DE69232902T2

DE69232902T2 - Trennung und Analyse

Info

Publication number: DE69232902T2
Application number: DE69232902T
Authority: DE
Inventors: Ramadan Arbi Abuknesha
Original assignee: Marconi Optical Components Ltd
Current assignee: Marconi Optical Components Ltd
Priority date: 1991-10-18
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2012-10-17
Also published as: US6225043B1; DE69232902D1; GB2260609A; GB9122180D0; EP0538053B1; ATE231615T1; JPH05249113A; GB9221578D0; GB2260609B; EP0538053A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trennverfahren, ein Detektionsverfahren, die Verwendung eines Sensors in einem Detektionsverfahren und ein Testkit, das bei der immunologischen Detektion Anwendung findet.
Gemäß eines ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Trennverfahren zur Trennung einer Primärspezies bereitgestellt, das zur Verwendung in einem Immunoassayverfahren zur Detektion einer zu analysierenden Spezies geeignet ist, wobei das Trennverfahren die Verwendung einer ersten Hilfsspezies beinhaltet, wobei die erste Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die erste Hilfsspezies geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgewandelt zu werden, wobei es sich bei der zweiten Hilfsspezies nicht um eine Primärspezies handelt und die zweite Hilfsspezies geeignet ist, mit einer dritten Spezies in Wechselwirkung zu treten, um die Trennung zu vereinfachen, wobei entweder (a) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, auf einem Trägermaterial bereitgestellt zu werden und die dritte Spezies geeignet ist, mit einer Primärspezies assoziiert zu werden oder (b) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, sich an eine Primärspezies anzulagern und die dritte Spezies geeignet ist, auf einem Trägermaterial bereitgestellt zu werden, und daß das Trennverfahren beinhaltet, die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies zu bilden und es so einzurichten, daß die zweite Hilfsspezies und die dritte Spezies eine Wechselwirkung einer spezifischen Bindung eingehen, um die Trennung zu erleichtern, so daß eine Primärspezies an das Trägermaterial angelagert wird.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion einer zu analysierenden Spezies mittels Immunoassay bereitgestellt, wobei das Verfahren ein Trennverfahren zur Trennung einer Primärspezies beinhaltet, wobei das Trennverfahren die Verwendung einer ersten Hilfsspezies beinhaltet, wobei die erste Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die erste Hilfsspezies geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgewandelt zu werden, wobei es sich bei der zweiten Hilfsspezies nicht um eine Primärspezies handelt und die zweite Hilfsspezies geeignet ist, mit einer dritten Spezies in Wechselwirkung zu treten, um die Trennung zu vereinfachen, wobei entweder (a) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, auf einem Trägermaterial bereitgestellt zu werden und die dritte Spezies geeignet ist, mit einer Primärspezies assoziiert zu werden oder (b) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, sich an die Primärspezies anzulagern, und die dritte Spezies geeignet ist, auf einem Trägermaterial aufgebracht zu werden und daß das Trennverfahren beinhaltet, die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies zu bilden und es so einzurichten, daß die zweite Hilfsspezies und die dritte Spezies eine Wechselwirkung einer spezifischen Bindung eingehen, um die Trennung zu erleichtern, so daß eine Primärspezies an das Trägermaterial angelagert wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion einer Analytspezies durch Immunoassay bereitgestellt, wobei das Verfahren beinhaltet, eine primäre Immunreaktion stattfinden zu lassen, anschließend die erste Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies umzusetzen und die zweite Hilfsspezies eine spezifische Bindungsreaktion mit der dritten Spezies eingehen zu lassen, um einen Trennschritt in dem Immunoassay zu erleichtern.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Test-Kit zur Durchführung eines Detektionsverfahrens bereitgestellt, wobei das Verfahren ein Trennverfahren zur Abtrennung einer Primärspezies gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet und das Test-Kit eine erste Hilfsspezies enthält, wobei die erste Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die erste Hilfsspezies geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgeformt zu werden, und die zweite Hilfsspezies keine Primärspezies ist, und die zweite Hilfsspezies geeignet ist, mit einer dritten Spezies eine Wechselwirkung einer spezifischen Bindung einzugehen, um eine Trennung zu bewirken.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Sensors bereitgestellt, wobei der Sensor ein Trägermaterial enthält und eine Spezies aus einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies in einem erfindungsgemäßen Verfahren auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Trägermaterials bereitgestellt, wobei in einem erfindungsgemäßen Verfahren eine Spezies von einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies auf das Trägermaterial aufgebracht ist.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Trägermaterials bereitgestellt, wobei in einem erfindungsgemäßen Verfahren eine Spezies an einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies auf das Trägermaterial aufgebracht ist.
Die zweite Hilfsspezies kann zum Beispiel ein Ligand sein. In den Fällen, in denen die zweite Hilfsspezies ein Ligand ist, kann die dritte Spezies zum Beispiel eine Binderspezies für den Liganden sein.
Die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies können in dem Sinne als "Hilfspezien" betrachtet werden, daß keine dieser Spezien an der Primärimmunreaktion teilnimmt. Demzufolge sind die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies nicht als Primärspezien zu betrachten. Es versteht sich, daß eine erfindungsgemäße Primärspezies eine Spezies ist, die an einer primären Immunreaktion teilnimmt.
Beispielsweise handelt es sich bei einer primären Immunreaktion (die ebenfalls als primäre Immun-Bindungsreaktion bezeichnet werden kann) um eine, in der eine Analytspezies oder eine zertifizierte Analytspezies (wie sie später definiert werden wird) eine spezifische Bindungsreaktion eingeht, oder eine Analytspezies und eine zertifizierte Analytspezies spezifische Bindungsreaktionen eingehen. (Es versteht sich, dass die Analytspezies und die zertifizierte Analytspezies mit anderen Spezien und nicht untereinander spezifische Bindungsreaktionen eingehen.
Beispielsweise kann es sich bei einer Primärspezies um einen primären Antikörper oder einen Liganden (z. B. ein Antigen) handeln. Es versteht sich, dass es sich bei der Primärspezies zum Beispiel um einen Antikörper für eine Analytspezies oder um einen Antikörper für eine zertifizierte Analytspezies handeln kann. Es versteht sich ferner, dass es sich in einem vorgegebenen Immunoassay bei dem Antikörper für die Analytspezies und dem Antikörper für die zertifizierte Analytspezies um denselben Antikörper handelt.
Es versteht sich ferner, dass es sich bei einer Primärspezies zum Beispiel um eine Analytspezies oder eine zertifizierte Analytspezies handeln kann.
Beispielsweise ist es möglich, eine dritte Spezies auszuwählen, bei der es sich um eine Spezies handelt, die nicht an einer primären Immunreaktion teilnimmt. Eine derartige dritte Spezies kann als dritte Hilfsspezies betrachtet werden. Beispielsweise kann eine dritte Spezies, bei der es sich um eine dritte Hilfsspezies handelt, mit einer Primärspezies assoziiert sein (wie weiter unten offenbart ist) oder auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden (wie es weiter unten offenbart ist).
Alternativ kann zum Beispiel eine dritte Spezies derart ausgewählt sein, daß sie einen Teil enthält, der eine Spezies bereitstellt, die eine Wechselwirkung mit einer zweiten Hilfsspezies eingeht, und einen Teil, der eine Primärspezies bereitstellt, bei der es sich um einen Binder für die Primärspezies handelt. Ein Beispiel für eine derartige dritte Spezies ist ein Antikörper mit mehr als einer Funktion (zum Beispiel ein bifunktioneller Antikörper). Es versteht sich, daß in den Fällen, in denen zum Beispiel eine dritte Spezies einen Teil aufweist, der eine Spezies bereitstellt, die eine Wechselwirkung mit der zweiten Hilfsspezies eingeht, dieser Teil dahingehend als "Hilfsfunktion" betrachtet werden kann, daß er mit der zweiten Hilfsspezies in Wechselwirkung treten kann. Es versteht sich ebenfalls, daß in den Fällen, in denen zum Beispiel eine dritte Spezies eine Spezies ist, die eine Hilfsfunktion aufweist und selbst einen Teil enthält, der eine Primärspezies bereitstellt, die dritte Spezies dahingehend als Primärspezies betrachtet werden kann, daß sie einen Teil aufweist, der eine Primärspezies bereitstellt.
Beispielsweise kann in den Fällen, in denen es sich bei der dritten Spezies um einen Antikörper für die zweite Hilfsspezies handelt, die dritte Spezies als "Anti-zweite Hilfsspezies-Agens" betrachtet werden.
Die erste Hilfsspezies kann zum Beispiel als Vorstufe für die zweite Hilfsspezies betrachtet werden. Die erste Hilfsspezies kann zum Beispiel über eine chemische Synthese in die zweite Hilfsspezies umgewandelt werden. Alternativ kann beispielsweise die erste Hilfsspezies im wesentlichen mit der zweiten Hilfsspezies vergleichbar sein, mit der Ausnahme, daß die erste Hilfsspezies eine "Blockier"-Einheit enthält, die die Fähigkeit der zweiten Hilfsspezies, mit der dritten Hilfsspezies in Wechselwirkung zu treten (z. B. zu reagieren), inhibiert. Wird die "Blockier"-Einheit entfernt, (zum Beispiel durch "Entblocken" der zweiten Hilfseinheit) wird die erste Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies umgewandelt, die dann wiederum fähig ist, mit der dritten Hilfsspezies in Wechselwirkung zu treten (z. B. zu reagieren).
Es versteht sich, daß das Entfernen der "Blockier"-Einheit als "Demaskieren" einer "maskierten" Hilfsspezies oder "Anschalten" einer Wechselwirkungs-(z. B. Reagier-)-Fähigkeit einer Hilfsspezies betrachtet werden kann.
Es kann erfindungsgemäß ebenfalls jede geeignete strukturelle Änderung ausgenutzt werden, um die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies zu erhalten.
Beispielsweise kann jede Substanz (z. B. eine organische Substanz), die als Ligand fungieren kann und die in mehr als einer stabilen Form oder Struktur vorliegen kann, geeignet sein, gemäß der vorliegenden Erfindung eine erste Hilfsspezies und eine zweite Hilfsspezies bereitzustellen.
So kann beispielsweise, um eine zweite Hilfsspezies als Ligand zu erhalten, jede geeignete erste Hilfspezies (, die als Proligand betrachtet werden kann), die geeignet ist, den Ligand zu bilden, verwendet werden.
Zum Beispiel kann ein Antigen-Ligand (z. B. ein Hapten) als zweite Hilfsspezies ausgewählt werden, und Antikörper (entweder monoklonale oder polyklonale) für den Liganden können gezüchtet werden (z. B. auf jede geeignete Weise, wie den nach dem Stand der Technik bekannten), wobei es sich bei diesen Antikörpern um eine Binderspezies handelt, die die dritte Spezies für die Reaktion mit der zweiten Hilfsspezies ausbilden.
Die zweite Hilfsspezies kann auf jede beliebige Weise aus der ersten Hilfsspezies gebildet werden, zum Beispiel chemisch oder biochemisch (z. B. enzymatisch).
Es versteht sich, daß die Bildung einer zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies auf jede beliebige Weise erfolgen kann (z. B. kann ein "Anschalten" einer Wechselwirkungs-(z. B. einer Reaktions-)-Fähigkeit einer Hilfsspezies auf jede beliebige Weise erfolgen), zum Beispiel durch Zugabe zu einer ersten Hilfsspezies, durch Entfernen von etwas aus der ersten Hilfsspezies oder durch Freisetzen eines Liganden (z. B. einer antigenen Determinante) einer ersten Hilfsspezies (zum Beispiel durch Konformationswechsel).
