DE60316471T2

DE60316471T2 - Sich selbst kalibrierende durchflusstestvorrichtungen

Info

Publication number: DE60316471T2
Application number: DE60316471T
Authority: DE
Inventors: Ning Roswell WEI; Yanbin Roswell HUANG; Xuedong Roswell SONG; Rosann Cumming KAYLOR
Original assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc; Kimberly Clark Corp
Current assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc; Kimberly Clark Corp
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2023-10-30
Also published as: CA2508285A1; EP1890149A3; AU2003287309A1; WO2004061455A1; MXPA05005950A; KR20050084095A; CN1720456A; EP1573330A1; EP1573330B1; US20040121334A1; ES2290524T3; TWI249032B; DE60316471D1; TW200413726A; EP1890149A2; ATE373825T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Verschiedene analytische Prozeduren und Vorrichtungen werden allgemein eingesetzt in Durchflusstestvorrichtungen, um das Vorliegen und/oder die Konzentration von Analyten zu bestimmen, welche in einer Testprobe vorhanden sein können. Beispielsweise setzen Immunoassays Mechanismen des Immunsystems ein, in welchem Antikörper erzeugt werden als Antwort auf das Vorliegen von Antigenen, welche pathogen oder fremd für den Organismus sind. Diese Antikörper und Antigene, d.h. Immunoreaktanten, sind in der Lage, miteinander zu binden, wodurch ein hochspezifischer Reaktionsmechanismus ausgelöst wird, welcher verwendet werden kann, um das Vorliegen oder die Konzentration dieses speziellen Antigens in einer biologischen Probe zu bestimmen.
Es gibt mehrere gut bekannte Immunoassayverfahren, welche Immunoreaktanten einsetzen, gelabelt mit einer nachweisbaren Komponente, so dass der Analyt analytisch nachgewiesen werden kann. Beispielsweise involvieren Assays von "Sandwichtyp" typischerweise das Mischen der Testprobe mit nachweisbaren Sonden, wie z.B. gefärbtem Latex oder einem Radioisotop, welche mit einem spezifischen Bindungselement für den Analyten konjugiert sind. Die konjugierten Sonden bilden Komplexe mit dem Analyten. Diese Komplexe erreichen dann eine Zone von immobilisierten Antikörpern, wobei das Binden auftritt zwischen den Antikörpern und dem Analyten, um sogenannte ternäre "Sandwichkomplexe" auszubilden. Die Sandwich komplexe sind lokalisiert an der Zone zum Nachweis des Analyten. Diese Technik kann eingesetzt werden, um quantitative oder semi-quantitative Ergebnisse zu erhalten. Einige Beispiele solcher Sandwichtyp-Assays werden beschrieben in US-Patent Nrn. 4,168,146 von Grubb et al., und 4,366,242 von Tom et al..
Desweiteren betrifft die internationale Anmeldung Nr. WO 97/09620 ein Verfahren für die Bestimmung für Analyten in einer Testprobe und offenbart die Verwendung von einer oder mehreren Testzonen zum Nachweis des Analyten und einer oder mehreren Kalibrationszonen, welche gelabelte Kalibratorwirksubstanzen aufnehmen. Die Signale, assoziiert mit den unterschiedlichen Testzonen und den Kalibrationszonen, werden verglichen, um auf das Vorliegen des Analyten zu bestimmen.
Eine alternative Technik ist der Assay vom "kompetitiven Typ". In einem Assay vom kompetitiven Typ ist der Label typischerweise ein gelabelter Analyt oder ein Analyt-Analog, welcher um die Bindung eines Antikörpers konkurriert mit einem ungelabelten Analyt, der in einer Probe vorliegt. Kompetitive Assays werden typischerweise verwendet zum Nachweis von Analyten, wie z.B. Haptenen, wobei jedes Hapten monovalent ist und in der Lage ist, nur ein Antikörpermolekül zu binden. Beispiele von kompetitiven Immunoassayvorrichtungen werden beschrieben in US-Patent Nrn. 4,235601 von Deutsch et al., 4,442,204 von Lotta, und 5,208,535 von Buechler, et al.
Viele dieser Assays verlassen sich auf die Kalibration, um richtige und bedeutsame Ergebnisse zur Verfügung zu stellen, insbesondere bei semi-quantitativen und quantitativen Nachweisen. Genauer gesagt können entweder externe oder interne Kalibrationssysteme im allgemeinen eingesetzt werden. In einem externen Kalibrationssystem kann eine Standardkurve erhalten werden aus Standardproben, welche eine Serie von einer bekannten Menge an Analyt enthalten und die Ergebnisse, erhalten für die Proben, werden dann verglichen mit der Standardkurve, um das Vorliegen und/oder die Menge des Analyten in der Probe zu extrahieren. Das externe Kalibrationsverfahren ist relativ einfach zu konzipieren und einfach zu implementieren. Jedoch ist es häufig eine Überlagerung mit Variationen, bedingt durch Umwelteinflüsse und Batch-und-Batch-Durchläufen unterzogen und daher nicht verlässlich.
Herkömmliche innere Kalibrationssysteme setzen andererseits typischerweise eine Membran ein, welche eine Kalibrationszone aufweist und eine Nachweiszone, auf welcher das einfache Reagenz, welches spezifisch für den Analyten ist, immobilisiert ist. Leider ist die Fähigkeit der Kalibrationszone einen verlässlichen und akkuraten Vergleich mit der Nachweiszone zu realisieren, häufig begrenzt. Darüber sind innere Kalibrationszonen relativ teuer, was sie für bestimmte Anwendungen unpraktisch machen.
Es existiert daher per se derzeit ein Bedürfnis für ein akkurates Kalibrationssystem für Durchflusstestvorrichtungen, welche akkurat und billig ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist die Durchflusstestvorrichtung von Anspruch 1. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Durchflusstestvorrichtung (beispielsweise Sandwich, kompetitiv, etc.) offenbart, die in der Lage ist, das Vorliegen oder die Menge eines Analyten, der in der Testprobe vor kommt, nachzuweisen. Die Durchflusstestvorrichtung umfasst eine poröse Membran, welches sich in Kommunikation befindet mit Nachweissonden und Kalibrationssonden, die in der Lage sind, ein Detektionssignal zu erzeugen bzw. ein Kalibrationssignal. Beispielsweise werden in einigen Ausführungsformen die Sonden aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Chromogenen, Katalysatoren, fluoreszierenden Verbindungen, chemilumineszenten Verbindungen, Phosphoreszenzverbindungen, radioaktiven Verbindungen, direkten visuellen Labeln, Liposomen und Kombinationen davon. In einer speziellen Ausführungsform enthalten die Sonden ein Latexmikropartikel.
Die poröse Membran definiert eine Nachweis-/Kalibrationszone, innerhalb welcher ein Polyelektrolyteinfangreagenz immobilisiert ist, das so konfiguriert ist, dass es direkt an die Kombination der Nachweissonden und der Kalibrationssonden bindet. Ein zweites Einfangreagenz, das ein spezifisches Bindungselement für den Analyten ist, kann eingesetzt werden. Die Detektions-/Kalibrationszone ist in der Lage, ein Detektions- und Kalibrationssignal zu erzeugen, so dass die Menge des Analyten in der Lage ist, das Nachweissignal, das durch das Kalibrationssignal kalibriert ist, zu bestimmen.
In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens oder der Menge eines Analyten, der in einer Testprobe vorkommt, in Anspruch 13 offenbart. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Durchflusstestvorrichtung. Eine Testprobe, welche den Analyten enthält, wird in Kontakt gebracht mit Nachweissonden und Kalibrationssonden, die mit der Vorrichtung vorliegen. An einer Nachweis-/Kalibrationszone werde die Intensität des Nachweissignals und des Kalibrationssignals gemessen. Die Menge des Analyten innerhalb der Testprobe ist proportional zur Intensität des Direktionssignals, kalibriert durch die Intensität des Kalibrationssignals.
Andere Merkmale und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in größeren Details unten erläutert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Eine vollständige und befähigende Offenbarung der vorliegenden Erfindung, einschließend die beste Art der Durchführung davon, die sich an einen Fachmann auf dem Gebiet wendet, wird im größeren Detail im Rest der Beschreibung dargelegt, welcher auf die folgenden beigefügten Figuren verweist, in welchen:
1 eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine grafische Illustration von einer Ausführungsform zur kovalenten Konjugation eines Antikörpers an carboxylierte Nanopartikel ist;
3 eine schematische Illustration einer Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
4 eine schematische Illustration einer anderen Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
5 eine schematische Illustration von noch einer anderen Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist; und
6 eine schematische Illustration einer weiteren Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist.
Die wiederholte Verwendung von Referenzziffern in der vorliegenden Beschreibung und in den Zeichnungen ist dazu gedacht, die gleichen oder analoge Merkmale oder Elemente der Erfindung zu repräsentieren.
Detaillierte Beschreibung von repräsentativen Ausführungsformen
Definitionen
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Analyt" im allgemeinen auf eine Substanz, welche nachgewiesen werden soll. Beispielsweise können Analyten, Antigensubstanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon einschließen. Analyten schließen ein Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Peptide, Mikroorganismen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Wirksubstanzen (einschließend diejenigen verabreicht für therapeutische Zwecke wie auch diejenigen verabreicht für verbotene Zwecke), Wirksubstanz zwischen Verbindungen oder Abfallprodukte, Bakterien, virale Partikel und Metabolite oder Antikörper von irgendwelchen der oben genannten Substanzen. Spezifische Beispiele einiger Analyte schließen Ferritin ein; Kreatininkinase MIB (CK-MB); Digoxin; Phenytoin; Phenobarbitol; Carbamazepin; Vancomycin; Gentamycin; Theophyllin; Valproinsäure; Quinidin; luteinisierendes Hormon (LH); follikelstimulierendes Hormon (FSH); Estradiol, Pro gesteron; C-reaktives Protein; Lipocaline; IgE Antikörper; Vitamin B2 Mikroglobulin; glykosyliertes Hämoglobin (Gly. Hb); Kortisol; Digitoxin; N-Acetylprocainamid (NAPA); Procainamid; Antikörper gegen Rubella, wie z.B. Rubella-IgG und Rubella-IgM; Antikörper gegen Toxoplasmose, wie z.B. Toxoplasmose IgG (Toxo-IgG) und Toxoplasmose IgM (Toxo-IgM); Testosteron; Salicylate; Acetaminophen; Hepatitis B-Virus Oberflächen-Antigen (HbsAg); Antikörper gegen das Hepatitis B Kern-Antigen, wie z.B. Anti-Hepatitis B Kern Antigen IgG und IgM (Anti-HBC); menschliche Immunschwäche Virus 1 und 2 (HIV 1 und 2); menschliche T-Zell Leukämie Virus 1 und 2 (HTLV); Hepatitis Be Antigen (HbeAg); Antikörper gegen Hepatitis Be Antigen (Anti-Habe); Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH); Thyroxine (T4); totales Triiodothyronin (Total T3); freies Triiodothyronin (freies T3); Karzinoecmbryo-Antigen (CEA); und alphafötales Protein (AFP). Wirksubstanzen des Missbrauches und kontrollierte Substanzen schließen ein, sind jedoch nicht dazu gedacht, limitiert zu sein auf: Amphetamin; Methamphetamin; Barbiturate, wie z.B. Amobarbital, Secobarbital, Pentobarbital, Phenobarbital und Barbital; Benzodiazepin, wie z.B. Librium und Valium; Cannabinoide, wie z.B. Haschisch und Marihuana; Dokain; Fentanyl; LSD; Methaqualon; Opiate, wie z.B. Heroin, Morphin, Kodein, Hydromorphon, Hydrocodon, Methadon, Oxycodon, Oxymorphon und Opium; Phencyclidin; und Propoxyhen. Andere mögliche Analyten können beschrieben werden in US-Patent Nrn. 6,436,651 von Everhart, et al. und 4,366,241 von Tom et al..
