JPH02213766A - 免疫測定用試薬および免疫測定器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〉 本発明は、競合法によってハブテンもしくは抗原または
抗体を測定する際に用いる免疫測定用試薬および免疫測
定器具に関する。

（従来の技術〉 近年の免疫学、遺伝子工学の急速な進歩を背景として、
免疫反応を利用する生体内の微量物質の測定方法、およ
びその測定に用いるキットが開発されている。

免疫反応を利用する測定は、その測定原理によって分類
すると、サンドイツチ法、競合法等がある。

サンドイツチ法の原理は、被検出物質が抗原である場合
を例に説明すると、その抗原分子中の抗原性を示すある
部位に親和性を有する抗体（不溶化抗体）と、やはり抗
原性を示す他の部位に親和性を有する抗体（標識抗体）
とで抗原を挟む（サンドイッチ）形で捕捉し、標識抗体
由来のシグナルから、検体中の抗原量々測定するもので
ある。　従って、被検出物質は、特異的な抗原性を示す
部位が２以上ある抗原でなければならない。

サンドイツチ法は、通常、被検出物質が高分子の蛋白質
、ポリペプチド、糖質、脂質あるいはそれらの複合体で
ある場合に利用される測定方法であり、多くの研究がな
されている。　そして、例えば、抗原の測定に用いる試
薬は不溶化抗体と標識抗体であり、不溶化杭体と標識抗
体とを混在させておいても互いに反応しないので、両者
を予め単一の反応容器に含有せしめたキットが開発され
ている（特開昭５７−１３８１６５号）。

また、このキットを利用し、検体を容器に分注するだけ
で免疫反応を開始せしめる測定操作の簡便な自動化測定
装置も開発されている。

一方、競合法は、同じく被検出物質が抗原である場合を
例に説明すると、検体中の抗原と標識抗原とを競合させ
て抗体に結合させた後、標識抗原由来のシグナルから、
検体中の抗原量を測定するものである。　従つて、被検
出物質は、抗原性を示す部位が１つしかない抗原性物質
、あるいはそのような抗原性物質に対して形成された抗
体であってもよく、また、ハブテン、あるいはハブテン
に免疫活性キャリヤーが結合した物質が免疫原となって
形成された抗体であってもよい。

競合法は、通常、被検出物質がサンドイツチ法を適用し
にくい物質、例えばステロイド類、アミン類、アミノ酸
類、ペプチド類等の比較的低分子量の物質である場合に
利用される測定方法である。

競合法では、抗体と抗原の反応が不可・逆鉤であるため
、被検出物質が抗原である場合を例に説明すると、不溶
化抗体を含有する反応容器に検体を入れた後、あるいは
検体と同時に、標識抗原を加えねば正確な測定ができな
い、　従って、免疫反応にかかわる不溶化抗体と標識抗
原とを、予め単一の反応容器内に存在せしめておくこと
はできないと考えられていた。　しかし、最近、凍結乾
燥手段を用い、不溶化抗体と標識抗原とを、予め単一の
反応容器内に存在せしめておく方法が提案された（特開
昭６２−１４８８５７号、特開昭６２−１５１７５８号
）。

〈発明が解決しようとする課題〉 上記のように、競合法は、微量の比較的低分子量の物質
の測定に有用な方法である。　しかし、免疫反応にかか
わる不溶化抗体と標識抗原は別容器に保存し、不溶化抗
体を含有する反応容器に検体を入れた後に、あるいは検
体と同時に、別容器に保存されている標識抗原を加えな
ければならないために、用手法による測定においては、
手技が煩雑であり、また、自動化測定装置においては、
測定項目毎に標識抗原の保持と分注添加システムを用意
せねばならず、この点が多項目自動測定装置開発の障害
となっていた。

これを解決する一方法として、特開昭６２−１４８８５
７号および特開昭６２−１５１７５８号に、凍結乾燥手
段を用い、不溶化抗体と標識抗原とを、予め単一の反応
容器内に保存せしめておく方法が提案されたが、この方
法を採用した場合の不溶化抗体と標識抗原との経時安定
性は検討されておらず、経時安定性に問題が残っている
。

本発明は、上記の事実に鑑みてなされたものであり、競
合法の原理を用いた免疫測定用試薬であって、可逆的に
結合する不溶化抗体と標識ハプテンとの組合せ、不溶化
抗体と標識抗原との組合せ、不溶化ハプテンと標識抗体
との組合せ、または不溶化抗原と標識抗体との組合せか
らなる免疫測定用試薬の提供を目的とする。

また、単一容器内に、前記免疫測定用試薬のいずれかを
存在せしめてなる免疫測定器具の提供を目的とする。

く課題を解決するための手段） 従来の免疫測定法は、免疫反応は抗体抗原結合物生成の
方向へ進み、この結合はほぼ不可逆的であるとの前提の
下になされている。

しかし、本発明者らは、競合法の原理を用いるハプテン
の免疫測定において、免疫反応が速やかに平衡状態に達
する抗体とハプテンとの組合せで、なおかつ、抗体とハ
プテンとの結合・解離が可逆的である組合せがあれば、
免疫反応にかかわる不溶化抗体と標識ハブテンとを、あ
るいは不溶化ハブテンと標識抗体とを、予め単一の反応
容器内に存在せしめておくことにより、保存期間中に抗
体とハプテンとの間で免疫反応が生じても、その結合・
解離の可逆性のために、新たに加えられた検体中のハプ
テン量に比例して、標識ハブテンが不溶化抗体から解離
し、あるいは標識抗体が不溶化ハブテンから解離し、か
わって検体中のハプテンが抗体と結合し、競合法が成立
すると予測した。

また、同様に、競合法の原理を用いる抗原または抗体の
免疫測定において、免疫反応が速やかに平衡状態に達す
る抗体とハプテンまたは抗原の組合せで、なおかつ、抗
体とハプテンまたは抗原との結合・解離が可逆的である
組合せがあれば、免疫反応にかかわる不溶化ハブテンま
たは不溶化抗原と標識抗体とを、あるいは不溶化抗体と
標識ハブテンまたは標識抗原とを、予め単一の反応容器
内に存在せしめておくことにより、保存期間中に、不溶
化抗体と標識ハブテンまたは標識抗原、あるいは不溶化
ハブテンまたは不溶化抗原と標識抗体との間で免疫反応
が生じても、その結合解離の可逆性のために、新たに加
えられた検体中の抗原量に比例して、標識抗原が不溶化
抗体から解離し、あるいは標識抗体が不溶化抗原から解
離し、かわって検体中の抗原が抗体と結合し、または、
新たに加えられた検体中の抗体量に比例して、標識抗体
が不溶化ハブテンまたは不溶化抗原から解離し、あるい
は、標識ハブテンまたは標識抗原が不溶化抗体から解離
し、かわって検体中の抗体がハブテンまたは抗原と結合
し、競合法が成立すると予測した。

そして、上記のように、免疫反応が速やかに平衡状態に
達し、なおかつ可逆的な免疫反応を行う抗体とハブテン
または抗原の組合わせを見い出し、本発明を完成したも
のである。

本発明は、ハブテンを測定するに際して用いる試薬であ
って、ハブテンと標識剤との結合体（ａ）と、ハブテン
と免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原として調製し
た抗体（ｂ）とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を
行いうることを特徴とする、あるいは、ハブテン（ｃ）
と、ハブテンと免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原
として調製した抗体（ｂ）と標識剤との結合体（ｄ）と
よりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いうることを
特徴とする免疫測定用試薬を提供するものである。

また、本発明は、抗原を測定するに際して用いる試薬で
あって、抗原と標識剤との結合体と、抗原を免疫原とし
て調製した抗体とよりなり、両者が可逆的な結合・解離
を行いうることを特徴とする、あるいは、抗原と、抗原
を免疫原として調製した抗体と標識剤との結合体とより
なり、両者が可逆的な結合・解離を行いうることを特徴
とする免疫測定用試薬を提供するものである。

さらに、本発明は、抗体を測定するに際して用いる試薬
であって、ハブテンと免疫活性キャリヤーとの結合体を
免疫原として調製した抗体（ｂ）と標識剤との結合体（
ｄ）と、ハブテン（ｃ）とよりなり、両者が可逆的な結
合・解離を行いうることを特徴とする、あるいは、ハブ
テンと免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原として調
製した抗体（ｂ）と、ハブテンと標識剤との結合体（ａ
）とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いうるこ
とを特徴とする免疫測定用試薬を提供するものである。

加えて、本発明は、抗体を測定するに際して用いる試薬
であつて、抗原を免疫原として調製した抗体と標識剤と
の結合体と、抗原とよりなり、両者が可逆的な結合・解
離を行いうることを特徴とする、あるいは、抗原を免疫
原として調製した抗体°ε、抗原と標識剤との結合体と
よりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いうることを
特徴とする免疫測定用試薬を提供するものである。

