung einer Zählvorrichtung bei Durchführung einer Messung entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung.

F i g. 2 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Thyroxin mit Hilfe von Säulen, enthaltend vernetzten Polyvinylalkohol,

F i g. 3 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen von Digoxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Polyvinylalkohol,

F i g. 4 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Thyroxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Dextran,

Fig. 5 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten

worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhai-(ung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von Säulen mit vernetztem Dextran.

F i g. 6 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung grgcn bekannte Mengen Thyroxin unter Verwendung von Säulen, die gefüllt waren mit Formaldehyd behandelter Stärke.

Fi β. 7 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von mit Stärke gefüllten Säulen, und

F i g. 8 eine beispielhafte Standardkurve, die erhalten worden ist durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen bekannte Mengen Digoxin unter Verwendung von Silicagels.iulen.

Ir.. Rahmen dieser Beschreibung haben die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: »Li^and« ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; »bindendes Mittel für die Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt, und »Bindungsanaloges des Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich in bezug auf die Bindungsaffinität z.u dem bindenden Mittel für den Ligangen im wesentlichen wie der Ligand selbst verhält.

Die Trennung der gebundenen von der freien Form der markierten Komponente bei spezifischen Bindungsbestimrr.ungen durch selektive Adsorption ist bekannt. Bei den bekannten Verfahren wird die Wechselwirkung zwischen dem Reaktionsgemisch und dem Adsorbens entweder durch Zugabe des Adsorbens in Form eines Pulvers, von Perlen oder Streifen zu dem Reaktionsgemisch und anschließende pyhsikalische Entfernung des Adsorbens, z. B. durch Zentrifugieren. Filtrieren oder Entfernen des Streifens, oder durch Perkulieren des Reaktionsgem'sches oder Durchleiten von oben nach unten unter dem Einfluß der Schwerkraft durch ein Bett des Adsorbens durchgeführt, wobei der Auslauf nur die gebundene oder freie Form der markierten Komponente enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt ein besseres Trennverfahren unter Anwendung eines selektiven Adsorbens, wobei das Reaktionsgemisch z. B. durch Kapillarwirkung, was bevorzugt ist, oder durch Einwirken einer äußeren Kraft, wie eines Vakuums, in eine Säule aus dem Adsorbens gezogen wird. Während es unter gewissen Umständen notwendig oder günstig sein kann, nur einen Teil des Reaktionsgemisches in die Adsorbenssäule zu ziehen, werden üblicherweise das Volumen des Reaktionsgemisches und die Kapazität der Säule so gewählt, daß das gesamte RcaktionsgcmsiLh in die Adsorbenssäule gezogen wird. Die selektive Adsorption der gebundenen oder freien Form findet unmittelbar nach Berührung zwischen dem Reaktionsgemisch und dem Adsorbens im Anfangsteil der Adsorbenssäule statt. Die nicht adsorbierte Form bewegt sich jedoch entlang der Säule mit dem fortschreitenden Lösungsmittel in dem Reaktionsgemisch. Nach Beendigung des Fortschreitens des Reaktionsgemisches in der Säule ist nahezu die gesamte selektiv adsorbierte Form am Anfang der Säule immobilisiert, während die andere Form sich gegen das Ende der Säule hin findet.

Eine Verbesserung der Trennung zwischen der gebundenen und freien Form kann erreicht v. erden, wenn man nach Aufnahme des Reaktionsgemisches den Anfangsteil der Säule einem Volumen einer Flüssigkeit aussetzt, die gegenüber der selektiven Adsorption der einen An am Anfangsteil der Säule inert ist. aber die als weiteres Lösungsmittel wirkt und die andere Form in der Adsorbenssäule weiter trägt. Im üblichen Falle ist diese Flüssigkeit Wasser oder eine wäßrige Pufferlösung.

Da zalilrc ehe Adsorbenticn. die für die gebundene oder freie Form selektiv sind, in der Literatur angegeben sind, soll hier keine erschöpfende Aufzählung angegeben werden. Die Adsorbenssäule ist vorzugsweise so ausgebildet, daß das Reaktionsgemisch durch Kapillarwirkung eingezogen werden kann. Das kann erreicht werden, indem man ein Adsorbens anwendet, das selbst kapillarabsorbierend ist, oder durch Vermischen des Adsorbens mit einem kapillarabsorbierenden Material oder beides. Besonders geeignete Adsorbentien sind z. B. vernetzter Polyvinylalkohol, vernetzte Dextrane, Stärke und Silicagel. Diese Adsorbentien sind angemessen hydrophil und gegenüber wäßrigen Reaktionsgemischen inert und können so gewählt werden, daß sie vorzugsweise die freien Formen, wie sie bei üblicherweise durchgeführten Bindungsbestimmungen auftreten, adsorbieren.