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Testprobe" im allgemeinen auf ein Material, von dem man glaubt, dass es den Analyten enthält. Die Testprobe kann direkt erhalten werden, wie sie von der Quelle erhalten wird oder nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu modifizieren. Die Testprobe kann abgeleitet sein von irgendeiner biologischen Quelle, wie z.B. der physiologischen Flüssigkeit, einschließend Blut, Saliva, Augenlinsenflüssigkeit, cerebrale spinale Flüssigkeit, Schweiß, Urin, Milch, Ascites-Flüssigkeit, Schleim, synovialer Flüssigkeit, peritonealer Flüssigkeit, amniotischer Flüssigkeit od. dgl., Die Testprobe kann vor der Verwendung behandelt werden, wie z.B. durch Herstellung von Plasma aus Blut, Verdünnen von viskosen Flüssigkeiten und dergleichen. Verfahren zur Behandlung können Filtration, Destillation, Konzentration, Inaktivierung von wechselwirkenden Komponenten, die Zugabe der Reagenzien involvieren. Neben physiologischen Flüssigkeiten können andere Flüssigkeitsproben verwendet werden, wie z.B. Wasser, Nahrungsmittelprodukte u. dgl. für die Durchführung von Assays. Zur Umweltanalyse und Nahrungsmittelherstellung. Darüber hinaus können feste Materialien, von denen man glaubt, dass sie den Analyten enthalten, als Testproben verwendet werden. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, eine feste Testprobe zu modifizieren, um ein flüssiges Medium auszubilden oder den Analyten freizusetzen.
Detaillierte Beschreibung
Nun wird im Detail auf verschiedene Ausführungsformen der Erfindung verwiesen, bzw. auf ein oder mehrere Beispiele, die unten dargelegt sind. Jedes Beispiel wird auf dem Wege der Erläuterung der Erfindung präsentiert, und soll die Erfindung nicht beschränken. Tatsächlich wird offensichtlich für die Fachleute auf dem Gebiet sein, dass verschiedene Modifikationen und Variationen in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können Merkmale, die illustriert werden oder als Teil einer Ausführungsform beschrieben werden, in einer anderen Ausführungsform eingesetzt werden, um noch eine weitere Ausführungsform zu erzielen. Folglich ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung solche Modifikationen und Variationen abdeckt, insofern sie sich innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche befinden.
Im allgemeinen ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein inneres selbst-kalibrierendes System für Durchflusstestvorrichtungen. Insbesondere setzt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer einzigen Nachweis-/Kalibrationszone ein, definiert durch eine poröse Membran des Assays. Durchführen der Signaldetektion und inneren Kalibration zur gleichen Zeit kann in starkem Maße die Nachweisverlässlichkeit und Reproduzierbarkeit durch Eliminieren der Einflüsse von Umweltfaktoren erhöhen, wie z.B. von Temperatur, pH und instrumenteller Instabilität des Nachweissignals.
Bezug nehmend auf 1 wird nun beispielsweise eine Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung ausgebildet werden kann, in größerem Detail beschrieben. Wie dargestellt wird enthält die Vorrichtung 20 eine poröse Membran 23, optional unterstützt durch ein steifes Material 21. Im allgemeinen kann die poröse Membran 23 aus irgendeiner der Vielzahl von Materialien erstellt werden, durch welche die Testprobe in der Lage ist, durchzudringen. Beispielsweise können die Materialien, welche verwendet werden, um die poröse Membran auszubilden, natürliche, synthetische oder natürlich auftretende Materialien einschließen, welche synthetisch modifiziert werden, sind aber nicht darauf beschränkt; Beispiele dafür sind Polysaccharide (beispielsweise Cellulosematerialien, wie z.B. Papier und Cellulosederivate, wie z.B. Celluloseacetat und Nitrocellulose); Silica; anorganische Materialien, wie z.B. deaktiviertes Alumina, Kieselerde, MgSO₄ oder ein anderes anorganisches, fein verteiltes Material, welches einheitlich in einer porösen Polymermatrix verteilt ist, mit Polymeren, wie z.B. Vinylchlorid, Vinylchloridpropylencopolymer und Vinylchlorid-Vinylacetatcopolymer; Kleidung, sowohl natürlich auftretend (beispielsweise Baumwolle) als auch synthetisch (beispielsweise Nylon oder Rayon); poröse Gele, wie z.B. Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine; Polymerfilme, wie z.B. Polyacrylamid; und dergleichen. In einer speziellen Ausführungsform wird die poröse Membran 23 ausgebildet aus Nitrozellulose und/oder Polyester-Sulfon-Materialien. Es sollte sich verstehen, dass der Begriff "Nitrozellulose" sich auf Salpetersäureester von Zellulose bezieht, welche Nitrozellulose allein sein können oder ein gemischter Ester von Salpetersäure und anderen Säuren, wie z.B. aliphatischen Karbonsäuren mit von 1 bis 7 Kohlenstoffatomen.
Die Vorrichtung 20 kann auch ein dochtartiges Feld 28 einschließen. Das dochtartige Feld (wicking pad) 28 nimmt im allgemeinen Flüssigkeit auf, welche durch die vollständige poröse Membran 23 gewandert ist. Wie im Stand der Technik wohl bekannt ist, kann das dochtartige Feld 28 helfen, Kapillarkräfte voranzutreiben, sowie den Flüssigkeitsfluss durch die Membran 23.
Um den Nachweis eines Analyten innerhalb der Testprobe auszulösen, kann ein Anwender direkt die Testprobe auf einen Abschnitt der porösen Membran 23 aufbringen, durch welche sie dann wandern kann, um eine Nachweis-/Kallibrationszone 31 zu erreichen (siehe Beschreibung unten). Alternativ kann die Testprobe zunächst auf ein Probenaufnahmefeld (nicht gezeigt) aufgebracht werden, das in flüssiger Kommunikation mit der porösen Membran 23 steht. Einige geeignete Materialien, die verwendet werden können, um das Probeaufnahmefeld auszubilden schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Nitrozellulose, Zellulose, poröse Polyethylenfelder und Glasfaserfilterpapier. Falls gewünscht, kann das Probenaufnahmefeld auch ein oder mehrere Vorrichtungsvorbehandlungs-Reagenzien einschließen, entweder diffusiv oder nicht diffusiv daran angebunden.
In der illustrierten Ausführungsform wandert die Testverbindung vom Probeaufnahmefeld (nicht gezeigt) zu einem Konjugatfeld 22, das in Kommunikation platziert ist mit einem Ende des Probeaufnahmefeldes. Das Konjugatfeld 22 wird aus einem Material gebildet, durch welches die Testprobe durchdringen kann. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform das Konjugatfeld 22 aus Glasfasern ausgebildet. Obwohl nur ein Konjugatfeld 22 dargestellt ist, sollte sich verstehen, dass andere Konjugatfelder auch in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Um einen akkuraten Nachweis des Vorliegens oder der Abwesenheit eines Analyten innerhalb der Testprobe zu ermöglichen, werden Sonden an verschiedenen Stellen der Vorrichtung 20 angebracht. Wie im größeren Detail unten beschrieben werden wird, werden Sonden sowohl für die Detektion des Analyten als auch für die Kalibration eingesetzt. Jegliche Substanz, die im allgemeinen in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das visuell nachweisbar ist oder durch eine Instrumentenvorrichtung, kann als Sonde eingesetzt werden. Verschiedene geeignete Substanzen können einschließen: Chromogene; Katalysatoren; Fluoreszenzverbindungen; chemilumineszente Verbindungen, phosphoreszente Verbindungen; radioaktive Verbindungen; direkte visuelle Label, einschließend kolloidale Metalle (beispielsweise Gold) und Nicht-Metallpartikel, Farbstoff-Partikel, Enzyme oder Substrate oder organische Polymer-Latexpartikel; Liposome oder andere Vesikel, welche Signal erzeugende Substanzen einschließen; und dergleichen. Beispielsweise werden einige Enzyme, die geeignet sind zur Verwendung als Sonden, offenbart in US-Patent Nr. 4,275,149 von Litman, et al. Ein Beispiel eines Enzym-Substrat-Systems ist das Enzym-alkalische Phosphatase und das Substrat Nitroblau-tetrazolium-5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat oder ein Derivat oder Analog davon, oder das Substrat 4-Methylumbelliferylphosphat. Andere geeignete Sonden können beschrieben sein in US-Patent Nrn. 5,670,381 von Jou et al. und 5,252,459 von Tarcha, et al..
In einigen Ausführungsformen können die Sonden eine fluoreszierende Verbindung einschließen, welche ein nachweisbares Signal erzeugt. Die fluoreszierenden Verbindungen können fluoreszierende Moleküle, Polymere, Dendrimere, Partikel und dergleichen sein. Einige Beispiele geeigneter fluoreszierender Moleküle schließen z.B. ein, sind jedoch nicht limitiert auf: Fluoreszin, Europiumchelate, Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate sowie Analoge. Eine visuell nachweisbare, farbige Verbindung kann auch als Sonde verwendet werden, wodurch eine direkte farbige Auslese des Vorliegens oder der Konzentration des Analyten in der Probe zur Verfügung gestellt wird, ohne dass eine Notwendigkeit besteht für weitere signalerzeugende Reagenzien.
