JPH0731202B2

JPH0731202B2 - 微量成分の新規な分別測定方法

Info

Publication number: JPH0731202B2
Application number: JP2016694A
Authority: JP
Inventors: 慎二里村; 賢治中村; 脩治松浦
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 1995-04-10
Anticipated expiration: 2010-04-10
Also published as: JPH03221865A

Description

【発明の詳細な説明】［発明の利用分野］本発明は、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、
リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の同
一の作用を有する２以上の測定対象物質又は類似した構
造を有するが異なる作用を有する２以上の測定対象物質
を、その化学的又は／及び物理的な性質に応じて、迅速
に、容易に且つ精度良く分別測定する方法に関する。

［発明の背景］生体試料中に含まれる微量成分の中には、同一の作用を
有するが化学的又は／及び物理的に異なる性質を有する
もの、或は類似の構造を有するが異なる作用を有するも
のが存在する。例えば、蛋白質部分或は糖鎖部分の構造
が異なる酵素（アイソザイム）や糖鎖構造の異なるホル
モン等の生理活性物質は前者に相当し、ステロイドホル
モン類や甲状腺刺激ホルモン（TSH），卵胞刺激ホルモ
ン（FSH），ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）等のホル
モン等の生理活性物質が後者に相当する。これらの試料
中の量を、種々の性質に応じて分別測定することができ
れば、臨床上有効な指標が得られることは良く知られて
いる。

これらを分別測定する一般的な方法としては、例えば電
気泳動法、イムノアッセイ法、抗体やインヒビターを用
いた酵素活性の阻害を利用した方法等が挙げられる。し
かしながら、これらの方法は、測定に時間を要する、定
量性が低い等の問題点があり、必ずしも実用的な方法と
はいい難い。

一方、このような問題点を解決する方法として、イオン
交換クロマトグラフィ用充填剤を充填したカラムを用い
た高速液体クロマトグラフィ（HPLC）により、乳酸脱水
素酵素のアイソザイムを分別測定する方法が提案されて
いる（J.Chromatogr.,374,45〜50頁,1986、J.Chromatog
r.,378,456〜461頁,1986）。しかしながら、この方法に
於いても、分別測定の対象となり得るものはある程度限
られており、しかも分別のための測定条件は測定対象物
質に応じて設定する必要がある等の問題点を有している
ので、必ずしも良い方法であるとは言い難く、更なる改
良が望まれていた。

［発明の目的］本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、生
体由来の試料中の、同一の作用を有する２以上の測定対
象物質又は類似した構造を有するが異なる作用を有する
２以上の測定対象物質を、その化学的又は／及び物理的
な性質に応じて、迅速に、容易に且つ精度良く分別測定
し得る方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］本発明は、同一の作用を有する２以上の測定対象物質又
は類似した構造を有するが異なる作用を有する２以上の
測定対象物質（以下、単に、測定対象物質と略記す
る。）を含む試料を、測定対象物質全てに対して結合能
を有し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な
性質を有しているか又は何らかの方法により検出可能な
物質により標識されている物質（以下、結合能物質Ａと
略記する。尚、結合能物質Ａは、担体に固定されていな
い。）及び測定対象物質の少なくとも１つに対しては結
合能を有するが少なくとも１つとは結合しない物質（以
下、結合能物質Ｂと略記する。尚、結合能物質Ｂは、担
体に固定されていない。）と混合して反応させた後、溶
液中の、測定対象物質と結合能物質Ａとの複合体（以
下、複合体Ａと略記する。）と、測定対象物質と結合能
物質Ａ及び結合能物質Ｂとの複合体（以下、複合体Ｂと
略記する。）と、遊離の結合能物質Ａとを高速液体クロ
マトグラフィにより分離し、複合体Ａ中の結合能物質Ａ
の量又は／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａの量を測定す
ることにより試料中の測定対象物質の何れかの量を測定
することを特徴とする分別測定方法の発明である。