また、本発明は、単一容器内に、上記のいずれかに記載
の免疫測定用試薬を存在せしめてなることを特徴とする
免疫測定器具を提供するものである 尚、ここでいうハブテンとは、抗原性を示す部位を有す
るが、単独では免疫原となり得す、免疫活性キャリヤー
と結合することによって免疫原となるいわゆる不完全抗
原を指し、抗原とは、単独で免疫原となり得るいわゆる
完全抗原を指す。

以下に、本発明の詳細な説明する。

本発明の免疫測定用試薬は、競合法にて検体中の特定物
質を測定する際に有用な試薬である。

本発明の試薬は、ハブテン、抗原あるいは抗体の測定に
使用することができるが、はじめに、被検出物質がハブ
テンである場合を例に、その測定原理を説明する。

被検出物質がハブテンである場合、本発明の試薬は、ハ
ブテンと標識剤との結合体（以下、単に標識ハブテンと
いう）（ａ）と、ハブテンと免疫活性キャリヤーとの結
合体を免疫原として調製した抗体（ｂ）との組合せであ
る場合（ケース１）と、ハブテン（ｃ）と、ハブテンと
免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原として調製した
抗体（ｂ）と標識剤との結合体（以下、単に標識抗体と
いう）（ｄ）との組合せである場合（ケース２）がある
。

ケース１では、試薬中の抗体（ｂ）と標識ハブテン（ａ
）との結合・解離が可逆的であるので、試薬中の抗体（
ｂ）に、検体中のハブテンと試薬中の標識ハブテン（ａ
）とが競合して結合する。　このような試薬を単一容器
内に存在せしめてなる本発明の測定器具について説明す
ると、容器内に不溶化されている抗体（ｂ）に、検体中
のハブテンと標識ハブテン（ａ）とが競合して結合する
。

一方、ケース２では、試薬中のハブテンＣＣ）と標識抗
体（ｄ）との結合・解離が可逆的であるので、試薬中の
ハブテン（ｃ）と検体中のハブテンとが、競合して試薬
中の標識抗体（ｄ）に結合する。　同じく本発明の測定
器具について説明すると、容器内に不溶化されているハ
ブテン（ｃ）と検体中のハブテンとが、競合して標識抗
体（ｄ）に結合する。

そして、いずれの場合も、Ｂ／Ｆ分離後、残存した標識
物の示すシグナルに基づき、検体中のハブテン量を測定
することができる。

被検出物質が抗原である場合は、免疫活性キャリヤーが
不要であること以外は、ハブテンを抗原と読み換えれば
よい。

また、被検出物質が、ハブテンと免疫活性キャリヤーと
の結合体あるいは抗原を免疫原とする抗体である場合も
、上記と同様である。

即ち、本発明の測定器具について説明すると、ハブテン
（または抗原）が容器に不溶化されており、このハブテ
ン（または抗原）に、検体中の抗体と標識抗体とが競４
合して結合する場合と、抗体が容器に不溶化されており
、この不溶化抗体と検体中の抗体とが、競合して標識ハ
ブテン（または抗原と標識剤との結合体、以下、単に標
識抗原という）に結合する場合がある。

そして、いずれの場合も、Ｂ／Ｆ分離後、残存した標識
物の示すシグナルに基づき、検体中の抗体量を測定する
ことができる。

以上が、本発明の免疫測定用試薬を用いる免疫測定の原
理である。

次に、このような免疫測定に用いる本発明の免疫測定用
試薬となる標識ハブテン（ａ）と抗体（ｂ）との組合せ
、および標識抗原と抗体との組合せについて説明する。

抗体（ｂ）を調製するための免疫原に用いるハブテン（
ただし、免疫活性キャリヤーと結合させて用いる）と標
識ハブテン（ａ）に用いるハブテンとは、類似ではある
が異なる化学構造を有する物質を用いることが好ましい
、　これにより、抗体（ｂ）と標識ハブテン（ａ）との
結合力は様々な程度となるので、抗体（ｂ）と標識ハブ
テン（ａ）との結合・解離が可逆的となる組合せを選択
する。　いいかえれば、抗体を調製するための免疫原に
用いたハブテンと類似ではあるが異なる化学構造を有し
、かつ抗体との交差率が比較的小さいハブテンを標識す
れば、抗体（ｂ）と標識ハブテン（ａ）との反応が可逆
的になる。　ただし、抗体（ｂ）を調製するための免疫
原に用いるハブテンおよび標識５ハブテン（ａ）に用い
るハブテンとして、同じ化学構造を有する物質を用いて
も、調製された抗体（ｂ）と標識ハブテン（ａ）との結
合・解離が可逆的となることもあるので、同じ化学構造
を有する物質を用いてもよい。

実際の免疫測定の場合は、さらに被検出物質の化学構造
の要素も加わり、三者の関係となるが、−船釣には、被
検出物質がハブテンである場合は、抗体（ｂ）を調製す
るための免疫原に用いるハブテンは、被検出物質である
ハブテンと同じか、その抗原性に差が出ない程度に構造
変換されたハブテンを用い、抗原性を示す部分に影響を
与えにくい部位に免疫活性キャリヤーを結合させて用い
る。

一方、標識ハブテンは、調製された抗体（ｂ）と親和性
はあるが、抗体（ｂ）との結合・解離が可逆的となる化
学構造の物質（ハブテン）を標識することによって得れ
ばよい。

また、被検出物質が、ハブテンに免疫活性キャリヤーが
結合した物質に対して生成された抗体である場合は、標
識ハブテン（ａ）には、被検出物質である抗体が生成さ
れる原因物質であるハブテンと同じか、その抗原性に差
が出ない程度に構造変換されたものを用い、抗体（ｂ）
調製のためのハブテン（免疫活性キャリヤーを結合させ
て用いる）は、被検出物質である抗体生成の原因物質で
あるハブテンとは構造の一部が異なるものを用いること
が好ましい。

なお、被検出物質が抗原である場合、あるいは抗原に対
して生成された抗体である場合は、免疫活性キャリヤー
が不要であること以外は、被検出物質がハブテンあるい
はハブテンと免疫活性キャリヤーとが結合した物質に対
して生成された抗体の場合と同様である。

続いて、本発明の免疫測定用試薬となる標識抗体（ｄ）
とハブテン（ｃ）、または標識抗体と抗原との組合せに
ついて説明する。

標識抗体（ｄ）を調製するための免疫原に用いるハブテ
ン（ただし、免疫活性キャリヤーと結合させて用いる）
と、本発明の免疫測定用試薬に用いるハブテン（ｃ）と
は、類似ではあるが異なる化学構造を有する物質を用い
ることが好ましい。　これにより、ハブテン（ｃ）と標
識抗体（ｄ）との結合力は様々な程度となるので、ハブ
テン（ｅ）と標識抗体（ｄ）との結合・解離が可逆的と
なる組合せを選択する。

ただし、標識抗体（ｄ）を調製するための免疫原に用い
るハブテンおよび本発明の免疫測定用試薬に用いるハブ
テン（ｃ）として、同じ化学構造を有する物質を用いて
も、調製された標識抗体（ｄ）と本発明の免疫測定用試
薬に用いるハブテン（ｃ）との結合・解離が可逆的とな
ることもあるので、同じ化学構造を有する物質を用いて
もよい。

一般的には、被検出物質が、ハブテンに免疫活性キャリ
ヤーが結合した物質に対して生成された抗体である場合
は、本発明の免疫測定用試薬に用いるハブテン（ｃ）は
、被検出物質である抗体が生成される原因物質であるハ
ブテンと同じか、その抗原性に差が出ない程度に構造変
換されたものを用い、標識抗体（ｄ）調製のためのハブ
テン（免疫活性キャリヤーを結合させて用いる）は、被
検出物質である抗体が生成される原因物質であるハブテ
ンとは構造の一部が異なるものを用い、標識抗体（ｄ）
と本発明の免疫測定用試薬に用いるハブテン（ｃ）との
結合・解離が可逆的となるようにする。

また、被検出物質がハブテンである場合は、標識抗体（
ｄ）を調製するための免疫原に用いるハブテンは、被検
出物質であるハブテンと同じか、その抗原性に差が出な
い程度に構造変換されたハブテンを用い、抗原性を示す
部分に影響を与えにくい部位に免疫活性キャリヤーを結
合させて用い、本発明の免疫測定用試薬に用いるハブテ
ン（ｃ）は、調製された標識抗体（ｄ）と親和性はある
が、標識抗体（ｄ）との結合・解離が可逆的となる化学
構造の物質（ハブテン）を用いればよい。

なお、被検出物質である抗体が生成される原因物質がハ
ブテンでなく抗原である場合、あるいは被検出物質が抗
原である場合は、免疫活性キャリヤーが不要であること
以外は、被検出物質である抗体が生成される原因物質あ
るいは被検出物質がハブテンの場合と同様である。