Die Sonden, wie oben beschrieben, können allein oder zusammen mit einem Mikropartikel verwendet werden (hier manchmal als "Bead" oder "Mikrobead") bezeichnet. Beispielsweise können natürlich vorkommende Mikropartikel, wie z.B. Kerne, Mikroplasma, Plasmide, Plastide, Säugetierzellen (beispielsweise Erythrocyte Ghosts), Einzeller-Mikroorganismen (beispielsweise Bakterien), Polysaccaride (beispielsweise Agarose) u. dgl. verwendet wer den. Desweiteren können auch synthetische Mikropartikel eingesetzt werden. Beispielsweise werden in einer Ausführungsform Latexmikropartikel, die gelabelt sind, mit einem fluoreszierenden oder gefärbtem Farbstoff eingesetzt. Obwohl jegliches Latexmikropartikel eingesetzt werden kann in der vorliegenden Erfindung, werden die Latexmikropartikel typischerweise aus Polystyrol, Butadien-Styrolen, Styrenacryl-Vinylterpolymere, Polymethacrylat, Polyethylmethacrylat, Styren-Maleinanhydrid Copolymer, Polyvinylacetat, Polyvinylpyridin, Polydivinylbenzen, Polybutylenterephthalat, Acrylonitril, Vinylchloridacrylaten u. dgl. oder einem Aldehyd, Carboxyl, Amino, Hydroxyl- oder Hydrazidderivaten davon hergestellt. Andere geeignete Mikropartikel können beschrieben werden in US-Patent Nrn. 5,670,381 von Jou, et al. und 5,252,459 von Tarcha, et al. Einige, kommerziell verfügbare Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Partikeln schließen ein fluoreszierende carboxylierte Mikrokugeln, verkauft von Molecular Probes, Inc. unter dem Handelsnamen "FluoSphere" (Red 580/605) und "TransfluoSphere" (543/620), die auch verkauft werden als "Texas Red" und 5- bzw. 6-Carboxytetramethylrhodamin. Kommerziell verfügbare Beispiele geeigneter, gefärbter Latex-Mikropartikel schließen caboxylierte Latex-Beads, verkauft von Bang's Laboratory, Inc. ein.
Wenn die Sonden Partikel sind, wie oben beschrieben, kann der mittlere Durchmesser der Partikel im allgemeinen je nach Bedarf variieren, abhängend von den Faktoren, wie z.B. dem Typus des gewählten Partikel, der Porengröße der Membran und der Membranzusammensetzung. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen der mittlere Durchmesser der speziellen Label von ungefähr 0,01 μm bis ungefähr 1000 μm reichen, in einigen Ausführungsformen von 0,01 μm bis ungefähr 100 μm und in einigen Ausführungsformen von ungefähr 0,001 μm bis ungefähr 10 μm. In einer speziellen Ausführungsform weisen die Partikel einen mittleren Durchmesser von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2 μm auf. Im allgemeinen sind die Partikel substantiell sphärisch in ihrer Form, obwohl andere Formen geeignet für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, einschließend, jedoch nicht limitiert auf plattenförmige Formen, stabförmige Formen, lattenförmige Formen, unregelmäßige Formen etc. Wie von den Fachleuten auf dem Gebiet eingesehen werden wird, kann die Zusammensetzung, Formgröße und/oder Dichte der Partikel weithin variieren.
Es ist gewünscht, die Sonden in gewisser Art und Weise zu modifizieren, so dass sie leichter in der Lage sind, an den Analyten zu binden. Die Sonden werden mit bestimmten spezifischen Bindungselementen modifiziert, welche daran angebunden sind, um Sondenkonju gate auszubilden. Spezifische Bindungselemente beziehen sich im allgemeinen auf ein Element eines spezifischen Bindungspaares, d.h. zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle chemisch und/oder physikalisch an das zweite Molekül bindet. Beispielsweise können immunoreaktive spezifisch bindende Elemente der Antigene einschließen, Haptene, Aptamere, Antikörper und Komplexe davon, einschließend diejenigen ausgebildet durch rekombinante DNA-Verfahren oder Peptid-Synthese. Ein Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein rekombinantes Protein oder eine Mischung (Mischungen) oder ein Fragment (Fragmente) davon, wie auch eine Mischung eines Antikörpers und anderer spezifischer bindender Elemente. Die Details der Herstellung solcher Antikörper und ihre eigenen zur Verwendung als spezifische Bindungselemente sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt. Andere allgemeine spezifische Bindungspaare schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nukleotidsequenzen (einschließend Sonden und einfangende Nukleinsäuresequenzen, die in DNA-Hybridisierungsassays verwendet werden, um eine Ziel-Nukleinsäuresequenz nachzuweisen), komplementäre Peptidsequenzen, einschließend diejenigen, ausgebildet durch rekombinante Verfahren, Effektor- und Rezeptor-Moleküle, Hormon- und hormonbindende Proteine, Enzym-Cofaktor und Enzyme, Enzym-Inhibitoren und Enzyme und dergleichen. Desweiteren werden spezifische Bindungspaare Elemente einschließen, welche Analoga der ursprünglichen spezifischen Bindungselemente sind. Beispielsweise kann ein Derivat oder Fragment des Analyten, d.h. ein Analyten-Analog, verwendet werden, so lange, als es zumindest ein Epitop gemeinsam mit dem Analyten aufweist.
Die spezifischen Bindungselemente können im allgemeinen an die Sonden angebunden werden unter Verwendung von irgendeiner einer Vielzahl von wohl bekannten Techniken. Beispielsweise kann das kovalente Anbinden von spezifischen Elementen an Sonden (beispielsweise Mikropartikel) realisiert werden unter Verwendung von Carboxy-, Amino-, Aldehyd-, Bromoacetyl-, Iodoacetyl-, Thiol-, Epoxy- und anderen reaktiven oder verbrückenden funktionellen Gruppen, wie auch freien Radikalresten sowie Radikal-Cationen, durch welche eine Proteinkopplungsreaktion realisiert werden kann. Eine Oberflächen-funktionelle Gruppe kann auch eingebracht werden als ein funktionalisiertes Co-Monomer, da die Oberfläche des Mikropartikel eine relativ hohe Oberflächenkonzentrationen von polaren Gruppen enthalten kann. Darüber hinaus sind in bestimmten Stellen, obwohl Mikropartikelsonden häufig nach der Synthese funktionalisiert werden, beispielsweise bei Poly-(Thiophenol), die Mikro partikel in der Lage, direkt kovalent verbrückt zu werden mit einem Protein, ohne dass eine weitere Modifikation notwendig ist. Beispielsweise wird unter Verweis auf 2 eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur kovalenten Konjugation einer Sonde illustriert. Wie dargestellt wird, ist der erste Schritt der Konjugation die Aktivierung von Carboxylgruppen auf der Sondenoberfläche unter Verwendung von Carbodiimid. In dem zweiten Schritt werden die aktivierten Carbonsäuregruppen umgesetzt mit einer Aminogruppe eines Antikörpers, um eine Amidbindung auszubilden. Die Aktivierung und/oder Antikörperkopplung kann in einem Puffer auftreten, wie z.B. Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (z.B. pH von 7,2) oder 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES) (z.B. pH von 5,3). Wie dargestellt ist, können die resultierenden Sonden dann beispielsweise mit Ethanolamin blockiert werden, um das Sondenkonjugat auszubilden. Neben dem kovalenten Binden werden andere Anbindungstechniken, wie z.B., physikalische Adsorption auch optional im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Nun wird erneut auf 1 Bezug genommen; die Vorrichtung 20 enthält auch die Detektions-/Kalibrationszone 31. Die Detektions-/Kalibrationszone 31 stellt im allgemeinen eine einzelne abgetrennte Detektions-/Kalibrationsregion zur Verfügung (beispielsweise eine Linie, ein Punkt, etc.), so dass ein Anwender akkurat die Konzentration eines speziellen Analyten innerhalb einer Testverbindung an einer Stelle entlang der Vorrichtung bestimmen kann. Beispielsweise wird in der illustrierten Ausführungsform eine einzelne Linie eingesetzt.
Darüber hinaus kann die Linie in einer Richtung angeordnet werden, welche substantiell senkrecht zum Fluss der Testvorrichtung durch die Vorrichtung 20 ist. Desweiteren kann in einigen Ausführungsformen die Linie in einer Richtung angeordnet sein, welche substantiell parallel zum Fluss der Testprobe durch die Vorrichtung 20 ist.
Die Nachweis-/Kalibrationszone 31 enthält eine oder mehrere immobilisierte Polyeelektrolyt-Einfangreagenzien, die in der Lage sind, an Sonden zu binden und zwar entweder direkt oder indirekt (d.h. an ein spezifisches Bindungselement, konjugiert an die Sonde an einen Analyten, komplexiert mit der Sonde etc.). In einigen Ausführungsformen wird ein erstes immobilisiertes Einfangreagenz konfiguriert, um an die Nachweissonden zu binden, während ein zweites Einfangreagenz konfiguriert wird, um an die Kalibrationssonden zu binden. Die ersten und zweiten immobilisierten Einfachreagenzien können die gleichen sein, oder sie können verschieden voneinander sein.
Allgemein gesagt können verschiedene Typen an einfachen Reagenzien immobilisiert werden innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform das Einfangreagenz identisch sein oder ausgebildet werden aus der gleichen Klasse oder Kategorie von Materialien (beispielsweise Antikörper, Antigene, Analoge davon, u.dgl.), wie die spezifischen Bindungselemente, die verwendet werden, um Konjugate der Sonden auszubilden. Folglich können in dieser Ausführungsform die Einfangreagenzien als eine stationäre Bindungsstelle für die Sonden dienen, wenn sie an einen Analyten gebunden werden. Genauer gesagt, kann der Analyt, wie z.B. ein Antikörper ein Antigen etc., zwei Bindungsstellen aufweisen. Nach Erreichen der Detektions-/Kalibrationszone 31 und Passieren durch das Konjugatfeld 22 wird eine dieser Bindungsstellen durch das spezifisch bindene Element belegt, dass an die Sonde konjugiert ist. Jedoch kann die freie Bindungsstelle des Analyten an das immobilisierte Einfangreagenz binden.
In einer anderen Ausführungsform kann das immobilisierte Polyelektrolyt-Einfang-Reagenz ein Polyelektrolyt sein, das an Sonden bindet und zwar direkt oder indirekt, durch ionische Wechselwirkung. Beispielsweise kann der Polyelektrolyt eine positive oder eine negative Nettoladung aufweisen, wie auch eine Nettoladung, die allgemein neutral ist. Einige Beispiele von Polyelektrolyten, die eine positive Nettoladung aufweisen, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Polylysin (kommerziell verfügbar von Sigma-Aldrich Chemical Co., Ltd. von St. Louis, Missouri), Polyethylenamin; Epichlorohydrin-funktionalisierte Polyamine und/oder Polyamidoamine, wie z.B. Poly(dimethylamin-Co-Epichlorhydrin); Polydiallyidimethyl-Ammoniumchlorid; kationische Zellulosederivate, wie z.B. Zellulosecopolymdere oder Zellulosederivate, aufgepfropft mit einem quaternären Ammonium-wasserlöslichen Monomer; u. dgl.. In einer speziellen Ausführungsform können CelQuat^® SC-230M oder H-100 (verfügbar von National Starch & Chemical, Inc.), welche Zellulosederivate sind, die quaternäre Ammonium-wasserlösliches Monomer enthalten, eingesetzt werden. Desweiteren sind einige geeignete Beispiele von Polyelektrolyten, welche eine negative Nettoladung aufweisen, solche, die Polyacrylsäuren einschließen, wie z.B. Poly(ethylen-Co-Methacrylsäure, Natriumsalz) u. dgl., aber nicht darauf limitiert sind. Es sollte sich auch verstehen, dass andere Polyelektrolyte auch in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, wie z.B. amphiphile Polyelektrolyte (d.h. solche mit polaren und nicht polaren Abschnitten). Beispielsweise schließen einige Beispiele von geeigneten amphiphilen Polyelektrolyten Poly(stryryl-b-N-methyl 2-Vinyl Pyridiumiodid) und Poly(styryl-b-Acrylsäure) ein, sind jedoch nicht limitiert darauf, wobei beide davon verfügbar sind von Polymer Source, Inc. aus Dorval, Kanada.
