DE69631471T2

DE69631471T2 - Verfahren zur verflüssigung von stärke

Info

Publication number: DE69631471T2
Application number: DE69631471T
Authority: DE
Inventors: L. Richard ANTRIM; Colin Mitchinson; P. Leif SOLHEIM
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2016-03-08
Also published as: EP0813607B1; DE69631471T3; EP0813607B2; NZ305062A; ATE258989T1; CN1177983A; NO974072L; NO974072D0; MX9706706A; DE69631471D1; EP0813607A1; AU710631B2; US5756714A; WO1996028567A1; JPH11501813A; CA2214383A1; KR19980702782A; CN1492045A; AU5298496A; CA2214383C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifizierung der Verwendung von α-Amylase bei der Umwandlung von Stärkegranulat in nachgeordnete Produkte, wie beispielsweise Dextrose, Fructose und Alkohol. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Entfernung und/oder Inaktivierung einer Enzym-hemmenden Zusammensetzung aus einem Stärkegranulat vor oder während einer Verflüssigung.
Getreide, wie beispielsweise Mais, werden schon lange als Stärkequelle genutzt. Eines der allgemein bekannten Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Stärke in industriellen Verfahren ist das Nassmahlverfahren. Dieses Verfahren wurde zu einem hoch spezialisierten und integrierten System entwickelt, das auf eine so komplette Abtrennung der Hauptkomponenten eines Getreidekorns wie möglich ausgerichtet ist (siehe Stanley A. Watson, Starch: Chemistry & Technology, Bd. II, Industrial Aspects, S. 30–51, Academic Press, New York (1967)).
Bei einem herkömmlichen Nassmahlverfahren werden trockene Körner, die zur Herstellung von Stärkeprodukten verwendet werden, zuerst einem Einweichverfahren unterzogen, das Quellen genannt wird. Während des Quellens werden die Körner einem gegenlaufenden Wasserstrom ausgesetzt, der viele lösliche Stoffe, einschließlich Phytat und Phytinsäure, Zucker, Salze und Proteine, von den Getreidekörnern trennen. Die gequellten Körner werden von der Einweichflüssigkeit (Quellflüssigkeit) getrennt und mechanischem Spalt- und Mahlverfahren unterzogen. Flotations- und Zentrifugationsverfahren werden dann verwendet, um den Keim von der Stärke, den Fasern und dem Protein zu trennen. Die resultierende Aufschlämmung von Endosperm (Stärke}, Fasern und Protein wird dann weiter gemahlen und gescreent, um die Fasern abzutrennen. Schließlich werden die protein- und endospermverwandten Komponenten basierend auf ihrer Dichte durch Gegenstromspülung und Zentrifugation aufgetrennt, um den Stärkestrom vom Protein/Gluten-Strom zu trennen. Der isolierte Stärkestrom wird dann gut gespült, um nichtgranuläre Stärke-verwandte lösliche Stoffe, einschließlich löslicher Stoffe, wie beispielsweise anorganische Salze, und Verbindungen, wie beispielsweise Phytat und Salze von Phytinsäure, zu entfernen. Das resultierende Produkt ist eine sehr reine Aufschlämmung von unlöslichem Stärkegranulat, das als Ausgangsprodukt zur Umwandlung in Fructose dient.
Im Allgemeinen besteht die Verarbeitung von Stärke zu Fructose aus vier Schritten: Verflüssigung von Stärkegranulat, Saccharifikation der verflüssigten Stärke zu Dextrose, Reinigung und Isomerisierung zu Fructose. Das Ziel eines Stärkeverflüssigungsverfahrens besteht in der Überführung einer konzentrierten Suspension von Stärkepolymerkörnchen in eine Lösung von löslichen kürzerkettigen Dextrinen mit geringerer Viskosität. Dieser Schritt ist entscheidend für eine bequeme Handhabung mit herkömmlicher Ausrüstung und für effiziente Umwandlung in Glucose und andere Zucker. Um Stärkegranulat zu verflüssigen, müssen die Körnchen verkleistert werden, indem die Temperatur des Stärkegranulats auf über etwa 72°C erhöht wird. Das Aufheizverfahren bricht die unlöslichen Stärkekörnchen sofort auf, um eine wasserlösliche Stärkelösung zu bilden. Die löslich gemachte Stärkelösung wird dann durch α-Amylase verflüssigt (EC 3.2.1.1.).
Ein herkömmliches enzymatisches Verflüssigungsverfahren umfasst eine Einstellung des pH einer Stärkegranulataufschlämmung auf zwischen 6,0 und 6,5, den optimalen pH einer vom Bacillus licheniformis stammenden α-Amylase, durch den Zusatz von Calciumhydroxid, Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat. Der Zusatz von Calciumhydroxid bringt den Vorteil mit sich, dass auch Calciumionen bereitgestellt werden, die bekannterweise die α-Amylase gegen Inaktivierung stabilisieren. Beim Zusatz einer α-Amylase wird die Suspension durch eine Dampfdüse gepumpt, um die Temperatur sofort auf zwischen 80 und 115°C zu erhöhen. Die Stärke wird unverzüglich verkleistert und – aufgrund der Gegenwart von α-Amylase – durch zufällige Hydrolyse von (1-4)-Glykosidbindungen durch α-Amylase zu einer Fluidmasse depolymerisiert, die leicht gepumpt werden kann.
Bei einer zweiten Variation des Verflüssigungsverfahrens wird α-Amylase zur Stärkesuspension zugesetzt, die Suspension wird auf einer Temperatur von 80 bis 100°C gehalten, um die Stärkekörnchen teilweise zu hydrolysieren, und die teilweise hydrolysierte Stärkesuspension wird bei einer Temperatur über etwa 105°C durch eine Düse gepumpt, um verbleibende Granulatstrukturen vollkommen zu verkleistern. Nachdem die verkleisterte Stärke abgekühlt wurde, kann ein zweites Mal α-Amylase zugesetzt werden, um die Stärke weiter zu hydrolysieren.