本発明の分別測定方法を実施するには、例えば以下のよ
うにして行えばよい。

即ち、先ず測定対象物質を含む生体由来の試料と、結合
能物質Ａ及び結合能物質Ｂとを、要すれば適当な緩衝液
中に添加、混合して反応させ、複合体Ａ及び複合体Ｂを
形成させた後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物
質Ａとを所定の充填剤を充填したカラムを装着したHPLC
により分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に含ま
れる結合能物質Ａの量又は／及び複合体Ｂ中に含まれる
結合能物質Ａの量を、結合能物質Ａが保有する性質に応
じた測定方法により求めれば、試料中の測定対象物質の
何れかの量が求められる。

本発明の分別測定方法により測定可能な測定対象物質と
しては、測定対象物質の全てと結合し、且つそれ自身が
何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は
何らかの方法により検出可能な物質（以下、検出物質と
略記する。）により標識が可能な物質が存在し、更に測
定対象物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用
（affinity;親和力或は親和性）を及ぼしあい、強固な
複合体を形成するが、それらの少なくとも１つとは結合
しない物質が存在するものであれば、特に限定すること
なく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生
体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試
料中に含まれる酵素、生理活性物質、癌関連抗原、糖鎖
を有する物質等が代表的なものとして挙げられる。更に
具体的には、例えばアミラーゼ，アルカリホスファター
ゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェ
ラーゼ（γ−GTP），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（C
K），乳酸脱水素酵素（LDH），グルタミン酸オキザロ酢
酸トランスアミナーゼ（GOT），グルタミン酸ピルビン
酸トランスアミナーゼ（GPT），レニン，プロテインキ
ナーゼ，チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイ
ドホルモン，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG），プロ
ラクチン，甲状腺刺激ホルモン（TSH），黄体形成ホル
モン（LH）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原
（PSA），α_２−マクログロブリン，癌胎児性抗原（CE
A），α−フェトプロテイン等の癌関連抗原等が好まし
く挙げられる。

本発明に係る結合能物質Ａとしては、測定対象物質の全
てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可
能な性質を有しているか又は検出物質により標識されて
いる物質であれば特に限定することなく挙げられる。結
合能物質Ａに係る、測定対象物質全てに対して結合能を
有する物質の具体例としては、例えば抗原性を有する物
質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定
部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能を有
する例えばコンカナバリンA,レンズマメレクチン，イン
ゲンマメレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタ
ケレクチン，ヒママメレクチン，ピーナッツレクチン，
小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラーゼ，ク
レアチンキナーゼ（CK），グルタミン酸オキザロ酢酸ト
ランスアミナーゼ（GOT）等の酵素に対するインヒビタ
ー等が挙げられ、これらに検出物質を標識したものが結
合能物質Ａの具体例として好ましく挙げられる。検出物
質としては、例えば酵素免疫測定法（EIA）に於いて用
いられるアルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダー
ゼ，パーオキシダーゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グ
ルコースオキシダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素
酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素
類、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられる
⁹⁹mTc,¹³¹I,¹²⁵I,¹⁴C,³H等の放射性同位元素、例えば蛍
光免疫測定法（EIA）で用いられるフルオレセイン，ダ
ンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン
或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリ
ン，イソルミノール，ルミノール，ビス（2,4,6−トリ
フロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えば
フェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘
導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ
−2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−１−オキシル,3
−アミノ−2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−１−オ
キシル,2,6−ジ−ｔ−ブチル−α−（3,5−ジ−ｔ−ブ
チル−４−オキソ−2,5−シクロヘキサジエン−１−イ
リデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する
化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有
する物質等が挙げられるが、これらに限定されるもので
はないことは言うまでもない。

上記した如き物質に、上記した如き検出物質を標識させ
て結合能物質Ａを調製する方法としては、自体公知のEI
A、RIA或はFIA等に於いて一般に行われている自体公知
の標識方法（例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄
一監修、第１版、中山書店、1971;図説蛍光抗体、川
生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983;酵
素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、
医学書院、1982等）が何れも例外なく挙げられ、これら
に準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジン
（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用し
た常法を利用しても良いことは言うまでもない。