Obwohl jegliches Polyelektrolyt im allgemeinen eingesetzt werden kann, kann das Polyelektrolyt, ausgewählt für spezielle Anwendungen je nach Natur der Sonden variieren, je nach spezifischen Bindungselementen, dem Analyt von Interesse, dem Typ der porösen Membran u. dgl.. Insbesondere ermöglicht die Ladungsverteilung des Polyelektrolyten, dass er an Substanzen bindet, welche entgegengesetzte Ladungen aufweisen. Folglich sind Polyelektrolyte, welche beispielsweise eine positive Ladung aufweisen, häufig besser ausgerüstet, um mit Sonden zu binden, welche negativ geladen sind, wohingegen Polyelektrolyte, welche eine negative Nettoladung aufweisen, häufig besser ausgerüstet sind, um an Sonden zu binden, welche positiv geladen sind. Folglich ermöglicht in solchen Fallen die ionische Wechselwirkung zwischen diesen Molekülen das erforderliche Binden, so dass es innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 auftritt. Nichtsdestotrotz, können, obwohl ionische Wechselwirkungen in erster Linie eingesetzt wird, um das gewünschte Binden zu erzielen, Polyelektrolyte auch mit Sonden binden, welche eine ähnliche Ladung aufweisen.
Da der Polyelektrolyt so konzipiert ist, dass er an Sonden bindet, ist typischerweise gewünscht, dass der Polyelektrolyt substantiell nicht diffusiv immobilisiert ist auf der Oberfläche der porösen Membran 23. Folglich können die Polyelektrolyte angewandt werden auf die poröse Membran 23 in solch einer Art und Weise, dass die Polyelektrolyte nicht substantiell in die Matrix der porösen Membran 23 diffundieren. Insbesondere bilden die Polyelektrolyte typischerweise eine ionische und/oder kovalente Bindung mit funktionellen Gruppen aus, die auf der Oberfläche der porösen Membran 23 vorliegen, so dass sie darauf immobilisiert verbleiben. Obwohl dies nicht notwendig ist, kann die Ausbildung von kovalenten Bindungen zwischen den Polyelektrolyten und der porösen Membran 23 gewünscht sein, um permanenter den Elektrolyten darauf zu immobilisieren.
Beispielsweise werden in einer Ausführungsform die Monomere, welche eingesetzt werden, um den Polyelektrolyten auszubilden, zunächst in einer Lösung ausgebildet und dann direkt auf die poröse Membran 23 aufgebracht. Verschiedene Lösungsmittel (beispielsweise organische Lösungsmittel, Wasser etc.), können eingesetzt werden, um die Lösung auszubilden. Sobald sie aufgebracht wurden, wird die Polymerisierung der Monomere ausgelöst unter Verwendung von Hitze, Elektronenbestrahlung, freier Radikalpolymerisierung u. dgl. In einigen Fällen bilden, wenn die Monomere polymerisieren, diese kovalente Bindungen mit bestimmen funktionellen Gruppen der porösen Membran 23 aus, wodurch die resultierenden Polyelektrolyte darauf immobilisiert werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform ein Ethylenaminmonomer eine kovalente Bindung mit einer Carboxylgruppe ausbilden, die auf der Oberfläche von einigen porösen Membranen vorliegt (beispielsweise Nitrozellulose).
In einer weiteren Ausführungsform kann der Polyelektrolyt ausgebildet werden vor der Anwendung auf die poröse Membran 23. Falls gewünscht, kann der Polyelektrolyt zunächst ausgebildet werden in eine Lösung unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln, Wasser u. dgl.. Anschließend wird die Polyelektrolytlösung direkt auf die poröse Membran 23 angewandt und anschließend getrocknet. Nach dem Trocknen kann der Elektrolyt, wie oben beschrieben, eine Ionenbindung ausbilden mit bestimmten funktionellen Gruppen, die auf der Oberfläche der porösen Membran 23 vorliegen, und eine Ladung aufweisen, die entgegengesetzt zu derjenigen des Polyelektrolyten ist. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform positiv geladenes Polyethylenamin eine Ionenbindung mit negativ geladenen Carboxylgruppen ausbilden, die auf der Oberfläche von einigen porösen Membranen vorliegen (beispielsweise Nitrozellulose).
Darüber hinaus kann der Polyelektrolyt auch quer vernetzt sein mit einer porösen Membran 23 unter Verwendung verschiedener wohl bekannter Techniken. Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen Epichlorhydrin-funktionalisierte Polyamine und/oder Polyamidoamine eingesetzt werden als ein quer vernetzbarer, positiv geladener Polyelektrolyt. Beispiele von diesen Materialien werden beschrieben in US-Patent Nrn. 3,700,623 von Keim; 3,772,076 von Keim; und 4,537,657 von Keim, wobei davon ausgegangen wird, dass diese verkauft werden von Hercules, Inc., Wilmington, Del. unter der Kymene^TM Handelsbezeichnung. Beispielsweise sind Kymene^TM 450 und 2064 Epichlorhydrin-funktionalisierte Polyamine und/oder Polyamidoamin-Verbindungen, welche Epoxidringe und quaternäre Ammoniumgruppen enthalten, welche kovalente Bindungen mit Carboxylgruppen ausbilden können, die auf bestimmten Typen von porösen Membranen (beispielsweise Nitrolzellulose) vorliegen und mit dem Polymerrückgrat der porösen Membran beim Aushärten quer vernetzen. In einigen Ausführungsformen kann die Quervernetzungstemperatur von ungefähr 50°C bis ungefähr 120°C reichen und die Quervernetzungszeit kann von ungefähr 10 bis ungefähr 600 Sekunden reichen.
Obwohl verschiedene Techniken für nicht diffusive immoobilisierende Polyelektrolyte auf der porösen Membran 23 oben beschrieben wurden, sollte sich verstehen, dass irgendwelche anderen Techniken für nicht diffusiv immobilisierende Polyelektrolyt-Verbindungen in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Tatsächlich sind die oben genannten Verfahren nur dazu gedacht, Beispiele für die Techniken darzustellen, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise können in einigen Ausführungsformen bestimmte Verbindungen zu der Polyelektrolytlösung hinzugefügt werden, welche substantiell die Diffusion von solchen Polyelektrolyten in die Matrix der porösen Membran 23 inhibieren können.
Im allgemeinen kann eine Vielzahl von Durchflussassay-Vorrichtungen konstruiert werden entsprechend der vorliegenden Erfindung. In dieser Hinsicht werden nun verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im größeren Detail beschrieben werden. Es sollte sich verstehen, dass jedoch die Ausführungsformen, wie die unten diskutierten, exemplarisch sind und dass andere Ausführungsformen durch die vorliegende Erfindung auch ins Auge gefasst sind. Beispielsweise wird unter Verweis auf 3 eine spezielle Ausführungsform gezeigt, in welcher Sonden 41 verwendet werden zum Nachweis und Sonden 43 verwendet werden für die Kalibration. In dieser Ausführungsform werden die Detektionssonden 41 auf das Konjugatfeld 22 angewandt und sind folglich in der Lage, durch die Vorrichtung 20, (wie durch den gerichteten Pfeil L angezeigt), zu schließen, wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die Nachweissonden (Detektionssonden) 41 werden konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement 90 für einen Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran binden, um Analyten/Sonden-Komplexe 49 auszubilden. Die Analyten/Sonden-Komplexe 49 können dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen.
Innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 wird ein Polyelektrolyt-Einfangreagenz immobilisiert (nicht gezeigt) zum Binden an die Kalibrationssonden 43 durch ionische Wechselwirkungen. In dieser Ausführungsform werden die Kalibrationssonden 43 auf dem Polyelektrolyten immobilisiert, bevor die Testprobe angewandt wird. Die Kalibrationssonde 43 kann beispielsweise einschließen Latex-Mikropartikel, konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement 91 (beispielsweise Antikörper, Antigene etc.). An der Detektions-/Kalibrationszone 31 können die Analyt-Sondenkomplexe 49 an das spezifische Bindungselement 91 der Kalibrationssonden 43 binden, um einen Sandwichkomplex 50 auszubilden. Jegliche Art von ungebundenen Sonden 41 wird durch die Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Falls gewünscht, kann die Menge des Polyelektrolyt-Einfangreagenzes predetermi niert werden, so dass das Kalibrationssignal innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 ihr vollständiges und vorherbestimmtes Potential für die Signalintensität erreicht. Das heißt, die Menge der Sonden 43, welche abgeschieden werden, ist vorherbestimmt, da die Menge des eingesetzten Polyelektrolyten auf ein vorherbestimmtes und bekanntes Niveau gesetzt ist.
Sobald es möglich ist, dass es sich vollständig entwickelt, kann das Intensitätsniveau der Sonden 43 verwendet werden, um das Intensitätsniveau der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 zu kalibrieren, um die Menge des Analyten zu bestimmen, die in der Testprobe vorliegt. Dieser Kalibrationsschritt kann visuell erscheinen, unter Zuhilfenahme einer Lesevorrichtung oder unter Verwendung anderer Techniken. Beispielsweise kann eine Ausführungsform der Sonden 41 und 43 gelabelt sein mit Fluoreszenz-erzeugenden Verbindungen, so dass die Signalintensität der Sonden 41 und 43 gemessen werden kann unter Verwendung von konventionellen Techniken. Beispielsweise können in einer Ausführungsform die Sonden 41 und 43 angeregt werden mit der gleichen äußeren Probe. In dieser Ausführungsform liefert die Quelle Strahlung bei einer Anregungswellenlänge, wodurch verursacht wird, dass die Sonden 41 Licht bei einer Wellenlänge emittieren, die unterschiedlich ist von der Wellenlänge, emittiert durch die Sonden 43. Dies ermöglicht, dass die Sonden 41 und 43 getrennt voneinander gemessen werden können. Alternativ können die Sonden 1 und 43 auch untereinander getrennt gemessen werden unter Verwendung von getrennten äußeren Quellen.
