JPH03206964A

JPH03206964A - 微量成分の分別測定方法

Info

Publication number: JPH03206964A
Application number: JP217090A
Authority: JP
Inventors: Shinji Satomura; 慎二里村; Kenji Nakamura; 賢治中村; Shuji Matsuura; 脩治松浦
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-01-09
Filing date: 1990-01-09
Publication date: 1991-09-10
Anticipated expiration: 2010-07-19
Also published as: JPH0765988B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の利用分野コ本発明は、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、
リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に存
在する、同一の作用を有し、且つ同一の検出町能な化学
特性を有する２以上の測定対象物質を，その化学的又は
／及び物理的な性質に応して、迅速に、容易に且つ精度
良く分別測定する方法に関する。

［発明の背景］生体試料中に含まれる微量成分の中には、同一の作用を
有するが化学的又は／及び物理的に異なる性質を有する
ものが存在する。例えば、蛋白質部分又は／及び糖鎖部
分の構造が異なる酵素（アイソザイム）や、糖鎖構造の
異なるホルモン等の生理活性物質がそれに相当する。こ
れらの試料中の量を、種々の性質に応じて分別測定する
ことができれば、臨床上有効な指標が得られることは良
く知られている。

これらを分別測定する一般的な方法としては、例えば電
気泳動法、イムノアッセイ法、抗体やインヒビターを用
いた酵素活性の阻害を利用した方法等が挙げられる。し
かしながら、これらの方法には、測定に時間を要する，
定量性が低い等の問題点があり、必ずしも実用的な方法
とはいい難い。

一方、このような問題点を解決する方法として、例えば
、イオン交換クロマトグラフィ用充填剤を充填したカラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィ　（ＨＰＬＣ）に
より、乳酸脱水素酵素のアイソザイムを分別測定する方
法が提案されている（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｊｏｇｒ．，３
７４，４５−５０頁，　１９８６、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒ．．，３７８，４５６〜４６１頁，　１９８８）
。しかしながら、この方法に於いても、分別測定の対象
となり得るものはある程度限られており、しかも分別の
ための測定条件は測定対象物質に応じて設定する必要が
ある等の問題点を有しているので、必ずしも良い方法で
あるとは言い難く、更なる改良が望まれていた。

［発明の目的コ本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、生
体由来の試料中に存在する、同一の作用を有し、且つ同
一の検出可能な化学特性を有する２以上の測定対象物質
を、その化学的又は／及び物理的な性質に応して，迅速
に、容易に且つ精度良く分別測定し得る方法を提供する
ことを目的とする。

［発明の構或］本発明は、同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化
学特性を有する２以上の測定対象物質（以下、単に、測
定対象物質と略記する。）を含む試料を，測定対象物質
の少なくとも１つに対しては結合能を有するが、それら
の少なくとも工つとは結合しない物質（以下、単に，結
合能物質と略記する。）と混合して反応させた後，測定
対象物質と結合能物質との複合体（以下，単に、複合体
と略記する。）と、遊離の測定対象物質とを高速液体ク
ロマトグラフィにより分離し、複合体中の測定対象物質
の量又は／及び遊離の測定対象物質の量を測定すること
により試料中の測定対象物質の何れかの量を測定するこ
とを特徴とする分別測定方法の発明である。

本発明の分別測定方法を実施するには、例えば以下のよ
うにして行えばよい。

即ち、先ず測定対象物質を含む生体由来の試料と結合能
物質とを，要ずれは適当な緩衝液中に添加、混合して反
応させ、複合体を形或させた後、該複合体と遊離の測定
対象物質とを所定の充填剤を充填したカラムを装着した
ＨＰＬＣにより分離する。

次いで、分離された複合体に含まれる測定対象物質の量
又は／及び遊離の測定対象物質の量を、測定対象物質の
性質に応じた測定方法により求めれば，試料中の測定対
象物質の何れかの量が求められる。