Eine dritte Variation dieses Verfahren nennt sich Trockenmahlverfahren. Beim Trockenmahlverfahren wird ein ganzes Korn gemahlen und mit Wasser kombiniert. Der Keim wird gegebenenfalls durch Flotationsabtrennung oder entsprechende Verfahren entfernt. Das resultierende Gemisch, das Stärke, Fasern, Protein und andere Komponenten des Korns enthält, wird unter Verwendung von α-Amylase verflüssigt. Das allgemeine Vorgehen auf dem Gebiet der Erfindung besteht darin, eine enzymatische Verflüssigung bei einer niedrigeren Temperatur durchzuführen, wenn das Trockenmahlverfahren verwendet wird. Im Allgemeinen wird angenommen, dass Verflüssigung bei einer niedrigeren Temperatur bei der Umwandlung von Stärke in lösliche Dextrine weniger effizient ist als Verflüssigung bei einer höheren Temperatur.
Typischerweise wird die Stärkelösung nach dem Verkleistern in Gegenwart von α-Amylase auf einer erhöhten Temperatur gehalten, bis ein DE von 10 bis 20 erreicht wird, üblicherweise für eine Dauer von 1 bis 3 Stunden. Ein Dextroseäquivalent (DE) ist ein industrieller Standard zur Messung der Konzentration aller reduzierenden Zucker und wird als D-Glucose auf Trockengewichtbasis berechnet. Nichthydrolysiertes Stärkegranulat weist ein DE von praktisch Null auf, während das DE von D-Glucose als 100 definiert ist.
Die maximale Temperatur, bei der die α-Amylase enthaltende Stärkelösung gehalten werden kann, hängt von der mikrobiellen Quelle, von der das Enzym erhalten wurde, und von der Molekülstruktur des α-Amylasemoleküls ab. α-Amylasen, die von B.-subtilis- oder B.-amyloliquefaciens-Stämmen vom Wildtyp produziert werden, werden typischerweise bei Temperaturen von nicht mehr als etwa 90°C verwendet, weil sie über dieser Temperatur rasch thermisch inaktiviert werden, während α-Amylasen, die von B.-licheniformis-Stämmen vom Wildtyp produziert werden, bei Temperaturen von bis zu etwa 110°C verwendet werden können.
Es ist bekannt, dass die Gegenwart von Stärke und Calciumionen α-Amylasen gegen Inaktivierung stabilisieren. Nichtsdestotrotz werden α-Amylasen bei pH-Werten über 6 verwendet, um Schutz gegen rasche Inaktivierung bereitzustellen. Bei niedrigen Temperaturen weist α-Amylase von B. licheniformis bekannterweise auf einem Stärkesubstrat bei niedrigen pH-Werten wie beispielsweise 5 hervorragende Hydrolyseaktivität auf. Wenn das Enzym jedoch bei herkömmlichen Düsentemperaturen, beispielsweise zwischen 102°C und 109°C, für eine Stärkehydrolyse verwendet wird, muss der pH zumindest über 5,7 gehalten werden, um eine übermäßig rasche Inaktivierung zu verhindern. Die pH-Anforderung stellt unglücklicherweise nur wenige Verarbeitungsmöglichkeiten bereit, weil pH-Werte über 6,0 in ungewünschten Nebenprodukten resultieren, wie beispielsweise Maltulose. Daher muss ein Verflüssigungs-pH in Wirklichkeit zwischen 5,9 und 6,0 gehalten werden, um eine zufrieden stellende Ausbeute an hydrolysierter Stärke zu erhalten.
Ein weiteres Problem der Verflüssigung in Bezug auf den pH besteht in der Notwendigkeit, den pH der Stärkesuspension von etwa 4, den pH einer Maisstärkelösung, wie sie von der Nassmahlphase kommt, auf 5,9 bis 6,0 zu erhöhen. Diese pH-Einstellung erfordert den kostspieligen Zusatz von säureneutralisierenden Chemikalien sowie eine zusätzliche Ionenaustauschreinigung des endgültigen Stärkeumwandlungsprodukts, um die Chemikalie zu entfernen. Außerdem erfordert der nächste Prozessschritt nach der Verflüssigung, typischerweise eine Saccharifikation der verflüssigten Stärke zu Glucose, einen pH von 4 bis 4,5; daher muss der pH von 5,9 bis 6,0 auf 4 bis 4,5 gesenkt werden; dies erfordert weitere Chemikalienzusätze und Reinigungssschritte.
Wie bei vielen Pflanzensamen üblich, ist Phytinsäure, der Hexaphosphatester von Myoinositol, bekannterweise in den Getreidekörnern in Form von Phytatsalzen, wie beispielsweise Kalium-, Calcium- und Magnesiumphytat, vorhanden. Wie oben ange führt, wurde allgemein angenommen, dass alle bedeutenden Mengen Phytinsäure, die in den Getreidekörnern enthalten sind, während des Quellverfahrens herausgelöst werden, wodurch sie vor weiterer Verarbeitung aus dem Verflüssigungsstrom entfernt werden. Überraschenderweise haben die Anmelder, wie hierin beschrieben, entdeckt, dass eine Form von Phytat auch nach dem Quellen und nach intensivem Spülen noch in Stärkegranulat vorhanden zu sein scheint. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, sind die Anmelden der Meinung, dass restliches Phytat tatsächlich innerhalb des Stärkekörnchens selbst gebunden wird und somit nicht während des intensiven Spülverfahrens von der Stärke abgetrennt wird.