Allgemein gesagt ist die Fluoreszenz das Ergebnis eines dreistufigen Prozesses, welche in bestimmten Fluoreszenzverbindungen auftritt. Im ersten Stadium wird die Energie durch eine äußere Quelle zugeführt, beispielsweise durch eine Glühlampe oder einen Laser und wird absorbiert durch die fluoreszierende Verbindung, wodurch ein angeregter elektronischer Singulett-Zustand erzeugt wird. In dem zweiten Stadium existiert der angeregte Zustand für eine begrenzte Lebensdauer, über weichen hinweg die fluoreszierende Verbindung konformatorischen Veränderungen unterzogen wird und auch einer Vielzahl von möglichen Wechselwirkungen mit seiner molekularen Umgebung. Während dieser Zeit wird die Energie des angeregten Zustandes teilweise abgeführt, was zu einem relaxierten Zustand führt, von welchem die Fluoreszenzemission ausgeht. Das dritte Stadium ist das Fluoreszenz-Emissionsstadium, in welchem Energie emittiert wird, was zur Rückkehr der fluoreszierenden Verbindung in ihren Grundzustand führt. Die Energie, die emittiert wird, ist geringer als die Anregungen aus Energie (Licht oder Laser) und folglich von einer längeren Wellenlänge. Diese Verschiebung oder der Unterschied an Energie oder Wellenlänge ermöglicht, dass die Emissionsenergie nachgewiesen werden kann und von der Anregungsenergie isoliert werden kann.
Der Fluoreszenznachweis setzt im allgemeinen Wellenlängenfilter ein, um die Emissionsphototonen von den Anregungsphotonen zu isolieren, sowie einen Detektor, welcher die Emissionsphotonen registriert und eine aufzeichenbare Ausgabe erzeugt, üblicherweise in Form eines elektrischen Signals oder eines fotografischen Bildes. Es gibt im allgemeinen vier anerkannte Typen von Detektoren: Spektrofluorometer und Mikroplatten-Lesegeräte; Fluoreszenz-Mikroskope; Fluoreszenz-Scanner; und Durchfluss-Cytometer. Ein geeigneter Fluoreszenz-Detektor für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung ist ein FluoroLog III Spektrofluorometer, welches verkauft wird durch SPEX Industries, Inc. of Edison, New Jersey.
Obwohl nicht notwendig, schließen die Auswahlkriterien von speziell gewünschten Nachweis- und Kalibrationssonden-Paaren das folgende ein: (1) wenig oder keinen spektralen Überlapp für entweder die Absorptionsspektren oder die Fluoreszenzspektren, so dass die Emissionsintensitäten separat voneinander gemessen werden können; (2) keine signifikanten Fluoreszenz-Energietransfere zwischen den Nachweis- und Kalibrationssonden, wenn sie in eine enge Nähe gebracht werden, so dass sie voneinander unabhängig emittieren können; und (3) relativ lange Emissionswellenlängen (beispielsweise mehr als 600 nm) so dass die Autofluoreszenz von biologischen Flüssigkeiten einen minimalen Effekt auf die Fluoreszenzmessung nimmt.
Desweiteren können, falls gewünscht, Techniken, die als "zeitaufgelöste Fluoreszenz-Detektion" bekannt sind, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Detektion ist so konzipiert, dass Hintergrundsignale von der Emissionsquelle oder von Streuprozessen (die vom Streuen der Anregungsstrahlung resultieren) reduziert werden, dadurch, dass die Vorteile der Fluoreszenz-Charakteristiken bestimmter fluoreszierender Materialien, wie z.B. Lanthanid-Chelaten von Europium (Eu (III)) und Terbium (Tb (III)) ausgenutzt werden. Solche Chelate können stark rot-verschobene langlebige Emission von enger Bandbreite nach Anregung des Chelats mit einer substantiell kürzeren Wellenlänge zeigen. Typischerweise besitzt das Chelat eine stark ultraviolette Absorptionsbande aufgrund eines Chromophors, der nahe an dem Lanthanid in den Molekülen lokalisiert ist.
Nachfolgend auf die Lichtabsorption durch den Chromophor kann die Anregungsenergie von dem angeregten Chromophor zum Lanthanid übertragen werden. Darauf folgt die Fluoreszenzemissions-Charakteristik des Lanthaniden. Die Verwendung einer pulsierten Anregung und einer gegateten Zeitdetektion, in Kombination mit Emissionsfiltern von enger Bandbreite ermöglicht die spezifische Detektion der Fluoreszenz nur aus dem Lanthaniden und das Ausblenden von Emission anderer Spezies, die in der Probe vorliegen, welche typischerweise kurzlebiger sind, oder kürzere Wellenlängenemission haben. Andere zeitaufgelöste Techniken zum Messen der Fluoreszenz werden geschrieben im US-Patent Nr. 5,585,279 von Davidson und 5,637,509 von Hemila, et al.
Unabhängig von der Technik, die verwendet wird, um die Signalintensität der Sonden 41 und 43 zu messen, wurde entdeckt, dass die Verwendung einer einzelnen Detektions-/Kalibrationszone 31 die Detektions- und Kalibrationssonden 41 und 43 in die Lage versetzen kann, dass sie an der gleichen Stelle der Vorrichtung 20 gemessen werden können. Dieser Ansatz, der "Einzelmessungsstelle" stellt einen einfachen und attraktiven Ansatz für Anwender der Assayvorrichtung zur Verfügung, insbesondere für diejenigen, die konzipiert sind für Heim- und Gesundheitsfragen-Anwendungen.
An der Detektions-/Kalibrationszone 31 kann die Menge des Analyten von der Signalintensität der Nachweissonden 41 sichergestellt werden, die durch die Signalintensität der Kalibrationssonden 43 kalibriert sind. Genauer gesagt, wird die Gesamtmenge der Sonden 43 vorherbestimmt und ist bekannt und kann folglich für Kalibrationszwecke eingesetzt werden. Folglich ist die Menge von Analyten in der Testprobe direkt proportional zu I_S (Signalintensität der Sonde 41), wohingegen die Signalintensität der Sonden 43, I_C, relativ konstant bleiben sollte, unabhängig vom Vorliegen des Analyten. Basierend auf der Intensitätsverteilung, in welche dieser kalibrierte Wert fällt, kann der allgemeine Konzentrationsbereich für den Analyten bestimmt werden. Als ein Ergebnis kann Kalibration und Probentests durchgeführt werden unter ungefähr den gleichen Bedingungen zur gleichen Zeit, wodurch verlässliche quantitative Ergebnisse bereitgestellt werden mit zunehmender Sensitivität.
Falls gewünscht, kann das Verhältnis von I_S zu I_C geplottet werden gegen die Analytenkonzentration für einen Bereich von bekannten Analyten-Konzentrationen, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen. Um die Menge des Analyten in einer unbekannten Testprobe zu bestimmen, kann das Signalverhältnis dann in eine Analytenkonzentration konvertiert werden entsprechend der Kalibrationskurve. Es sollte festgehalten werden, dass alternative mathematische Beziehungen zwischen I_S und I_C aufgetragen werden können gegen die Analytenkonzentration, um die Kalibrationskurve zu erzeugen. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform der Wert von I_S/(I_S + I_C) aufgetragen werden gegen die Analytenkonzentration um die Kalibrationsgruppe zu erzeugen.
Nun wird unter Bezugnahme auf 4 eine weitere Ausführungsform gezeigt, in welcher die Sonden 41 zum Nachweis und die Sonden 43 zur Kalibration eingesetzt werden. Die Detektionssonden 41 werden auf das Konjugatfeld 22 angewandt und sind daher in der Lage, durch die Vorrichtung 20 zu fließen, (wie durch den gerichteten Pfeil L angezeigt wird), wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die Detektionssonden 41 sind konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement 40 für einen Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonde 41 daran bindet, um Analyt/-Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die Analyt-/Sondenkomplexe 49 können dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen. Die Kalibrationssonden 43 sind immobilisiert innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 über ein Polyelektrolyt-Einfangreagenz. Beispielsweise können die Kalibrationssonden 43 gelabelte Mikropartikel einschließen, Polymere oder Moleküle, welche an den Polyelektrolyt durch ionische Wechselwirkung binden. Darüber hinaus wird ein spezifisches Bindungselement 41 (beispielsweise ein Antikörper, Antigen etc.) auch separat immobilisiert innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31. Basierend auf der Natur der Nachweissonden 41 binden weder die Komplexe 49, noch ungebundene Sonden 41 an das Polyelektrolyteinfangreagenz. Stattdessen binden die Analyt-/Sondenkomplexe 49 an das spezifische Bindungselement 91, um Komplexe 50 auszubilden und jegliche ungebundene Sonden 41 fließen durch die Detektions-/Kalibrationssonde 31. Sobald die vollständige Entwicklung ermöglicht wird, kann das Identitätssignal I_S der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationssonde 31 so bestimmt werden, dass die Menge des Analyten, der in der Testprobe vorliegt, berechnet werden kann. In dieser Ausführungsform ist die Menge des Analyten in der Testprobe direkt proportional zu I_S. Darüber hinaus kann das Identitätssignal I_C der Kalibrationssonden 43 auch verwendet werden, um I_S zu kalibrieren. Beispielsweise kann das Verhältnis von I_S zu I_C gegen die Analyten-Konzentration über einen Bereich von bekannten Analyten-Konzentrationen aufgetragen werden, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen. Nun wird auf 5 Bezug genommen, in der noch eine weitere Ausführungsform gezeigt ist, in welcher Sonden 41 zum Nachweis und Sonden 43 zu Kalibration verwendet werden. Die Nachweissonden 41 und die Kalibrationssonden 43 werden auf das Konjugatfeld 22 angewandt und sind folglich in der Lage, durch die Vorrichtung 20 zu fließen (wie durch den gerichteten Pfeil L angezeigt wird), wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die Detektionssonden 41 sind konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement 90 für einen Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran binden, um Analyten-/Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die Analyten-/Sondenkomplexe können dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen. Ein Polyelektrolyt ist innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 immobilisiert zum selektiven Binden mit den Kalibrationssonden 43 (beispielsweise gelabelte Mikropartikel, Polymere oder Moleküle) durch ionische Interaktion. Im einzelnen können die Sonden 43 in ihrer Größe kleiner sein, als die Sonden 41, so dass sie an der Detektions-/Kalibrationszone 31 vor den Sonden 41 ankommen und alle Bindungsplätze bereitgestellt durch den Polyelektrolyten belegen. Alternativ können die Ladungen der Sonden 41 und 43 so sein, dass nur die Sonden 43 an den Polyelektrolyten binden. In jedem Fall wird auch ein spezifisches Bindungselement 91 (beispielsweise Antikörper, Antigen, etc.) separat innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 immobilisiert. An der Detektions-/Kalibrationszone 31 können die Analyt-/Sondenkomplexe 49 an das spezifische Bindungselement 91 binden, um Komplexe 50 auszubilden. Jegliche nicht gebundene Sonden 41 werden durch die Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Sobald es möglich ist, dass es sich vollständig entwickelt, kann das Intensitätssignal I_S der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 bestimmt werden, um die Menge des Analyten, die in der Testprobe vorliegt, zu berechnen. In dieser Ausführungsform ist die Menge des Analyten in der Testprobe direkt proportional zu I_S. Darüber hinaus kann das Intensitätssignal I_C der Kalibrationssonden 43 auch verwendet werden, um I_S zu kalibrieren. Beispielsweise kann das Verhältnis von I_S zu I_C gegen die Analytenkonzentration geplottet werden über einen Bereich von bekannten Analytkonzentrationen, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen.