本発明の分別測定方法により測定可能な測定対象物質と
しては、それ自身が何らかの方法により測定（検出）可
能であって、且つ、結合能物質、即ち測定対象物質の少
なくとも工つとは互いに強い相互作用（ａｆｆｉｎｉｔ
ｙ　；　ｉｉｌ！和力或は親和性）を及ぼしあい、強固
な複合体を形成するが、それらの少なくともｌつとは結
合しない性質を有する物質が存在するものであれば、特
に限定することなく挙げられるが、例えば血清，血液，
血漿，尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等
の生体由来の試料中に含まれる酵素等が代表的なものと
して挙げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ，
アルカリホスファターゼ，ａ性ホスファターゼ，γ−グ
ルタミルトランスフエラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ
，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵！（ＬＤ
Ｈ），グルタミン酸オキザ口酢酸トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）　，グルタミン酸ビルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ）　，レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ）
，チロシンキナーゼ等の酵素等が挙げられる。

本発明に係る測定対象物質に対する結合能物質としては
、測定対象物質の少なくともｌつとは互いに強い相互作
用（ａｆｆｉｎｉｔｙ　；親和力或は親和性）を及ぼし
あい，強固な複合体を形戊するが、測定対象物質の少な
くとも１つとは結合しない物質であれば特に限定するこ
となく挙げられるが、例えば抗原性を有する物質（ハプ
テンを含む。）の特定の部分構造或は抗原決定部位に対
する抗体、特定構造のａｍに対して結合能を有する例え
ばコンカナバリンＡ，レンズマメレクチン，インゲンマ
メレクチン，ダツラレクチン，ヒイロチャワンタケレク
チン，ヒママメレクチン，ピーナツツレクチン，小麦胚
芽レクチン等のレクチン類、例えばアミラーゼ，クレア
チンキナーゼ（ＣＫ），グルタミン酸オキザ口酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するインヒビタ
ー等が挙げられる。

本発明に係る測定対象物質が有する検出可能な化学特性
としては、例えば酵素活性、蛍光性、発光性或は紫外部
に吸収を有する性質等が挙げられる。

本発明の分別測定方法に於いて、測定対象物質と結合能
物質とを反応させて、複合体を形或させる際の反応条件
としては、測定対象物質や結合能物質を変質させてしま
う様な条件でさえなければ特に限定されないが、例えば
酵素免疫測定法（ＥＩＡ），ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ），蛍光免疫測定法（ＦＩＡ），アフイニテイクロ
マトグラフィ等の自体公知の方法に於いて採用されてい
る複合体等を形或させる際の反応条件に準じて行われる
のが一般的である。例えば、反応時に緩衝液を用いる場
合には，使用される緩衝剤やその他の試薬はこれら自体
公知の方法に於いて用いられるものを適宜選択して用い
ればよい。

本発明の分別測定方法に於いて、複合体を形戒させる際
の結合能物質の使用濃度は、測定対象物質の検量限界や
測定感度をどの程度に設定するかによって適宜設定すれ
ばよく、特に限定されない。

尚、結合能物質は通常１種を用いれば足りるが、要すれ
ば２種以上組み合わせて用いてもよい。この場合、任意
の測定対象物質上の異なる部位に各々結合する性質を有
する２種類以上の結合能物質を用いれば、結果的に該測
定対象物質から或る複合体の分子量が大きくなり、また
、場合によっては等重点も変動すること等から、複合体
と遊離の測定対象物質との分離がより容易となり、測定
精度の向上を計ることができる。また、測定対象物質が
、例えばＡ．Ｂ及びＣの混合物である場合に、例えばＡ
に対する結合能物質とＢに対する結合能物質とを併せて
用いれば．Ａ．Ｂ及びＣを各々同時に分別測定すること
も可能となる。

本発明の分別測定法に於いて、反応時のｐＨとしては、
複合体が形或されるのを妨げない範囲であれば特に限定
されるものではないが、通常２〜１０、好ましくは５〜
９の範囲が挙げられる。反応時の温度も、複合体が形或
されるのを妨げない範囲であれば特に限定されるもので
はないが、通常Ｏ〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の
範囲が好ましく挙げられる。反応時間は、複合体が形或
されるのに要する時間が測定対象物質と結合能物質との
性質により異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至
数時間適宜反応させればよい。