Im US-Patent Nr. 5.322.778 wurde eine Verflüssigung zwischen pH 4,0 und 6,0 erreicht, indem ein Antioxidans, wie beispielsweise Hydrogensulfit oder ein Salz davon, Ascorbinsäure oder ein Salz davon, Erythorbinsäure, oder phenolische Antioxidanzien, wie beispielsweise butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, oder α-Tocopherol zur Verflüssigungsaufschlämmung zugesetzt wurden. Gemäß diesem Patent muss Natriumhydrogensulfit in einer Konzentration von mehr als 5 mM zugesetzt werden.
Im US-Patent Nr. 5.180.669 wurde eine Verflüssigung zwischen pH 5,0 und 6,0 erreicht, indem zur gemahlenen Stärkeaufschlämmung Carbonat-Ion zugesetzt wurde, und zwar mehr, als zur Pufferung der Lösung erforderlich war. Aufgrund einer erhöhten pH-Wirkung, die durch den Zusatz eines Carbonat-Ions entsteht, wird die Aufschlämmung im Allgemeinen durch den Zusatz einer Wasserstoffionenquelle, wie beispielsweise einer anorganischen Säure, wie z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, neutralisiert.
In der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/02597 wird eine mutierte α-Amylase mit verbesserter Oxidationsbeständigkeit beschrieben, worin ein oder mehrere Methionine durch eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Cystein oder Methionin, ersetzt sind.
In der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/18314 wird eine mutierte Amylase mit verbesserter Oxidationsbeständigkeit beschrieben, worin einer oder mehrere Methionin-, Tryptophan-, Cystein-, Histidin- oder Tyrosinresten durch eine nichtoxidierbare Aminosäure ersetzt sind.
In der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/00353 werden die Probleme in Zusammenhang mit der Verflüssigung durch gentechnische Modifikation von α-Amylase gelöst, so dass diese Merkmale wie erhöhte Wärme-, Säure- und Alkalibeständigkeit aufweist.
Im US-Patent Nr. 4.914.029 wird Phytase zur Maisquellflüssigkeit zugesetzt, um die Menge an Phytinsäure in der Maisquellflüssigkeit zu verringern und die Maisquellflüssigkeit so effektiver in Futtermittel zu verwenden.
Die US-A-3.663.369 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Stärkehydrolysaten mit geringem Umwandlungsgrad durch eine Zweiphasenhydrolyse, wobei die Hydrolyse der ersten Phase bei erhöhter Temperatur kurze Zeit mit einer Säure oder einem Enzym durchgeführt wird, um eine Verflüssigung der Stärke mit sehr wenig Dextrinierung oder Saccharifikation zu erreichen, und die Hydrolyse der zweiten Phase mit Bakterien-α-Amylase bei einem alkalischen pH durchgeführt wird, um einen gewünschten Dextroseäquivalenzwert zu erreichen.
Trotz der Fortschritte im Stand der Technik besteht Bedarf an einem effizienten Mittel zur Verflüssigung von Stärke bei niedrigen pH-Werten unter Verwendung von handelsüblicher α-Amylase. Auf ähnliche Weise besteht auf dem Gebiet der Erfindung Bedarf an einem Verfahren, das die Verflüssigung von trockengemahlenem Getreide bei höheren Temperaturen ermöglicht. Nichtsdestotrotz bringt keines der oben beschriebenen Verfahren die bedeutenden Vorteile mit sich, dass es die Entfernung und/oder Inaktivierung einer Zusammensetzung ermöglicht, die für eine nicht ineffiziente oder nicht vorhandene enzymunterstützte Verflüssigung von Stärke bei einem niedrigen pH verantwortlich ist. Außerdem ermöglicht keines der oben be schriebenen Verfahren einen flexiblen Zugang zu einer Verflüssigung, die keinen Zusatz von Antioxidanzien oder einer neutralisierenden Säure, keine Herstellung eines gentechnisch modifizierten Enzyms oder keine Entdeckung einer neuen α-Amylase, welche aussergewöhnliche Stabilitätsmerkmale bei niedrigem pH aufweist, erfordert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von effizienter Verflüssigung von Stärke bei einem niedrigen pH unter Verwendung von leicht erhältlichen mutierten α-Amylase-Enzymen oder α-Amylase-Enzymen vom Wildtyp.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung der Entfernung und/oder Inaktivierung einer Enzym-hemmenden Zusammensetzung, die in einem Stärkegranulat vorhanden ist und hauptsächlich für ineffiziente Verflüssigung durch α-Amylase bei niedrigem pH verantwortlich ist.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Verflüssigung von Stärke ohne Zusatz von kostspieligen Antioxidanzien.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung einer einfachen und effizienten Weise zur Verflüssigung von Stärke, welche ein flexibles Verfahren ermöglicht und keinen Zusatz von gentechnisch modifizierter α-Amylase erfordert.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren, wie es in Anspruch 1 oder Anspruch 9 definiert ist, zur Verflüssigung von Stärke bereitgestellt, das die Schritte des Behandelns der Stärke vor oder während der Verflüssigung der Stärke, um eine in der Stärke vorhandene Enzym-hemmende Zusammensetzung zu inaktivieren und/oder zu entfernen und behandelte Stärke zu bilden; des Zusetzens von α-Amylase zur behandelten Stärke; und des Umsetzens der behandelten Stärke für eine Zeit und bei einer Temperatur, die wirksam sind, die behandelte Stärke zu verflüssigen, umfasst. Ge mäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung, wie sie in Anspruch 15 definiert ist, bereitgestellt.