Bevorzugt ist jegliche Affinität der ersten Hilfsspezies zu der dritten Spezies erheblich niedriger (z. B. dreimal niedriger und bevorzugt 1% oder weniger) als die Affinität zwischen zweiter Hilfsspezies und dritter Spezies.
Die erste Hilfsspezies kann so ausgewählt oder so eingestellt sein, daß sie eine Stabilität aufweist, die unter Bedingungen ihrer Aufbewahrung und Verwendung befriedigend sind.
Eine zweite Hilfsspezies und eine dritte Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel jedes geeignete Ligand-Binderspeziespaar sein, wobei es sich bei dem Liganden um die zweite Hilfsspezies und bei der Binderspezies um die dritte Spezies handelt. Beispiele für Ligand- Binderspeziespaare sind Antigen-Antikörper-Paare, nicht- antigene Ligand-Binderspeziespaare und Co-Faktor- Proteinpaare.
Beispielsweise kann jeder geeignete Ligand als zweite Hilfsspezies verwendet werden. Beispiele für diese Liganden sind Antigenliganden (wie Haptene) und nicht-antigene Liganden.
Beispiele für Antigenliganden sind 2,4-Dinitrophenol, Fluoreszein, Digitoxin, Cumann und Cibacron-Blau. Beispiele für nicht-antigene Liganden sind Liganden eines spezifischen Ligand-Binderspeziespaares (z. B. der Ligand Biotin im Falle des spezifischen Ligand-Binderpaares Biotin-Avidin).
Beispielsweise kann jede geeignete Binderspezies als eine dritte Spezies verwendet werden. Bei der Binderspezies kann es sich zum Beispiel um ein Bindungsprotein (z. B. einen Antikörper oder einen Bindungspartner für einen Liganden) handeln.
So kann in den Fällen, in denen die zweite Hilfsspezies ein Antigenligand ist, die Binderspezies ein Antikörper für den Liganden sein.
Folglich kann in den Fällen, in denen es sich bei der Hilfsspezies um 2,4-Dinitrophenol, Fluoreszein, Digitoxin, Cumann oder Cibacron-Blau handelt, die Binderspezies ein Anti-2, 4-Dinitrophenol-Antikörper, ein Anti-Fluoreszein- Antikörper, ein Anti-Digitoxin-Antikörper, ein Anti- Cumann-Antikörper, oder ein Anti-Cibacron-Blau-Antikörper sein.
In den Fällen, in denen es sich bei der zweiten Hilfsspezies um einen nicht antigenen Liganden handelt, kann der Ligand zum Beispiel so vorliegen, daß die Binderspezies ein Bindungspartner ist, d. h. ein Nicht-Immunoglobulin (z. B. ein natürlich auftretendes Protein). Der Bindungspartner kann als Binder des Liganden betrachtet werden. Ein Beispiel für einen derartigen Bindungspartner ist Avidin in einem spezifischen Ligand-Binderspeziespaar, das einen Biotin-Avidin-Komplex enthält.
Ein Trennverfahren der vorliegenden Erfindung kann infolgedessen zum Beispiel Trennsysteme verwenden, die 2,4- Dinitrophenol/Anti-2, 4-Dinitrophenol-Antikörper, Fluoreszein/Anti-Fluoreszein-Antikörper, Digitoxin/Anti-Digitoxin- Antikörper, Cumann/Anti-Cumann-Antikörper, Cibacron- Blau/Anti-Cibacron-Blau-Antikörper oder einen Biotin- Avidin-Komplex enthalten.
Die zweite Hilfsspezies kann auf jede beliebige Weise aus der ersten Hilfsspezies gebildet werden, wie es hier zuvor offenbart wurde. Zum Beispiel kann die erste Hilfsspezies ein Enzymsubstrat sein (z. B. ein Substrat für eine Hydrolase), das enzymatisch in Bestandteile oder Produktfragmente umgewandelt werden kann, die als zweite Hilfsspezies wirken können. Ein Enzymsubstrat und durch einen enzymatischen Vorgang erzeugte Bestandteile können zum Beispiel so eingestellt werden, daß sie sich strukturell stark unterscheiden, so daß sie große Differenzen in der Affinität für die dritte Spezies aufweisen.
Beispiele für Enzyme, die für die Verwendung in einem Enzym/Enzymsubstratsystem geeignet sind, sind Glaktosidasen, Glucosidasen und Phosphatasen. So kann Galactosyl-7- hydroxycumann zum Beispiel in Galactose + 7-Hydroxycumann umgewandelt werden, oder Glucosyl-7-hydroxycumann zum Beispiel in Glucose + 7-Hydroxycumann umgewandelt werden, oder Phosphat-7-hydroxycumann zum Beispiel in Phosphat + 7-Hydroxycumann umgewandelt werden. Beispielsweise kann ein Enzym/Enzymsubstratsystem, das Nitrophenol erzeugt (z. B. durch Umwandlung von Nitrophenolderivaten) verwendet werden. Aus den direkt zuvor angegebenen Beispielen ist zu entnehmen, daß die enzymatischen Substrate eine erste Hilfsspezies (bei der es sich um eine Vorstufe des Liganden handelt) bilden und die Liganden 7-Hydroxycumann und Nitrophenol eine zweite Hilfsspezies bilden.
Beispielsweise kann erfindungsgemäß ein Cofaktorsystem, wie Cofaktor I → Cofaktor II, verwendet werden, um eine erste Hilfsspezies und eine zweite Hilfsspezies bereitzustellen. So können zum Beispiel NAD → NADH oder NADP → NAD verwendet werden.
Auch kann beispielsweise ein System, das einen reduzierten Chromophorfarbstoff oxidierten Chromophorfarbstoff enthält, erfindungsgemäß verwendet werden, um eine erste Hilfsspezies und eine zweite Hilfsspezies bereitzustellen.
Beispiele für weitere Systeme, die verwendet werden können, um eine erste Hilfsspezies und eine zweite Hilfsspezies herzustellen, sind gegenüber Ultraviolettem Licht (UV) empfindliche Vorstufensubstanzen, die durch Photolyse und Chelatbildner/Chelat-Metallkomplexsysteme beeinflußbar sind.
Beispielsweise kann jede gewünschte Hilfsspezies, die in einem immunologischen Vorgang verwendet wird, erfindungsgemäß optional auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden. Auf Wunsch kann eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden. Das Trägermaterial selbst kann zum Beispiel eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies bereitstellen, oder das Trägermaterial kann eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies aufweisen, welche an dieses entweder direkt oder indirekt geknüpft ist.
So bedeutet "bereitgestellt auf einem Trägermaterial", wenn der Ausdruck in Bezug auf eine erste Hilfsspezies, eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies verwendet wird, Situationen, in denen das Trägermaterial selbst eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies bereitstellt, und Situationen, in denen an das Trägermaterial entweder direkt oder indirekt eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies geknüpft sind. So kann zum Beispiel eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies durch chemische Gruppen oder Einheiten des Trägermaterials bereitgestellt werden oder eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte kann zum Beispiel auf beliebige Weise (z. B. durch eine kovalente Bindung oder Adsorption) an das Trägermaterial geknüpft sein. In den Fällen, in denen es sich bei dem Polymer zum Beispiel um ein Polymer handelt, können Einheiten des Polymers als eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies fungieren. Beispielsweise können Oberflächengruppen, die auf dem Trägermaterial, wie Polystyrol oder modifiziertem Siliciumdioxid, vorliegen, als erste Hilfsspezies oder als zweite Hilfsspezies fungieren.
Beispielsweise kann das Trägermaterial auf Wunsch Oligomere oder Polymere einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Hilfsspezies bereitstellen.
In den Fällen, in denen eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann die erste Hilfsspezies oder die zweite Hilfsspezies oder die dritte Hilfsspezies direkt mit dem Trägermaterial verknüpft sein oder indirekt über eine andere Spezies mit dem Trägermaterial verknüpft sein (z. B. ein Trägerprotein).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das ebenfalls den Schritt beinhaltet, eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies entweder direkt oder indirekt mit einem Trägermaterial zu verknüpfen.
Beispielsweise kann die Oberfläche eines Trägermaterials auch aktiviert werden, um so die Verknüpfung mit einer ersten Hilfsspezies oder einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Hilfsspezies zu ermöglichen. Die Oberfläche eines geeigneten Trägermaterials kann zum Beispiel durch chemische Behandlung aktiviert werden, um freie Aminogruppen bereitzustellen, an die eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies geknüpft werden können.
Ferner können beispielsweise, anstatt eine einzelne erste Hilfsspezies oder eine einzelne zweite Hilfsspezies oder eine einzelne dritte Hilfsspezies mit freien Aminogruppen zu verknüpfen (, die wie oben dargestellt hergestellt werden), Oligomere oder Polymere einer ersten Hilfsspezies oder einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Hilfsspezies direkt oder indirekt mit einem Trägermaterial verknüpft werden.
So können zum Beispiel Oligomere oder Polymere einer ersten Hilfsspezies oder einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Hilfsspezies mit einem Trägermaterial verknüpft werden (Z. B. über freie Aminogruppen).
Beispielsweise können auch eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies (z. B. kovalent oder auf andere Weise) mit einer weiteren Spezies (z. B. einem Trägerprotein oder einem Polymer) verknüpft werden und die weitere Spezies kann auf jede beliebige Weise (z. B. Adsorption, kovalente Verknüpfung oder über Verwendung eines weiteren Ligand-Binderpaares) mit dem Trägermaterial derart verknüpft sein, daß die erste Hilfsspezies oder die zweite Hilfsspezies oder die dritte Hilfsspezies indirekt auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird.
Beispielsweise ist es, anstatt daß eine einzelne erste Hilfsspezies oder eine einzelne zweite Hilfsspezies oder eine einzelne dritte Hilfsspezies indirekt an ein Trägermaterial gebunden wird, möglich (z. B. kovalent oder auf andere Weise) Oligomere oder Polymere dieser Spezien an eine weitere Spezies (z. B. ein Trägerprotein oder ein Polymer) zu binden und diese weitere Spezies kann auf jede beliebige Weise (z. B. Adsorption, kovalente Bindung oder durch Verwendung eines weiteren Ligand-Binderpaares) mit dem Trägermaterial assoziiert sein, dass Oligomere oder Polymere einer ersten Hilfsspezies oder einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Hilfsspezies indirekt auf dem Trägermaterial bereitgestellt werden.
Es versteht sich, daß in den Fällen, in denen zunächst eine zweite Hilfsspezies auf dem Trägermaterial vorgesehen ist, diese zweite Hilfsspezies so behandelt werden kann, daß sie in die erste Hilfsspezies umgewandelt wird, so daß diese für die erfindungsgemäße Verwendung bereitsteht.
Beispiele für Trägermaterialien, die erfindungsgemäß Anwendung finden (z. B. an die entweder direkt oder indirekt eine erste Hilfsspezies oder eine zweite Hilfsspezies oder eine dritte Hilfsspezies geknüpft sind) sind Festphasenmaterialien, wie die Wand eines Reaktionsgefäßes, unlösliche Polysaccharide (die teilchenförmig vorliegen können), Mikroteilchen (z. B. teilchenförmige Microcellulose), unlösliche Poysaccharide mit eingeschlossenem Eisenoxid (z. B. magnetisierbare Teilchen, wie magnetisierbares Mikroteichenmaterial), Polystyrol (z. B. in Form von Kugeln, Röhrchen, Vertiefungen, Microtiterplatten, Platten oder Tauchstäben), vernetztes Dextran (z. B. Sephadex (eingetragene Marke)), unlösliche Polymerstrukturen, Glasflächen (z. B. eines Immunosensors), Oberflächen aus Siliziumdioxidderivaten (z. B. die verknüpfte Silylgruppen mit chemischen Funktionen aufweisen), lösliche Polymere, die an eine geeignete Fläche (z. B. eine Glasfläche, wie die Oberfläche einer optischen Faser) geknüpft sind, Nylon oder ein Polyamid. Das Trägermaterial kann zum Beispiel die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes sein.