本発明の分別測定方法に於いて，複合体と遊離の測定対
象物質の分離に用いられる｝ＩＰＬｆ１，としては、装
置自身は通常分析の分野に於いて用いられているもので
定流速のものであれば特に問題なく用いることができる
が，分離用カラムに使用する充填剤は，複合体と，遊離
の測定対象物質との間にどのような性質の差があるかに
より種々のものが適宜選択されて使用されなければなら
ないことは言うまでもない。即ち、例えば複合体の分子
量が遊離の測定対象物質の分子量の約１．２倍以上、好
ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２倍以上ある場
合にはゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用の充填剤が
適しており，例えば複合体の等電点と遊Ｉｌ型の測定対
象物質の等電点との差がＰＨで０．０５以上，好ましく
は０．２以上ある場合にはイオン交換クロマトグラフィ
用或は等電点クロマトグラフィ用の充填剤が適しており
、例えば複合体とＴ１離型の測定対象物質の疎水性がか
なり異なっている場合には疎水クロマトグラフィ用充填
剤、逆相クロマトグラフィ用充填剤或はハイドロキシア
パタイトが適している。

｝ＩＰＬｃにより複合体とＴｔｊ！１の測定対象物質と
の分離を行う際に用いられる溶媒（溶離液）としては、
形成された複合体が再び測定対象物質と結合能物質とに
分解されるようなことがなく、且つ複合体に含まれる測
定対象物質の検出可能な化学特性を失わしめるようなも
のでなければ特に限定されることなく挙げられるが、通
常は例えばＥＩＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡ，アフイニティクロ
マトグラフィ等の自体公知の方法に於いて緩衝液として
用いられているようなものが好ましく用いられる。具体
例としては、例えばリン酸塩，＃酸塩，クエン酸塩，グ
ッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤，トリス（ヒドロキシエチル
）アミノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム，塩
化カリウム，硫酸アンモニウム等の塩類，例えばメタノ
ール，エタノール，イソプロビルアルコール，アセトニ
トリル，テトラヒドロフラン等の極性有機溶媒類及び界
面活性剤等を、複合体と遊離の測定対象物質の性質に応
じて適宜選択し、添加、混合してｍ製された、ＰＨ２〜
１０の緩暫液が好ましく用いられる。

本発明の分別測定方法に於いて、ＨＰＬＣにより分離さ
れた複合体中に含まれる測定対象物質或は遊離の測定対
象物質の測定は、測定対象物質の有する検出可能な化学
特性の種類に応じて夫々所定の方法に従って実施される
。例えば、測定対象物質が酵素の場合にはＥＩＡの常法
、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核ｍｓ素別冊Ｎｏ．
３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集，５
１〜６３頁，共立出版（株）　．　１９８７年９月１０
日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく
、測定対象物質が蛍光性物質の場合には蛍光光度針等の
測定機器を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説蛍光抗体
、川生明著、第１版，（株）ソフトサイエンス社、１９
８３４等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、
測定対象物質が発光性物質の場合にはフオトンカウンタ
ー等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法
、蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫
・辻章夫・石川榮治編集，２５２〜２６３頁、共立出版
（株）　，　１９８７年９月１０日発行」等に記載され
た方法に準じて測定を行えばよい。更に，測定対象物質
が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の
測定機器を用いる常法によって測定を行えばよい。