Die Adsorbenssäule liegt vorzugsweise in Form eines Bettes des Adsorbens in einem Rohr vor, das an einem Ende durch Rückhaltvorrichtungen festgehalten wird. Ein Beispiel für eine brauchbare Säule ist ein Plastikrohr (aus Polypropylen oder Polystyrol), das mit teilchenförmigen! Adsorbens gefüllt ist, das zwischen porösen Scheiben aus Kunststoff, Glaswolle oder Papier festgehalten wird.

In der Regel ist das für die Bestimmung angewandte Volumen des Reaktionsgemisches gering und beträgt z. B. 0,5 bis 1 ml. Die Adsorbenssäule sollte so dimensioniert sein, daß die nicht adsorbierte Komponente von der bevorzugt adsorbierten Komponente, die im Anfangsteil der Säule verbleibt, ausreichend weit entfernt ist, so daß eine getrennte Messung der Markierung möglich ist. Wenn z. B. das Adsorbensmaterial in einem Rohr enthalten ist. kann der innere Durchmesser des Rohres 0,1 bis 1,0 cm betragen und liegt vorzugsweise bei ungefähr 0,5 cm. Das Aufnahmeende eines solchen Rohres ist vorzugsweise verengt, so daß ein Stopfen aus porösem Material, z. B. als Glaswolle, festgehalten werden kann, der zur Rückhaltung des Adsorbens dient, während er für das wäßrige Reaktionsgemisch durchlässig ist. Eine praktische Länge für ein solches Rohr beträgt 5 bis 10 cm.

Im. Prinzip kann irgendeine bekannte Markierung, wie oben angegeben, angewandt werden, die in der Adsorbenssäule gemessen werden kann, ohne Entfernung des Adsorbens. Für ein solches System wird das Adsorbens in einer Vorrichtung festgehalten, die für die Markierungseigenschaft durchlässig ist. Die Anwendung von radioaktiven Markierungen, besonders Gammastrahlen des Isotopen, paßt gut in dieses Schema. In der Literatur sind zwahlreiche Verfahren angegeben, bei denen radioaktive Markierungen, wie ¹²⁵J, ¹³¹J. ⁵⁷Co usw. für Bindungsbestimmungen angewandt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trennungsverfahren, das gut geeignet ist radiologische Bestimmungen, da die Säule selbst für die Messung angewandt werden kann und nach Beendigung des Versuchs weggeworfen werden kann und die gesamte für die Bestimmung aufgewertete Radioaktivität enthält.

Die selektive Messung der Radioaktivität im Eingangsbereich der Säule ist eine einfache Verfahrensstufe aufgrund der physikalischen Trennung der Komponenten in der Säule und der geringen Strahlungsintensitäten de^r vorzugsweise angewandten radioaktiven Markierungen (.m häufigsten ¹²⁵J mit Intensitäten von nicht mehr als 200 kcpm). In der Regel umfaßt eine Zählvorrichtung zur Messung der Radioaktivität eine sogenannte Bohrung (well), d. h. eine Vertiefung oder Hülse zur Aufnahme der zu messenden Probe. Außerhalb der Seitenwand dieser Bohrung befindet sich mindestens ein Detektor. Wenn der Abstand zwischen der nicht adsorbierten Komponente und der adsorbierten Komponente größer ist als die Tiefe der Bohrung, kann die selektive Messung automatisch durchgeführt werden durch Einführen der Säule in die Bohrung mit dem Eintrittsbereich nach innen. Wenn das nicht der Fall ist und die Tiefe der Bohrung größer ist als der Abstand zwischen den beiden Komponenten, ist es möglich, den Teil der Säule, der die nicht adsorbierte Komponente enthält, mit einem für die radioaktive Strahlung undurchlässigen Absorptionsmaterial, z. B. Blei, abzuschirmen, so daß der Detektor nur auf die Radioaktivität in dem Eintrittsbereich der Säule anspricht. Eine solche Abschirmung besitzt eine Form und Größe, die in Übereinstimmung steht mit der speziellen Geometrie der Zählvorrichtung und der Probe. Die Abschirmung kann die Form einer Platte oder vorzugsweise eines zylindrischen Rohres mil einem inneren Durchmesser besitzen, der nur etwas größer ist als der (äußere Durchmesser) der Säule.