本発明に係る結合能物質Ａとしては、このように検出物
質で標識されたもの以外にそれ自身何らかの方法により
検出可能な性質を有するものも挙げることができる。本
発明に係る結合能物質Ａが有する何らかの方法により検
出可能な性質の例としては、例えば酵素活性、蛍光性、
発光性或は紫外部に吸収を有する性質等が挙げられる。

本発明に係る結合能物質Ｂとしては、測定対象物質の少
なくとも１つとは互いに強い相互作用（affinity;親和
力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体を形成する
が、測定対象物質の少なくとも１つとは結合しない物質
であれば特に限定することなく挙げられる。具体的に
は、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含む。）の
特定の部分構造或は抗原決定部位に対する特定の抗体や
特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えばコンカナ
バリンA,レンズマメレクチン，インゲンマメレクチン，
ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレクチン，ヒママ
メレクチン，ピーナッツレクチン，小麦胚芽レクチン等
のレクチン類、或はアミラーゼ、クレアチンキナーゼ
（CK），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（GOT）等の酵素に対する特定のインヒビター等が好ま
しく挙げられる。

尚、要すれば、結合能物質Ｂを、結合能物質Ａのところ
で述べたような検出物質で上記した如き方法により標識
してもよい。この場合に、結合能物質Ａが保持している
検出物質と同じものを標識すれば、複合体Ｂの検出感度
が高くなって検出が容易となると言う利点が生じる。但
し、標識された結合能物質Ｂを用いて本発明の分別測定
方法を実施する場合には、遊離の結合能物質Ｂは、複合
体Ａ及び複合体Ｂと、HPLCにより分離し得る性質を有し
ていなければならないことは言うまでもない。

本発明の分別測定方法に於いて、測定対象物質と、結合
能物質Ａ及び結合能物質Ｂとを反応させて、複合体Ａ及
び複合体Ｂを形成させる際の反応条件としては、複合体
Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げたり、測定対象物
質、結合能物質Ａ並びに結合能物質Ｂを変質させてしま
う様な条件でさえなければ特に限定されないが、例えば
EIA,RIA,FIA,アフィニティクロマトグラフィ等の自体公
知の方法に於いて採用されている複合体等を形成させる
際の反応条件に準じて行われるのが一般的である。例え
ば、反応時に緩衝液を用いる場合には、使用される緩衝
剤やその他の試薬はこれ自体公知の方法に於いて用いら
れるものを適宜選択して用いればよい。

本発明の分別測定方法に於いて、複合体Ａ及び複合体Ｂ
を形成させる際の結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂの使用
濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度をどの程度
に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限定さ
れない。結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂは通常夫々１種
を用いれば足りるが、要すれば夫々について２種以上組
み合わせて用いてもよい。この場合に、測定対象物質上
の異なる部位に各々結合する性質を有する２種類以上の
結合能物質Ａ、任意の測定対象物質上の異なる部位に各
々結合する性質を有する２種類以上の結合能物質Ｂ等を
組み合わせて用いれば、結果的に複合体Ａ及び複合体Ｂ
の分子量が大きくなり、また、場合によっては等電点も
変動すること等から、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結
合能物質Ａの分離がより容易となり、測定精度の向上を
計ることができる。また、測定対象物質が、例えばＸ、
Ｙ及びＺの混合物である場合に、例えばＸに対する結合
能物質ＢとＹに対する結合能物質Ｂを併せて用いれば、
Ｘ、Ｙ及びＺを各々同時に分別測定することも可能であ
る。

本発明の分別測定法に於いて、反応時のpHとしては、複
合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げない範囲であ
れば特に限定されるものではないが、通常２〜10、好ま
しくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の温度も、複
合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げない範囲であ
れば特に限定されるものではないが、通常０〜70℃、好
ましくは20〜40℃の範囲が挙げられる。反応時間は、複
合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのに要する時間が測定
対象物質や結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂの性質により
異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至数時間適宜
反応させればよい。