Wie weiter unten genauer beschrieben, bringt die Umsetzung der vorliegenden Erfindung bedeutende Vorteile für kommerzielle Stärkeverflüssigungsverfahren mit sich. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, sind die Anmelden der Meinung, dass ihre Entdeckung, dass eine spezifische Zusammensetzung, die in einem Stärkegranulat vorhanden ist und bisher nicht als Bestandteil davon identifiziert wurde, für Probleme in Zusammenhang mit Verflüssigung von Stärke mit α-Amylase bei niedrigem pH verantwortlich ist. Eine Elementaranalyse der isolierten Zusammensetzung zeigt, dass diese Zusammensetzung anscheinend eine Form eines Phytats umfasst. Die überraschende Identifizierung der Zusammensetzung, die für Probleme bei der Verflüssigung bei niedrigem pH verantwortlich ist, macht eine Inaktivierung und/oder Entfernung des verantwortlichen Stoffs und somit eine effiziente Verflüssigung eines Stärkegranulats bei niedrigen pH-Werten, wie beispielsweise einem pH von nur 4,5, mit allgemein bekannten und charakterisierten α-Amylasen möglich. Wie weiter unten gezeigt, ermöglicht die Erfindung der Anmelder zum ersten Mal eine Verflüssigung von Stärke bei niedrigem pH, bei der handelsübliche brauchbare Systeme, einschließlich α-Amylase, verwendet werden können. Außerdem müssen bei der vorliegenden Erfindung keine speziell gestalteten mutierten Enzyme oder Enzyme vom Wildtyp verwendet werden, die außergewöhnliche Stabilitätsmerkmale bei niedrigem pH aufweisen, oder kostspielige Maßnahmen, wie beispielsweise Zusatz von Antioxidanzien oder Säureneutralisierung, getroffen werden.
Ein besseres Verständnis der Erfindung selbst sowie weiterer Ziele und damit verbundener Vorteile wird durch die folgende detaillierte Beschreibung und die beiliegenden Abbildungen geschaffen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
„Verflüssigung" oder „verflüssigen" bezeichnet ein Verfahren, durch welches Stärke in kürzerkettige Dextrine mit geringerer Viskosität umgewandelt wird. Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren die Verkleisterung von Stärke gleichzeitig mit oder mit darauf folgendem Zusatz von α-Amylase.
„Quellflüssigkeit" bezeichnet eine Flüssigkeit, die während des Quellverfahrens aus gequellten Getreidekörnern gewonnen wird. Die Quellflüssigkeit enthält einen bedeutenden Anteil der löslichen Komponenten des Getreides.
„Stärkegranulat" oder „Stärkekörnchen" bezeichnen eine wasserunlösliche Komponente von essbarem Getreide, die nach Entfernung der Schale, der Fasern, des Proteins, des Kerns und der löslichen Stoffe durch das Quellen, mechanische Spalt-, Abtrennungs-, Screening-, Gegenstromspül- und Zentrifugationsschritte, die typische für Getreide-Nassmahlverfahren sind, übrig bleibt. Stärkegranulate umfassen intakte Stärkekörnchen, die fast ausschließlich gepackte Stärkemoleküle (d. h. Amylopektin und Amylose) enthalten. Bei Mais enthält die Stärkegranulatkomponente etwa 99% Stärke; das restliche Prozent besteht aus Proteinen, Asche, Fasern und Spurenkomponenten, die eng mit den Körnchen verbunden sind. Die Packungsstruktur von Stärkegranulat hemmt die Fähigkeit von α-Amylase, Stärke zu hydrolysieren, beträchtlich. Die Stärke wird verkleistert, um die Körnchen aufzubrechen und um eine lösliche Stärkelösung zu bilden und eine enzymatische Hydrolyse zu erleichtern.
„Stärkelösung" bezeichnet die wasserlösliche verkleisterte Stärke, die durch Erhitzen des Stärkegranulats entsteht. Beim Erhitzen der Körnchen auf mehr als etwa 72°C wird das Stärkegranulat aufgespalten, um ein wässriges Gemisch von freien Stärkemolekülen zu bilden. Dieses Gemisch, das bei gelbem Zahnmais beispielsweise etwa 75% Amylopektin und 25% Amylose enthält, bildet in Wasser eine viskose Lösung. Bei kommerziellen Verfahren zur Bildung von Glucose oder Fructose wird die Stärkelösung verflüssigt, um eine lösliche Dextrinlösung zu bilden.
„Enzym-hemmende Zusammensetzung" oder „EHZ" bezeichnet eine Zusammensetzung in einem Stärkegranulat, das α-Amylasehydrolyse einer Stärkelösung während einer Verflüssigung bei niedrigem pH hemmt. Eine chemische Analyse einer Zusammensetzung (EHZ), die aus verkleisterten Stärkekörnchen extrahiert ist und die α-Amylase bei niedrigem pH hemmt, hat gezeigt, dass EHZ eine Form von Phytat umfasst. Formen von Phytat, welche die Enzym-hemmende Zusammensetzung umfassen, sind wahrscheinlich Magnesium-, Eisen-, Kalium-, Mangan-, Zink- und/oder Calciumsalze von Phytat.
„Behandlung" bezeichnet die Behandlung von Stärkegranulat oder einer Stärkelösung, um eine Wirkung zu verringern oder aufzuheben, die durch die Enzymhemmende Zusammensetzung während einer enzymatischen Hydrolyse von Stärke bei niedrigem pH, beispielsweise unter pH 5,7, verursacht wird. Eine Behandlung umfasst beispielsweise den Zusatz einer Verbindung oder von Verbindungen zu Stärkegranulat oder einer Stärkelösung, welche die Enzym-hemmende Zusammensetzung daran hindern, die Stärkehydrolyse-Aktivierungsmerkmale von α-Amylase zu destabilisieren, inaktivieren oder auf andere Weise zu schwächen; das Aussetzen von Stärkegranulat oder einer Stärkelösung gegenüber Bedingungen oder Abtrennungsverfahren, um die Hemmeigenschaft der Enzym-hemmenden Zusammensetzung vor der Verflüssigung bei niedrigem pH aufzuheben oder beträchtlich zu verringern; oder das Zusetzen einer Verbindung oder von Verbindungen, welche die Enzymhemmende Zusammensetzung durch chemische Modifikation der EHZ zu einer Nicht-EHZ-Verbindung aus der Lösung entfernen.