Wie in F i g. 1 angegeben, ist die Bohrung I der Zählvorrichtung teilweise durch ein Metallrohr 2, ζ. Β. aus Blei, abgeschirmt, das abnehmbar angeordnet ist. Die Abschirmung 2 ist in F i g. 1 schematisch dicht neben der Wand der Bohrung 1 dargestellt, aber, wie oben gesagt, sollte die Abschirmung vorzugsweise dicht um das die Probe enthaltende Testrohr 4 angeordnet sein. Gegenüber dem nicht abgeschirmten Teil der Bohrung I befindet sich der Detektor 3. In die Bohrung ist das Testrohr 4 eingeführt, in dem die Inkubation ursprünglich durchgeführt wurde, und aus dem das Reaktionsgemisch in das Rohr 5 gezogen wurde, das mit dem selektiven Absorbens 6 gefüllt ist. Das Absorbens 6 wird durch zwei Stopfen 7 und 8, z. B. aus Glaswolle, festgehalten. Als Folge der Aufnahme des Reaktionsgemsiches durch das Absorbens 6 in dem Rohr 5 ist die Flüssigkeit bis zu der Grenze 9 gestiegen, und auf diese Weise wurde die nicht adsorbierte Komponente in den Bereich der Bohrung 1 transportiert, der durch die Abschirmung 2 abgeschirmt ist. während die adsorbierte Komponente in dem unteren Eintrittsbereich des Rohres 5 in dem nicht abgeschirmten Bereich der Bohrung enthalten ist. Auf diese Weise wird nur die Radioaktivität des Eintrittsbereiches selektiv gemessen. Wenn die gesamte Radioaktivität des Materials in dem Rohr 5 gemessen werden soll, wird die Abschirmung 2 entfernt.

Es sind auch Radioaktivitätszählvorrichtungen bekannt, bei denen ein Detektor sich unterhalb des Bodens der Bohrung befindet zusätzlich zu dem seitlichen Detektor. Wenn eine solche Zählvorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird, muß darauf geachtet werden, daß der Detektor, der sich unterhalb des Bodens der Bohrung befindet, abgeschirmt wird, um zu vermeiden, daß er Strahlung von der darübirliegenden nicht adsorbierten Komponente, die in der Adsorptionssäule nach oben gewandert ist.

zählt.

Das erfindungsgemä'ße Verfahren kann angewandt werden auf den Nachweis bzw. die Bestimmung irgendeines Liganden, für den es einen .jpez.ifisehen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glykoprotein, Steroid oder anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird praktisch üblicherweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen und deren Antikörpern. Maptenen und deren Antikörpern, Hormonen. Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin. Choriongonadotropin. Thyroxin. Triiodthyronin und östriol. Antigene und Haptene. wie Ferritin, Brad>kin. Prostaglandine, und tumorspezifische Antigene. Vitamine, wie Biotin, Vitamin Bi >, Folsäure, Vitamin t und Ascorbinsäure; Metaboliten, wie J',5'-Adenosin-monophosphat und 3',5'-Guanosin-monophosphat: pharmakologische Mittel, wie Dilantin, Digoxin, Morphin. Digiloxin und Barbiturate; Antikörper, wie Mikrosomen-Antikörper und Antikörper zu Hepatitis und Allergenen; und spezifisch bindende Rezeptoren, wie Thyroxin-bindendes Globulin, Avidin, Inlrinsikfaktor undTranskobalamin.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird der Nachweis bzw. die Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Medium, üblicherweise wäßrigen Medium, durchgeführt durch ein verbessertes radioimmunologisches Bestimmungsverfahren der Art. bei der das wäßrige Medium mit einer readioaktiv markierten Form des Liganden oder eines Bindungsanalogen davon und einem Antikörper zu dem Liganden vermischt wird und das entstehende Reaktionsgemisch inkubiert wird, wobei eine gebundene Form des readioaktiv markierten Liganden oder Analogen gebildet wird, die an den Antikörper gebunden ist. und eine freie t-orm des radioaktiv markierten Liganden oder Analogen, die nicht an Antikörper gebunden ist, wobei die gebundene Form und die freie Form getrennt werden und die Radioaktivität der abgetrennten gebundenen oder freien Form gemessen wird. Die erfindungsgemäße Verbesserung besteht darin, daß man die Trennung der gebundenen Form von der freien Form durchführt, indem man das Reaktionsgemisch mit einer Säule eines kapillarabsorbierenden Adsorptionsmaterials zusammenbringt, das für die gebundene Form oder die freie Form spezifisch ist und das das gesamte Reaktionsgemisch durch Kapillarwirkung einsaugen kann, wodurch die gebundene Form und die freie Form entlang der Säule getrennt werden.