本発明の測定方法に於いて、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊
離の結合能物質Ａの分離に用いられるHPLCとしては、装
置自身は通常分析の分野に於いて用いられているもので
定流速のものであれば特に問題なく用いることができる
が、分離用カラムに使用する充填剤は、複合体Ａ、複合
体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａとの間にどのような性質の
差があるかにより種々のものが適宜選択されて使用され
なければならないことは言うまでもない。即ち、例えば
複合体Ｂの分子量が複合体Ａの分子量の約1.2倍以上、
好ましくは1.5倍以上、更に好ましくは２倍以上あり、
且つ複合体Ａの分子量が遊離の結合能物質Ａの分子量の
約1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、更に好ましくは２
倍以上ある場合にはゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）
用の充填剤が適している。また、例えば複合体Ａ、複合
体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａの等電点が互いに異なる場
合であって、各等電点の差がpHで0.05以上、好ましくは
0.2以上ある場合にはイオン交換クロマトグラフィ用或
は等電点クロマトグラフィ用の充填剤が適しており、例
えば複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａの疎水
性に明らかな差が有る場合には疎水クロマトグラフィ用
充填剤、逆相クロマトグラフィ用充填剤或はハイドロキ
シアパタイト等が適している。

HPLCにより複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａ
の分離を行う際に用いられる溶液（溶離液）としては、
形成された複合体Ａ及び複合体Ｂが再び測定対象物質と
結合能物質Ａ或は測定対象物質と結合能物質Ｂとに分解
されるようなことがなく、且つ複合体Ａ及び複合体Ｂに
含まれる結合能物質Ａが有している或は結合能物質Ａが
保持している検出物質が有している、何らかの方法によ
り検出し得る性質を失わしめるようなものでなければ特
に限定されることなく挙げられるが、通常は例えばEIA,
RIA,FIA,アフィニティクロマトグラフィ等の自体公知の
方法に於いて緩衝液として用いられているようなものが
好ましく用いられる。具体例としては、例えばリン酸
塩，酢酸塩，クエン酸塩，グッド（Good）の緩衝剤，ト
リス（ヒドロキシエチル）アミノメタン等の緩衝剤、例
えば塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸アンモニウム
等の塩類、例えばメタノール，エタノール，イソプロピ
ルアルコール，アセトニトリル，テトラヒドロフラン等
の極性有機溶媒類及び界面活性剤等を、複合体Ａ、複合
体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａの性質に応じて適宜選択
し、添加、混合して調製された、pH2〜10の緩衝液が好
ましく用いられる。

本発明の分別測定方法に於いて、HPLCにより分離された
複合体Ａ及び複合体Ｂ中に含まれる結合能物質Ａの量の
測定は、結合能物質Ａが或は結合能物質Ａに保持されて
いる検出物質が有している、何らかの方法により検出し
得る性質に応じて夫々所定の方法に従って実施される。
例えば、その性質が酵素活性の場合にはEIAの常法、例
えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊No.3
1、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜6
3頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載
された方法に準じて測定を行えばよく、検出物質が放射
性物質の場合にはRIAの常法に従い、該放射性物質の出
す放射線の種類及び強さに応じて液浸型GMカウンター，
液体シンチレーションカウンター，井戸型シンチレーシ
ョンカウンター,HPLC用カウンター等の測定機器を適宜
選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験
講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971
等参照。）。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光
度計等の測定機器を用いるFIAの常法、例えば「図説
蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス
社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
く、その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等
の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋
白質核酸酵素別冊No.31、北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版（株）、
1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定
を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する
性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法に
よって測定を行えばよく、検出物質がスピンの性質を有
する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、
例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊N
o.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、26
4〜271頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に
記載された方法に準じて測定を行えばよい。