„α-Amylase" bezeichnet eine enzymatische Aktivität, welche die α(1-4)-Glycosidbindung, beispielsweise in Stärke, Amylopektin oder Amylosepolymeren, spalten oder hydrolysieren. Geeignete α-Amylasen sind natürlich vorkommende α-Amylasen sowie rekombinante oder mutierte Amylasen, die bei der Verflüssigung von Stärke nützlich sind. Bei der vorliegenden Erfindung bevorzugte Amylasen sind α-Amylasen, die von Bacillus, insbesondere Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus, stammen.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren ermöglicht eine Behandlung der Stärke gemäß vorliegender Erfindung die effiziente Durchführung einer Verflüssigungsreaktion, d. h. eine enzymatische Hydrolyse der Stärke, des Amylopektins oder der Amylose, bei einem pH von weniger als 6,0 oder sogar weniger als 5,0. Vorzugsweise wird die Verflüssigungsreaktion bei einem pH von zwischen etwa 4,5 und etwa 5,7, noch bevorzugter zwischen etwa 4,5 und etwa 5,5, insbesondere zwischen etwa 4,5 und etwa 5,2, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Stärkegranulat oder eine Stärkelösung behandelt, um eine darin vorhandene Enzym-hemmende Zusammensetzung vor dem Zusatz einer α-Amylase durch Wärmebehandlung zu inaktivieren. In dieser Ausführungsform wird α-Amylase vorzugsweise nach dem Erhitzen zum Stärkegranulat oder zur Stärkelösung zugesetzt, um sicherzustellen, dass die Enzym-hemmende Zusammensetzung inaktiviert wird, ohne zuerst die α-Amylase zu beeinträchtigen. Die Aufschlämmung wird dann für eine geeignete Zeit bei einem geeigneten pH und einer geeigneten Temperatur inkubiert, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, um die Stärke zu verflüssigen. Gemäß vorliegender Erfindung kann die Fähigkeit der Enzym-hemmenden Zusammensetzung, α-Amylaseaktivität durch Erhitzen der Stärkelösung vor der Verflüssigung; d. h. vor dem Zusatz von α-Amylase, zu hemmen, beträchtlich verringert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Stärkegranulat oder die Stärkelösung mit einer Zusammensetzung behandelt, welche die Enzym-hemmende Zusammensetzung chemisch modifiziert oder abbaut, um ihr Enzym-hemmendes Merkmal aufzuheben und so die Enzym-hemmende Zusammensetzung aus der Stärke zu entfernen. Vorzugsweise wird vor der Verflüssigung ein Phytat abbauendes Enzym zur den Stärkekörnchen oder der Stärkelösung zugesetzt. Ein bevorzugtes Phytat abbauendes Enzym umfasst Phytase oder saure Phosphatase. Viele der Enzyme, die von Mikroorganismen produziert werden, welche die Überführung von Phytat zu Inositol und anorganischem Phosphat katalysieren, sind allgemein als Phytasen bekannt. Phytaseproduzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien und filamentöse Pilze und Hefen, einschließlich Bacillus subtilis, Pseudomonas, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus terreus, Aspergillus ficuum. Vorzugsweise stammt die Phytase von Aspergillus ficuum. Eine Reinigung solcher Phytaseenzyme aus mikrobiellen Quellen wird durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren erreicht. In Ullah et al., Preparative Biochemistry 18(4), 443–458 (1988), wird beispielsweise die Reinigung einer Phytase von Aspergillus ficuum beschrieben, wobei die Beschreibung durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Die Konzentration eines Phytat abbauenden Enzyms, das zum Stärkegranulat oder zur Stärkelösung zugesetzt wird, sollte die Enzym-hemmende Zusammensetzung in der Lösung beträchtlich abbauen können. Natürlich hängt die Bestimmung der geeigneten Konzentration eines Phytat abbauenden Enzyms vom pH, von der Temperatur, von der Reaktionszeit, von der spezifischen enzymatischen Aktivität und außerdem von der Getreideart ab, aus der das Stärkegranulat oder die Stärkelösung erhalten wird. Optimale Bedingungen für die Aktivität eines Phytat abbauenden Enzyms können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung jedoch leicht bestimmt werden. Vorzugsweise beträgt die Konzentration eines Phytat abbauenden Enzyms etwa 0,1 bis etwa 100 Einheiten Phytase (Phytaseeinheit) pro Gramm Stärke. Noch bevorzugter beträgt die Konzentration eines Phytat abbauenden Enzyms etwa 1 bis etwa 25 Einheiten Phytase pro Gramm Stärke. Eine Phytaseeinheit (Phytatabbauaktivität) wird als die Menge eines Enzyms definiert, die bei 37°C pro Minute 1 μmol eines anorganischen Phosphors (P) von 0,042 M Mg-K-Phytat freisetzt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Es wird angenommen, dass ein Phytat abbauendes Enzym zu entweder dem Stärkegranulat oder der Stärkelösung zugesetzt werden kann. Weiters wird angenommen, dass Phytat abbauende Enzyme für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wirksam sind, egal ob die Stärke in Granulatform oder löslich in einer Lösung vorliegt. Die Anmelden haben tatsächlich herausgefunden, dass der Zu satz eines Phytat abbauenden Enzyms zum Stärkegranulat, d. h. vor der Verkleisterung, wirksam bei der Behandlung der Lösung gemäß vorliegender Erfindung ist. Alternativ dazu kann die Phytase auch während oder nach einer Verkleisterung zur Stärkelösung zugesetzt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Enzym-hemmende Zusammensetzung vor der Verflüssigung inaktiviert und/oder aus dem Stärkegranulat oder der Stärkelösung entfernt. Das Entfernen der Enzym-hemmenden Zusammensetzung kann durch jedes beliebige auf dem Gebiet der Erfindung anerkannte chemische oder mechanische Abtrennungsverfahren stattfinden, das wirksam zur Entfernung von Verbindungen, einschließlich Phytinsäure oder Phytatsalze, aus einer Lösung eingesetzt werden kann. Geeignete Abtrennungsverfahren umfassen Chromatographie, Ionenaustausch, Mikrofiltration und Zentrifugation. Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren umfasst das Entfernen durch pH-abhängige Phytatausfällung oder Wärmebehandlung gefolgt von Filtration oder Zentrifugation. Außerdem wird die Enzym-hemmende Zusammensetzung vorzugsweise durch Zentrifugation bei hoher Temperatur oder Filtration bei hoher Temperatur entfernt.