Aus der Gesamtradioaklivität (Gesamtzählung) und der Radioaktivität des Eintrittsbereiches der Säule (Teilzählung), wie sie nach der Trennung der Komponenten gemessen wird, wird die prozentuale Rückhaltung(Retention) nach der folgenden Formel berechnet:

prozentuale Rückhaltung =

Teilzählung Gesamtziihlunj;

χ 1(X)

el immi ι η er

Liganden ist es zunächst nötig, eine Reihe von Bestimmungen mit unterschiedlichen bekannten Mengen an Liganden durchzuführen und dadurch eine Kurve zu bilden, bei der die prozentuale Standardrückhaltung

Il

gegen die Konzentration aufgetragen Kt. Diese Kurve *ird dann angewandt zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration aus der prozentualen Rückhr.ltiing. die aus den Radioaktivitätszähliingcn berechnet worden ist.

Im Prinzip wird die Gcsamtradioaklivität bestimmt durch die Menge des radioaktiv markierten Liganden oder Analogen, die angewandt wird zur Herstellung des Reaktionsgemisches. Um jedoch Umgenanigkeitcn /u vermeiden, die durch ein ungenaues Aufbringen bzw. Zugeben der markierten Komponente auftreten können, kann es günstiger sein, die Gcsamtradioaktiviiät experimentell /ii bestimmen. Das kann erfolgen entweder vor oder nach der selektiven Bestimmung der Radioaktivität des Eintriitsberciches der Adsorbenssiiu Ie. Die Gesamtradioaktivität kann bestimmt werden nach Inkubation und vor der Einführung der Adsorbenssäule in das Rerklionsgemisch. Wahlweise ist es, wenn die selektive Zählung des Eintrittsbereiches durch teilweise Abschirmung der Bohrung der Zählvorrichtung durchgeführt werden soll, erfindungsgemaß auch möglich, die Gesamtradioaktivität nach der Trennung der Komponenten zu messen. Hierzu wird, nachdem die Zählung des Eintrittsbereiches der Säule abgeschlossen ist, die Abschirmung aus der Bohr ng entfernt, wodurch der gesamte Körper der Zählvorrichtung ausgesetzt wird.diedann auf die Gesamtradioaktivität anspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahien ist auch geeignet zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazitat in einem flüssigen Medium. Bei einer solchen Bestimmung wird von dem flüssigen Medium angenommen, daß es ein Bindungsmittel für den Liganden enthält Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden zur Durchführung des sogenannten »T-3-Aufnahmelestes«. Bei diesem Test wird das Thyroidhormon im Serum indirekt bestimmt durch Bestimmung der verfügbaren Bindungsstcllcn von Thyroid-bindendem Globulin (TBG), das in dem Serum vorhanden ist. Bei diesem Versuch wird angenommen, daß die Menge an TBG in normalen Sera verhältnismäßig konstant ist und daß es den größten Teil des verfügbaren Thyroidhormons bindet. Wenn markiertes (T-3 (Trijodthyronin) zu einer Serumprobe zugesetzt wird, wird es von dem TBG gebunden im Verhältnis zu den restlichen verfügbaren Bindungsstellen. Wenn eine große Menge an markiertem T-3 vor dem Serum gebunden wird, zeigt das eine große Zahl verfügbarer Bindungsstellen und damit einen geringen Gehalt an Thyroidhormon an und umgekehrt. Die Messung des ungebundenen markierten R-3 kann damit in Zusammenhang gebracht werden mil der Schilddrüsenfunktion. Bei der klinischen *\nwendung des R-3-Aufnahmetestes reicht es in vielen Fällen, das Verhältnis der T-3-Aufnahme im Vergleich mit einem normalen Standardserum zu bestimmen. Dieses Verhältnis kann erhalten werden durch Teilung der Teilzählung (wie oben definiert), die von der unbekannten Probe erhalten worden ist, durch die Teilzählung einer Standardserumprobe, die einem parallelen identischen Besummungsverfahre:i unterworfen worden ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden speziellen Beispiele noch näher erläutert:

Herstellung von vernetzten! Polyvinylalkohol

5 ml konz. Salzsäure werden unter Rühren zu einer Lösung von 10 g in kaltem Wasser löslichem kristallinen Polyvinylalkohol (PVA) Typ il (Katalog Nr. P 8136 der Siema Chemical Co, St. Louis. Missouri. USAi in 600 ml Wasser gegeben. Die entstehende viskose Lösung wurde mit einem Rührer mit hoher Kraft gerührt und auf M C erwärmt. Dann wurden 10 ml einer 25%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldchyd zugegeben und . das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 6VC gerührt. Der entstehende unlösliche vernetzte PVA wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral war. Der nasse Filterkuchen wurde mit Äthanol oder Aceton gewaschen und an der in Luft getrocknet. Die Ausbeute an körnigem weißen Polymer betrug 11,0 g. Beim Erhitzen auf 260"C wurde kein Schmelzen. Erweichen oder Zersetzung beobachtet. Das Produkt erwies sich als in Wasser und organischen Lösungsmitteln, einschließlich unter Riick-, fluß siedendem Dimethylformamid (DMF"), unlöslich.