また、本発明の分別測定方法に於いて、HPLCによる分離
後の測定方式としては、例えば「最新液体クロマトグラ
フィ、原昭二・辻章夫編、第１版、92〜104頁、南山
堂、1978年２月１日発行」等に記載されているような、
HPLCのカラムからの流出液をそのまま検出部に導き、流
出液中の複合体Ａ及び複合体Ｂ中に含まれる結合能物質
Ａの量を直接測定する方式が、測定が迅速に行えるので
より好ましい。この場合に、結合能物質Ａが或は結合能
物質Ａに保持されている検出物質が有している、何らか
の方法により検出し得る性質が、例えば酵素活性であれ
ば、HPLCのカラムと検出部との間に、酵素活性測定用の
試薬を添加し流出液と反応させる、所謂ポストカラム法
の反応部を設ける必要があることは言うまでもない。係
合能物質Ａの該性質が酵素活性である場合に該反応部に
於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は、常法、例え
ば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊No.3
1、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜6
3頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載
された方法に準じて調製したものを用いてもよいし、市
販されている臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利
用してもよい。また、結合能物質Ａの該性質が酵素活性
以外の場合に於いても、検出感度を増加させる目的で所
定の試薬を添加、反応させるために、HPLCのカラムと検
出部との間に適当な反応部を設けることは任意である。
尚、結合能物質Ｂが、結合能物質Ａに保持されているの
と同じ検出物質により標識されている場合には、各複合
体中の結合能物質Ａの量を測定することにより、複合体
Ｂ中の結合能物質Ｂの量も併せて測定されることは言う
までもない。

本発明の分別測定方法に於いて、結合能物質Ａに係る、
測定対象物質全てに対して結合能を有する物質及び／又
は結合能物質Ｂとして抗体を用いる場合には、目的に応
じて使用する抗体を適宜ペプシン，パパイン等の酵素を
用いて消化してＦ（ab′）_２、Fab′或はFabとして使用
することも可能である。特に、Fab′とした場合には、
これに対して検出物質を容易に標識し得ると言う利点が
生じる。また、Fab′或はFabとして利用した場合には、
結合能物質Ａや結合能物質Ｂが、各々が結合能を有する
測定対象物質１個当りに１個（測定対象物質が２量体や
３量体等になっている場合には単量体あたりに１個）結
合するため、複合体Ａ及び複合体ＢがHPLCにより溶出さ
れて来る時間がほぼ一定となるのでより好ましい。ま
た、抗体として１つの抗原認識部位のみと結合する性質
を備えたモノクローナル抗体を用いた場合にも、測定対
象物質１個当りに１個（測定対象物質が２量体や３量体
等になっている場合には単量体あたりに１個）のモノク
ローナル抗体が結合するため、複合体Ａ及び複合体Ｂが
HPLCにより溶出されて来る時間がほぼ一定となるのでよ
り好ましい。この場合にも、これを消化してFab′或はF
abとして用いてもよいことは言うまでもない。

本発明に於いて用いられる、結合能物質Ａに係る、測定
対象物質全てに対して結合能を有する物質又は／及び結
合能物質Ｂとしての抗体は、常法、例えば「免疫学実験
入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、19
81」等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、
ラット、マウス等の動物に測定対象物質を免疫して作製
されるポリクローナル抗体でも、或はまた常法、即ちケ
ラーとミルスタイン（G.Khler and C.Milstein;Natur
e,256,495,1975）により確立された細胞融合法に従い、
マウスの腫瘍ラインからの細胞と、測定対象物質で予め
免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイ
ブリドーマが産生する単クローン性抗体でも何れにても
よく、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用
いる等は任意である。

本発明の分別測定方法によれば、測定に要する時間は数
分から数時間程度であり、必要な測定操作自体は、測定
対象物質を含む試料、結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂを
混合した後、HPLCにより複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の
結合能物質Ａとを分離し、複合体Ａ中の結合能物質Ａの
量又は／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａの量を検出する
のみである。これらのことから明らかなように、本願発
明の分別測定方法は、従来の同様な目的の分別測定方法
に比べて、簡便に且つ迅速に目的の測定を行うことがで
きる。