Der pH des Stärkegranulats oder der Stärkelösung während einer Behandlung weist einen Wert auf, der eine Entfernung oder Inaktivierung der Enzym-hemmenden Zusammensetzung ermöglicht. Während der Behandlungsschritt bei jedem pH-Wert durchgeführt werden kann, ist die Behandlung bei einem pH von zwischen etwa 4 und etwa 6 effizient, weil die Notwendigkeit, den pH des Stärkegranulatstroms vom Nassmahlverfahren unerwünschterweise einzustellen, wegfällt. Vorzugsweise liegt der pH zwischen etwa 4,5 und etwa 5,7; noch bevorzugter liegt der pH zwischen etwa 4,5 und etwa 5,5; und insbesondere zwischen etwa 4,5 und etwa 5,2. Es gilt anzumerken, dass durch Beibehaltung des pH beim Behandlungsschritt in diesen Bereichen der pH beim Behandlungsschritt gut mit jenem des nass gemahlenen Getreidestärkeverarbeitungsstroms korreliert, wodurch übermäßige Kosten in Zusammenhang mit der Einstellung des pH des nass gemahlenen Getreides vermieden werden.
Die Temperatur beim Behandlungsschritt ist eine Temperatur, die zum Entfernen oder Inaktivieren der Enzym-hemmenden Zusammensetzung geeignet ist, und kann von der jeweiligen gewählten Behandlungsart abhängen. Wenn der Behandlungsschritt den Zusatz von Phytase umfasst, sollte eine Temperatur gewählt werden, die für Hydrolyseaktivität für das spezifische Enzym geeignet ist. Für mikrobielle Phytase wird im Allgemeinen eine geeignete Temperatur gewählt, die zwischen etwa 20°C und etwa 60°C, vorzugsweise zwischen etwa 30°C und etwa 40°C, liegt. Die Entwicklung von temperaturbeständigen Phytaseenzymen, die bei Temperaturen von beispielsweise 100 bis 110°C zur Hydrolyse von Phytat fähig sind, wird insbesondere als Teil des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung betrachtet und bevorzugt. Wenn der Behandlungsschritt Wärmebehandlung umfasst, gegebenenfalls gefolgt von Filtration oder Zentrifugation, sollte die Temperatur höher sein als die Verkleisterungstemperatur der Stärke; vorzugsweise sollte sie zwischen etwa 80°C und etwa 150°C, noch bevorzugter zwischen etwa 90°C und etwa 110°C, insbesondere zwischen etwa 95°C und etwa 110°C, liegen.
Die Dauer des Behandlungsschritts kann ebenfalls je nach der gewählten Behandlungsart variieren. Wenn der Behandlungsschritt den Zusatz von Phytase umfasst, hängt die Behandlungsdauer von der spezifischen Aktivität des zugesetzten Phytaseenzyms und der Inkubationstemperatur ab. Bei mikrobieller Phytase beträgt die Behandlungsdauer je nach den Bedingungen vorzugsweise etwa 1 bis etwa 24 Stunden, noch bevorzugter etwa 3 bis etwa 6 Stunden. Wenn der Behandlungsschritt die Entfernung der Enzym-hemmenden Zusammensetzung aus dem Stärkegranulat oder der Stärkelösung durch Wärmebehandlung, gegebenenfalls gefolgt von Filtration oder Zentrifugation, umfasst, beträgt die Behandlungsdauer vorzugsweise etwa 10 Sekunden bis etwa 60 Minuten, noch bevorzugter von etwa 3 bis etwa 10 Minuten. Es wird angenommen, dass eine Inaktivierung des Phytats von Stärkegranulat unter geeigneten Bedingungen, wie beispielsweise Wärme, im Wesentlichen unverzüglich erfolgt, wodurch die Behandlungsdauer eventuell nur durch technische Einschränkungen begrenzt ist.
Nach einer Wärmebehandlung kann eine Zentrifugation oder Filtration zur Abtrennung des inaktivierten Phytats von einer Lösung durch auf dem Gebiet der Erfindung anerkannte Mittel verwendet werden. Wenn Zentrifugation verwendet wird, um das Phytat während einer Behandlung von der Stärke abzutrennen, kann eine Zentrifugation bei einer g-Kraft von zumindest 2.000 × g, vorzugsweise bei einer g-Kraft von zwischen etwa 5.000 × g und etwa 10.000 × g, durchgeführt werden.
Die Behandlungsbedingungen können auch von der Art des verwendeten Getreides oder dem Mahlverfahren abhängen. Getreide, das beispielsweise eine relativ hohe Konzentration einer Enzym-hemmenden Zusammensetzung aufweist, kann eine längere Behandlung erfordern als Getreide, das eine geringere Konzentration einer Enzym-hemmenden Zusammensetzung aufweist. Verschiedene Phytinsäuregehalte in unterschiedlichen pflanzlichen Materialien sind in Lehrfield, J. Agric. Food Chem., Bd. 42, 2726–2731 (1994), beschrieben, das durch Verweis hierin aufgenommen ist. Wenn das Getreide durch das Trockenmahlverfahren für eine Verflüssigung vorbereitet wird, ist aufgrund der Gegenwart des Faser- und Proteinanteils wahrscheinlich eine viel größere Menge Phytat vorhanden als beim Nassmahlverfahren. Somit kann die Behandlung von trocken gemahlener Stärke strengere Bedingungen erfordern als nass gemahlene Stärke.