Im Hinblick auf die vorangegangene Offenbarung vesrteht sich, daß das Trägermaterial zum Beispiel eine erste Hilfsspezies, die ein Enzymsubstrat oder einen Enzym-Cofaktor oder eine auf UV-Licht empfindlich reagierende Einheit oder einen Chelatbildner, um mit einem Metall ein Metallchelat zu bilden oder einen reduzierten Chromophor-Farbstoff bereitstellen kann, wobei die erste Hilfsspezies enzymatisch oder durch UV-Strahlung oder mit Metallionen oder durch Oxidationsbedingungen angeregt werden kann, um eine zweite Hilfsspezies zu bilden, die geeignet ist, eine Reaktion mit der dritten Spezies einzugehen.
Die vorliegenden Erfindung findet Anwendung bei der Detektion einer Analytspezies in einer beliebigen Probe. So können zum Beispiel Wasserproben, Erdproben, Proben lebender Spezien (wie Pflanzen (z. B. Gemüse) oder Tiere) oder Luftproben eine Analytspezies für die Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung bereitstellen. Beispiele für biologische Proben, in denen eine Analytspezies gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden kann, sind Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel und Milch. Eine Analytspezies kann zum Beispiel in Wasser, einer wässrigen Zubereitung oder einem Fluidextrakt vorliegen. Bei einer Analytspezies kann es sich zum Beispiel um einen Liganden (z. B. ein Hapten) oder einen Binder (z. B. einen Antikörper) handeln.
Beispiele für Analytspezien, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, sind:
(a) Steroidhormone, wie Progesteron, 17 α-Hydroxyprogesteron und Estradiol (z. B. in einer Blut-, Serum-, Speichel-, Urin- oder Milchprobe),
(b) Hormone, wie Thyroidhormon (z. B. Thyroxin oder Triiodothyronin),
(c) Steroide in Extrakten (z. B. Extrakten von Feststoffen oder Flüssigkeiten),
(d) Arzneimittel/Drogen, wie Drogen bei Drogenmissbrauch (z. B. Phenobarbital) und Arzneimittel (z. B. Dioxin) (z. B. in Blut-, Serum-, Speichel- oder Urinproben),
(e) Polypeptidhormone (z. B. in einer Blut- oder Urinprobe),
(f) Tumormarker, wie Markerproteine (z. B. in einer Blut- oder Serumprobe),
(g) Proteinantigene,
(h) Blutproteine (z. B. menschliches Serumalbumin, Immunoglobuline (z. B. IgG), Enzymmarker oder Rezeptoren),
(i) Markerproteine für Gewebe- oder Organerkrankungen,
(j) Pestizide, wie Insektizide oder Herbizide (z. B. in Wasser- oder Erdproben)
(k) Toxine (z. B. solche, die aus Futtermitteln oder Nahrungsmitteln extrahiert wurden), und
(l) Mikroorganismen (z. B. Viren und Bakterien)
(m) Antikörper für Mikroorganismen.
Weitere Beispiele für Analytspezien, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, sind Metallkomplexe.
Die vorliegende Erfindung kann somit Anwendung bei der Detektion von Metallkomplexen finden, wie zum Beispiel Schwermetallkomplexen, die als toxisch betrachtet werden können (z. B. vom biologischen Standpunkt aus, wenn sie in der Umgebung vorliegen).
Ein Beispiel für Metallkomplexe, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, ist Methylquecksilber.
Beispielsweise können Metallionen unter Verwendung eines Komplexbildners (z. B. eines Chelatbildners) in einen Metallkomplex umgewandelt werden, und der so gebildete Komplex kann als erfindungsgemäße Analytspezies dienen. So kann die vorliegende Erfindung zum Beispiel Anwendung bei der Detektion von Metallionen finden.
Es versteht sich, daß, wenn erfindungsgemäß ein Metallkomplex detektiert werden soll, zum Beispiel ein Antikörper für den Metallkomplex verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung kann bei der qualitativen Analyse einer Analytspezies verwendet werden, die ebenfalls als qualitative Detektion betrachtet werden kann, oder bei der quantitativen Analyse einer Analytspezies, die ebenfalls als quantitative Detektion betrachtet werden kann (d. h. bei der Messung oder Bestimmung).
Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung für jedes immunologische Verfahren oder für jeden Sensor angewendet werden, bei dem eine Trennung gebundener und ungebundener Fraktionen einer Markierungssubstanz (die ebenfalls als Kennzeichnungssubstanz betrachtet werden kann) erforderlich ist. Derartige Verfahren und Sensoren umfassen Verfahren konkurrierender Immunoassays (z. B. heterogene Antigenmarkierte Immunoassays oder heterogene Antikörper markierte Immunoassays für Substanzen mit geingem oder großem Molekulargewicht), Verfahren nichtkonkurrierender Immunoassays (z. B. heterogene Assays für Substanzen mit großem Molekulargewicht oder Mikroorganismen, in denen die Immobilisierung durch einen Antikörper erforderlich ist) und alle Arten von Immunosensoreinrichtungen, bei denen es erforderlich ist, eine Reaktionspezies mit der Oberfläche eines Immunosensors zu verknüpfen (z. B. eine Einrichtung, die einen elektronischen Detektionsmodus aufweist (z. B. ein optischen Signal ausgibt) oder einen elektrochemischen Detektionsmodus (z. B. ein elektrisches Signal ausgibt).
Jede geeignete detektierbare Spezies oder Markierungsspezies kann erfindungsgemäß verwendet werden.
Beispiele für Markierungssubstanzen sind Enzyme (z. B. Alkalinphosphatase, β-Galactosidase und Meerrettich- Peroxidase), Fluorophore (z. B. Fluoreszeine, Cumarine oder Rhodamin), chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungnen, Radioisotope und Farbstoffe.
Die vorliegende Erfindung kann im wesentlichen dazu verwendet werden, die Nachteile bekannter Arten von immunologischen Verfahren zu überwinden oder zu vermeiden: So ist es bei bestimmten bekannten Arten von Immunoassays, die die Verwendung einer Primärspezies erfordern, welche ein Antigen oder einen Antikörper enthält, der an das Trägermaterial geknüpft sind, um eine Trennung einer gebundenen und ungebundenen Fraktion einer Markierungssubstanz zu erlauben, oft notwendig, Trägermaterial während des Assays zuzugeben. Dies kann sich im Hinblick auf die Handhabung und schnelle Zugabe von Trägermaterial bei einigen Assays als unangenehm erweisen und damit einen Nachteil darstellen. Die Verwendung von Trägermaterial kann zum Beispiel zu Problemen in automatisierten Systemen führen. Außerdem kann in den Fällen, in denen zum Beispiel ein primärer Antikörper auf einem Trägermaterial immobilisiert ist, jede immunologische Reaktion zwischen dem primären Antikörper und einer Analytspezies oder einer zertifizierten Analytspezies (wie sie später definiert wird), welche eine Markierungssubstanz trägt, oder jede beliebige andere Spezies langsam sein, so daß ein Gleichgewicht oder ein beliebiger anderer gewünschter Punkt der Reaktion erreicht werden kann (d. h. eine primäre Immunreaktion kann so langsam sein, daß sie ein Gleichgewicht oder jeden anderen gewünschten Punkt der Reaktion erreicht.
Vergleichbare Nachteile können in Situationen auftreten, in denen ein immobilisiertes Antigen (zum Beispiel eine immobilisierte zertifizierte Analytspezies) verwendet wird, um eine primäre Immunreaktion auszulösen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann man eine primäre Immunreaktion in Lösung bis zum Gleichgewicht oder zu einem anderen gewünschten Reaktionspunkt laufen lassen, so daß die Reaktion nicht durch den Beitrag immobilisierter Spezien inhibitiert wird. Schließlich kann gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu einem ausgewählten Zeitpunkt die zweite Hilfsspezies aus einer ersten Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, gebildet werden, so daß eine Verknüpfung mit dem Trägermaterial erfolgen kann (d. h. das Reaktionsvermögen einer Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, kann "angeschaltet" werden). So kann zum Beispiel eine geeignete Spezies, die an der primären Immunreaktion teilnimmt, mit dem Trägermaterial verknüpft werden.
In den Fällen, in denen eine dritte Spezies mit einer Primärspezies assoziiert ist (z. B. einem primären Antikörper oder einem Antigen) versteht es sich, daß die Verknüpfung an ein Trägermaterial zum Beispiel infolge einer Reaktion (z. B. einer Bindungsbildung) der zweiten Hilfsspezies (aus der ersten Hilfsspezies erzeugt) auf dem Trägermaterial mit der dritten Spezies, die mit der Primärspezies assoziiert ist. Es versteht sich ebenfalls, daß die Bildung der zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies als "Anschalten" des Reaktionsvermögens einer Spezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, betrachtet werden kann. So kann in den Fällen, in denen ein Ligand-Binder-Paar erfindungsgemäß verwendet wird, und dies beinhaltet die Verwendung von antigenen aktiven Stellen, die vorliegende Erfindung so angesehen werden, als verwende sie "schaltbare" antigene aktive Stellen.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann man eine primäre Immunreaktion bis zum Gleichgewicht oder einen anderen gewünschten Punkt der Reaktion in Lösung laufen lassen, so daß die Reaktion durch die Hinzunahme einer immobilisierten Spezies nicht inhibiert wird. Anschließend wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu einem ausgewählten Zeitpunkt die zweite Hilfsspezies aus einer ersten Hilfsspezies gebildet, die mit einer Primärspezies assoziiert ist (d. h. das Reaktionsvermögen einer mit einer Primärspezies assoziierten Hilfsspezies "wird angeschaltet"). So kann zum Beispiel eine geeignete Spezies, die an einer primären Immunreaktion beteiligt ist, mit dem Trägermaterial verknüpft werden.
In den Fällen, in denen eine erste Hilfsspezies mit einer Primärspezies verknüpft ist (z. B. einem primären Antikörper oder einem Antigen) versteht es sich, daß die Verknüpfung an ein Trägermaterial beispielsweise infolge der Reaktion (z. B. der Bindungsbildung) der zweiten Hilfsspezies (die aus der ersten Hilfsspezies erzeugt wird) mit der dritten Hilfsspezies erfolgt, die auf dem Trägermaterial vorgesehen ist. Es versteht sich ebenfalls, daß die Bildung der zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies als "Anschalten" des Reaktionsvermögens der Spezies betrachtet werden kann.
Es versteht sich, daß in den Fällen, in denen eine dritte Spezies keinen Teil aufweist, der eine Primärspezies bereitstellt, bei der es sich um einen Binder für eine Primärspezies handelt, die dritte Spezies eine dritte Hilfsspezies ist und sie durch eine geeignete Verknüpfung mit der Primärspezies verknüpft sein kann. Es versteht sich ebenfalls, dass in den Fällen, in denen eine dritte Spezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, die dritte Spezies als dritte Hilfsspezies betrachtet werden kann.
Beispielsweise kann eine Primärspezies mit einer einzigen ersten Hilfsspezies oder einem Oligomer oder einem Polymer der ersten Hilfsspezies verknüpft sein.
Alternativ kann beispielsweise eine Primärspezies mit einer einzigen dritten Hilfsspezies oder einem Oligomer oder einem Polymer der dritten Hilfsspezies verknüpft sein.
Eine erste Hilfsspezies (oder eine zweite aus dieser gebildete Hilfsspezies) oder eine dritte Spezies kann durch jede beliebige Verknüpfung mit der Primärspezies verbünden werden; eine derartige Verknüpfung kann eine nicht spezifische Bindung oder Bindungen (z. B. eine kovalente Bindung oder Bindungen oder eine Adsorption) oder eine spezifische Bindung oder Bindungen oder jede beliebige Kombination derartiger Bindungen beinhalten.
Da erfindungsgemäß eine primäre Immunreaktion in Lösung erfolgen kann, kann die Reaktion infolgedessen schneller als bei Verfahren des Standes der Technik sein und, da das Trägermaterial während der gesamten Reaktion vorliegt, ist es nicht notwendig, während eines Assays Feststoffmaterialien zuzufügen.
Indem die Verknüpfung einer Spezies an ein Trägermaetreial zeitlich verschoben wird, bis erfindungsgemäß eine primäre Immunreaktion erfolgt ist, können die Geschwindigkeit, die Empfindlichkeit und die Genauigkeit zum Beispiel eines Immungssay-Vorgangs verbessert werden. (Für ein Immunoassayverfahren kann eine Empfindlichkeit notwendig sein, so daß femtomolare oder picomolare Konzentrationen einer Analytspezies detektiert werden können.)