Herstellung der Adsorbenssiiulen

Es wurden Kunststoffrohr mit einer Länge von ungefähr 8 cm und einem inneren Durchmesser von " ungefähr 0,5 cm ungewandt. Eine poröse Scheibe wurde auf den Boden jedes Rohres gepreßt, so daß sie mit dem Boden bündig abschloß, aber nicht herausfiel. Die Säule wurde dann gleichmäßig mit ungefähr 0.1 g trockenem Adsorbens (wie vernetztem Polyvinylalkohol, wie oben _■ · hergestellt) bis auf eine Höhe von ungefähr 6 cm gefüllt und eine zweite poröse Scheibe koaxial in dichtem Kontakt mit dem oberen Ende des Adsorbensbettes gepreßt.

Beispiel 1
Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T-4)

Um eine radioimmunologische Bestimmung von T-4 durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien, alle gelöst in Tris-maleat-Puffer, pH 7,4 (hergestellt durch -,, Lösen von 2,85 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 1.2 g Maleinsäure und 0,43 g Äthylendiamin-tctraessigsäure in 290 ml destilliertem Wasser), nacheinander in Reagensgläser gegeben:

1. 200 μΙ '«l-T-4 (ungefähr 100 kcpm)

2. 200 μΐ Τ-4-Standard (1 :4 verdünnt im Konzentra

tionsbereich von 4 bis 60 μg/l) oder ein= i : 4 verdünnte klinische Serumprobe

3. 50 μΙ ANS-Lösung (8-Anilin-l-naphthalensulfon-

säurc ammoniumsalz, 4 g/l

4. 200 μΙ Anti-T-4-Antikörper (gelöst in 5 ml Puffer)

Die Reagensgläser wurden nach der dritten und vierten Stufe leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen der Reagentien sicherzustellen. Dann

■ii wurde nach 20 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur eine Adsorbenssäule mit vernetztem PVA als Adsorbens, die wie oben hergestellt worden war, senkrecht in das Reagensglas gestellt, und das Reaktionsgemisch konnte in dem trockenen vernetzten

Vi Polyvinylalkohol aufsteigen. Wenn das gesamte Reaktionsgemisch adsorbiert war, wurde die Gesamtradioaktivität (Gesamtzähiung) bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die Adsorbenssäule in die Bohrung eines Gammazählers eingeführt, ohne Verwendung eines

mi Metallschildes. Die Radioaktivität des Eintrittsteils der Säule (enthaltend freies ¹²⁵J-T-4) wurde dann bestimmt (Teilzählung) unter Verwendung des Metallschildes, um zu verhindern, daß die Radioaktivität aus dem Restteil der Säule mitgezählt wird. Die prozentuale Rückhaltung

(■-> jeder Säule wurde berechnet nach der Gleichung

Teilzahlung

prozentuale Ruckhaltunsi = -^, nr,- ■< KK)

- Gesamtzaniune

Eine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen die entsprechenden Konzentrationen von Thyroxinstandard (F i g. 2).

Unbekannte Mengen an T-4, z. B. in Serum, können auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der ί Standardkurve der Fig.2 bestimmt werden. Unter Anwendung dieser Standardkurve wurden zwei Vergleichsseren, die bezeichnet werden als Led-I und Led-Il (Lederle Diagnostics, American Cyanamid Company, Pearl River, N. Y, USA) jeweils im Duplikat untersucht, m Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Led-I 7,0 und 7,9 μg/100 ml (erwarteter Wert =

8-11 μg/100)

Led-Il 16,5 und 17,6 μg/100 ml (erwarteter Wert =

16,9-25,5 μg/100 ml)

Beispiel 2 Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Säu'cn mit vernetzten! Polyvinylalkohol als Adsor- -■» bens wurden, wie oben beschrieben, hergestellt. Der bei diesem Versuch angewandte Puffer war ein Hhosphatpuffer, pH 7,4 (6,25 g/l Natriumbiphosphat, pH eingestellt mit Natriumhydroxidlösung).