本発明の分別測定方法に於いて、ＨＰＬＣによる分離後
の測定方式としては、例えば「最新液体クロマトグラフ
ィ，原昭二・辻童夫編，第工版、９２〜１０４頁、南山
堂，　１９７８年２月１日発行」等に記載されているよ
うな＋　ＨＰＬＣのカラムからの流出液をそのまま検出
部に導き、流出液中の複合体中に含まれる測定対象物質
の量或は遊離の測定対象物質の量を直接測定する方式が
、測定が迅速に行えるのでより好ましい。この場合に、
測定対象物質が例えば酵素であれば、ＨＰＬＣのカラム
と検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出
液と反応させる、所謂ボストカラム法の反応部を設ける
必要があることは言うまでもない。測定対象物質が酵素
である場合に該反応部に於いて用いられる酵素活性測定
用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核
酸酵素別冊Ｎｏ．３１．北川常廣・南原利夫・辻章夫・
石川榮治編集、５ｌ〜６３頁、共立出版（株）　＋　１
９８７年９月１０日発行」等に記載された方法に準じて
調製したものを用いてもよいし、市販されている臨床検
査用キットの試薬を適宜選択して利用してもよい。また
、測定対象物質が酵素以外の場合に於いても、検出感度
を増加させる目的で所定の試薬を添加、反応させるため
に．　ＨＰＬＣのカラムと検出部との間に適当な反応部
を設けることは任意である。

本発明の分別測定方法に於いて、結合能物質として抗体
を用いる場合には，目的に応じて使用する抗体を適宜ペ
プシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ　（ａｂ
’）２、Ｆａｂ’或はＦａｂとして使用することが望ま
しい。即ち、通常の抗血清中に抗体として含まれる免疫
グロブリンは通常ＩｇＧクラスであるが、この工ｇＧの
分子量は約１５万であり、これと測定対象物質が反応し
た結果得られる複合体と遊離の測定対象物とを例えばゲ
ルクロマトグラフィの原理で分離しようとすれば、測定
対象物質の分子量が約５万以上なければ分離が難しくな
り、必然的に測定対象物質の種類が限られてくる。従っ
て、使用する抗体を酵素により消化してＦ　（ａｂ’）
２　（分子量約１０万）　．　Ｆａｂ’　（分子量約５
万）或はＦａｂ（分子量約５万）として用いれば，分子
量が工万程度以上のものが測定対象物質と戊り得るので
好ましい。また、抗体として１つの抗原ｔｌＲ部位のみ
と結合する性質を備えたモノクローナル抗体を用いた場
合には，Ｓ定対象物質１個当りに１個（測定対象物質が
２量体や３１ｋ体等になっている場合には単量体あたり
に１個）の結合能物質が結合するため、複合体がＨＰＬ
Ｃにより溶出されて来る時間がほぼ一定となるのでより
好ましい。この場合に，これを消化してＦａｂ’或はＦ
ａｂとして用いれば、前記した如き利点が生じるので更
に好ましいことは言うまでもない。

本発明に於いて用いられる結合能物質としての抗体は、
常法、例えば「免疫学実験入門、第２刷、松橋直ら、（
株）学会出版センター＋　１９８１」等に記載の方法に
準じて、馬，牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動
物に測定対象物質を免疫して作製されるポリクローナル
抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（
Ｇ．　Ｋδｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ．　Ｍｉｌｓｔ．ｅｉ
ｎ；　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５．　１９７５
）により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラ
インからの細胞と、測定対象物質で予め免疫されたマウ
スの牌細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産
生ずる単クローン性抗体でも何れにてもよく、これらを
単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意で
ある。

本発明の分別測定方法によれば、測定に要する時間は数
十分から数時間程度であり、必要な測定操作自体は、測
定対象物質を含む試料と結合能物質を混合した後、ＨＰ
ＬＣにより複合体と遊離の測定対象物質とを分離、検出
するのみである。これらのことから明らかなように、本
願発明の分別測定方法は、従来の同様な目的の分別測定
方法に比べて、簡便に且つ迅速に目的の測定を行うこと
ができる。

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない
。

［実施例コ実施例１．α−アミラーゼアイソザイムの分別測定（溶離液）２０ｍＭ　ＮａＣｌ及び２ｍＭ　ＣａＣ１２を含む７５
ｍＭ　Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−ア
ミノエタンスルホン！ｌ（ＢＥＳ）　・ＮａＯＨ　１ａ
ｆｒ液（ｐＨ７．６）を溶離液とした。

（基質液）Ｐ−ニトロフェニル　ベンジル−α−マルトペンタオシ
ドを１４Ｂ／ｍｌ．　　α−グルコシダーゼを１５００
／ｍｌ及びグルコアミラーゼを３０００／ｍｌとなるよ
うに、上記溶離液に溶解したものを基質液とした。