In einer Form eines bekannten Assay-Verfahrens, das als "Enzym markiertes Immunosorbens-Assay (enzyme labelled immunosorbent assay)" (ELISA) bekannt ist, wird die Oberfläche eines Assay-Behälters (z. B. die Oberfläche eines "Wells" oder einer Mikrotiterplatte) zur Adsorption eines Assay-Bestandteils verwendet, so daß ein Trennschritt erfolgen kann. Inkubationszeiten bei der Verwendung eines solchen Assayverfahrens variieren zwischen 2 und 24 Stunden bei Assay-Gesamtzeiträumen von 4 bis 24 Stunden. Diese Zeiten können durch die vorliegende Erfindung reduziert werden. So kann die vorliegende Erfindung z. B. eine Anwendung beim "Enzyme labelled Immunosorbent Assay" finden.
Die Bildung der zweiten Hilfsspezies kann zum Beispiel durch Zugabe eines geeigneten Reagenzes oder durch die Zugabe von Energie erfolgen.
So kann zum Beispiel die zweite Hilfsspezies mit Hilfe von Enzymen, chemischen Reagentien oder äußeren Einflüssen, wie Lichtquellen (z. B. wie UV) aus der ersten Hilfsspezies erfolgen. Weiterhin kann die Bildung der zweiten Hilfsspezies zum Beispiel durch eine pH-Wertänderung oder die Zugabe einer chemischen Lösung erfolgen.
Es versteht sich, daß die vorliegenden Erfindung dazu genutzt werden kann, die Initiierung der Trennung bis zu einem gewünschten Zeitpunkt nach der Initiierung einer Primärreaktion zu steuern oder zu verschieben.
Es versteht sich ebenfalls, daß die erste Hilfsspezies, die geeignet ist, in die zweite Hilfsspezies umgewandelt zu werden, nicht auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden muß, da zum Beispiel jede ausgewählte Hilfsspezies, die an einem Immunoassay beteiligt ist, auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden kann; dies wird später erläutert.
Es versteht sich, daß eine "zertifizierte Analytspezies" eine Spezies ist, die geeignet ist, im wesentlichen auf gleiche Weise wie eine unter im wesentlichen gleichen Bedingungen zu detektierende Analytspezies zu reagieren. Eine zertifizierte Analytspezies kann zum Beispiel ein Antigen (z. B. ein Derivat einer Analytspezies) sein, das eine Bindung mit einem Antikörper eingeht, der in einem Assay auf im wesentlichen gleiche Weise wie eine zu detektierende Analytspezies verwendet wird.
Es versteht sich, dass eine zertifizierte Analytspezies unter anderem als Kalibriersubstanz oder Standard verwendet werden kann.
Wo es beispielsweise die Umstände erlauben, kann eine Markierungssubstanz (die ebenfalls als kennzeichnende Substanz betrachtet werden kann) als Markiereungssubstanz oder kennzeichnende Spezies verwendet werden und ebenfalls als Mittel zur Umbildung der ersten Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies fungieren kann.
Wo es infolgedessen die Umstände erlauben und es sich bei einer Markierungssubstanz oder einer kennzeichnende Spezies um ein Enzym handelt, kann das Enzym als Markierungs- oder kennzeichnende Spezies fungieren und ebenfalls die enzymatische Umwandlung der ersten Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies bewirken (d. h. die Bildung der zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies).
Daher versteht es sich, daß zusätzlich zur Bereitstellung einer Markierungssubstanz oder einer kennzeichnende Substanz, ein Marker oder eine kennzeichnende Substanz verwendet werden kann, um ein Interaktions- (z. B. ein Reaktions- )-vermögen "anzuschalten.
Beispielsweise können eine Galactosidase (z. B. Glactosidase) oder eine alkalische Phosphatase verwendet werden, um einen Liganden aus einer seiner Vorstufen (d. h. einen Proliganden) zu erzeugen, der ein Galactosidasecumann bzw. ein Phosphatcumann enthält.
Aus der vorangegangenen Offenbarung wird deutlich, daß eine erste Hilfsspezies (z. B. ein Proligand) zum Beispiel mit einem Reagenz oder können Reagentien behandelt werden kann, um so die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies, nachdem man einen Reaktanden (oder Reaktanden) zur Initiierung anderer Wechselwirkungen (z. B. einer primären Immunreaktion) über einen gewünschten Zeitraum hat reagieren lassen.
Wo es jedoch die Umstände erlauben, kann ein Reaktionspartner oder Reaktionspartner zur Bildung der zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies zum Beispiel gleichzeitig mit einem Reaktionspartner oder Reaktionspartnern zur Initiierung anderer Wechselwirkungen (z. B. einer primären Immunreaktion) verwendet werden.
In den Fällen, in denen zum Beispiel eine erste Hilfsspezies (z. B. ein Proligand) auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, können ein oder mehrere Reaktionspartner zur Bildung einer zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies (d. h. ein Reaktionspartner oder Reaktionspartner, die geeignet sind, ein Interaktions- (z. B. ein Reaktions-) vermögen der ersten Hilfsspezies) und ein oder mehrere Reaktionspartner zur Initiierung anderer Wechselwirkungen (z. B. einer primären Immunreaktion) gleichzeitig zugegeben werden. Die anderen Wechselwirkungen (z. B. eine primäre Immunreaktion) können in Lösung (und damit relativ schnell) erfolgen, wohingegen die Bildung der zweiten Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies auf dem Trägermaterial relativ langsam erfolgen kann, zum Beispiel aufgrund der Tatsache, dass die erste Hilfsspezies mit einem Trägermaterial verknüpft ist. So können zum Beispiel unter bestimmten Umständen Vorteile einer relativ schnellen Reaktion in Lösung, der ein "Einschalten" eines Trennverfahrens folgt, erzielt werden, wohingegen die Einfachheit beibehalten wird, einige, die meisten oder alle notwendigen Reaktionspartner gleichzeitig zusammenzubringen.
Die vorliegende Erfindung wird nun in bezug auf die beiliegenden Beispiele von Konfigurationen von Immunoassay- Verfahren, die die Erfindung verwenden, genauer beschrieben: So:
(A) Beispielsweise kann die vorliegenden Erfindung die Verwendung beinhalten von:
(i) einem Trägermaterial, das eine Vorstufe für einen Liganden bereitstellt,
(ii) einer zertifizierte Analytspezies, die mit einer Binderspezies für den Liganden konjugiert ist (z. B. ein Antikörper für den Liganden, und
(iii) eine Markerspezies (wie sie hier später beschrieben wird), die mit einer Analytspezies konjugiert ist (z. B. ein primärer Antikörper) (z. B. eine Spezies, die mit der zertifizierten Analytspezies oder einer Analytspezies eine Bindung eingeht).
Es versteht sich, daß die Vorstufe für den Liganden in diesem Beispiel eine erste Hilfsspezies und dass ein Ligand die zweite Hilfsspezies ist; es versteht sich ebenfalls, dass die Binderspezies für den Liganden eine dritte Spezies ist und in diesem Beispiel eine dritte Hilfsspezies.
Bei der Durchführung eines Assays kann man eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine zertifizierte Analytspezies, die mit der Binderspezies konjugiert ist, in Konkurrenz mit der Analytspezies in einer Probe treten läßt (wenn sie überhaupt vorliegt), (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), um mit der zu analysierenden Bindespezies, die mit der Markierungssubstanz konjugiert ist, eine Bindung einzugehen.
Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann, mit dem Ergebnis, daß jegliche Markierungsspezies, die mit der Binderspezies assoziiert ist, (durch Bindung zwischen der zertifizierten Analytspezies und der zu analysierenden Binderspezies) mit dem Trägermaterial verknüpft wird.
Jegliche Markierungsspezies, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann auf eine beliebige, nach dem Stand der Technik bekannte Weise oder mit einem beliebigen, nach dem Stand der Technik bekannten Mittel detektiert werden.
Es versteht sich, dass "unbekannt" wie es in der Beschreibung in Bezug auf eine Menge einer Analytspezies verwendet wird, eine unbekannte, in einer Probe zu detektierende Menge bedeutet. Es versteht sich ebenfalls, dass "bekannt" oder "Standard", wie es in der Beschreibung in Bezug auf eine Menge einer Analytspezies verwendet wird, eine bekannte oder Standardmenge einer Analytspezies bedeutet, wie sie zum Beispiel durch eine Standardlösung einer Analytspezies bereitgestellt wird.
Es versteht sich, dass in diesem Beispiel, wenn in einer Probe keine Analytspezies vorliegt, die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nachdem ein Assay nach der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, für eine maximale Menge stehen kann. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nimmt mit steigender Menge an Analytspezies in einer Probe ab.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezies in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
(B) Nach einem weiteren Beispiel kann die Erfindung die Verwendung von:
(i) einem Trägermaterial, das eine Vorstufe für einen Liganden beinhaltet,
(ii) einem Hybrid, das eine Binderspezies für den Liganden beinhaltet (z. B. einen primären Antikörper), und
(iii) eine zertifizierte Analytspezies, die mit einer Markierungssubstanz konjugiert ist, beinhalten.
Es versteht sich, daß die Vorstufe für den Liganden in diesem Beispiel eine erste Hilfsspezies und dass ein Ligand eine zweite Hilfsspezies ist; es versteht sich ebenfalls, dass die Binderspezies für den Liganden eine dritte Spezies ist und in diesem Beispiel eine dritte Hilfsspezies.
Bei der Durchführung eines Assays kann man eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine zertifizierte Analytspezies, die mit der Binderspezies konjugiert ist, in Konkurrenz mit der Analytspezies in einer Probe treten läßt (wenn sie überhaupt vorliegt), (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), um mit der zu analysierenden Bindespezies, die mit der Markierungssubstanz konjugiert ist, eine Bindung einzugehen. Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann, mit dem Ergebnis, daß jegliche Markierungsspezies, die mit der Binderspezies assoziiert ist, (durch Bindung zwischen der zertifizierten Analytspezies und der zu analysierenden Binderspezies) mit dem Trägermaterial verknüpft wird.
Jegliche Markierungsspezies, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann auf eine beliebige, nach dem Stand der Technik bekannte Weise oder mit einem beliebigen, nach dem Stand der Technik bekannten Mittel detektiert werden.
Es versteht sich, dass in diesem Beispiel, wenn in einer Probe keine Analytspezies vorliegt, die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nachdem ein Assay nach der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, für eine maximale Menge stehen kann. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nimmt mit steigender Menge an Analytspezies in einer Probe ab.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezies in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
(C) Nach einem weiteren Beispiel kann die vorliegende Erfindung die Verwendung von:
(i) einer zertifizierten Analytspezies, die mit einer Vorstufe eines Liganden konjugiert ist,
(ii) einer Analytbinderspezies (z. B. einem primären Antikörper), der mit einer Markierungsspezies konjugiert ist, und
(iii) einem Trägermaterial, das eine Binderspezies für den Liganden bereitstellt, beinhaltet.
Es versteht sich, daß die Vorstufe für den Liganden in diesem Beispiel eine erste Hilfsspezies und dass ein Ligand eine zweite Hilfsspezies ist; es versteht sich ebenfalls, dass die Binderspezies für den Liganden eine dritte Spezies ist und in diesem Beispiel eine dritte Hilfsspezies.
Bei der Durchführung eines Assays kann man eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine zertifizierte Analytspezies, die mit der Binderspezies konjugiert ist, in Konkurrenz mit der Analytspezies in einer Probe treten läßt (wenn sie überhaupt vorliegt), (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), um mit der zu analysierenden Bindespezies, die mit der Markierungssubstanz konjugiert ist, eine Bindung einzugehen. Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß - eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann, mit dem Ergebnis, daß jegliche Markierungsspezies, die mit der Binderspezies assoziiert ist, (durch Bindung zwischen der zertifizierten Analytspezies und der zu analysierenden Binderspezies) mit dem Trägermaterial verknüpft wird.