Um die radioimmunologische Bestimmung von :> Digoxin durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien stufenweise in Reagensgläser gegeben:

1. 200 μΐ i«J-Digoxin(27kcpm)

2. 150μΙ Standarddigoxin. Die Standards wurden her- _J()

gestellt durch Verdünnen von 1 ml Vorratsie sung mit einer Konzentration von 0,5, 2,0 und 5,0 μΙ/ml mit 1 ml normalem Serum und 1 ml Puffer. Die Standards wurden so 1:3 verdünnt.

3. 150μ1 Antidigoxin-Kaninchenantiserum in Phosphatpuffer, enthaltend 0,2⁰/o Rinderserumalbumin

Der Test wurde durchgeführt durch Zugabe der folgenden Reagentien in ein Reagensglas:

1. 200 μΙ ¹³⁵J-T-3(inCitronensäurepuffer,

120kcpm)

2. 20 μΐ Serum (Standard oder klinische Probe)

Das Reagensglas wurde leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen des Inhaltes sicherzustellen. Eine Adsorbenssäule wurde dann, wie in Beispiel 1, senkrecht in das Reagensglas gestellt, und das Reaktionsgemisch konnte in dem vernetzten Polyvinylalkohol aufsteigen. Unmittelbar nachdem das ganze Reaktionsgemisch absorbiert war, wurden 200 μ! Puffer in das Reagensglas gegeben und konnten ebenfalls in die Säule aufsteigen.

Eine Teilzählung der Radioaktivität an der Eintrittsstelle der Säule wurde mit dem Metallschild durchgeführt.

Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Zählungen der Säule mit der klinischen Probe

Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten im Reagensglas bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde eine Absorbenssäule, wie in Beispiel 1, senkrecht in das Reagensglas gestellt, und das Reaktionsgemisch konnte in den trockenen vernetzten Polyvinylalkohol aufsteigen. Wenn das gesamte Reaktionsgemisch adsorbiert war, wurde die Gesamt- und Teilradioaktivität gezählt und die prozentuale Rückhaltung, wie in Beispiel 1 berechnet, und eine Standardkurve auf ähnliche Weise gebildet (F i g. 3).

Unbekannte Mengen an Gigoxin, z. B. in Serum, können auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der Standardkurve der F i g. 3 bestimmt werden.

Unter Anwendung dieser Standardkurve wurden zwei Verglciehssera (Led-I und Led-Il) jeweils im Duplikat untersucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Led-I 1,0 ng/ml (erwarteter Wert: 0,8-1,2 ng/ml) Led-Il 3,8 ng/ml (erwarteter Wert: 2,5-4,0 ng/ml)

Beispiel 3

Radioimmunologische Bestimmung der Trijodthyronin-(T-3)-Aufnahme

Säulen mit vcrnet/.tem Polyvinylalkohol als Adsorbens wurden, wie oben beschrieben, hergestellt. Der bei diesem Versuch angewandte Puder wurde hergestellt durch Lösen von 14,4 g Citronensäure und 43.75 g Natriumbiphosphat (NaH₂PO₄ ■ 8 H₂O) und 2.7 ml 37%igcm Formaldehyd in ! I Wasser.

Zählungen der Säule mit dem Standardserum
.χ = 1 normal, .x < 1 niedrig, χ > 1 hoch.

Die Ergebnisse für geringe, normale und hohe Seragehalte in Werten für die bekannte T-3-Aufnahme waren: 0,6,0,9 bzw. 1,5.

Beispiel 4
Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T-4)

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt mil dem einzigen Unterschied, daß anstelle von Säulen mil vernetzten! PVA Säulen der gleichen Art angewandi r. wurden, die mit Sephadex G-10 (vernetztem Dextrar [Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden]' gefüllt waren.

Die prozentuale Rückhaltung wurde wie in Beispiel 1 berechnet, und die erhaltenen Werte wurden gegen di< in entsprechenden Konzentrationen der Τ-4-Standard: aufgetragen. Man erhielt die in Fig.4 angegeben« Kurve.

Unbekannte Mengen an T-4, z. B. in Serum, wurder auf die oben angegebene Weise mit Hilfe dei r» Standardkurve bestimmt.

Beispiel 5
Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

vi Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt wobei anstelle von Säulen mit vernetztem PVA Säuler mit Dextran, wie in Beispiel 4, angewandt wurden.

Die Gesamtzählungen und Teilzahlungen der Radio aktivität wurden bestimmt und die prozentuale Rück

">") haltung, wie in Beispiel 1 beschrieben, berechnet. Mi Hilfe der erhaltenen Standardkurve, die in Fig.! angegeben ist, wurden unbekannte Mengen Digoxin z. B in Serum, auf die oben angegebene Weis« bestimmt.