Nach oder gleichzeitig mit der Behandlung des Stärkegranulats oder der Stärkelösung, um die Enzym-hemmende Zusammensetzung zu inaktivieren und/oder zu entfernen, wie in den Ansprüchen spezifiziert ist, wird α-Amylase zur Stärke zugesetzt, um die Stärke zu Dextrinen mit niedrigerem Molekufargewicht zu verflüssigen. Somit umfasst der Schutzumfang der Erfindung die Behandlung des Stärkegranulats oder der Stärkelösung entweder vor oder gleichzeitig mit der Verflüssigung unter Verwendung von α-Amylase, wie in den Ansprüchen eingeschränkt. Die Verflüssigung kann gemäß beliebiger allgemein bekannter Verflüssigungsverfahren durchgeführt werden, bei denen α-Amylase verwendet wird. Der pH während des Verflüssigungsschritts gemäß vorliegender Erfindung beträgt vorzugsweise weniger als etwa 5,7, noch bevorzugter weniger als 5,3, insbesondere zwischen etwa 4,5 und etwa 5.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der Vorteile, die durch die Verwendung der Erfindung bereitgestellt werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können jedoch Bedingungen, Getreidearten, Temperatur, Enzyme und dergleichen gemäß der oben genannten Offenbarung ersetzen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Test zur α-Amylase-Aktivitätsbestimmung
α-Amylase-Aktivität wurde durch einen Test bestimmt, der auf der Fähigkeit von Stärke, mit Iod einen blaufärbigen Komplex zu bilden, und dem Verschwinden dieser Farbe, wenn Stärke zu kürzeren Dextrinmolekülen hydrolysiert wird, basiert. Die α-Amylase-Aktivität wurde in Bezug auf Verdauzeit, die benötigt wird, um eine Farbänderung hervorzurufen, die einen definierten Zustand der Dextrinierung von Stärke anzeigt, definiert.
Die folgenden Reagenzien wurden verwendet:
Phosphatpuffer – Kaliumdihydrogenphosphat (340 g) und Natriumhydroxid (25,3 g) wurden in Wasser gelöst und auf etwa 2 l verdünnt. Der Puffer wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der pH wurde auf 6,2 ± 0,1 eingestellt. Der Puffer wurde in einem Messkolben auf 2 l verdünnt.
Stärkesubstrat – 10 g (trockene Substanz) lösliche Lintner-Stärke wurden in 50 ml Wasser suspendiert und in etwa 300 ml siedendes Wasser gewaschen. Die Suspension wurde erneut zum Sieden gebracht und 5 min lang unter ständigem Rühren sieden gelassen. Dann wurde die Stärkelösung unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt, und 125 ml Phosphatpuffer wurden zugesetzt. Die Lösung wurde mit Wasser auf 500 ml verdünnt. Das Stärkesubstrat wurde täglich frisch hergestellt.
Iodstammlösung – Iodkristalle (5,5 g) und Kaliumiodid (11,0 g) wurden in Wasser gelöst und volumetrisch auf 250 ml verdünnt. Die Lösung wurde vor Licht geschützt.
Verdünnte Iodlösung – Kaliumiodid (20 g) und 2 ml Iodstammlösung wurden in Wasser gelöst und volumetrisch auf 500 ml verdünnt. Die Lösung wurde täglich frisch hergestellt.
Enzymverdünnungslösung – Calciumchlorid (11,1 g) wurde in 4 l Wasser gelöst.
Das für alle Reagenzien verwendete Wasser war entweder destilliert oder entionisiert.
Die unbekannte α-Amylaseprobe wurde mit einer Enzymverdünnungslösung auf zwischen 10 und 15 LU (weiter unten definiert) verdünnt. Bei vielen handelsüblichen α-Amylasezubereitungen stellte sich eine 2.000fache Verdünnung als geeignet heraus. 5-ml-Aliquoten einer verdünnten Iodlösung wurden in 13 × 100 mm große Reagenzgläser dispensiert, und 10 ml Stärkesubstrat wurden in ein 23 × 200 mm großes Reagenzglas gegeben. Alle Reagenzgläser wurden in ein Wasserbad mit 30°C gegeben. Ein Hellige-Komparator, der mit einer speziellen α-Amylase-Farbscheibe (Katalognummer 620-s5) ausgestattet war, wurde für die Ablesungen verwendet. 5 ml eines verdünnten Enzyms (ebenfalls mit 30°C) wurden mit dem Stärkesubstrat vermischt, und die Zeitmessung wurde begonnen. In geeigneten Zeitabständen, beispielsweise 1-Minutenabstände zu Beginn der Reaktion und später während der Reaktion Intervalle von 15 s, wurden 1-ml-Aliquoten des Enzym-Substrat-Gemischs in ein Reagenzglas übertragen, das die temperierte verdünnte Iodlösung enthielt. Die Stärke-Iod-Lösung wurde vermischt und in ein 13 mm großes quadratisches Präzisions-Reagenzglas gegeben, wonach die Farbe mit der α-Amylase-Standardfarbscheibe im Hellige-Komparator verglichen wurde. Nahe dem Endpunkt wurden Proben in Abständen von 0,25 min entnommen.
Die Zeit, die erforderlich war, damit die Farben der Proben und der Farbscheibe übereinstimmten, wurde aufgezeichnet, und die Aktivität (in Liquefon-Einheiten pro g oder ml) wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
worin LU = Liquefon-Einheit
V = Volumen des Enzyms (5 ml)
t = Dextrinierungsdauer (min)
D = Verdünnungsfaktor: Verdünnungsvolumen dividiert durch ml oder g des verdünnten Enzyms.