In einigen Ausführungsformen kann die Vorrichtung 20 zusätzliche Zonen enthalten, welche hilfreich bei der Detektion des Analyten von Interesse sind. Beispielsweise kann, wie in 6 gezeigt, die Vorrichtung 20 eine Einfangzone 33 enthalten, welche stromaufwärts von der Detektions-/Kalibrationszone 31 positioniert ist. Die Einfangzone 33 enthält ein erstes Einfangreagenz, das entweder spezifisch für die Detektions- oder Kalibrationssonden ist. Beispielsweise werden in der illustrierten Ausführungsform Detektionssonden 41 auf das Konjugatfeld 22 aufgebracht und sind folglich in der Lage, durch die Vorrichtung 20 zu fließen, wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die Testproben 41 können mit einem spezifischen Bildungselement 90 für einen Analyten A konjugiert werden, so dass der Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran binden, um Analyt-/Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die Analyt-/Sondenkomplexe 49 können dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Einfangzone 33 erreichen. Spezifische Bindungselemente 91, wie z.B. ein Antikörper oder Antigen, welche mit dem Analyten A korrespondiert, sind innerhalb der Einfangzone 33 immobilisiert. Folglich können an der Einfangzone 33 die Analyt-/Sondenkomplexe 49 an die spezifischen Bindungselemente 91 binden, die darauf immobilisiert sind, um die Komplexe 50 auszubilden.
Alle ungebundenen Sonden 41 werden dann zur Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. In dieser Ausführungsform ist auf ein zweites Einfangreagenz (beispielsweise ein Polyelektrolyt) immobilisiert innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31, die in der Lage ist, an alle ungebundenen Sonden 41 durch ionische Wechselwirkung zu binden. Desweiteren können die Kalibrationssonden 43 auch immobilisiert sein, auf dem zweiten Einfangreagenz innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31. Beispielsweise können die Kalibrationssonden 43 Latex-Mikropartikel einschließen, die auch an den Polyelektrolyten durch ionische Wechselwirkung binden.
Sobald es möglich ist, dass es sich vollständig entwickelt, kann das Intensitätssignal I_S der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 bestimmt werden, um die Menge des Analyten, die in der Testprobe vorliegt, zu bestimmen. In dieser Ausführungsform ist die Menge des Analyten in der Testprobe indirekt proportional zu I_S. Darüber hinaus kann die Signalintensität I_C der Kalibrationssonden 43 auch verwendet werden, um I_S zu kalibrieren. Beispielsweise kann das Verhältnis von I_S zu I_C aufgetragen werden gegen die Analyt-Konzentration über einen Bereich von bekannten Analyt-Konzentration, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen. Um die Menge des Analyten in einer unbekannten Testprobe zu bestimmen, kann dann der Signalanteil in die Analyten-Konzentration entsprechend der Kalibrationskurve konvertiert werden. Es sollte festgehalten werden, als alternative mathematische Beziehungen zwischen I_C und I_S gegen die Analyten-Konzentration aufgetragen werden können, um die Kalibrationskurve zu erzeugen.
Obwohl verschiedene Ausführungsformen von Assay-Konfigurationen oben beschrieben wurden, sollte sich verstehen, dass ein Assay der vorliegenden Erfindung im allgemeinen jegliche Art von Konfiguration aufweisen kann, die gewünscht wird, um nicht alle Komponenten, wie oben beschrieben, enthalten muss. Desweiteren können auch andere wohl bekann te Komponenten von Assays, auf die hier nicht spezifisch Bezug genommen wird, auch in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise werden verschiedene Assay-Konfigurationen beschrieben in US-Patent-Nrn. 5,395,754 von Lambotte, et al.; 5,670,381 von Jou et al.: und 6,194,220 von Malick, et al. Darüber hinaus sollte sich auch verstehen, dass kompetitive Assays auch entsprechend der vorliegenden Erfindung ausgebildet werden können. Techniken und Konfigurationen von kompetitiven Assays sind den Fachleuten auf dem Gebiet auch wohl bekannt.
In einem Beispiel kann die Durchflussvorrichtung 20, wie oben beschrieben, und in 3 illustriert, leicht modifiziert werden, um einen kompetitiven Assay auszubilden. In dieser Ausführungsform können die Detektionssonden 41 ein Analyt oder Analytanalog sein, wohingegen die Kalibrationssonden 43 beispielsweise Latex-Mikropartikel einschließen können, konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement für den Analyt von Interesse. Wenn die Testprobe aufgebracht wird, wandern die Detektionssonden durch die poröse Membran 23, bis sie die Detektions-Kalibrationszone 31 erreichen. An der Zone 31 konkurrieren die Sonden 41 und jegliche Art von Analyt A innerhalb der Testprobe, um das spezifische Bindungselement 91 (beispielsweise Antikörper, Antigen etc.). Jegliche ungebundene Sonden 41 werden durch die Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Diese Ausführungsform ist die Menge des Analyten in der Testprobe umgekehrt proportional zu I_S (Signalintensität der Sonden 41). Falls gewünscht, kann das Verhältnis von I_S zu I_C (Signalintensität der Proben 43) gegen die Analytkonzentration aufgetragen werden über einen Bereich von bekannten Analytkonzentrationen, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden unter Verweis auf die folgenden Beispiele.
BEISPIEL 1
Die Fähigkeit einer inneren Detektions-/Kalibrationszone der vorliegenden Erfindung, einen Sandwich-Assay zu kalibrieren, wurde demonstriert. Anfangs wurden HF-120 Membranproben, die porös waren, auf korrespondierende Unterlagenkarten laminiert, welche eine Länge von ungefähr 30 cm aufwiesen. Fluoreszentbeads (Kalibrationssonden) wurden erhalten von Molecular Probes, Inc., und diese hatten eine Partikelgröße von 0,2 μm und Anregungs-/Emissionswellenlängen von 505/515 nm. Die Beads wurden gewaschen und gelagert in einem Speicherpuffer bei 0,28 Gew.-%. 40 Mikroliter an fluoreszierender Bead-Lösung wur den gemischt mit 10 Mikrolitern mit einer Polylysinlösung und auf die Membran abgestreift, um die Detektions-/Kalibrationslinie auszubilden. Der monoklonale Antikörper CRP Mab 5804 mit einer Konzentration von 2,36 mg pro ml (erhalten von Biogenesis, Inc.) wurde immobilisiert auf den porösen Membranproben, um eine Einfanglinie auszubilden. Die Membranproben wurden anschließend für eine Stunde bei einer Temperatur von 37°C getrocknet. Ein dochtartiges Feld aus Zellulosefasern (Millipore Co.) wurde an ein Ende der Membran angebunden und in 4 mm Streifen geschnitten.
Die halbstabförmigen Proben wurden in verschiedene Mikrowells platziert, in welchen Mischungen von fluoreszierenden Beads (Nachweissonde) und unterschiedliche Konzentrationen von CRP-Antigenen enthalten waren. Die Menge der fluoreszierenden Beads war die gleiche für jede Mischung, d.h. 4 mg. Die fluoreszierenden Detektionsbeads wurden wie folgt ausgebildet. Ursprünglich wurde Polystyren-Beads mit funktionalisierten Carboxylgruppen (erhalten von Molecular Probes, Inc.) bereitgestellt. Diese Beads hatten eine Partikelgröße von 0,5 μm und Anregungs-/Emissionswellenlängen von 580/605 nm. 100 ml der Polystyren-Beads (2% Konzentration) wurden 2 × gewaschen mit MES-Puffer und mit einer Zentrifuge abgetrennt. Die ausgefällten Beads wurden erneut aufgelöst in 100 ml an MES-Puffer und gemischt mit 50 ml an MES-Puffer enthaltend 4 mg an Carbodiimid (von Polysciences, Inc.). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten auf einem Schüttler umgesetzt. Die aktivierten Beads wurden dann zweimal mit einem Borat-Puffer gewaschen. Die aktivierten Beads wurden in 200 ml an Borat-Puffer re-suspendiert und mit 15 ml an monoklonalem Antikörper von C-reaktivem Protein (CRP Mab 5811 von Biogenesis, Inc.) vermischt mit einer Konzentration von 6,4 mg pro Milliliter. Man ließ die Reaktion über Nacht ablaufen mit einem Schüttler bei Raumtemperatur. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann mit 100 ml an Ethanolamin für 15 Minuten mit einem Schüttler vermischt. Die überstehende Lösung wurde verworfen und die Beads wurden zweimal gewaschen mit einem PBS-Puffer und bei 4°C in einem Speicherpuffer gelagert, welche 0,1 molares PBS, 0,15 molare NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol und 0,1% NaN₃ erzielt, um in konjugierten Beads zu münden von einer Konzentration von 4 mg/ml.
Die Fluoreszenz-Intensität wurde dann gemessen bei der Detektions-/Kalibrationslinie unter Verwendung eines Fluorolog III Spectrofluoremeter (SPEX industries; Inc., Edison, NJ) in einem rechtwinkligen Modus. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt, wobei I_S die Signal intensität repräsentiert der Detektionssonden an der Detektionskalibrationslinie und I_C die Signalintensität der Kalibrationssonden und der Detektionskalibrationslinie repräsentiert. Tabelle 1: Signal-Intensitätsergebnisse