また、上記の説明の中に構造変換を行う旨の記載がある
が、これは、一般に行われているいわゆる誘導体の作製
等を指し、通常の方法で行えばよい。

以上、本発明の測定器具に用いる標識ハプテンまたは標
識抗原と抗体との組合せ、およびハブテンまたは抗原と
標識抗体との組合せについて、その原理を説明したが、
続いて、本発明の免疫測定用試薬あるいは免疫測定器具
を用いて検出１．測定することのできる被検出物質の例
と、それらの物質を測定するために、本発明の免疫測定
用試薬に用いる物質について、具体的に説明する。

本発明の免疫測定用試薬あるいは免疫測定器具を用いる
と、エストロン、エストラジオール、エストリオール等
の卵胞ホルモン、プロゲステロン等の黄体ホルモン、テ
ストステロン等の男性ホルモン、アルドステロン等の鉱
質副腎皮質ホルモン、コルチコステロン等の糖質副腎皮
質ホルモン等のステロイド類、サイロキシン等の甲状腺
ホルモン類、アミノ酸およびアミン類、ジゴキシン等の
薬物類、アンジオテンシン、α−ｈＡＮＰ等のペプチド
類その他の比較的低分子量の物質や、それらの代謝産物
等、いわゆるハブテンの測定を行うことができる。

また、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、癌胎児
性抗原（ｃＥＡ）等の抗原性物質やそれらの代謝産物の
測定を行うことができる。

さらには、Ｂ型肝炎ウィルス、風疹ウィルス、各種アレ
ルゲン等を原因物質として生体内で生成された抗体の測
定を行うことができる。

本発明の免疫測定用試薬および免疫測定器具は、特にハ
ブテンの測定に有用であり、中でも、卵胞ホルモン類や
その代謝産物、あるいは黄体ホルモン類やその代謝産物
の測定には特に有用である。　そこで、以下に、尿中エ
ストロゲン、血中エストラジオールまたは血中プロゲス
テロンを測定するための本発明の免疫測定用試薬および
免疫測定器具に用いる抗体と標識ハブテンとの組合せに
ついて、具体例をあげて説明する。

尿中エストロゲンまたは血中エストラジオールを測定す
るための本発明の免疫測定用試薬および免疫測定器具に
は、ハブテン部分が下記構造式Ｉ−ＩＶで表わされる物
質である標識ハブテン（ａ）と、下記構造式！−ＩＶで
表わされる物質と免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫
原として調製した抗体（ｂ）とを用いることが好ましい
。

構造式工 （ＲＩ　　がＨのとき、Ｒ２はＹ’−Ｚであり、Ｒ１が
ｙ２−ｚのとき、Ｒ２はＯである。

Ｙｌは、ステロイド骨格とは二重結合で結合する１〜１
０個の炭素原子および／またはへテロ原子な主鎖とする
直鎮状または分枝鎖状または環構造を有する連結基であ
り、Ｙ２は、酸素原子と単結合で結合する０〜１０個の
炭素原子および／またはへテロ原子を主鎖する直鎮状ま
たは分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、２は
Ｈ，ＮＨｚ　、ＳＨ，Ｃ０ＯＨ，ＣＲ２京たは υ 構造式■ （ＲＩ　　Ｒ２およびＲ３がＨのとき、Ｒ４とＲ１１の
いずれかがＨで、他方はｙ３−ｚであり、Ｒ２Ｒ３およ
びＲ５がＨ，Ｒ’がＹ３−Ｚのとき、Ｒ１がＹ”−Ｚで
あり、Ｒ１およびＲ′がＨ，Ｒ’がＯＨのとき、Ｒ２と
Ｒ３のいずれかがＨで、他方がＹ３−Ｚであるか、ある
いはＲ２がステロイド骨格と二重結合で結合してＹ’−
Ｚとなり、Ｒ３は消失するｓ　　ｙ’は、ステロイド骨
格とは単結合で結合する０〜１０個の炭素原子および／
またはへテロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎖状ま
たは環構造を有する連結基であり、Ｙ２は、酸素原子と
単結合で結合する０〜１０個の炭素原子および／または
へテロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎖状または環
構造を有する連結基であり、ｙｌは、ステロイド骨格と
は二重結合で結合する１〜１０個の炭素原子および／ま
たはへテロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎖状また
は環構造を有する連結基であり、２はＨｌＮＨ，、ＳＨ
，Ｃ０ＯＨ，ＣＨＯまたは構造式■ （Ｒ１がＨで、Ｒ３とＲ４のいずれかがＨのとき、Ｒｓ
とＲ４のうちのＨではない方およびＲ２はＹ’−Ｚであ
り、Ｒ１およびＲ４がＨのとき、Ｒ２とＲ３のいずれか
がＯＨで、他方はＹｌ−Ｚであり、Ｒ４がＨのとき、Ｒ
１はＹ２−Ｚ、Ｒ’　＃ｔＹ”−Ｚ、Ｒ’　はＹ’　−
Ｚ”ｌ’ある。　ＹｌおよびＹ４は、ステロイド骨格と
は単結合で結合する０〜１０個の炭素原子および／また
はへテロ原子を主鎖とする直鎮状または分枝鎮状または
環構造を有する連結基であり、Ｙ２は、酸素原子と単結
合で結合する０〜ｌＯ個の炭素原子および／またはへテ
ロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎮状または環構造
を有する連結基であり、ＺはＨ％ＮＨ２、ＳＲ，Ｃ０Ｏ
Ｈ，ＣＨＯまたは 構造式■ （１ｔ　ｌ　　１ｔ　２　１ｃ　３　　Ｒ４Ｒ６Ｒ８の
うちのいずれかひとつがＹ’−Ｚのとき、他はＨであり
、Ｒ’　　　Ｒ”　　　Ｒ”　　　Ｒ’　　　Ｒ″　　
Ｒ６のうちのいずれかひとつがステロイド骨格と二重結
合で結合してｙ’−ｚとなるとき、ステロイド骨格と二
重結合で結合したＲ８と同一炭素に結合していたＲｙ　
　は消失し、他はＨテア６　、　　ｔｔ　ｉｓ、Ｒ”と
Ｒ’Ｇｔ、ＲＩ　　Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ＠およびＲ６のうち
の同一炭素に結合した２つの基を示す、　Ｙｌは、ステ
ロイド骨格とは単結合で結合する０〜１０個の炭素原子
および／またはへテロ原子を主鎖とする直鎖状または分
枝鎖状または環構造を有する連結基であり、Ｙｌは、ス
テロイド骨格とは二重結合で結合する１〜１０個の炭素
原子および／またはへテロ原子を主鎖とする直鎮状また
は分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、ＺはＨ
，ＮＨ２、ＳＨ％Ｃ０ＯＨ，ＣＨＯまたは り 上記構造式■〜■で示される物質の具体例をあげると、
構造式Ｉに相当するものとしては、エストロン、エスト
ロン−１７−カルボキシメチルオキシム、エストロン−
３−カルボキシメチルエーテル等、構造式Ｈに相当する
ものとしては、エストラジオール、エストラジオールー
３−カルボキシメチルエーテル、エストラジオール−６
α−ヘミサクシネート、エストラジオール−６−カルボ
キシメチルオキシム、エストラジオール−１７α−ヘミ
サクシネート、エストラジオール−１７β−ヘミサクシ
ネート等、構造式ＩＩＩに相当するものとして、エスト
リオール、エストリオール−３−カルボキシメチルエー
テル、エストリオール−１６α。

１フβ−ジヘミサクシネート、エストリオール−１６β
、１７β−ジヘミサクシネート、エストリオール−１６
α−グルクロナイド、エストリオール−１７β−グルク
ロナイド等、構造式■に相当するものとして、エストラ
ジオール−７−ヘミサクシネート、エストラジオール−
７−カルボキシエチルチオエーテル、エストラジオール
−１１−ヘミサクシネート、エストラジオール−１６α
−ヘミサクシネート等がある。

尿中エストロゲン測定用の本発明の免疫測定用試薬およ
び免疫測定器具に用いる抗体と標識ハブテンの調製法お
よび組合せは、以下の通りである。

尿中エストロゲンの測定は、もっばら妊婦の胎児胎盤系
のモニターに用いられている。　これは、胎児胎盤系で
産生されたエストリオールが妊婦尿中に排泄され、その
量から、胎児胎盤系の状態を評価できるからである。

尿中エストロゲンの主成分は、エストリオール誘導体で
あり、そのなかでも、エストリオール−１６α−グルク
ロナイドが重要である。　したがって、尿中エストロゲ
ンの測定では、エストリオール−１６α−グルクロナイ
ドを主たる被測定物質とし、他に、共存するエストリオ
ール抱合体、エストラジオール抱合体およびエストロン
抱合体とも交差反応性がある抗体を用いることが望まし
い。

このような抗体は、エストリオール誘導体、エストラジ
オール誘導体またはエストロン誘導体に免疫活性キャリ
ヤーを結合させた結合体を免疫原として用い、動物に投
与し、免疫した後、細胞融合を行い、抗エストロゲン抗
体産生性バイプリドーマを作製することにより得ること
ができる。

尿中エストロゲン測定を目的とした抗体の調製は、尿中
エストロゲンの主成分がエストリオール抱合体であるか
ら、免疫原のハプテン部分として、エストロン誘導体を
用いるより、エストリオール誘導体を用いる方が有利で
ある。