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。

［実施例］実施例1.糖鎖構造の異なるヒト絨毛性ゴナドトロピン
（hCG）の分別測定（溶離液）リン酸１ナトリウム3.9g、リン酸２ナトリウム（12水
塩）81g、塩化ナトリウム44g及び３−（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）−プロピオン酸8.3gをイオン交換水に溶解
し、pH7.5となるように1N NaOH溶液を加えた後、全量5l
として溶離液とした。

（基質液） 30％過酸化水素水をイオン交換水で希釈し、H₂O₂の20mM
溶液を調製して基質液とした。

（抗体液）抗hCG−β鎖モノクローナル抗体（和光純薬工業（株）
製）を常法により処理してFab′とし、これに常法によ
り西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）を標識して得たP
OD標識抗hCG−β鎖−Fab′を、50mMリン酸緩衝液（pH7.
0、150mM塩化ナトリウム含有）中に95ng/mlの蛋白濃度
となるように添加して抗体液とした。

（レクチン液）レンズマメレクチン（LCA−Ａ）を、50mMリン酸緩衝液
（pH7.0）中に1.5mg/mlの蛋白濃度となるように添加し
てレクチン液とした。

（試料）市販のhCG（胎盤絨毛由来、シグマ社製）又は絨毛癌患
者血清から精製された絨毛癌由来のhCGをイオン交換水
に溶解して、hCG濃度100,200,300,400又は500mIU/mlの
溶液を夫々調製し、試料とした。

（HPLCの使用条件）システムの概略は第２図の通り。

・カラム及び充填剤:0.46φ×60cm。YMC−パックDiol−
200（山村化学研究所（株）社商品名）。

・流速：溶離液;0.5ml/min.、基質液;0.05ml/min.。

・反応部:0.04φ×900cm（40℃保温）。

・検出：励起波長320nm、蛍光波長404nmで蛍光を測定し
た。

（測定操作）抗体液40μｌ、レクチン液40μｌ及び試料20μｌとを混
合し、30℃で30分間放置した後、混合液の20μｌをHPLC
により分析した。

（結果） HPLCによる分析の結果、POD標識抗hCG−β鎖−Fab′は1
2.5分後に、POD標識抗hCG−β鎖−Fab′と胎盤絨毛由来
のhCGとの複合体（複合体Ａ）は11.0分後に、POD標識抗
hCG−β鎖−Fab′とLCA−Ａ及び絨毛癌由来のhCGとの複
合体（複合体Ｂ）は10.2分後に溶出してくることが判っ
た。この結果から明らかな如く、POD標識抗hCG−β鎖−
Fab′とLCA−Ａとを夫々結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂ
として用いることにより、糖鎖構造の異なるhCGを分離
できることが判る。

実施例2.hCG及び甲状腺刺激ホルモン（TSH）の分別測定（溶離液）実施例１と同じ。

（基質液）実施例１と同じ。

（抗体液１）抗hCG−α鎖モノクローナル抗体（和光純薬工業（株）
製）を常法により処理してFab′とし、これに常法によ
り西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）を標識して得たP
OD標識抗hCG−α鎖−Fab′を、50mMリン酸緩衝液（pH7.
0、150mM塩化ナトリウム含有）中に70ng/mlの蛋白濃度
となるように添加して抗体液１とした。

（抗体液２）抗hCG−β鎖モノクローナル抗体（和光純薬工業（株）
製）を50mMリン酸緩衝液（pH7.5、150mM NaCl含有）中
に950μg/mlの蛋白濃度となるように添加して抗体液２
とした。

（ホルモン液）市販のhCG（胎盤絨毛由来、シグマ社製）及びTSH（UCB
バイオプロダクトS.A.社製）を夫々が0.04,0.08,0.12,
0.16又は0.20nMとなるように、50mMリン酸緩衝液（pH7.
5、150mM NaCl含有）に溶解したものをホルモン液とし
た。

（HPLCの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・流速：溶離液;0.5ml/min.、基質液;0.05ml/min.。