（抗体液）抗ヒト唾液型α−アミラーゼ（マウス）モノクローナル
抗体（和光純薬工業（株）製）を、上記溶離液に０．５
ｍｃ／ｍｌの蛋白濃度となるように添加して抗体液とし
た。

（試料）ヒト血清を生理食塩水で適宜希釈した溶液を試料とした
。

（　ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略を第２図に示す。

・カラム：　０．７５φＸ３０ｃｍ（東ソー（株）社製
、ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ２０００ＳＷ）　，・流速：溶離液；　１．Ｏｍｌ／ｍｉｎ．、基質液；　
０．１ｍｌ／ｍｉｎ．。

・反応部：　０．０４φＸ　９００ｃｍ　（３７℃保温
）。

・検出：　４０５ｎｍの吸光度を測定した。

（測定操作）抗体液３００μｌと試料３０μ１とを混合し，３７℃で
３０分間反応させた後、混合液の５０μ１を｝ＩＰＬＣ
により分析した。

（結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、α−アミラーゼのピークが
２つ観察され、唾液型α−アミラーゼと膵臓型α−アミ
ラーゼが分離できることが判った。

また、膵臓型α−アミラーゼを生理食塩水中に適宜添加
したものを試料として、同様の操作を行い、得られるピ
ーク面積値と膵臓型α−アミラーゼの活性値との関係を
示す検量線を作威した。

結果を第１図に示す。尚、第ｌ図は横軸の各膵臓型α−
アミラーゼの活性値（Ｕ／ｌ）に対して得られたピーク
面積値を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。

Ｉｌｌ図から明らかな如く、原点を通り且つ直線性の良
好な検量線が得られた。

実施例２．γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ一Ｇ
ＴＰ）アイソザイムの分別測定（溶離液）７０ｍＭ　グリシルグリシン、０．１５Ｍ　ＮａＣ１及
び２ｍＭＥＤＴＡ　を含む０．１Ｍ　　｝リス（ヒドロ
キシエチル）アミノメタンーＨＣＩ緩衝液（ＰＨ８．１
）を溶離液とした。

（レクチン溶液）５０ｍＭ　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（
ＭＥＳ）緩衝液（ＰＨ７．０）にレンズマメレクチン（
ＬＣＡ−Ａ）を３　ｔｇ／ｍｌとなるように溶解したも
のをレクチン溶液とした。

（基質液） γ−グルタミルー７−アミドー４−メチルクマリンを０
．４ｍＭとなるように、上記溶離液に溶解したものを基
質液とした。

（試料）新鮮なヒト血清を試料とした。

（　ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・カラム：　０．９４φＸ２５ｃｍ（デュポン社製、Ｚ
ｏｒｂａｘ　　ＧＦ−２５０）　　。

・流速：溶離液；　ｌ．Ｏｍｌ／ｍｉｎ．、基質液：　
０．５ｍｌ／ｍｉｎ．ａ・反応部：　０．０４φＸ　９００ｃｍ　（　４０℃保
温）。

・検出：励起波長３９５ｎｍ．蛍光波長４８０ｎｍで蛍
光を測定した。

（測定操作）レクチン溶液２０μ１と試料２０μ１とを混合し，３７
℃で３０分間反応させた後、混合液の１５μｌをＨＰＬ
Ｃにより分析した。

（結果）｝ＩＰＬＣによる分析の結果、フコースの付いた！鎖を
有するγ一ＧＴＰとＬＣＡ−Ａとの複合体は５．８分後
に、フコースの付いた糖鎖を有さないγ−ＧＴＰはｌ１
．３分後に溶出してくることが判った。

実施例３．乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アイソザイムの分
別測定（溶離液）０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　を含む１０ｍＭ　　トリス（ヒ
ドロキシエチル）アミノメタン一ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ８
．７）を溶離液とした。