Analyt (ng/ml) I_C I_S/I_C

0 400 1258

33 426 1068

66 450 971

189 470 860

378 50 822

756 470 564
Wie aus den Ergebnissen oben evident wird, bewegten sich, wenn kein Analyt in der Probe vorlag, die Detektionssonden so, dass sie die Einfanglinie überquerten und sie wurden auf der Detektions-/Kalibrationslinie eingefangen. Wenn der Analyt in der Probe vorlag, komplexierten die Detektionssonden mit dem Analyten und wurden auf der Einfanglinie eingefangen, wobei jegliche verbleibende Detektionssonden von der Detektions-/Kalibrationslinie eingefangen wurden. Daher war die Intensität der Detektionssonden (I_S) auf der Direktions /Kalibrationslinie umgekehrt proportional zur Anaytenkonzentration, wohingegen die Intensität (I_C) der Kalibrationssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie relativ konstant für unterschiedliche Analytkonzentrationen blieb, d.h. ungefähr ~444 ± 27. Variationen von I_C traten vermutlich aufgrund von variierter Umgebung, Assaybedingungen und instrumenteller Instabilität auf. Jedoch ist zu erwarten, dass die Variation einen ähnlichen Effekt auf I_S aufwies. Daher sollte I_S/I_C ein akkurates Ergebnis in diesem Fall liefern.
BEISPIEL 2
Die Fähigkeit einer inneren Detektions-/Kalibrationszone der vorliegenden Erfindung, einen Sandwich-Assay zu kalibrieren, wurde demonstriert. Ursprünglich wurden verschiedene poröse HF 120 Membranproben auf korrespondierenden Unterlagenkarten laminiert, welche eine Länge von ungefähr 30 cm hatten. Fluoreszierende Polymere (Kalibrationssonden) wurden dann wie folgt ausgebildet. Ursprünglich wurden 0,5 g an Polyacrylsäure (MW = 450.000 D.P. = 6250) in 20 ml an Methanol aufgelöst. 3,8 mg an Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 1 ml an Methanol wurden zur Lösung hinzugegeben, um das Polyacrylsäure polymer zu aktivieren. Die resultierende Lösung wurde für 30 Minuten gerührt. Eine Lösung von fluoreszierendem Farbstoff wurde erstellt durch Auflösen von 10 mg von 5-(und-6)-((N-(5-Aminopentyl)amino)-carbonyltetramethylrhodamin (Anregungs-/Emissionswellenlängen von 544/590 Nanometer, Molecular Probes, Inc.) in 1 ml an Methanollösung. Die Farbstofflosung wurde zur aktivierten Polyacrylsäurelösung hinzugegeben und gerührt. Die Reaktion wurde für weitere 24 Stunden fortgeführt bei Raumtemperatur mit einer Aluminiumfolie, gewickelt um die Lösung. Nachdem die Reaktion angehalten worden war, wurde Diethylether hinzugegeben, um ein Präzipitat auszubilden. Das Präzipitat wurde zentrifugiert und in Ethanol aufgesogen, um jeglichen nicht reagierten Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen. Nach Entfernen der Ethanollösung wurde das verbleibende rote Gel an Luft getrocknet.
Die fluoreszierenden Polymere (Kalibrationssonden), wie oben beschrieben, wurden dann in Wasser aufgelöst und vermischt mit CelQuat^® 100-H (ein Zellulose-basiertes Polyelektrolytderivat verfügbar von National Starch & Chemical, Inc.). Diese Mischung wurde auf die Membran abgestreift, um eine Detektions-/Kalibrationslinie auszubilden. Monoklonaler Antikörper CRP Mab 5811 mit einer Konzentration von 6,4 mg pro ml (erhalten von Biogenesis, Inc.) wurde immobilisiert auf den porösen Membranproben, um eine Einfanglinie auszubilden. Die Membranproben wurden dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur von 37°C getrocknet. Ein dochtartiges Feld aus Zellulosefaser (Millipore Co.) wurde an ein Ende der Membran angebunden und in 4 mm-Streifen geschnitten.
Die halben Stabproben wurden in verschiedene Mikrowells eingebracht, in welchen Mischungen von fluoreszierenden Beads (Detektionssonden) und unterschiedliche Konzentrationen von CRP-Antigen enthalten waren. Die Menge der fluoreszierenden Beads (Detektionssonden) war für jede Mischung gleich, d.h. 4 Mikrogramm. Die fluoreszierenden Beads (Nachweissonden) wurden wie folgt ausgebildet. Anfangs wurden Polystyrenbeads mit funktionellen Carboxylgruppen (erhalten von Molecular Probes, Inc.) vorgelegt. Die Beads wiesen eine Partikelgroße von 0,2 μm auf und Anregungs-/Emissions-Wellenlängen von 505/515 nm. 100 Mikroliter der Polystyrenbeads (2% Konzentration) wurden zweimal mit MES-Puffer gewaschen und mit einer Mikrozentrifuge abgetrennt. Die ausgefällten Beads wurden re-suspendiert in 200 μl von MES-Puffer und mit 20 μl an MES-Puffer vermischt, welcher 4,8 mg an Carbodiimid enthielt (von Polysciences, Inc.). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten in einem Schüttler umgesetzt. Die aktivierten Beads wurden dann zweimal mit einem Boratpuffer gewaschen. Die aktivierten Beads wurden re suspendiert in 200 μl an Boratpuffer und mit 90 μl an monoklonalen Antikörpern von C-reaktivem Protein re-suspendiert (CRP Mab 5804 von Biogenisis, Inc.) mit einer Konzentration von 2,36 mg pro ml. Man ließ die Reaktion über Nacht in einem Schüttler bei Raumtemperatur weiterlaufen. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann mit 100 μl an Ethanolamid 15 Minuten mit einem Schüttler vermischt. Die überständige Lösung wurde verworfen und die Beads wurden zweimal mit einem PBS-Puffer gewaschen und bei 4°C in einem Lagerpuffer gelagert, welcher 0,1 molares PBS, 0,15 molare NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol und 0,1% NaN₃ enthielt, um in konjugierten Beads von einer 4 mg/ml-Konzentration zu resultieren.
Die resultierende Intensität wurde dann gemessen an der Detektions-/Kalibrationslinie unter Verwendung eines Fluorolog III Spektrofluorometer (SPEX Industries, Inc., Edison, NJ) mit einem rechtwinkligen Modus. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 dargestellt, wobei I_S die Signalintensität der Nachweissonden an der Detektions-/Kalibrationslinie repräsentiert und I_C die Signalintensität der Kalibrationssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie. Tabelle 2: Signalintensitätsergebnisse