・反応部:0.04φ×900cm（55℃加温）。

・検出：励起波長320nm、蛍光波長404nmで蛍光を測定し
た。

（測定操作）抗体液1 40μｌ、ホルモン液20μｌ及び抗体液2 40μｌ
とを混合し30℃で30分間放置した後、混合液の15μｌを
HPLCにより分析した。

（結果） HPLCによる分析の結果、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′は1
2.5分後に、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′とTSHとの複合
体（複合体Ａ）は11.7分後に、POD標識抗hCG−α鎖−Fa
b′と抗hCG−β鎖モノクローナル抗体及びhCGとの複合
体（複合体Ｂ）は10.2分後に溶出してくることが判っ
た。この結果から明らかな如く、POD標識抗hCG−α鎖−
Fab′と抗hCG−β鎖モノクローナル抗体を夫々結合能物
質Ａ及び結合能物質Ｂとして用いることにより、hCGとT
SHとを分離できることが判る。

また、HPLCによる分析の結果得られた、各試料のhCG濃
度（nM）又はTSH濃度（nM）と、複合体のピーク高さ値
（μＶ）との関係を表わす検量線を第１図に示す。尚、
第１図に於いて、−○−はhCGに係る検量線を、−●−
はTSHに係る検量線を夫々示す。

実施例3.hCG、黄体形成ホルモン（LH）及び甲状腺刺激
ホルモン（TSH）の分別測定（溶離液）実施例１と同じ。

（基質液）実施例１と同じ。

（抗体液１）実施例２と同じ。

（抗体液２）抗hCG−β鎖モノクローナル抗体（和光純薬工業（株）
製）及び抗LH−β鎖モノクローナル抗体（バイオクロン
・オーストラリア社）を常法により処理して各々をFab
とし、50mMリン酸緩衝液（pH7.5、150mM NaCl含有）中
に夫々が２μg/mlの蛋白濃度となるように添加して抗体
液２とした。

（ホルモン液）市販のhCG（胎盤絨毛由来、シグマ社製）、LH（UCBバイ
オプロダクトS.A.社製）及びTSH（UCBバイオプロダクト
S.A.社製）を夫々が1nMとなるように、50mMリン酸緩衝
液（pH7.5、150mM NaCl含有）に溶解したものをホルモ
ン液とした。

（HPLCの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・流速：溶離液;0.5ml/min.、基質液;0.05ml/min.。

・反応部:0.04φ×900cm（55℃加温）。

・検出：励起波長320nm、蛍光波長404nmで蛍光を測定し
た。

（測定操作）抗体液1 40μｌ、ホルモン液30μｌ及び抗体液2 40μｌ
とを混合し30℃で30分間放置した後、混合液の15μｌを
HPLCにより分析した。

（結果） HPLCによる分析の結果、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′は1
2.5分後に、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′と抗hCG−β鎖
−Fab及びhCGとの複合体は10.0分後に、POD標識抗hCG−
α鎖−Fab′と抗LH−β鎖−Fab及びLHとの複合体は11.0
分後に、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′とTSHとの複合体は
11.9分後に夫々ピークとして溶出した。

この結果から明らかな如く、本発明の分別測定方法によ
り、hCG、LH及びTSHが混在する試料中の各ホルモンを夫
々定量することができることが判る。

比較例1. （溶離液）実施例１と同じ。

（抗体液１）実施例１と同じ。

（ホルモン液）実施例３と同じ。

（HPLCの使用条件）実施例３と同様にして行った。

（測定操作）抗体液1 40μｌ、ホルモン液30μｌ及び50mMリン酸緩衝
液（pH7.5、150mM NaCl含有）40μｌとを混合し30℃で3
0分間放置した後、混合液の15μｌをHPLCにより分析し
た。

（結果） HPLCによる分析の結果、12.5分後にPOD標識抗hCG−α鎖
−Fab′のピークが観察された以外は、ブロードなピー
クが１つ観察されたのみで、POD標識抗hCG−α鎖−Fa
b′とhCGとの複合体、POD標識抗hCG−α鎖−Fab′とLH
との複合体及びPOD標識抗hCG−α鎖−Fab′とTSHとの複
合体のピークは何れも特定し得なかった。