Jegliche Markierungsspezies, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann auf eine beliebige, nach dem Stand der Technik bekannte Weise oder mit einem beliebigen, nach dem Stand der Technik bekannten Mittel detektiert werden.
Es versteht sich, dass in diesem Beispiel, wenn in einer Probe keine Analytspezies vorliegt, die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nachdem ein Assay nach der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, für eine maximale Menge stehen kann. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nimmt mit steigender Menge an Analytspezies in einer Probe ab.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezies in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
(D) Nach einem weiteren Beispiel kann die vorliegende Erfindung die Verwendung von:
(i) einer Vorstufe für einen Liganden, die mit einer Analytbindespezies (z. B. einem primären Antikörper) konjugiert ist,
(ii) einer zertifizierten Analytspezies, die mit einer Markierungssubstanz konjugiert ist, und
(iii) einem Trägermaterial, das eine Binderspezies für den Liganden bereitstellt, beinhalten.
Es versteht sich, daß die Vorstufe für den Liganden in diesem Beispiel eine erste Hilfsspezies und dass ein Ligand eine zweite Hilfsspezies ist; es versteht sich ebenfalls, dass die Binderspezies für den Liganden eine dritte Spezies ist und in diesem Beispiel eine dritte Hilfsspezies.
Bei der Durchführung eines Assays kann man eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine zertifizierte Analytspezies, die mit der Binderspezies konjugiert ist, in Konkurrenz mit der Analytspezies in einer Probe treten läßt (wenn überhaupt), (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), um mit der zu analysierenden Binderspezies, die mit der Markierungssubstanz konjugiert ist, eine Bindung einzugehen. Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann, mit dem Ergebnis, daß jegliche Markierungsspezies, die mit der Binderspezies assoziiert ist, (durch Bindung zwischen der zertifizierten Analytspezies und der zu analysierenden Binderspezies) mit dem Trägermaterial verknüpft wird.
Jegliche Markierungsspezies, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann auf eine beliebige, nach dem Stand der Technik bekannte Weise oder mit einem beliebigen, nach dem Stand der Technik bekannten Mittel detektiert werden.
Es versteht sich, dass in diesem Beispiel, wenn in einer Probe keine Analytspezies vorliegt, die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nachdem ein Assay nach der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, für eine maximale Menge stehen kann. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden kann, nimmt mit steigender Menge an Analytspezies in einer Probe ab.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezies in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
(E) Nach einem weiteren Beispiel kann die vorliegende Erfindung die Verwendung von:
(i) einer Vorstufe für einen Liganden, die mit einer Analytbindespezies (z. B. einem ersten Antikörper für die Analytspezies) konjugiert ist,
(ii) einer Markierungsspezies, die mit einer zweiten Analytbinderspezies konjugiert ist, und
(iii) einem Trägermaterial, das eine Binderspezies für den Liganden bereitstellt,
beinhalten.
Es versteht sich, daß die Vorstufe für den Liganden in diesem Beispiel eine erste Hilfsspezies und dass ein Ligand eine zweite Hilfsspezies ist; es versteht sich ebenfalls, dass die Binderspezies für den Liganden eine dritte Spezies ist und in diesem Beispiel eine dritte Hilfsspezies.
Bei der Durchführung eines Assays kann man eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine erste Analytbinderspezies mit der Analytspezies (wenn sie überhaupt vorliegt) in einer Probe eine Bindung eingehen läßt, (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), und eine zweite Analytbinderspezies mit der Analytspezies eine Bindung eingehen läßt.
Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann, mit dem Ergebnis, daß jegliche Markierungsspezies, die mit dem Liganden assoziiert ist, (durch Bindung zwischen der ersten Analytbinderspezies und der einer beliebigen zu analysierenden Binderspezies) mit dem Trägermaterial verknüpft wird.
Jegliche Markierungsspezies, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann auf eine beliebige, nach dem Stand der Technik bekannte Weise oder mit einem beliebigen, nach dem Stand der Technik bekannten Mittel detektiert werden.
Es versteht sich, dass in diesem Beispiel, wenn in einer Probe keine Analytspezies vorliegt, so gut wie keine Markierungssubstanz mit dem Trägermaterial verknüpft wird, da keine Analytspezies vorliegt, die eine "Brücke" zwischen der ersten Analytbinderspezies und der zweiten Analytbinderspezies bildet. Mit steigender Konzentration einer Analytspezies in der Probe steigt die jedoch die Menge der Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft ist.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezien in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
Nach einem weiteren Beispiel können (i), (ii) und (iii) von E, wie sie hier zuvor offenbart wurden, auf alternative Weise verwendet werden.
So kann man zum Beispiel eine Primärimmunreaktion stattfinden lassen, indem man eine erste Analytbinderspezies in einer Probe (soweit sie vorliegt), (z. B. eine "unbekannte" Menge oder eine "bekannte" (oder "Standard")-Menge), mit der zu analysierenden Spezies eine Bindung eingehen läßt. Wenn die Primärimmunreaktion bis zu einem gewünschten Punkt abgelaufen ist (z. B. zum Gleichgewicht), wird die Vorstufe für den Liganden in den Liganden umgewandelt, derart daß eine Bindung zwischen dem Liganden und der Binderspezies erfolgen kann
Anschließend wird die zweite Analytbinderspezies zugegeben, derart dass die zweite Analytbinderspezies mit der Analytspezies eine Bindung eingeht, soweit sie vorliegt, welche an die erste Analytbinderspezies gebunden ist, die indirekt mit dem Trägermaterial verknüpft ist.
In diesem Beispiel werden Markierungsspezien (die mit der zweiten Analytbinderspezies konjugiert sind) in Gegenwart der Analytspezies mit dem Trägermaterial verknüpft. Steigende Konzentrationen einer Analytspezies in einer Probe können durch ansteigende Mengen der Markierungsspezies auf dem Trägermateriäl gezeigt werden.
Liegt keine Analytspezies vor, wird im wesentlichen keine Markierungsspezies mit dem Trägermaterial assoziiert werden.
Durch Verwendung von Kalibrierungskurven, die erhalten werden, indem eine Serie von Proben verwendet wird, die bekannte Mengen von Standard-Analytspezien enthalten, kann die Menge der Analytspezies in einer "unbekannten" Probe bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen in Bezug auf ein konkurrierendes Immunoassay genauer beschrieben:
Die verwendeten Reaktionspartner können wie folgt sein:
(a) ein Binder für eine Analytspezies (bei der es sich um einen gereinigten primären Antikörper handelt), der mit einer geeigneten Markierungssubsstanz gekennzeichnet ist (z. B. einem Enzym),
(b) ein Trägermaterial, das eine erste Hilfsspezies trägt (bei der es sich um eine Vorstufe für eine zweite Hilfsspezies handelt, die einen Liganden enthält (z. B. ein Hapten)),
(c) eine zertifizierte Analytspezies, die mit einer dritten Hilfsspezies konjugiert ist (bei der es sich um einen gereinigten Antikörper für den Liganden handelt),
(d) eine Standard-Analytspezies.
Der Reaktionspartner (b) liegt im Überschuss vor und die Reaktionspartner (a) und (c) liegen in "begrenzten" Mengen vor, derart daß durch Zusammenführen der Reaktionspartner, der Reaktionspartner (d) in Konkurrenz mit dem Reaktionspartner (c) tritt, um eine Bindung mit dem Binder des Reaktionspartners (a) einzugehen.
Wenn diese Reaktion, die Primärimmunreaktion, bis zu einem gewissen Grad fortgeschritten ist, wird der Reaktionspartner (b) so behandelt, daß die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies gebildet wird, derart dass alles oder ein wesentlicher Teil des Reaktiosnpartners (c) oder der mit diesem assoziierten Komplexe mit (b) gebunden sind.
Nach Entfernen des löslichen ungebundenen Materials kann die Aktivität der Markierungsspezies (z. B. eines Enzyms), das mit (b) assoziiert ist, als umgekehrt proportional zur Menge von (d) gemessen werden.
Beispielsweise kann eine Kalibrierungskurve aufgestellt werden, indem der konkurrierende Immunoassay, der direkt zuvor beschrieben wurde, mit verschiedenen Mengen einer Standard-Analytspezies wiederholt wird. So können zum Beispiel die Mengen einer Standard-Analytspezies von Null bis zum Maximalwert variiert werden, um so den Bereich, der für ein bestimmtes Assay notwendig ist, abzudecken.
Die maximale Aktivität der Markierungsspezies auf dem Trägermaterial wird bestimmt, wenn die Menge an Standard- Analytspezies Null beträgt, und diese Aktivität nimmt mit ansteigender Menge an Standard-Analytspezies ab.
Indem der Reaktionspartner (d) durch eine Probe ersetzt wird, die eine unbekannte Menge einer Analytspezies enthält und das direkt zuvor beschriebene Immunoassay wiederholt wird, kann die Menge der Analytspezies in der Probe unter Verwendung der Kalibrierungskurve bestimmt werden.
Bei dem Trägermaterial, das in dem direkt zuvor beschriebenen Immunoassay verwendet wird, kann es sich zum Beispiel um magnetisierbare Teilchen oder die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes handeln.
Beispielsweise versteht es sich, dass es sich bei einem Sensor, der erfindungsgemäß verwendet wird, auf Wunsch um einen wiederverwertbaren handeln kann. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem die zweite Hilfsspezies so eingestellt wird, dass sie geeignet ist, nach Abschluß eines ersten Immunoassays zurück in die erste Hilfsspezies umgewandelt zu werden, umso zu erlauben, dass ein zweiter Immunoassay durchgeführt werden kann.
Es versteht sich, daß der Ausdruck "immunologische Detektion", wie er in der Beschreibung verwendet wird, zum Beispiel jegliche Form von Detektion und Analyse umfaßt, die eine immunochemische Wechselwirkung beinhaltet.
In den Fällen, in denen es gewünscht ist, einen Antikörper für den erfindungsgemäßen Einsatz herzustellen (z. B. einen Antikörper für den gewählten Liganden), kann ein derartiger Antikörper mit Hilfe jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, zum Beispiel jenen die zur Züchtung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bekannt sind, so können zum Beispiel Antikörper gezüchtet werden, indem Tiere durch Konjugate immunisiert werden, die aus Derivaten von Liganden und immunogenen Trägerproteinen, wie Bovin-Serumalbumin oder Key-hole-Limit-Hämocyanin bestehen. Das Produkt, das bei der Immunisierung von Tieren erhalten wird, kann wie gewünscht gereinigt werden (z. B. unter Verwendung der Affinitätschromatographie), um die erforderlichen Antikörper zu erhalten.
Der Ausdruck "Antikörper" wie er in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt den gesamten Antikörper oder Antikörperfragmente, wie Fab und (Fab)2 und infolgedessen umfaßt der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird ganze Antikörper und Antikörperfragmente.
Beispielsweise kann auf Wunsch ein Waschschritt oder können Waschschritte zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Immunoassays eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft wie folgt beschrieben:

Beispiel 1

Darstellung von 7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure

Nach diesem Beispiel wird 7-Hydroxy-4-methylcumann-3- propionsäure als Beispiel für einen Liganden hergestellt, um diesen als zweite Hilfsspezies gemäß der Erfindung zu verwenden.
So wird 7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäureethylester hergestellt, indem Resorcinol (11 g) und Diethyl-2- acetylglutarat (23 g) in konzentrierter Schwefelsäure (50 ml) kondensiert werden. Nachdem die resultierende Mischung 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen wurde, wird sie in 2 l kaltes destilliertes Wasser geschüttet, so daß sich ein cremig-weißer Niederschlag bildet. Der cremigweiße Niederschlag wird mit destilliertem Wasser (4 l) gewaschen und als Zwischenprodukt aufgefangen. Dünnschichchromatographie auf Siliziumdioxidplatten zeigt, dass das Zwischenprodukt hochrein ist.
7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure wird aus dem Zwischenprodukt hergestellt, indem Ethylester mit Kaliumhydroxid in Methanol (5%) entfernt wird. Das endgültige Produkt wird durch Standard-Säure-Base-Ausfäll-Löseverfahren isoliert.

Beispiel 2

Darstellung eines Antiserums für 7-Hydroxy-4-methylcumann- 3-propionsäure

Nach diesem Beispiel wird ein Antikörper hergestellt, bei dem es sich um einen Antikörper für den nach Beispiel 1 dargestellten Liganden handelt. Der Antikörper wird hergestellt, um ihn als eine dritte Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
So wird zunächst eine Probe des wie in Beispiel 1 hergestellten Endproduktes (0,48 g) in Tetrahydrofuran (THF) (24 ml) gelöst und dann N-Hydroxysuccinimid (0,24 g) zugegeben und anschließend Dicyclohexylcarbodiimid (0,41 g). Nachdem das resultierende Produkt, 7-Hydroxy-4-methylcumann-3- propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 24 h lang stehengelassen wurde, wird es ohne weitere Reinigung weiterverwendet. Ein Immunogen wird hergestellt, indem der Ester (der wie zuvor offenbart hergestellt wird) an Bovin-Serumalbumin gekoppelt wird. Dann werden 2 ml einer Lösung des Esters in THF (50 mg des Esters) zu BSA (80 mg), das in 0,1 M NaHCO&sub3; (10 ml; pH 8,6) und Dioxan (6 ml) gelöst ist, gegeben. Das resultierende Konjugat wird bei dremaligem Austausch von 4 1 l%-iger NaHCO&sub3; über einen Zeitraum von 3 Tagen dialysiert.
Schafe werden mit 1,5 mg des Konjugats (bei dem es sich um ein Immunogen handelt) immunisiert, wobei Standardverfahren verwendet werden. Nach 9-monatiger wiederholter Immunisierung wird ein Antiserum erhalten, das eine hohe Bindungsaktivität an 7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure zeigt.

Beispiel 3

Titration der Antikörperbindungsaktivität des in Beispiel 2 hergestellten Antikörpers

Um die Aktivität des in Beispiel 2 hergestellten Antikörpers zu beurteilen, wird ein auf eine Platte aufgebrachter Antigen-Reaktionspartner wie folgt hergestellt:
Eine Ovalbumin-Lösung wird hergestellt, indem Ovalbumin (20 mg) in 0,1 M NaHCO&sub3; (5 ml; pH 8,6) und Dimethylformamid (5 ml) gelöst werden. N-Hydroxysuccinimidester (5 mg), wie er in Beispiel 2 hergestellt wurde, wird in Dimethylsulfoxid (0,5 ml) gelöst und die resultierende Lösung wird der Ovalbumin-Lösung zugegeben. Die resultierende Mischung wird sorgfältig gemischt und über einen Zeitraum von 24 Stunden stehengelassen.
Das resultierende Platten beschichtende Antigenreagenz (das ein konjugiertes Material ist) wird durch Dialyse über einen Zeitraum von 3 Tagen bei 3maligem Austausch von 4 l 1% NaHCO&sub3;, gefolgt von einer Behandlung mit aktivierter Norit (eingetragene Marke)-A-Aktivkohle gereinigt.
Die Titration der Antikörperbindungsaktivität des in Beispiel 2 hergestellten Antikörpers wird mit Hilfe von ELISA durchgeführt.
Anschließend wird die Bindungsaktivität mit Hilfe von ELISA wie folgt bewertet:
ELISA-Mikrotiterplatten (Polystyrol) werden mit einem Plattenbeschichtungs-Antigen-Reagenz beschichtet, das wie hier zuvor offenbart hergestellt wurde. Dann werden jeder Vertiefung 150 ul eines Plattenbeschichtungs-Antigenreagenzes in 1% NaHCO&sub3; (0,5 ug/ml eines Plattenbeschichtungs-Antigen- Reagenzes) der Platten zugegeben und die Platten werden bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Überzählige aktive Stellen werden mit 0,5 mg/ml Pferdehämoglobinlösung blockiert (200 ul). Eine Verdünnungsreihe des Antiserums (hergestellt wie in Beispiel 2) wird in einem Assaypuffer (50 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,4, der 0,1 M NaCl, 0,1% Gelatine, 0,01% Thimerosal (eingetragenen Marke) und 0,1 mg/ml Rhodamin-B-base enthält) hergestellt.
Der Titrationsassay erfolgt durch Zugabe von 150 ul eines Antiserums (unterschiedliche Verdünnungen, Bereich: 1/100 bis 1/106), Schütteln über einen Zeitraum von 1h bei Zimmertemperatur, Waschen (3 x) mit Waschpufferlösung (bestehend aus 0,1 M NaHCO&sub3;-Lösung, die 0,1 M NaCl und 0,05% Tween (eingetragene Marke) 20 enthält) und Zugabe eines Entwicklungskonjugat aus zweitem Antikörper und Enzym (enthaltend Kaninchen-Anti-Schaf-IgG-HRP), Inkubation bei 37ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde, Waschen (3 ·) mit Waschpuffer und anschließender Zugabe von HRP-Substat und Chromogenlösung (1,3 mM H&sub2;O&sub2; in Citrat-Natriumacetatpuffer; pH 4,1, das 0,5 mg/ml ABTS enthält). Nach einer 20-minütigen Reaktion mit dem Substrat wird die Optische Dichte in einem Mikrotiterplatten-ELISA-Lesegerät abgelesen.
Der Antikörper-Titer wird zu 1/380000 bestimmt (d. h. Verdünnung des Antiserums, die bei 415 nm eine ELISA-Otische- Dichte (O. D.) von 1,7 ergab).