Analyt (ng/ml) I_C I_S/I_C

0 37 16622

5 42 13714

25 36 15111

50 34 14971

250 34 9529

500 33 7152

2500 34 1765
Wie durch die obigen Ergebnisse belegt wird, bewegten sich, wenn kein Analyt in der Probe vorlag, die Detektionssonden und durchquerten die Einganglinie und wurden eingefangen an der Detektions-/Kalibrationslinie. Wenn der Analyt in der Probe vorlag, komplexierten die Detektionssonden mit dem Analyten und wurden auf der Einfanglinie eingefangen, wobei jegliche verbleibende Detektionssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie eingefangen wurden. Daher war die Intensität der Detektionssonden (I_S) auf der Detektions-/Kalibrationslinie umgekehrt proportional zur Analytenkonzentration, wohingegen die Intensität der Kalibrationssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie relativ konstant blieb für verschiedene Analytkonzentrationen, d.h. ungefähr ~36 ± 6. Variationen von I_C stammen ver mutlich aufgrund von veränderten Umgebungen, Assaybedingungen und instrumentellen Instabilitäten. Jedoch sollte diese Variation einen ähnlichen Effekt auf I_S haben. Daher sollte I_S/I_C ein akkurateres Ergebnis in diesem Fall geliefert haben.
Wenn die Erfindung im Detail unter Verweis auf die spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, wird nach Aufbringen von Verständnis für das oben Dargelegte anerkannt werden, dass die Fachleute auf dem Gebiet leicht Änderungen dazu, Variationen dazu und Äquivalente zu diesen Ausführungsformen ins Auge fassen können. Dementsprechend sollte der Umfang der vorliegenden Erfindung als derjenige der beigefügten Ansprüche bewertet werden.

Claims

Eine Durchflußtestvorrichtung, welche in der Lage ist, das Vorliegen oder die Menge eines Analyten, welche sich in einer Testprobe befindet, nachzuweisen, wobei besagte Durchflußtestvorrichtung eine poröse Membran umfasst, besagte Membran sich in Kommunikation mit Detektionssonden befindet, welche in der Lage sind, ein Detektionssignal zu erzeugen, sowie Kalibrationssonden, welche in der Lage sind, ein Kalibrationssignal zu erzeugen, wobei die Menge des Analyten bestimmt werden kann aus besagtem Detektionssignal, wie es durch besagtes Kalibrationssignal kalibriert wird, wobei besagte Detektionssonden, besagte Kalibrationssonden oder Kombinationen davon verknüpft sind mit einem spezifischen Bindungselement für den Analyten, wobei der Durchflußtest charakterisiert ist dadurch, dass besagte poröse Membran, welche eine einzelne Detektions-/Kalibrationszone definiert, innerhalb welcher ein Polyelektrolyt-Einfang-Reagenz immobilisiert ist, und das konfiguriert ist, um direkt oder indirekt an Kombinationen der Detektionssonden und der Kalibrationssonden zu binden, wobei besagte Detektionssonden in der Lage sind, ein Detektionssignal zu erzeugen und besagte Kalibrationssonden in der Lage sind, ein Kalibrationssignal zu erzeugen, während sie sich innerhalb besagter Detektions-/Kalibrationszone befinden, und wobei besagter Polyelektrolyt eine positive Nettoladung aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polylysin, Polyethylenimin, Epichlorohydrin-funktionalisierten Polyaminen oder Polyamidoaminen, Polydialiyldimethylammoniumchlorid, kationischen Zellulosederivaten oder Kombinationen davon, oder besagter Elektrolyt eine Netto-negative Ladung aufweist und eine Polyacrylsäure ist, oder besagter Polyelektrolyt-amphiphil ist.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei besagte Detektionssonden und besagte Kalibrationssonden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Chromogenen, Katalysatoren, fluoreszierenden Verbindungen, chemilumineszierenden Verbindungen, phosphoreszierenden Verbindungen, radioakiven Verbindungen, direkt sichtbaren Labels, Liposomen sowie Kombinationen davon.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 2 definiert, wobei besagte Detektionssonden und besagte Kalibrationssonden fluoreszierende Verbindungen sind.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei besagte Detektionssonden, besagte Kalibrationssonden oder Kombinationen davon Mikropartikel enthalten.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei ein zweites Einfangreagenz immobilisiert ist auf besagter poröser Membran innerhalb besagter Detektions-/Kalibrationszone, welches ein spezifisch bindendes Element für den Analyten ist.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 5 definiert, wobei besagtes zweites Einfangreagenz so konfiguriert ist, dass es direkt oder indirekt an besagte Detektionssonden bindet, wenn es damit in Kontakt gebracht wird.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei besagte poröse Membran desweiteren eine Einfangzone definiert, welche stromaufwärts bezüglich besagter Detektions-/Kalibrationszone lokalisiert ist, wobei innerhalb selbiger ein oder mehrere Einfangreagenzien immobilisiert sind, die so konfiguriert sind, dass sie direkt oder indirekt an besagte Detektionssonden binden.
Die Duchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 7 definiert, wobei besagtes Einfangreagenz von besagter Einfangzone ein spezifisch bindendes Element für den Analyten darstellt.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei die Vorrichtung eine sandwichartige Testvorrichtung ist.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei die Vorrichtung eine Testvorrichtung vom kompetitiven Typus ist.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 definiert, wobei das Polyelektrolyt-Einfang-Reagenz nicht-diffusiv immobilisiert ist.
Die Durchflußtestvorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, wobei die Menge des Analyten innerhalb der Testprobe proportional zur Intensität des Detektionssignals ist, dividiert durch die Intensität des Kalibrationssignals.
Ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens oder der Menge eines Analyten, welcher sich in einer Testprobe befindet, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst: I) Bereitstellen der Durchflußtestvorrichtung gemäß Anspruch 1; II) Inkontaktbringen einer Testprobe, welche den Analyten umfasst, mit besagten Detektionssonden und besagten Kalibrationssonden; III) Messen der Intensität des Detektionssignals und der Intensität des Kalibrationssignals, erzeugt innerhalb von besagter Detektions-/Kalibrationszone, und IV) Kalibrieren der Intensität des Detektionssignals mit dem Kalibrationssignal, wobei die Menge des Analyten innerhalb der Testoprobe bestimmt wird aus besagtem Detektionssignal, wie es durch besagtes Kalibrationssignal kalibriert wird.
Das Verfahren, wie in Anspruch 13 definiert, wobei besagte Detektionssonden und besagte Kalibrationssonden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Chromogenen, Katalysatoren, fluoreszierenden Verbindungen, chemilumineszierenden Verbindungen, phosphoreszierenden Verbindungen, radioaktiven Verbindungen, direkt sichtbaren Labeln, Liposomen sowie Kombinationen davon.
Das Verfahren, wie in Anspruch 14 definiert, wobei besagte Detektionssonden und besagte Kalibrationssonden fluoreszierende Verbindungen darstellen.
Das Verfahren, wie in Anspruch 15 definiert, desweiteren umfassend das Anregen von besagten Detektionssonden und besagten Kalibrationssonden innerhalb von besagter Detektions-/Kalibrationszone, wobei die Anregung bewirkt, dass besagte Detektionssonden das Detektionssignal emittieren und besagte Kalibrationssonden das Kalibrationssignal emittieren.
Das Verfahren, wie in Anspruch 13 definiert, wobei ein zweites Einfangreagenz immobilisiert ist innerhalb von besagter Detektions-/Kalibrationszone, welches ein spezifisch bindendes Element für den Analyten darstellt.
Das Verfahren, wie in Anspruch 17 definiert, wobei besagtes zweites Einfangreagenz so konfiguriert ist, dass es direkt oder indirekt an besagte Detektionssonden bindet, wenn es damit in Kontakt tritt.
Das Verfahren, wie in Anspruch 13 definiert, wobei besagte poröse Membran desweiteren eine Einfangzone definiert, welche stromaufwärts von besagter Detektions-/Kalibrationszone angeordnet ist, wobei innerhalb dieser ein oder mehrere Einfangrea genzien immobilisiert sind, welche so konfiguriert sind, dass sie direkt oder indirekt an besagte Detektionssonden binden.
Ein Verfahren, wie in Anspruch 13 definiert, desweiteren umfassend das Erzeugen einer Kalibrationskurve durch Auftragen der Intensität des Detektionssignals, kalibriert um die Intensität des Kalibrationssignals, für eine Vielzahl von vorherbestimmten Analytkonzentrationen.