^h" Beispiel 6

Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T-4)

Λ I lerstcllung von mit Formaldehyd

behandelter Stärke

ι-. /.u einer Suspension von 100 g Stärke (Starch Soliibli Aniilat brand. The British Drug House. Poolc, England in 200 ml Wasser wurden 45 ml einer 40%igen wäDrij!ci Formaldchydlösung gegeben und anschließend 10 πι

27 5t 588

konz. Salzsäure. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das feste Produkt wurde wiederholt mit Wasser gewaschen bis zur Neutralität und dann mit Aceton und getrocknet.

B. Herstellung der Adsorbenssäulen

Die Säulen wurden, wie oben angegeben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß sie mit mil Formaldehyd behandelter Stärke, die entsprechend A hergestellt worden war, gefüllt wurden.

C. Radioimmunologische Bestimmung von T-4

Die folgenden Reagentien wurden jeweils in Tris-maleat-Puffer gelöst und stufenweise in Reagensgläser gegeben:

1. 100 μΙ '«j-T-4 (ungefähr 90 kcpm)

2. 100 μΙ Τ-4-Standard (verdünnt 1 :4 im Konzentra-

lionsbereäch von 4 bis 50 μ§/1) oder eine 1 : 4 verdünnte klinische Serumprobe

3. 50 μΐ ANS-Lösung (8-Anilin-l-naphthalin-sulfon-

säure-ammoniumsalz.4 g/l)

4. 100 μΙ Anti-T-4-Antikörper(gelöstin3ml Puffer)

Es wurde genau das Verfahren des Beispiels 1 wiederholt und durch Auftragen der berechneten prozentualen Rückhaltung die in Fig.6 angegebene Standardkurve erhalten.

Beispiel 7
Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Es wurde entsprechend Beispiel 2 gearbeitet, wobei anstelle der mit vernetzten! PVA gefüllten Säulen. Säulen verwendet wurden, die mit Stärke (ungefähr 0.5 g) (Starch Soluble Analar brand. The British Drug House, Poole, England) gefüllt waren.

Die folgenden Volumina von Reagentien wurden angewandt:

1. 150 μΙ '«J-Digoxin (27 kcpm)

2. 50 μΙ Standarddigoxin oder Serumprobe

3. 100 μ| Antidigoxin-Kaninchenantiscrum

Man erhielt die in F i g. 7 angegebene Standardkurvc.

Mit Hilfe der Standardkurvc wurden zwei klinische Vergleichsseren untersucht (Dreifachbestimmung) und die Ergebnisse mit den Digoxinbestimmungen nach Standardverfahren verglichen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Serumprobe Nr. 1:

1.2 ng/ml (erwarteter Wert 1,0- 1,5 ng/ml)

Serumprobe Nr. 2:

3,7 ng/ml (erwarteter Wert 2.0- 5,0 ng/ml)

Beispiel 8
Radioimmunologische Bestimmung von Digoxin

Es wurde ähnlich wie in Beispiel 2 gearbeitet, wobei anstelle von Säulen mit vernetztem PVA Säulen verwendet wurden, die mit Silicagel gefüllt waren (Korngröße 0,037 bis 0,074 mm, Kieselgel 60, Katalog Nr. 9385, E. Merck, Darmstadt).

Die folgenden Volumina von Reagentien wurden verwendet:

1. 200 μΙ i25j-Digoxin

2. Ι50μΙ Standarddigoxin oder Serumprobe

3. ί50μΙ Antidigoxin-Kaninchenserum

Das Reaktionsgemisch wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend eine Adsorbenssäule in das Reagensglas gegeben, und das Reaktionsgemisch konnte in dem trockenen Silicagel aufsteigen. Wenn das gesamte Reaktie-sgemisch adsorbiert war, wurde ein weiteres Volumen von 400 μΙ Phosphatpufferlösung in das Reagensglas gegeben, das ebenfalls in der Silicagelsäule aufsteigen konnte. Die Gesamt- und Teilzählung der Radioaktivität wurde gemessen und die Rückhaltwerte, wie in Beispiel 1, berechnet. Die Standardkurve ist in F i g. 8 angegeben.

Mit Hilfe der Standardkurve wurden 20 Versuche an einem (pooled) klinischen Serum durchgeführt. Man erhielt folgende Ergebnisse:

Konzentration an Digoxin

gefunden: 2,9 ng/μΙ

nach bekanntem Verfahren

bestimmt: 2.5-3.0 ng/μΙ

Variationskoeffizient = 12%.