調製した抗体は、エストロゲン測定範囲と交差反応性を
求める。　そして、標準曲線で５０％阻止となるエスト
リオール−１６α−グルクロナイド濃度が１１００ｎ／
ｍｕ程度であり、エストリオール、エストラジオール、
エストロン、エストリオール１７位地合体、エストリオ
ール１６位地合体、エストリオール１６位１７位地合体
、エストラジオール１７位地合体等と交差反応性を有す
る抗体を選択する。

標識エストロゲンの作製は、抗体の交差反応性の結果を
参考とし、測定対象となるエストロゲン（エストリオー
ル−１６α−グルクロナイド）と抗体との結合力に比べ
、抗体との結合力がやや弱いか同程度のエストロゲン誘
導体を選択する。

例えば、エストリオール１６位１７位誘導体に免疫活性
キャリヤーを結合させた結合体を免疫原として調製した
抗体を用いるならば、エストロン１７位誘導体で標識エ
ストロゲンを作製するのがよい、　もちろん、抗体と標
識エストロゲンの組合せは、この組合せに限定されるも
のではない。

次に、血中エストラジオールが被検出物質である場合に
ついて説明する。

血中エストラジオールの測定は、婦人の性腺機能、とり
わけ卵胞の発育および排卵のモニタリングに用いられる
。

エストラジオール測定に使用する抗体は、エストラジオ
ール３位、６位、７位、１１位、１６位誘導体に免疫活
性キャリヤーを結合させた結合体を免疫原として用い、
動物に投与し、免疫した後、細胞融合を行い、抗エスト
ラジオール抗体産生性バイプリドーマを作製することに
より得ることができる。

このうち、エストラジオール３位または６位誘導体に免
疫活性キャリヤーを結合させた免疫原を用いて抗体を調
製する方法が、交差反応性の面から有利である。

調製した抗体は、エストラジオール測定範囲と各ステロ
イドおよびその誘導体との交差反応性を求−める、　そ
して、標準曲線で５０％阻止となるエストラジオール濃
度が２００ｐｇ／ｍｊ２程度であり、エストラジオール
以外のステロイド類との交差反応性が小さな抗体を選択
する。

標識エストラジオールの作製は、測定に使用する抗体が
エストラジオール６位の誘導体で調製した抗体ならば、
エストラジオール３位の誘導体あるいは同じ６位でも架
橋構造が異なるエストラジオール６位誘導体で作製する
のがよい。　もちろん、抗体と標識エストラジオールと
の組合せは、この組合せに限定されるものではない。

続いて、被検出物質が血中プロゲステロンである場合に
ついて説明する。

血中プロゲステロンを測定するための本発明の免疫測定
用試薬および免疫測定器具には、ハブテン部分が下記構
造式Ｖで表される物質である標識ハブテン（ａ）と、下
記構造式ゾで表される物質と免疫活性キャリヤーとの結
合体を免疫原として調製した抗体（ｂ）とを用いること
が好ましい。

構造式■ Ｃｌ−１゜ （ＲｌがＯのとき、Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５ Ｒ６のうちのいずれか一つがＹ’−Ｚで、他はＨであり
、Ｒ１がｙ’−Ｚ（７）とき、Ｒ２Ｒ３Ｒ’　　Ｒ’　
　Ｒ’　はＨ”Ｑある＠　　　Ｙ’は、ステロイド骨格
またはステロイド骨格に結合したメチレン基と単結合で
結合する０〜１０個の炭素原子および／またはへテロ原
子を生娘とする直鎮状または分枝鎖状または環構造を有
する連結基であり、Ｙ′は、ステロイド骨格とは二重結
合で結合する１〜１０個の炭素原子および／またはへテ
ロ原子を生娘とする直鎮状または分枝鎖状または環構造
を有する連結基であり、２はＨ，ＮＨ２Ｓ）Ｉ、Ｃ０Ｏ
Ｈ，ＣＨＯまたは す 上記構造式Ｖで示される物質の具体例をあげると、プロ
ゲステロン、プロゲステロン−３−カルボキシメチルオ
キシム、プロゲステロン−１１α−ヘミサクシネート、
プロゲステロン−１６α−ヘミサクシネート、プロゲス
テロン−１フα−ヘミサクシネート、プロゲステロン−
１８−ヘミサクシネート、プロゲステロン−１９−ヘミ
サクシネート等がある。

血中プロゲステロン測定用の本発明の免疫測定用試薬お
よび免疫測定器具に用いる抗体と標識ハブテンの調製法
および組合せは、以下め通りである。

血中プロゲステロンの測定は、婦人の性腺機能、とりわ
け黄体機能の診断に用いられる。

プロゲステロン測定に使用する抗体は、プロゲステロン
３位、１１位、１６位、１７位、１８位、１９位誘導体
に免疫キャリヤーを結合させた結合体を免疫原として用
い、動物に投与し、免疫した後、細胞融合を行い、抗プ
ロゲステロン抗体産生性バイプリドーマを作製すること
により得ることができる。　　このうち、プロゲステロ
ン１１位認導体に免疫活性キャリヤーを結合させた結合
体を免疫原として用いて抗体を調製する方法が、交差反
応性の面から有利である。

調製した抗体は、プロゲステロン測定範囲と各ステロイ
ドおよびその誘導体との交差反応性を求める。　そして
、標準曲線で５０％阻止となるプロゲステロン濃度が３
　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｉｔ程度であり、プロゲステロン以
外のステロイド類との交差反応性が小さな抗体を選択す
る。

標識プロゲステロンの作製は、測定に使用する抗体がプ
ロゲステロン１１位の誘導体で調製した抗体ならば、プ
ロゲステロン１９位の誘導体で作製するのがよい、　も
ちろん、抗体と標識プロゲステロンとの組合せは、この
組合せに限定されるものではない。

尚、ハブテンに免疫活性キャリヤーを結合させた結合体
を免疫原とする抗体の調製の際に用いる免疫活性キャリ
ヤーとは、牛血清アルブミン、カギ穴カサガイヘモシア
ニン、サイログロブリン等をいい、ハブテンとの結合は
、酵素免疫測定法（９，４６〜６０、医学書院）や続ラ
ジオイムノアッセイ（９，５６〜６２、ｐ、７８〜８７
、講談社）等に記載された公知の方法で行うことができ
る。

また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル
抗体でもよいが、ポリクローナル抗体を使用する場合は
、アフィニティクロマトグラフィー等を行い、測定に通
した分画を得る方がよい、　従って、作業性等の点から
、抗体は、モノクローナル抗体とすることが好ましい、
　抗体調製のための動物は、特に限定されないが、−船
釣にはマウスを用いる。

標識剤としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカ
リフオスファダーゼ等の酵素、１２１１１等のラジオア
イソトープ、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、
ユウロピウム等の蛍光物質、アクリジニクム誘導体等の
化学発光物質等が使用できるが、取扱い易さ等の点から
、酵素が好ましい。

また、これらの標識剤のハブテン、抗原または抗体への
結合は、酵素免疫測定法（ｐ、４６〜６０、医学書院）
等に記載された公知の方法で行うことができる。

本発明の免疫測定器具は、例えばプラスチック、ガラス
等の材料製の単一の容°器内に、本発明の免疫測定用試
薬（Ｍ！Ａ識ハダハブテン体、標識抗原と抗体、ハブテ
ンと標識抗体、あるいは抗原と標識抗体との組合せ）を
存在せしめたものであるが、これは以下のように作製す
る。

まず、容器に、不溶化させる抗体、ハブテンあるいは抗
原を加え、化学的結合による共有結合あるいは物理的吸
着で不溶化させる。　ここに、対応する標識ハブテン、
標識抗原あるいは標識抗体のバッファー溶液を加え、一
定時間（免疫反応が平衡に達する、あるいは平衡に近づ
くのに十分な時間）反応させる。　その後、凍結あるい
は凍結乾燥を行う。

測定は、検体を添加することにより開始される。　検体
添加後一定時間（免疫反応が平衡に達する、あるいは平
衡に近づくのに十分な時間）が経通したら、Ｂ／Ｆ分離
を行い、残存した標識物由来のシグナル（活性または物
性値）の測定により、検体中の被検出物質量を算出する
。　あるいは、被検出物質の有無を判定する。

本発明の免疫測定用試薬中の標識ハブテン、標識抗原あ
るいは標識抗体は、対応する抗体、あるいはハブテンま
たは抗原との結合・解離が可逆的であるので、検体が添
加されることにより、結合していた標識ハブテン、標識
抗原あるいは標識抗体の一部が検体中の被検出物質量に
比例して解離し、かわって検体中の被検出物質が結合す
る。　従って、標識された物質は予め免疫反応を行って
結合しているにもかかわらず、後から添加された検体中
の被検出物質と競合し、ある一定の平衡状態となり、競
合法による免疫測定が可能となる。