この結果から明らかな如く、POD標識抗hCG−α鎖−Fa
b′のみを用いた場合には、hCG、LH及びTSHを分別して
検出することができないことが判る。

［発明の効果］以上述べた如く、本発明は、生体由来の試料中の測定対
象物質を、その化学的又は／及び物理的な性質に応じ
て、迅速に、容易に且つ精度良く分別測定し得る方法を
提供するものである。本発明の方法によれば、測定に要
する時間は数分から数時間程度であり、必要な測定操作
自体は、測定対象物質を含む試料と結合能物質Ａ及び結
合能物質Ｂとを混合した後、HPLCにより複合体Ａ、複合
体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａとを分離し、複合体Ａ中の
結合能物質Ａの量又は／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａ
の量を検出するのみであるので、従来の同様な目的の分
別測定方法に比べて、簡便に且つ迅速に目的の測定を行
うことができる点に顕著な効果を有する発明であり、斯
業に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於いて得られた検量線を示す。第２図は、実施例１、２、３及び比較例１で使用したHP
LCのシステムの概略図を示したものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/543 Ｄ 9217−2Ｊ (56)参考文献特開平２−221860（ＪＰ，Ａ) 特開平２−266263（ＪＰ，Ａ) 特開平３−218463（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−45454（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−126856（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−120058（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／8263（ＷＯ，Ａ) Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，206（１），Ｐ158−66，（1978) Ｍｅｔｈｏｄｏｌ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３，Ｐ．135−46，（1985)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】同一の作用を有する２以上の測定対象物質
又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２以上
の測定対象物質（以下、単に、測定対象物質と略記す
る。）を含む試料を、測定対象物質全てに対して結合能
を有し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な
性質を有しているか又は何らかの方法により検出可能な
物質により標識されている物質（以下、結合能物質Ａと
略記する。尚、結合能物質Ａは、担体に固定されていな
い。）及び測定対象物質の少なくとも１つに対しては結
合能を有するが少なくとも１つとは結合しない物質（以
下、結合能物質Ｂと略記する。尚、結合能物質Ｂは、担
体に固定されていない。）と混合して反応させた後、溶
液中の、測定対象物質と結合能物質Ａとの複合体（以
下、複合体Ａと略記する。）と、測定対象物質と結合能
物質Ａ及び結合能物質Ｂとの複合体（以下、複合体Ｂと
略記する。）と、遊離の結合能物質Ａとを高速液体クロ
マトグラフィにより分離し、複合体Ａ中の結合能物質Ａ
の量又は／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａの量を測定す
ることにより試料中の測定対象物質の何れかの量を測定
することを特徴とする分別測定方法。
【請求項２】測定対象物質が、酵素、生理活性物質、癌
関連抗原又は糖鎖を有する物質である請求項１に記載の
分別測定方法。
【請求項３】結合能物質Ａに係る、測定対象物質全てに
対して結合能を有する物質が抗体又はレクチンであり、
結合能物質Ｂが測定対象物質の少なくとも１つとは特異
的に結合するが、少なくとも１つに対しては結合しない
抗体又はレクチンである請求項１に記載の分別測定方
法。
【請求項４】抗体が、モノクローナル抗体である請求項
３に記載の分別測定方法。
【請求項５】レクチンが、コンカナバリンＡ、レンズマ
メレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、
ヒイロチャワンタケレクチン、ヒママメレクチン、ピー
ナッツレクチン又は小麦胚芽レクチンである請求項３に
記載の分別測定方法。
【請求項６】複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質
Ａの分離を、ゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用充填
剤、イオン交換クロマトグラフィ用充填剤、疎水クロマ
トグラフィ用充填剤、等電点クロマトグラフィ用充填
剤、逆相クロマトグラフィ用充填剤又はハイドロキシア
パタイトを充填したカラムを装着した高速液体クロマト
グラフィにより行う請求項１〜５の何れかに記載の分別
測定方法。