Beispiel 4

Darstellung einer Vorstufe von 7-Hydroxy-4-methylcumann-3- propionsäure

Nach diesem Beispiel wird eine Vorstufe für den in Beispiel 1 hergestellten Liganden zubereitet. Die Vorstufe dient als erfindungsgemäße erste Hilfsspezies.
Die Vorstufe ist β-Galactopyranosid-o-(4-mthylcumann-3- propionsäure).
Anschließend wird Tetraacetyl-α-D-galactopyranosylbromid (5 g) einer Lösung aus 7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäureethylester (0,75 g) in Aceton (50 ml) mit 0,5 g wasserfreiem Kaliumcarbonat zugefügt. Die resultierende Mischung wird 10 h unter Rückfluß behandelt, so daß die Nachreaktionsmischung erhalten wird. Das Produkt, das Tetratacetylgalactopyranosidderivat von 7-Hydroxy-4- methylcumann-3-propionsäureethylester, wird mit Hilfe von Standard-Extraktionsschritten isoliert. Anschließend wird eine Chloroform (300 ml)-Lösung der Nachreaktionsmischung wiederholt mit 0,5 M Natriumhydroxid gewaschen, bis alle Spuren des Startermaterials aus der Chloroformschicht entfernt worden sind. Das Produkt wird aus der Chloroformschicht rückgewonnen. Die Acetylgruppen und der Ethylester werden durch 5% Kaliumhydroxid in Methanol entfernt.
Anschließend wird Tetraacetyl-β-D-galactopyranosid-o-(4- methylcumann-3-propionsäureehylester (0,7 g) bei 50ºC über einen Zeitraum von 16 h in 40 ml 5% Kaliumhydroxid in Methanol gehalten.
Das freie Glycosidprodukt wird rückgewonnen und durch präparative Flüssigkristallographie auf Silicagelplatten gereinigt.
Eine Kreuzreaktion von β-D-Glactopyranosid-o-(4- methylcumann-3-Propionsäure) mit Anti-7-hydroxy-4- methylcumann-3-propionsäure-Antiserum wird unter Verwendung eines vergleichenden ELISA bewertet.
Wird die Bindung von 7-Hydroxy-4-methylcumann-3- propionsäure mit Anti-7-hydroxy-4-methylcumann zu 100% angesetzt, wird für die Kreuzreaktion von β-D- Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3-propionsäure) mit dem Antiserum ein Wert von 0,016% bestimmt.

Beispiel 5

Kupplung von β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3- propionsäure) an Dextran

Dextran wird wie folgt aktiviert:
Dextran (ex. Sigma: MW 500000) (2 g) in 1% NaHCO&sub3; (50 ml) wird mit Natriumperiodad (0,25 g) oxidiert. Die resultierende Mischung wird in der Dunkelheit über einen Zeitraum von 6 Stunden stehengelassen und dann 16 h lang bei 4ºC gegen 4 l destilliertes Wasser destilliert. Die Oxidation von Dextran mit Natriumperiodad führt Aldehydfunktionen in die Dextranstruktur ein. Aldehydgruppen reagieren mit freien Aminogruppen, so daß sie kovalente Bindungen bilden. Die kovalenten Bindungen können durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert werden.
Verbindungsglieder werden wie folgt n oxidiertes Dextran eingeführt:
Oxidiertes Dextran (0,5 g) in 0,1 M NaHCO&sub3; (25 ml; pH 7,4) wird mit Bis-hexamethylen)-triamin (H&sub2; N-(CH&sub2;)&sub6;-NH-(CH&sub2;)&sub6;-NH&sub2;) (0,25 g) zur Reaktion gebracht. Der pH der resultierenden Reaktionsmischung wird mit konzentrierter HCl auf 7,2 eingestellt, und die Reaktionsmischung wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang gerührt. Natriumborhydrid (0,2 g) wird zugegeben und nach einem 4-stündigem Mischvorgang wird die resultierende Mischung einer Dialyse gegen 1% NaHCO&sub3; unterzogen, um Materialien mit niedrigem MW zu entfernen. Die Kupplung von β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3- propionsäure) an Dextran wird wie folgt durchgefhrt:
Die β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3-propionsäure) wird in β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3- propionsäure)-N-hydroxysuccinimidester umgesetzt. Anschließend wird β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3- propionsäure) (0,4 mg) in Methanol (20 ml) und Dioxan (30 ml) gelöst. Daraufhin werden N-Hydroxysuccinimid (0,12 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,22 g) zugegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wird über einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen in der Kälte stehen gelassen. Eine so hergestellte Esterprobe (100 mg) wird einem wie in diesem Beispiel zuvor offenbart hergestellten Dextran-NH-(CH&sub2;)s- NH-(CH&sub2;)&sub6;-NH&sub2; (200 mg) in 0,1 M NaHCO&sub3; (10 ml; pH 8,6) zugegeben. Die resultierende weitere Reaktionsmischung wird zur Reaktion gebracht, und 24 Stunden später wird ein Hapten zugegeben, wie es weiter in Beispiel 6 offenbart ist.

Beispiel 6

Darstellung von Dextran, um es an eine Polystyrolfläche zu knüpfen

Obwohl einige Trägermaterialien (wie Dextran) geeignete hydrophile Materialien (z. B. Polymere) sein können, mit denen zum Beispiel Liganden oder Vorstufen für Liganden verknüpft sein können, adsorbieren einige Trägermaterialien (wie Dextran) nicht ausreichend an Polystyroloberflächen (z. B. wie solche, die bei Polystyrolmikrotiterplatten gefunden werden).
Einige Trägermaterialien (z. B. Dextran) können jedoch zum Beispiel mit einem adsorbierenden Protein über eine beliebige geeignete kovalente Bindung mit Polystyroloberflächen verknüpft werden.
Beispielsweise können derartige Trägermaterialien (z. B. Dextran) über ein Ligandspezies-Binderspeziespaar mit der Oberfläche (z. B. einer Polystyroloberfläche) verknüpft werden. Folglich kann zum Beispiel eine Binderspezies (die einen Antikörper enthält) an eine Oberfläche adsorbiert werden und eine Ligandenspezies für eine Binderspezies kann mit dem Trägermaterial (z. B. Dextran) verknüpft sein.
In diesem Beispiel werden mehrere Liganden mit Dextran-NH- (CH&sub2;)&sub6;-NH-(CH&sub2;)&sub6;-NH&sub2; verknüpft, wobei jeder Ligand 5(6) - Carboxyfluoreszein enthält.
Nach 24 Stunden wird dann ein Haptenderivat, das 5(6)- Carboxyfluoreszein-N-Hydroxysuccinimid (10 mg) enthält der Mischung zugegeben, die gebildet wird, indem die weitere Reaktionsmischung in Beispiel 5 zur Reaktion gebracht wird, und die resultierende Mischung 4 h lang stehengelassen wird. Die so hergestellte Nachreaktionsmischung wird 3 Tage lang in der Kälte einer Dialyse unterzogen, um Substanzen mit niedrigem MW zu entfernen, und die endgültige Reinigung wird durch Behandlung mit 1% Norit-(eingetragene Marke)-Aaktivierter Kohle durchgeführt.
Das Verhältnis von β-D-Galactopyranosid-o-(4-methylcumann- 3-propionsäure)-Eingheiten zu 5(6)- Carboxyfluoreszeineinheiten, die mit Dextran verknüpft sind, kann gut größer als 1 : 1 sein und zum Beispiel gut 100 : 1 betragen.

Beispiel 7

Reinigung eines nach Beispiel 2 hergestellten Antikörpers

Die IgG-Fraktion eines Antiserums (wie in Beispiel 2 hergestellt) wird durch Ionenaustauschchromatographie hergestellt.
Die Reinigung wurde unter Verwendung der Immunoaffinitätschromatographie durchgeführt. Ein Immunoadsorbens für diese Immunoaffinitätschromatographie wird durch Verknüpfung eines 7-Amino-4-methylcumann-3-essigsäureovalbuminkonjugats an mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose (eingetragene Marke) 4B hergestellt. Nach dem In-Kontakt- Bringen mit dem an das Immunosorbens gebundenen Immunosobensantikörper werden mit einem Gradient von 20% Acetonitril und 1% Propionsäure in destilliertem Wasser eluiert. Der so eluierte Antikörper wird gegen 0,05 M Na- Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M Nacl enthält, dialysiert.
Die Titration der Bindungsaktivität durch ELISA zeigte, daß der resultierende Antikörper einen hohen Titer hat. Bei 0,5 ng des Antikörpers wird eine O. D. (bei 415 nm) von 1,7 erhalten.

Beispiel 8

Darstellung eines Konjugats von 17β-Estradiol und Anti-7- hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure-Antikörpers

17β-Estradiol wird als Analytspezies ausgewählt, um beispielhaft eine erfindungsgemäße Detektion zu zeigen.
Es wird ein Konjugat von 17β-Estradiol und einem Anti-7- hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure-Antikörper hergestellt.
Dann wird 17β-Estradiol-3-o-carboxybutyrylether-N- succinimidester (0,15 mg) in Dioxan (75 ul) dem Antikörper (IgG-Fraktion), der wie in Beispiel 7 (12 mg) in 0,1 M NaH- CO&sub3; (4 ml; pH 8,6), das 0,1 M NaCl enthält, hergestellt wurde.
Nachdem die resultierende Reaktionsmischung über einen Zeitraum von 4 h stehengelassen wurde, wird sie mit 0,5% Norit (eingetragene Marke) behandelt. Kohle und die resultierende Mischung werden über Nacht in der Kälte gegen 50 mM Phosphat (pH 7,4) einer Dialyse unterzogen.

Beispiel 9

Darstellung eines Anti-17β-Estradiol-Antikörpers

Es wird durch Immunisierung über einen Zeitraum von 7 Monaten ein Kaninchen-Anti-17β-estradiol-Antikörper gegen ein Immunonogen gezüchtet, bei dem es sich um ein Konjugat von 17β-Estradiol-3-carboxymethylether und KLH (Keyholelimpithaemocyanin) handelt.
Das Antiserum wird durch Standardverfahren erhalten.

Beispiel 10

Darstellung eines Anti-5(6)-Carboxyfluoreszein-Antikörpers

Es wird durch Immunisierung über einen Zeitraum von 7 Monaten ein Schaf-Anti-fluoreszein-Antiserum gegen ein Immunonogen gezüchtet, bei dem es sich um ein Konjugat von 5(6)- Carboxyfluoreszein und KHL handelt.
Die IgG-Fraktion des Schaf-Antiserums wird mit Hilfe von ionenaustausch-Chromatographie isoliert.
Der IgG-Antikörper wird isoliert und mit Hilfs von Immunoaffinitätschromatographie gereinigt.
Durch Kupplung eines 2',7'-Dichlor-5(6)-carboxyfluoreszeinovalbumin-Konjugats an mit Bromwasserstoff aktivierte Sepharose (eingetragene Marke) 4B wird ein Immunoadsorbens für diese Immunoaffinitätschromatographie hergestellt.
Nachdem das Antiserum mit dem Immunosorbens in Kontakt gebracht wurde, wird der durch das Immunosorbens gebundene mit Hilfe eines Gradienten von 20% Acetonitril und 1% Propionsäure in destilliertem Wasser eluiert. Der eluierte Antikörper wird gegen 50 mM Na-Phosphat (pH 7,0, welches 0,1 M NaCl enthält, in der Kälte über einen Zeitraum von 3 Tagen einer Dialyse unterzogen.