なお、本発明の免疫測定用試薬や免疫測定器具を用いる
場合、免疫反応が平衡状態となるのに要する時間は、３
０分以内程度の短時間である。

〈実施例〉 以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明す
る。

（実施例１） エストラジオール−１７エビーヘミサクシネート、エス
トリオール−１６，１７−ジヘミサクシネート、エスト
リオール−１６エビ。

１７−ジヘミサクシネート、プロゲステロン−１９−ヘ
ミサクシネート、プロゲステロン−１６α−ヘミサクシ
ネート、プロゲステロン−１７α−ヘミサクシネート、
プロゲステロン−１８−へ゛ミサクシネートの製造 １７エビー二ストラジオール、エストリオール、１６エ
ピーエストリオール、１９−ヒドロキシプロゲステロン
、１６α−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロ
キシプロゲステロン、１８−ヒドロキシプロゲステロン
（いずれもＳ　Ｉ　ＧＭＡ社製）を、各々ピリジンに溶
解し、１０〜３０倍モル量の無水コハク酸を加え、窒素
雰囲気下、加熱還流を行った。　反応液に適量の水を加
えて冷却した後、希塩酸で水相を中性とし、その水相か
ら酢酸エチルで生成物を抽出した。　酢酸エチル相を希
塩酸、水、飽和塩化ナトリウム水溶液の順で洗浄した。

エストロゲン誘導体は、さらに酢酸エチル相から飽和炭
酸ナトリウム水溶液で抽出し、酸分面を分離し、水冷下
、酸分面に希塩酸を加えて水溶液を酸性とした後、再度
酢酸エチルで抽出した。　酢酸エチル相を水、飽和塩化
ナトリウム水溶液で洗浄した。

酢酸エチル相に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した後
、減圧下で酢酸エチルを留去した。

得られたステロイド誕導体は、薄層クロマトグラフィで
純度を確認した後、次の操作に使用した。　薄層クロマ
トグラフィにおいて出発物質の混入が認められた場合は
、シリカゲルカラムクロマトグラフィで分離精製を行っ
た。

表１に、各誘導体合成の条件と収率を示した。

（実施例２） エストロン−１７−カルボキシメチルオキシム・牛血清
アルブミン、エストラジオール−１７−ヘミサクシネー
ト・牛血清アルブミン、エストリオール−１６，１７−
ジヘミサクシネート・牛血清アルブミン、エストリオー
ル−１６α−グルクロナイド・牛血清アルブミン、エス
トラジオール−３−カルボキシメチルエーテル・牛血清
アルブミン、エストラジオール−６−カルボキシメチル
オキシム・牛血清アルブミン、エストラジオール−６α
−ヘミサクシネート・牛血清アルブミン、プロゲステロ
ン−１１α−ヘミサクシネート・牛血清アルブミン、プ
ロゲステロン−１９−ヘミサクシネート・牛血清アルブ
ミン、プロゲステロン−１６α−ヘミサクシネート・牛
血清アルブミン、プロゲステロン−１７α−ヘミサクシ
ネート・牛血清アルブミン、プロゲステロン−１８−ヘ
ミサクシネート・牛血清アルブミン、プロゲステロン−
３−カルボキシメチルオキシム・牛血清アルブミンの製
造 エストリオール−１６，１フージヘミサクシネート、プ
ロゲステロン−１９−ヘミサクシネート、プロゲステロ
ン−１６α−ヘミサクシネート、プロゲステロン−１７
α−ヘミサクシネート、プロゲステロン−１８−ヘミサ
クシネート（以上、いずれも実施例１で製造）、エスト
ロン−１７−カルボキシメチルオキシム、エストラジオ
ール−１７−ヘミサクシネート、エストリオール−１６
α−グルクロナイド、エストラジオール−６−カルボキ
シメチルオキシム、プロゲステロン−１１α−ヘミサク
シネート、プロゲステロン−３−カルボキシメチルオキ
シム（以上、いずれもＳ　Ｉ　ＧＭＡ社製）、エストラ
ジオール−３−カルボキシメチルエーテル、エストラジ
オール−６α−ヘミサクシネート（以上、いずれも三谷
産業社製）のステロイド誘導体を用い、混合酸無水物法
で、牛血清アルブミンを結合させた。

ステロイド誘導体の混合酸無水物は、１２±２℃の条件
下、ステロイド誘導体をジオキサンに溶かし、１．１倍
モルのトリｎ−ブチルアミン存在下、等モルの塩化ギ酸
イソブチルを滴下し、２０分間反応させることにより、
調製した。

ステロイド誘導体の混合酸無水物は、直ちに牛血清アル
ブミンと結合反応を行わせた。　即ち、牛血清アルブミ
ンを１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ＩＬの濃度で５０％ジオキ
サン水溶液に溶解し、ｐＨを８に調製した。　　１０±
２℃に冷却し、さきに調製したステロイド誘導体の混合
酸無水物５〜１００倍モルを滴下した。　滴下後、溶液
のｐＨを８に調整し、１０±２℃でさらに２時間攪拌を
行った。　その後、透析チューブに移し、１００倍量の
生理食塩水で透析を３回行い、さらにセファデックスＧ
−５０カラムで精製した。

（実施例３） エストロン−１７−カルボキシメチルオキシム・ペルオ
キシダーゼ、エストラジオール−１７−ヘミサクシネー
ト・ペルオキシダーゼ、エストリオール−１６，１７−
ジヘミサクシネート・ペルオキシダーゼ、エストリオー
ル−１６α−グルクロナイド・ペルオキシダーゼ、エス
トラジオール−１７エビーヘミサクシネート・ベルオキ
ダーゼ、エストリオール−１６エビ、１７−ジヘミサク
シネート・ペルオキシダーゼ、エストラジオール−３−
カルボキシメチルエーテル・ペルオキシダーゼ、エスト
ラジオール−６−カルボキシメチルオキシム・ペルオキ
シダーゼ、エストラジオール−６α−ヘミサクシネート
・ペルオキシダーゼ、プロゲステロン−１１α−ヘミサ
クシネート・ペルオキシダーゼ、プロゲステロン−１９
−ヘミサクシネート・ペルオキシダーゼ、プロゲステロ
ン−１６α−ヘミサクシネート・ペルオキシダーゼ、プ
ロゲステロン−３−カルボキシメチルオキシム・ペルオ
キシダーゼの製造 エストロン−１７−カルボキシメチルオキシム、エスト
ラジオール−１７−ヘミサクシネート、エストリオール
−１６α−グルクロナイド、エストラジオール−６−カ
ルボキシメチルオキシム、プロゲステロン−１１α−ヘ
ミサクシネート、プロゲステロン−３−カルボキシメチ
ルオキシム（以上、いずれもＳ　Ｉ　ＧＭＡ社製）、エ
ストラジオール−３−カルボキシメチルエーテル、エス
トラジオール−６α−ヘミサクシネート（以上、いずれ
も三谷産業社製）、エストリオール−１８，１７−ジヘ
ミサクシネート、エストラジオール−１フエビーヘミサ
クシネート、エストリオール−１６エビ。

１７−ジヘミサクシネート、プロゲステロン−１９−ヘ
ミサクシネート、プロゲステロン−１６α−ヘミサクシ
ネート（以上、いずれも実施例１で製造）を、混合酸無
水物法あるいはＮ−ヒドロキシコハク酸エステル活性化
法を用い、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼＣＴＯＹＯＢ
Ｏ社製）と結合させた。

３−１）混合酸無水物法 ステロイド誘導体の混合酸無水物は、１２±２℃の条件
下、ステロイド誘導体をジオキサンに溶かし、１．１倍
モルのトリｎ−ブチルアミン存在下、等モルの塩化ギ酸
イソブチルを滴下し、２０分間反応させることにより、
調製した。

ステロイド誘導体の混合酸無水物は、直ちにペルオキシ
ダーゼと結合反応を行わせた。　即ち、ペルオキシダー
ゼを５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｊ！の濃度で５０％ジオキサ
ン水溶液に溶解し、ｐＨを８に調整した。　　１０±２
℃に冷却し、さきに調製したステロイド誘導体の混合酸
無水物１〜１００倍モルを滴下した。　滴下後、溶液の
ｐＨを８に調製し、１０±２℃でさらに２時間攪拌を行
った。　　２時間後、透析チューブに穆し、１００倍量
の０．０７６Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＨ７，０）で
透析を３回行い、さらにセファデックスＧ−５０カラム
で精製した。

３−２）Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル活性化法 ステロイド誘導体を９５％ジオキサン水溶液に溶解し、
Ｎ−ヒドロキシコハク酸１．５倍モルと水溶性カルボジ
イミド２倍モルとを添加し、１〜６時間攪拌した。

反応液に酢酸エチルを加え、水相から酢酸エチルで生成
物を抽出した。　酢酸エチル相を水、飽和塩化ナトリウ
ム水溶液の順で洗浄した。

酢酸エチル相に無水硫酸ナトリウム水溶液を加えて乾燥
した後、減圧下で酢酸エチルを留去した。　得られた活
性化ステロイド誘導体は、ジオキサンに溶解し、０℃以
下で保存した。