Beispiel 9

Radioimmunoiogische Bestimmung der Trijodthyronin-(T-3)-Aufnahme

Pasteurpipetten aus Glas wurden so abgeschnitten, daß sie eine Säule mit einer Länge von ungefähr 7 cm und einem inneren Durchmesser von ungefähr 6 mm mit einer Verengung am unteren Teil bildeten. Ein kleiner Pfropfen Glaswolle wurde auf den Boden der Säule geschoben und die Säule mit feinem Silicagel (0.037 - 0,074 mm Kieselgel. Katalog Nr. 9385. E. Merck, Darmstadt) gefüllt. Ein zweiter Pfropfen aus Glaswolle wurde in die Säule geschoben, um den Inhalt festzuhalten.

Das Verfahren, die Reagentien und Volumina waren die gleichen wie in Beispiel V mit der Ausnahme, daß, nachdem das Peaktionsgemisdi adsorbiert war. 500 μΙ destilliertes Wasser (anstelle der 200 μΙ Puffer in Beispiel 3) in (Ins Rcagensglas gegeben wurden und in der Säule aufsteigen konnten.

Die Teilzählung der Radioaktivität wurde durchgeführt und die T-3-Aufnahme wie in Beispiel 3 berechnet. Für Sera mit geringem, normalem und hohem Gehalt erhielt man in Werten für die bekannte T-3-Aufnahme die folgenden Ergebnisse:

/anhingen

T-I berechnetes Aul'nahmrvcrhiiltni¹;

1-3 Milch bekanntem Verfahren bestimmtes

Λ iilnahmcvcrhiiltnis

Serum	nieder	normal	hoch
Standard	m	27.3	45.0
2o.<>	0.72	1.02	1.71
	0 70	1.02	1.37

I Ik-ivu S Itliiic

Claims

Patentansprüche:

1. Spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigem Medium, durch Zusammenbringen des flüssigen Mediums mit Bestimmungsreagentien, enthaltend 1. als markierte Komponente den Liganden oder ein Bindungsanaloges dazu, der bzw. das mit einer radioaktiven Markierung versehen ist, und gegebenenfalls 2. ein Bindungsreagens für den Liganden; Bildung eines Reaktionsgemisches, das eine an das Bindungsreagens gebundene Form der markierten Komponente und eine freie Form derselben, die nicht an das Bindungsreagens gebunden ist, enthält; Trennung der gebundenen von der freien Form durch Zusammenbringen des Reaktionsgemisches mit einem Adsorptionsmittel, das für die gebundene oder die freie Form spezifisch ist, und Messen der Radioaktivität einer der voneinander getrennten Formen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung-der gebundenen Form von der freien Form der markierten Komponente durchführt, indem man mindestens einen Teil des Reaktionsgemisches in eine Säule aus dem Adsorptionsmittel aufzieht, in der die beiden Formen entlang der Säule voneinander getrennt werden, und die Radioaktivität eines Teils der Säule mißt, in dem eine der beiden Formen enthalten ist.

2. Verfahren nach Anspru- Ί 1, dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem zumindest ein Teil des Reaktionsgemisches in die Sau" · aus dem Adsorptionsmittel aufgezogen worden ist, das gleiche Ende der Säule, das mit dem Reaktionsgemisch in Berührung gebracht worden ist, mit einem Volumen einer für die selektive Adsorption der gebundenen oder freien Form inerten Flüssigkeit zusammenbringt und die Flüssigkeit zur Verstärkung der Trennung der beiden Formen in die Säule aufzieht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Adsorptionsmittel verwendet, das gegenüber dem Reaktionsgemisch kapillare Wirkungen aufweist und das Reaktionsgemisch durch Berührung mit dem einen Ende der Säule durch Kapillarwirkung in die Säule aufzieht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein ausreichend großes Adsorptionsmittelvolumen verwendet, so daß das gesamte Reaktionsgemisrh kapillar aufgezogen wird.

5. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung der Radioaktivität der gebundenen Form oder der freien Form durchführt, indem man die Säule in eine Bohrung einer Zählvorrichtung für radioaktive Strahlung einführt und den Teil der Säule, in dem sich die Form, deren Radioaktivität jeweils nicht gemessen werden soll, befindet, selektiv von der Zählvorrichtung durch ein für radioaktive Strahlung undurchlässiges Material abschirmt.

6. Verfahren nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß man zur Abschirmung den betreffenden Teil der Bohrung mit einem für radioaktive Strahlung undurchlässigen Material auskleidet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmaterial vernetzten Polyvinylalkohol, -crnetztes Dextran, Stärke und/oder Silicagcl verwendet.

8. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 7 zur Bestimmung von Antigenen und deren Antikörpern, Haptenen und deren Antikörpern, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln und ihren Rezeptoren und Bindungssubstanzen.