（抗体液）市販の抗ヒトＬＤＨ（Ｈ−ｓｕｂｕｎｉｔ）モノクロー
ナル抗体液（ＩＣＮバイオメディカルズ社１！）を溶離
液で１０倍希釈したものを抗体液とした。

（基質液）３８５ａ＋Ｍ　Ｌ一乳酸及び２２ｍＭ　β−ＮＡＤ＋を
含む５００ｍＭトリス（ヒドロキシエチル）アミノメタ
ンー｝ＩＣＩ緩衝液（ＰＨ８．７）を基質液とした。

（試料）新鮮なヒト血清を試料とした。

（ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・カラム：０．８φＸ３０ｃｍ　（山村化学研究所（株
）社製、ＹＭＣ−パックＤｉｏｌ−３００）。

・流速：溶離液；　１．Ｏｍｌ／＊ｉｎ．、基質液；０
．１ｍｌ／瓜ｉｎ−。

・反応部：　０．０４φＸ　９００ｃｍ　（３７℃保温
）。

・検出：励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで蛍
光を測定した。

（測定操作）抗体液１２０μ１と試料３０μ１とを混合し、３０℃で
６０分間反応させた後、混合液の１００μｌをＨＰＬＣ
により分析した。

（結果）ＨＰＬＣによる分析の結果、ＬＤＨ　，はｌ１．１分後
、ＬＤＨ２は１０．ｌ分後、ＬＤＨ　３は９．３分後、
Ｌ　Ｄ　Ｈ４は８．９分後、ＬＤＨ５は８．３分後に夫
々溶出された。

［発明の効果コ以上述べた如く，本発明は、生体由来の試料中の測定対
象物質を、その化学的又は／及び物理的な性質に応じて
、迅速に、容易に且つ精度良く分別測定し得る方法を提
供するものである。本発明の方法によれば、測定に要す
る時間は数十分から数時間程度であり、必要な測定操作
自体は、測定対象物質を含む試料と結合能物質を混合し
た後、ＨＰＬＣにより複合体と遊離の測定対象物質とを
分離検出するのみであるので，従来の同様な目的の分別
測定方法に比べて、簡便に且つ迅速に目的の測定を行う
ことができる点に顕著な効果を看する発明であり、斯業
に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第ｉ図は、実施例ｌに於いて得られた検量線を示す。第２図は、実施例工、２及び３で使用したＨＰＬＣのシ
ステムの概略図を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）同一の作用を有し、且つ同一の検出可能な化学特
性を有する２以上の測定対象物質（以下、単に、測定対
象物質と略記する。）を含む試料を、測定対象物質の少
なくとも１つに対しては結合能を有するが、それらの少
なくとも１つとは結合しない物質（以下、単に、結合能
物質と略記する、）と混合して反応させた後、測定対象
物質と結合能物質との複合体（以下、単に、複合体と略
記する。）と、遊離の測定対象物質とを高速液体クロマトグラフ
ィにより分離し、複合体中の測定対象物質の量又は／及
び遊離の測定対象物質の量を測定することにより試料中
の測定対象物質の何れかの量を測定することを特徴とす
る分別測定方法。
（２）測定対象物質が酵素である請求項１に記載の分別
測定方法。
（３）結合能物質が、測定対象物質の少なくとも１つに
対して結合能を有するが、少なくとも１つとは結合しな
い抗体又はレクチンである請求項１に記載の分別測定方
法。
（４）抗体がモノクローナル抗体である請求項３に記載
の分別測定方法。
（５）レクチンが、コンカナバリンＡ、レンズマメレク
チン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、ヒイロ
チャワンタケレクチン、ヒママメレクチン、ピーナッツ
レクチン又は小麦胚芽レクチンである請求項３に記載の
分別測定方法。
（６）複合体と、遊離の測定対象物質との分離を、ゲル
濾過（ゲルクロマトグラフィ）用充填剤、イオン交換ク
ロマトグラフィ用充填剤、疎水クロマトグラフィ用充填
剤、等電点クロマトグラフィ用充填剤、逆相クロマトグ
ラフィ用充填剤又はハイドロキシアパタイトを充填した
カラムを装着した高速液体クロマトグラフィにより行う
請求項１〜５の何れかに記載の分別測定方法。