ペルオキシダーゼを１０　Ｂ／＋ａＪＺの濃度で５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）に溶解し、４±２℃冷却
下、さきに調製した活性化ステロイド誘導体１〜５０モ
ルを滴下した。　滴下後、４±２℃でさらに４時間攪拌
を行った。

その後、透析チューブに穆し、１００倍量の０．０７６
Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，０）で透析を３回行
い、さらにセファデックスＧ−５０カラムで精製した。

なお、各標識物の合成条件は、表２に示した。

（実施例４）モノクローナル抗エストロゲン抗体の製造 エストロゲン誕導体と牛血清アルブミンとの結合物を免
疫原に用い、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに免疫を行った。　追
加免疫を行いながら血中抗体価の変動をモニターし、抗
体価の上昇したマウスの牌細胞を細胞融合に用いた。　
細胞融合は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏｔｇ
ｙ（ＶｏｆＬ、　　７３．　　ｐ、　　３〜４６）記載
の方法に準じて行った。　得られたバイプリドーマの培
養上清をスクリーニングし、抗エストロゲン抗体が検出
されたものについてクローン化を行った。　　さらに、
抗体による交差反応性、測定範囲を測定し、尿中エスト
ロゲン測定に不適当なものを除外した。　選ばれた抗体
を産生ずるハイプリドーマの培養上清から、目的の抗体
を１、プロティンＡを用いたアフィニティカラムで精製
した。

表３に、抗エストロゲン抗体産生性バイプリドーマの作
製過程を示した。

（実施例５）尿中エストロゲン測定用試薬の製造 精製したモノクローナル抗エストロゲン抗体をガラス試
験管に不溶化し、ベルオキダーゼ標識エストロゲン誘導
体溶液を加え、６０分間反応させた。　次に、エストロ
ゲン標準液（１０，５０，２００，１１０００ｎ／ｍｊ
２）を加え、２０分間免疫反応を行わせた後、洗浄を行
った。　さらに、過酸化水素・オルトフェニレンジアミ
ン溶液を加え、１０分間酵素反応を行わせた後、吸光度
を測定した。

精製した抗体を不溶化させであるガラス試験管に、ベル
オキダーゼ標識エストロゲン誘導体溶液を加え、直ちに
エストロゲン標準液を添加し、２０分間免疫反応を行わ
せた場合と比較した。

抗体として、［１５−００８（免疫原：エストリオール
ー１６．１７−ジヘミサクシネート・牛血清アルブミン
）％Ｅ１７−１０２　　（免疫原二ニストラジオールー
１７−ヘミサクシネート・牛血清アルブミン）ｔＭｌｌ
識エストロゲン話導体として、エストロン−１７−カル
ボキシメチルオキシム・ペルオキシダーゼ、エストリオ
ール−１６，１７−ジヘミサクシネート・ペルオキシダ
ーゼを用いて行った場合について、その結果を第１ａ図
、第１ｂ図、第１ｃ図および第１ｄ図に示した。

抗体Ｅ１５−００８とペルオキシダーゼ標識エストロン
−１７−カルボキシメチルオキシムとの組合せは、尿中
エストロゲン測定に適していることが明らかとなった。

　　また、結果は示さないが、この他にＥ５−０５７　
（免疫原：エストリオールー１６．１７−ジヘミサクシ
ネート・牛血清アルブミン）　　Ｅ７−００８　（免疫
原：エストラジオール−１７−ヘミサクシネート・牛血
清アルブミン）の２抗体が測定に適していた。

さらに、抗体Ｅ１５−００８とエストロン−１７−カル
ボキシメチルオキシム・ペルオキシダーゼとの組合せで
、エストロゲン標準液添加後の免疫反応時間を変化させ
た結果を、第２図に示した。

第２図より、抗体とペルオキシダーゼ標識エストロゲン
との反応が可逆的であり、かつ、検体（エストロゲン標
準液）中のエストロゲンと標識エストロゲン誘導体が競
合する抗体との免疫反応が、短時間（約１０分間）で平
衡に達することが確認された。

（実施例６）モノクローナル抗エストラジオール抗体の
製造 エストラジオール誘導体と牛血清アルブミンとの結合体
を免疫原に用い、マウスに免疫を行った。　追加免疫を
行いながら血中抗体価の変動をモニターし、抗体価の上
昇したマウスの牌細胞を細胞融合に用いた。　細胞融合
は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ　　
（Ｖ　ｏ　１１　、　７３　。

ｐ、３〜４６）記載の方法に準じて行った。

得られたバイプリドーマの培養上清をスクリーニングし
、抗エストラジオール抗体が検出されたものについてク
ローン化を行った。　さ　らに、抗体による交差反応性
、測定範囲を測定し、血中エストラジオール測定に不適
当なものを除外した。　選ばれた抗体を産生ずるハイブ
リドーマの培養上清から、目的の抗体を、プロティンＡ
を用いたアフィニティカラムで精製した。

表４に、抗エストラジオール抗体産生性ハイブリドーマ
の作製過程を示した。

（実施例７）血中エストラジオール測定用試薬の製造 精製したモノクローナル抗エストラジオール抗体をガラ
ス試験管に不溶化し、ベルオキダーゼ標識エストラジオ
ール誘導体溶液を加え、６０分間反応させた。　次に、
エストラジオール標準液（１０，５０，２００、ｔｏｏ
ｏ。

５０００　ｐｇ／Ｊ２　）を加え、２０分間免疫反応を
行わせた後、洗浄を行った。　さらに、過酸化水素・オ
ルトフェニレンジアミン溶液を加え、１０分間酵素反応
を行わせた後、吸光度を測定した。

精製した抗体を不溶化させであるガラス試験管に、ベル
オキダーゼ標識エストラジオール誘導体溶液を加え、直
ちにエストラジオール標準液を添加し、２０分間免疫反
応を行わせた場合と比較した。

抗体として、Ｅ２１３−０７４　（免疫原：エストラジ
オール−６−カルボキシメチルオキシム・牛血清アルブ
ミン）　、Ｅ２２６−１０！１　（免疫原：エストラジ
オールー６−カルボキシメチルオキシム・牛血清アルブ
ミン）、標識エストラジオール誘導体として、エストラ
ジオール−６−カルボキシメチルオキシム・ペルオキシ
ダーゼ、エストラジオール−６α−ヘミサクシネート・
ペルオキシダーゼを用いて行った場合について、その結
果を第３ａ図、第３ｂ図、第３ｃ図および第３ｄ図に示
した。

抗体Ｅ２１３−０７４とペルオキシダーゼ標識エストラ
ジオール−６α−ヘミサクシネートとの組合せは、血中
エストラジオール測定に適していることが明かとなった
。　　また、Ｅ、１３−０７４の他にはこのような抗体
を得ることはできなかった。

さらに、Ｅ２１３−０７４とエストラジオール−６α−
ヘミサクシネート・ペルオキシダーゼとの組合せで、エ
ストラジオール標準液添加後の反応時間を変化させた結
果を第４図に示した。

第４図より、抗体とペルオキシダーゼ標識エストラジオ
ールとの反応が可逆的であり、かつ、検体（エストラジ
オール標準液）中のエストラジオールと標識エストラジ
オール誘導体が競合する抗体との免疫反応が、短時間（
約２０分間）で平衡に達することが確認された。

（実施例８）モノクローナル抗プロゲステロン抗体の製
造 プロゲステロン誘導体と牛血清アルブミンとの結合体を
免疫原に用い、マウスに免疫を行った。　追加免疫を行
いながら血中抗体価のＲ動をモニターし、抗体価の上昇
したマウスの牌細胞を細胞融合に用いた。　細胞融合は
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　（
Ｖ　ｏ　Ｉｔ　、　　７３　。

ｐ、３〜４６）記載の方法に準じて行った。

得られたハイブリドーマの培養上清をスクリーニングし
、抗プロゲステロン抗体が検出されたものについてクロ
ーン化を行った。　さらに、抗体による交差反応性、測
定範囲を測定し、血中プロゲステロン測定に不適当なも
のを除外した。　選ばれた抗体を産生ずるハイブリドー
マの培養上清から、目的の抗体を、プロティンＡを用い
たアフィニティカラムで精製した。

表５に、抗プロゲステロン抗体産生性ハイブリドーマの
作製過程を示した。

（実施例９）血中プロゲステロン測定用試薬の製造 精製したモノクローナル抗プロゲステロン抗体をガラス
試験管に不溶化し、ベルオキダーゼ標識プロゲステロン
誘導体溶液を加え、６０分間反応させた。　次に、プロ
ゲステロン標準液（０，２，１，１０，３０，１００ｎ
ｇ／ｓｊ！　）を加え、２０分間免疫反応を行わせた後
、洗浄を行った。　さらに、過酸化水素・オルトフェニ
レンジアミン溶液を加え、１０分間酵素反応を行わせた
後、吸光度を測定した。