Beispiel 11

17β-Estradiol-Enzym-Immunoassay unter Verwendung einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies und einer dritten Spezies

In diesem Beispiel ist die erste Hilfsspezies β-D- Galactopyranosid-o-(4-methylcumann-3-propionsäure), die geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgewandelt zu werden, bei der es sich um 7-Hydroxy-4-methylcumann-3- propionsäure handelt.
Die dritte Spezies in diesem Beispiel ist ein Antikörper für 7-Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure.
Trägermaterial (in Form von Polystyrol-Mikrotiterplatten) wird mit 5(6)-Carboxyfluoreszein-Antikörper beschichtet. So werden Polystyrol-Mikrotiterplatten mit gereinigtem 5(6)- Carboxyfluoreszein-Antikörper (IgG-Fraktion) beschichtet, der wie in Beispiel 10 hergestellt wurde.
Um dies zu erzielen, wird der Antikörper (IgG-Fraktion), der wie in Beispiel 10 hergestellt wurde, auf die Platten gegeben, indem 150u1 einer Lösung, die den Antikörper enthält, in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben wird. Die Lösung wird aus 10 ug/ml Antikörper in PBS hergestellt (0,01 M Natriumphosphat (pH 7,4), das 0,9% NaCl enthält).
Die Lösung wird über einen Zeitraum von 16 Stunden bei 4ºC gehalten und anschließend werden die Vertiefungen geleert und überschüssige Verknüpfungsstellen blockiert, indem die Vertiefungen 1 h lang Pferdehämoglobin ausgesetzt werden (200 ul pro Vertiefung einer Lösung von 0,5 mg/ml Pferdehämoglobin in einer 1%-igen NaHCO&sub3;-Lösung).
Anschließend wird Dextran, welches eine erste Hilfsspezies und mehrere Liganden mit 5(6)-Carboxyfluoreszein aufweist (welches wie hier zuvor beschrieben hergestellt wurde), in die Vertiefungen gefüllt, so daß Dextran mit Hilfe einer Bindung zwischen dem Antikörper auf den Platten und den Liganden von Dextran verknüpft werden kann.
So werden 150 ul einer Dextranlösung (die mit der ersten Hilfsspezies und mit den 5(6)-Carboxyfluoreszeinliganden verknüpft ist), welche wie in Beispiel 6 hergestellt worden sind, in einem Assay-Puffer (5 ug/ml) in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt und über einen Zeitraum von 30 Minuten geschüttelt, um eine Verknüpfung von Dextran an die Platten zu erlauben. Der Assay-Puffer ist in Beispiel 3 offenbart. Die Platten werden viermal mit Waschpufferlösung gewaschen. Die Waschpufferlösung entspricht der in Beispiel 3.
Anschließend wird eine Blindprobe (50 ul) (die aus einem Assay-Puffer besteht, der kein 17β-Estradiol enthält) und 17β-Estradiol-Standards (jeweils 50 ul), die 17β-Estradiol im Assay-Puffer enthalten (in Konzentrationen von 10 pg bis 250 pg 17β-Estradiol pro 50 ul des Assay-Puffers) zweifach in die Vertiefungen gefüllt.
In jede Vertiefung werden ebenfalls 50 ul einer Lösung, die aus einem wie in Beispiel 8 hergestelltem Konjugat besteht, das auf geeignet Art in einem Assaypuffer gelöst ist (nach den Immunoassay-Verfahren 1/8000) und 50 ul einer Lösung von Anti-β-estradiol-Antikörper, der wie in Beispiel 9 auf geeignete Art in einem Assaypuffer gelöst ist (nach den Immunoassay-Verfahren 1/18000), zugefügt.
Nach dem Mischen (durch Schütteln der Platten) über einen Zeitraum von 20 min wird ein Regens zugegeben, um eine Umsetzung der ersten Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies zu bewirken (d. h. in diesem Beispiel die Umsetzung von β- D-Galactopyranosid-o(4-methylcumann-3-Propionsäure) in 7- Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäure).
Das Reagens für diese Umsetzung ist ein E.-coli-β- Galactosidase-Präparat (ex. Sigma) (0,5 Einheit in einem Assaypuffer) mit zugefügtem MgCl&sub2; (10 uM) und Methanol (15%) v/v); 50 ul des Reagenzes werden jeder Vertiefung zugegeben.
Nachdem die Platten 20 min lang geschüttelt werden, werden sie sechs Mal mit Waschpuffer gewaschen. An diesem Punkt wird das wie in Beispiel 8 hergestellte Konjugat (zusammen mit einem beliebigen Kaninchen-Anti-17β-estradiolantikörper, der an dieses geknüpft ist) über eine Bindung mit den PLatten verknüpft, die zwischen den Anti-7-hydroxy- 4-methylcumann-3-propionsäure-Antikörper und dem 7- Hydroxy-4-methylcumann-3-propionsäureliganden entsteht, der durch die enzymatische Wirkung von β-Galactopyranosido-(4-methylcumann-3-propionsäure) gebildet wird.
Anschließen wird das im Handel erhältliche zweite Antikörper-Enzymkonjugat (Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP- Konjugat(Sigma)) zugegeben (150 ml pro Vertiefung) und mit einem beliebigen Anti-17β-estradiol-Antikörper, der mit den Platten verknüpft ist, zur Reaktion gebracht.
Die Platten werden mit Waschpufferlösung gewaschen und jegliches Assay-Signal wird unter Verwendung eines HRP- Substrates (150 ul pro Vertiefung), das aus 1,3 mM H&sub2;O&sub2; in Acetat/Citratpuffer (pH 4,1) besteht und 0,5 mg pro ml ABTS enthält, entwickelt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, in der die Ergebnisse für die O. D. (Optische Dichte) die Mittel aus zwei abgelesenen Daten sind. Tabelle
Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse bestätigen, dass mit Ansteigen der Konzentration der Analytspezies (in diesem Beispiel 17β-Estradiol) die Menge des primären Antikörpers, der an das Trägermaterial geknüpft sein kann, abnimmt.

Claims

1. Trennverfahren zur Abtrennung einer Primärspezies, wobei das Trennverfahren zur Verwendung in einem Immunoassay-Verfahren zur Detektion einer zu analysierenden Spezies geeignet ist, wobei das Trennverfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Trennverfahren die Verwendung einer ersten Hilfsspezies, wobei es sich bei der ersten Hilfsspezies nicht um die Primärspezies handelt und die erste Hilfsspezies geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgebildet zu werden, wobei die zweite Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die zweite Hilfsspezies geeignet ist, mit einer dritten Spezies in Wechselwirkung zu treten, um die Trennung zu erleichtern, wobei entweder (a) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, auf ein Trägermaterial aufgebracht zu werden und die dritte Spezies geeignet ist, mit einer Primärspezies assoziiert zu werden oder (b) die erste Hilfsspezies und die zweite Hilfsspezies geeignet sind, sich an die Primärspezies anzulagern und die dritte Spezies geeignet ist, auf ein Trägermaterial aufgebracht zu werden und daß das Trennverfahren beinhaltet, die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies zu bilden und es so einzurichten, daß die zweite Hilfsspezies und die dritte Spezies eine Wechselwirkung einer spezifischen Bindung eingehen, um die Trennung zu erleichtern, so daß eine Primärspezies an das Trägermaterial angelagert wird.

2. Verfahren zur Detektion einer zu analysierenden Spezies durch Immunoassay, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es das Trennverfahren nach Anspruch 1 beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Detektion einer zu analysierenden Spezies durch Immunoassay, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es das Verfahren erlaubt, daß eine primäre Immunreaktion stattfindet, anschließend die erste Hilfsspezies in die zweite Hilfsspezies umgebildet wird und die zweite Hilfsspezies mit der dritten Spezies reagiert, um einen Trennschritt im Immunoassay zu erleichtern.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der dritten Spezies um eine Hilfsspezies handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zweiten Hilfsspezies um einen antigenen Liganden handelt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zweiten Hilfsspezies um einen nicht antigenen Liganden handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der dritten Spezies um eine Binderspezies für einen Liganden handelt und es sich bei der Binderspezies um einen Antikörper handelt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der dritten Spezies um eine Binderspezies handelt und es sich bei der Binderspezies um eine Binderspezies für einen nicht antigenen Liganden handelt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 oder 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der dritten Spezies um einen Antikörper mit mehr als einer Funktion handelt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Anspruch 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Hilfsspezies und eine dritte Spezies durch ein Antigen-Antikörper-Paar bereitgestellt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Anspruch 6 oder 8, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Hilfsspezies und eine dritte Spezies durch ein nicht-antigenes Ligand-Binder-Speziespaar bereitgestellt sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine zweite Hilfsspezies und eine dritte Spezies durch ein Protein-Cofaktor-Paar bereitgestellt sind.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Hilfsspezies enzymatisch aus der ersten Hilfsspezies gebildet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Hilfsspezies aus der ersten Hilfsspezies unter Verwendung von oxidierenden Bedingungen und einem reduzierten Chromophor-Farbstoff-/oxidierten Chomophor-Farbstoff-System hergestellt wird oder unter Verwendung von ultraviolettem Licht oder eines Metallions oder eines pH-Wertwechsels.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, ferner dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial verwendet wird und es sich bei dem Trägermaterial um die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes, ein unlösliches Polysaccharid, ein Mikropartikel, ein unlösliches Polysaccharid mit eingeschlossenem Eisenoxid, Polystyrol, vernetztes Dextran, eine unlösliche Polymerstruktur, eine Glasoberfläche, eine Siliciumoxid-derivatfläche, ein lösliches Polymer, das auf eine geeignete Fläche aufgebracht ist, Nylon oder ein Polyamid handelt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zu analysierenden Spezies um ein Hormon, ein Steroid, einen pharmazeutischer Inhaltsstoff, ein Polypeptidhormon, einen Tumormarker, ein Proteinantigen, ein Blutprotein, ein Markerprotein, ein Pestizid, einen Giftstoff, einen Mikroorganismus oder einen Antikörper für einen Mikroorganismus handelt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein kompetitives Immunoassay- Verfahren beinhaltet.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein nicht-kompetitives Immunoassay- Verfahren beinhaltet.

19. Test-Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 18, wobei das Test-Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß das Test-Kit eine erste Hilfsspezies und eine dritte Spezies enthält, wobei die erste Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die erste Hilfsspezies geeignet ist, in eine zweite Hilfsspezies umgebildet zu werden und die zweite Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die zweite Hilfsspezies geeignet ist, mit der dritten Spezies eine Wechselwirkung einer spezifischen Bindung einzugehen, um eine Trennung zu bewirken.

20. Verwendung eines Sensors, dadurch gekennzeichnet, daß der Sensor ein Trägermaterial enthält und eine Spezies von einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies auf das Trägermaterial aufgebracht ist in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18.

21. Verwendung eines Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezies von einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies auf das Trägermaterial aufgebracht ist in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 18.

22. Verwendung eines Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezies von einer ersten Hilfsspezies, einer zweiten Hilfsspezies oder einer dritten Spezies auf das Trägermaterial aufgebracht ist in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18.