精製した抗体を不溶化させであるガラス試験管に、ベル
オキダーゼ標識プロゲステロン誘導体溶液を加え、直ち
にプロゲステロン標準液を添加し、２０分間免疫反応を
行わせた場合と比較した。

抗体として、Ｐ７−００８　（免疫原：ブロゲステロン
−１１α−ヘミサクシネート・牛血清アルブミン）、抗
体Ｐ１５−０３７　　（免疫原：プロゲステロンー１１
α−ヘミサクシネート・牛血清アルブミン）、標識プロ
ゲステロン誘導体として、プロゲステロン−１１α−ヘ
ミサクシネート・ペルオキシダーゼ、プロゲステロン−
１９−ヘミサクシネート・ペルオキシダーゼを用いて行
った場合について、その結果を第５ａ図、第５ｂ図、第
５ｃ図および第５ｄ図に示した。

抗体Ｐ７−００６とペルオキシダーゼ標識プロゲステロ
ン−１９−ヘミサクシネートとの組合せは、血中プロゲ
ステロン測定に適していることが明らかとなった。

また、結果は示さないが、この他に、Ｐ６−０５７（免
疫原：ブロゲステロン−１１α−ヘミサクシネート・牛
血清アルブミン’）　、ＰＩ３−０１６　　（免疫原：
ブロゲステロン−１１α−ヘミサクシネート・牛血清ア
ルブミン）の２抗体が測定に適していた。

さらに、抗体Ｐ７−００６とプロゲステロン−１９−ヘ
ミサクシネート・ペルオキシダーゼとの組合せで、プロ
ゲステロン標準液添加後の免疫反応時間を変化させた結
果を第６図に示した。

第６図より、抗体とペルオキシダーゼ標識プロゲステロ
ンとの反応が可逆的であり、かつ、検体（プロゲステロ
ン標準液）中のプロゲステロンと標識プロゲステロン誘
導体が競合する抗体との免疫反応が、短時間（約２０分
間）で平衡に達することが確認された。

（実施例１０）尿中エストロゲンの測定抗体Ｅ１５−０
０８をガラス試験管（直径１０ｍｍ、長さ８５ｍｍ）に
不溶化し、これに、ペルオキシダーゼ濃度で５０　ｎｇ
／ｍｕのエストロン−１７−カルボキシメチルオキシム
・ペルオキシダーゼ溶液２００μｌを分注し、６０分間
反応させた。　反応後、凍結乾燥を行い、密栓をして保
存し、これを尿中エストロゲン測定用試験管とした。

測定操作は、次のように行った。　即ち、尿中エストロ
ゲン測定用試験管に、検体（場合によってはあらかじめ
希釈した検体）、あるいはエストロゲン標準溶液を一定
量（通常２５０μＡ）加え、２０分間免疫反応を行わせ
た後、洗浄した。　さらに、オルトフェニレンジアミン
（０，３％）と過酸化水素水（０，０２７％）との混合
溶液５００μｍを加え、１０分間酵素反応を行わせ、１
０００μＡの３Ｍリン酸溶液（硫酸、塩酸溶液等でも可
）で酵素反応を停止させた後、吸光度（４９２ｎｍ）を
測定した。　標準曲線より、検体中のエストロゲン濃度
を算出した。

同じ検体について、ラジオイムノアッセイ（アマジャム
社）　蛍光偏光イムノアッセイ（ダイナボット社）およ
びＥ、キット（帝国臓器社）でエストロゲン濃度を測定
し、相関係数を求めた。　なお、検体数は５４であった
。

結果は表６に示したが、本発明の免疫測定用試薬および
免疫測定器具を用いた場合の測定値と、上記の従来法で
測定した測定値とは、高い相関があった。

表　　　６ （実施例１１）血中エストラジオールの測定抗体Ｅ２１
３−０７４をガラス試験管（直径１０ｍｍ、長さ６５ｍ
ｍ）に不溶化し、これに、ペルオキシダーゼ濃度で１０
　ｎｇ／ｍＡのエストラジオール−６α−ヘミサクシネ
ート・ペルオキシダーゼ溶液２００μｍを分注し、６０
分間反応させた。　反応後、凍結乾燥を行い、密栓をし
て保存し、これを血中エストラジオール測定用試験管と
した。

測定操作は、次のように行った。　即ち血中エストラジ
オール測定用試験管に、検体（場合によってはあらかじ
め希釈した検体）、あるいはエストラジオール標準溶液
を一定量（通常２５０μ℃）加え、２０分間免疫反応を
行わせた後、洗浄した。　さらに、オルトフェニレンジ
アミン（０，３％）と過酸化水素水（０，０２７％）と
の混合溶液５００ｕｊ２を加え、１０分間酵素反応を行
わせ、１０００μ互の３Ｍリン酸溶液（硫酸、塩酸溶液
等でも可）で酵素反応を停止させた後、吸光度（４９２
ｎｍ）を測定した。　標準曲線より、検体中のエストラ
ジオール濃度を算出した。

同じ検体について、ラジオイムノアッセイ（ＤＰＣ社、
ＣＩＳ社製！−１２５キツト）でエストラジオール濃度
を測定し、相関係数を求めた。　なお、検体数は３４で
あった。

結果は表７に示したが、本発明の免疫測定用試薬および
免疫測定器具を用いた場合の測定値と、上記の従来法で
測定した測定値とは、高い相関があった。

表 フ （実施例１２）血中プロゲステロンの測定抗体Ｐ７−０
０６をガラス試験管（直径１０ｍｍ。

長さ６５ｍｍ）に不溶化し、これに、ペルオキシダーゼ
濃度で２０　ｎｇ／ｍｆｔのプロゲステロン−１９−ヘ
ミサクシナート・ペルオキシダーゼ溶液２００μｍを分
注し、６０分間反応させた。　反応後、凍結乾燥を行い
、密栓をして保存し、これを血中プロゲステロン測定用
試験管とした。

測定操作は、次のように行った。　即ち、血中プロゲス
テロン測定用試験管に、検体（場合によってはあらかじ
め希釈した検体）、あるいはプロゲステロン標準溶液を
一定量（通常２５０μＪ２）加え、２０分間免疫反応を
行わせた後、洗浄した。　さらに、オルトフェニレンジ
アミン（０，３％）と過酸化水素水（０，０２７％）と
の混合溶液５ｏｏｕＪＺを加え、１０分間酵素反応を行
わせ、１０００ｕＪ２の３Ｍリン酸溶液（硫酸、塩酸溶
液等でも可）で酵素反応を停止させた後、吸光度（４９
２％ｍ）を測定した。ｌ１ｌｌＩ準曲線より、検体中の
プロゲステロン濃度を算出した。

同じ検体について、ラジオイムノアッセイ（ＤＰＣ社、
第一ラジオアイソトープ研究所社）でプロゲステロン濃
度を測定し、相関係数を求めた。　なお、検体数は５４
でありた。

結果は表８に示したが、本発明の免疫測定用試薬および
免疫測定器具を用いた場合の測定値と、上記の従来法で
測定した測定値とは、高い相関があった。

表　　　８ 〈発明の効果〉 本発明により、免疫反応にかかわる抗体と、標識ハブテ
ンまたは標識抗原、あるいは、ハブテンまたは抗原と、
標識抗体との組合せであって、可逆的な結合・解離を行
う組合せからなる免疫測定用試薬と、該試薬を単一容器
内に存在せしめた免疫測定器具が得られる。

本発明の免疫測定器具を用いると、標識物の添加操作が
不要であるので、用手法においては、操作がより簡便と
なり、また、自動化測定装置においては、機械の構造を
簡素化できる。

また、本発明の免疫測定器具を用いると、その測定原理
は競合法であるが、反応操作手順がサンドイツチ法を用
いた免疫測定と同一となり、手技の習得が容易になるほ
か、自動化装置もサンドイツチ法と共通で使用可能とな
る。

さらに、本発明の免疫測定器具を用いると、短時間で免
疫測定を行える。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図、第１ｂ図、第１ｃ図および第１ｄ図は、抗エ
ストロゲン抗体と標識エストロゲン誘導体との免疫反応
の可逆性の有無を検討した結果を示すグラフである。 第２図は、エストロゲンの測定にあたり、免疫反応が平
衡状態となるのに要する時間を検討した結果を示すグラ
フである。 第３ａ図、第３ｂ図、第３ｃ図および第３ｄ図は、抗エ
ストラジオール抗体と標識エストラジオール読導体との
免疫反応の可逆性の有無を検討した結果を示すグラフで
ある。 第４図は、エストラジオールの測定にあたり、免疫反応
が平衡状態となるのに要する時間を検討した結果を示す
グラフである。 第５ａ図、第５ｂ図、第５ｃ図および第５ｄ図は、抗プ
ロゲステロン抗体と標識プロゲステロン説導体との免疫
反応の可逆性の有無を検討した結果を示すグラフである
。 第６図は、 プロゲステロンの測定にあたり、 免疫反応が平衡状態となるのに要する時間を検討した結
果を示すグラフである。 エストーケン係単衣を市刀ｐ Ｇ、２ 免疫反応時間 （分） ニストランオー゛ル係準液を亦り口 Ｆ ■ ３．４ 免疫反応時間 （分） ７０ケステロ７係準？ｌＩをさ加 Ｉ ３．６ 免疫反応時間 （分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ハブテンを測定するに際して用いる試薬であって
   、ハブテンと標識剤との結合体（ａ）と、ハブテンと免
   疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原として調製した抗
   体（ｂ）とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行い
   うることを特徴とする免疫測定用試薬。 （２）ハブテンを測定するに際して用いる試薬であって
   、ハブテン（ｃ）と、ハブテンと免疫活性キャリヤーと
   の結合体を免疫原として調製した抗体（ｂ）と標識剤と
   の結合体（ｄ）とよりなり、両者が可逆的な結合・解離
   を行いうることを特徴とする免疫測定用試薬。 （３）前記ハブテンが卵胞ホルモンおよび／またはその
   類縁物質である請求項１または２に記載の免疫測定用試
   薬。 （４）前記ハブテンが黄体ホルモンおよび／またはその
   類縁物質である請求項１または２に記載の免疫測定用試
   薬。 （５）前記ハブテンが、下記構造式 I 〜IVで表される
   物質のうちの１種以上である請求項１〜３のいずれかに
   記載の免疫測定用試薬。 構造式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＾１がＨのとき、Ｒ＾２はＹ＾１−Ｚであり、Ｒ＾
   １がＹ＾２−Ｚのとき、Ｒ＾２は０である。Ｙ＾１は、
   ステロイド骨格とは二重結合で結合する１〜１０個の炭
   素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖状ま
   たは分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、Ｙ＾
   ２は、酸素原子と単結合で結合する０〜１０個の炭素原
   子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖状または
   分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、ＺはＨ、
   ＮＨ＿２、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼である。） 構造式II ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３がＨのとき、Ｒ＾４とＲ
   ＾５のいずれかがＨで、他方はＹ＾３−Ｚであり、Ｒ＾
   ２、Ｒ＾３およびＲ＾５がＨ、Ｒ＾４がＹ＾３−２のと
   き、Ｒ＾１がＹ＾２−Ｚであり、Ｒ＾１およびＲ＾５が
   Ｈ、Ｒ＾４がＯＨのとき、Ｒ＾２とＲ＾３のいずれかが
   Ｈで、他方がＹ＾３−Ｚであるか、あるいはＲ＾２がス
   テロイド骨格と二重結合で結合してＹ＾１−Ｚとなり、
   Ｒ＾３は消失する。 Ｙ＾３は、ステロイド骨格とは単結合で結合する０〜１
   ０個の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする
   直鎖状または分枝鎖状または環構造を有する連結基であ
   り、Ｙ＾２は、酸素原子と単結合で結合する０〜１０個
   の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖
   状または分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、
   Ｙ＾１は、ステロイド骨格とは二重結合で結合する１〜
   １０個の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とす
   る直鎖状または分枝鎖状または環構造を有する連結基で
   あり、ＺはＨ、ＮＨ＿２、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまた
   は ▲数式、化学式、表等があります▼である。） 構造式III ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＾１がＨで、Ｒ＾３とＲ＾４のいずれかがＨのとき
   、Ｒ＾３とＲ＾４のうちのＨではない方およびＲ＾２は
   Ｙ＾３−Ｚであり、Ｒ＾１およびＲ＾４がＨのとき、Ｒ
   ＾２とＲ＾３のいずれかがＯＨで、他方はＹ＾３−Ｚで
   あり、Ｒ＾４がＨのとき、Ｒ＾１はＹ＾２−Ｚ、Ｒ＾２
   はＹ＾３−Ｚ、Ｒ＾３はＹ＾４−Ｚである。Ｙ＾３およ
   びＹ＾４は、ステロイド骨格とは単結合で結合する０〜
   １０個の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とす
   る直鎖状または分枝鎖状または環構造を有する連結基で
   あり、Ｙ＾２は、酸素原子と単結合で結合する０〜１０
   個の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直
   鎖状または分枝鎖状または環構造を有する連結基であり
   、ＺはＨ、ＮＨ＿２、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼である。） 構造式IV ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５、Ｒ＾６の
   うちのいずれかひとつがＹ＾３−Ｚのとき、他はＨであ
   り、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５、Ｒ＾６
   のうちのいずれかひとつがステロイド骨格と二重結合で
   結合してＹ＾１−Ｚとなるとき、ステロイド骨格と二重
   結合で結合したＲ＾ｘと同一炭素に結合していたＲ＾ｙ
   は消失し、他はＨである。なお、Ｒ＾ｘとＲ＾ｙは、Ｒ
   ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５およびＲ＾６の
   うちの同一炭素に結合した２つの基を示す。Ｙ＾３は、
   ステロイド骨格とは単結合で結合する０〜１０個の炭素
   原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖状また
   は分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、Ｙ＾１
   は、ステロイド骨格とは二重結合で結合する１〜１０個
   の炭素原子および／またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖
   状または分枝鎖状または環構造を有する連結基であり、
   ＺはＨ、ＮＨ＿２、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼である。） （６）前記ハブテンが、下記構造式Ｖで表される物質の
   うちの１種以上である請求項１、２または４のいずれか
   に記載の免疫測定用試薬。 構造式Ｖ ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＾１が０のとき、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５
   、Ｒ＾６のうちのいずれか一つがＹ＾３−Ｚで、他はＨ
   であり、Ｒ＾１がＹ＾１−Ｚのとき、Ｒ＾２、Ｒ＾３、
   Ｒ＾４、Ｒ＾５、Ｒ＾６はＨである。Ｙ＾３は、ステロ
   イド骨格またはステロイド骨格に結合したメチレン基と
   単結合で結合する０〜１０個の炭素原子および／または
   ヘテロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎖状または環
   構造を有する連結基であり、Ｙ＾１は、ステロイド骨格
   とは二重結合で結合する１〜１０個の炭素原子および／
   またはヘテロ原子を主鎖とする直鎖状または分枝鎖状ま
   たは環構造を有する連結基であり、ＺはＨ、ＮＨ＿２、
   ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼である。） （７）前記ハブテンと標識剤との結合体（ａ）中のハブ
   テンと、前記抗体（ｂ）の調製に用いるハブテンと免疫
   活性キャリヤーとの結合体中のハブテンとが、異なる化
   学構造を有する類縁物質である請求項１、３〜６のいず
   れかに記載の免疫測定用試薬。 （８）前記ハブテン（ｃ）と、前記結合体 （ｄ）の抗体（ｂ）部分の調製に用いるハブテンと免疫
   活性キャリヤーとの結合体中のハブテンとが、異なる化
   学構造を有する類縁物質である請求項２〜６のいずれか
   に記載の免疫測定用試薬。 （９）抗原を測定するに際して用いる試薬であって、抗
   原と標識剤との結合体と、抗原を免疫原として調製した
   抗体とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いうる
   ことを特徴とする免疫測定用試薬。 （１０）抗原を測定するに際して用いる試薬であって、
   抗原と、抗原を免疫原として調製した抗体と標識剤との
   結合体とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いう
   ることを特徴とする免疫測定用試薬。 （１１）抗体を測定するに際して用いる試薬であって、
   ハブテンと免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原とし
   て調製した抗体（ｂ）と標識剤との結合体（ｄ）と、ハ
   ブテン（ｃ）とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を
   行いうることを特徴とする免疫測定用試薬。（１２）抗
   体を測定するに際して用いる試薬であって、ハブテンと
   免疫活性キャリヤーとの結合体を免疫原として調製した
   抗体（ｂ）と、ハブテンと標識剤との結合体（ａ）とよ
   りなり、両者が可逆的な結合・解離を行いうることを特
   徴とする免疫測定用試薬。 （１３）抗体を測定するに際して用いる試薬であって、
   抗原を免疫原として調製した抗体と標識剤との結合体と
   、抗原とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いう
   ることを特徴とする免疫測定用試薬。 （１４）抗体を測定するに際して用いる試薬であって、
   抗原を免疫原として調製した抗体と、抗原と標識剤との
   結合体とよりなり、両者が可逆的な結合・解離を行いう
   ることを特徴とする免疫測定用試薬。 （１５）前記ハブテンと免疫活性キャリヤーとの結合体
   を免疫原として調製した抗体（ｂ）がモノクローナル抗
   体である請求項１〜８、１１、１２のいずれかに記載の
   免疫測定用試薬。 （１６）前記抗原を免疫原として調製した抗体がモノク
   ローナル抗体である請求項９、 １０、１３、１４のいずれかに記載の免疫測定用試薬。 （１７）前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナ
   ル抗体である請求項１５または１６に記載の免疫測定器
   具。 （１８）前記標識剤が酵素である請求項１〜１７のいず
   れかに記載の免疫測定用試薬。 （１９）単一容器内に、請求項１〜１８のいずれかに記
   載の免疫測定用試薬を存在せしめてなることを特徴とす
   る免疫測定器具。