Beispiel 2
Stärkeverflüssigungsbedingungen – Bestimmung des DE (Dextroseäquivalent) von verflüssigter Stärke
Stärke wurde unter Verwendung eines Reaktors verflüssigt, der aus einem 50 Fuß langen, zu einer Spirale mit einem Durchmesser von etwa 10 Zoll und einer Höhe von etwa 5,5 Zoll gebogenen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 0,24 Zoll (0,21 Zoll Innendurchmesser) bestand. Die Spirale war mit einem statischen Inline-Mischer mit 11,5 Zoll (Cole-Parmer Nr. G-04669-60) ausgestattet, der etwa 4 Fuß vom vorderen Ende entfernt angebracht war. Das hintere Ende der Spirale war mit einem einstellbaren Inline-Überdruckventil von Swagelok (Nr. SS-4CA-3) ausgestattet, das auf einen Öffnungsdruck von etwa 20 psi eingestellt war. Eine Stärkeaufschlämmung wurde mithilfe einer Kolbendosierpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 70 ml/min in die Spirale gepumpt. Die Spirale wurde durch Eintauchen in ein Glycerinwasserbad auf 105,5°C erhitzt. Die Temperatur im Bad wurde unter Verwendung eines Umlaufheizgeräts/Temperaturreglers (Fisher Scientific Modell 7305) gehalten.
Stärkegranulat wurde mithilfe eines Mais-Nassmahlgeräts erhalten und innerhalb von zwei Tagen verwendet. Als weitere Stärkequelle diente LO-DEX^TM 10 (ein wasserlösliches gereinigtes Dextrin, das durch begrenzte Hydrolyse von Getreidestärke erhalten wurde), das von der American Maize-Products Company, Hammond, Indiana, USA, bezogen wurde. Das hierin verwendete LO-DEX^TM 10 wies ein anfängliches DE von etwa 9,5 auf.
Die Stärke oder das Maltodextrin wurde mit entionisiertem Wasser auf einen gewünschten Feststoffgehalt von etwa 30 bis 35% trockener Feststoffe verdünnt, und der pH wurde mit 2,5% NaOH oder 6% HCl wie gewünscht eingestellt. Calcium wurde in Form von CaCl₂·2H₂O zugesetzt. Typische Verflüssigungsbedigungen waren wie folgt:

Stärke oder LO-DEX^TM 10 30% bis 35% Feststoffgehalt

Calcium 40 bis 60 ppm (30 ppm zugesetzt)

pH 5,0 bis 6,0

α-Amylase 12 bis 14 LU/g Kohlenhydrat (Trockenbasis)
Stärke oder LO-DEX^TM 10, die ein Enzym und Calcium in Form von CaCl₂·2H₂O enthielten, wurden mit etwa 70 ml/min in den Reaktor zugeführt. Die Temperatur des Reaktors wurde durch Eintauchen des Reaktors in ein Glycerinwasserbad bei 105,5 °C gehalten. Stärkeproben wurden vom Reaktor in ein zweites 95°C heißes Verflüssigungsbad gegeben und 90 min lang darin gelassen. Der Grad der Stärkeverflüssigung wurde direkt nach der zweiten Verflüssigungsphase gemessen, indem das Dextroseäquivalent (DE) der Probe gemäß dem in Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., 6. Ausg., Analytical Procedure Committee (1980), beschriebenen Verfahren gemessen wurde.
Beispiel 3
HPLC-Analyse von Phytat
Phytat wurde wie folgt durch HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) analysiert. Ein HPLC-System, das aus einem Millipore/Waters, Modell 510 Waters Automated Gradient Controller, einer 250 mm mal 4,6 mm (Innendurchmesser) großen Säule, die mit Harz Poros 20 PI/M (PerSeptive Biosystems) gepackt war, und einem Dionex-Leitfähigkeitsdetektor, der mit einem Dionex-Anionensuppressor und einem Dionex-SRS-Regler ausgestattet war, bestand, wurde verwendet. Proben von handelsüblichem Phytat, eine EHZ aus dem Maisglutenstrom, gemahlenes Vollkorn, Quellflüssigkeit, gemahlenes Vollkornmehl, gemahlener Reis und eine EHZ aus dem Stärkegranulat wurden mit entionisiertem Wasser auf zwischen 10 und 200 mg/l Phytat verdünnt und filtriert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Zwischen 20 und 500 ml der Probe (je nach Phytatkonzentration) wurden in die Säule injiziert, und die Säule wurde 2 min lang mit Wasser bei einer Strömungsrate von 1,3 ml/min gewaschen. Nach 2 min wurde ein linearer Gradient von 0 bis 40 mM NaOH begonnen und über die folgenden 20 min mit einer Strömungsrate von 1,3 ml/min fortgesetzt.
Nach etwa 15 min wurde Phytat von der Säule eluiert. Eine lineare Reihe von Verdünnungen von Natriumphytat (Sigma Chemical Company, Nr. P 8810) wurde verwendet, um die Reaktion des Leitfähigkeitsdetektors zu kalibrieren. Die EHZ der einzelnen Quellen ergab Elutionspeaks, die mit jenen von handelsüblichem Phytat identisch waren.
Beispiel 4
Isolierung einer EHZ aus einem Maisglutenstrom
Eine Zusammensetzung, die α-Amylase inaktiviert oder hemmt, wurde aus einem proteinreichen Stärkestrom (Maisglutenstrom genannt) isoliert, der während der Maisendospermfraktionierung in einer Mais-Nassmahlanlage wie folgt gebildet wurde. Unlösliche Proteine und Stärkekörnchen wurden aus der Maisglutenfraktion (etwa 18,6% Feststoffe) durch Zentrifugation (etwa 6000 × g, 15 min) entfernt. Der Überstand wurde durch Vakuumfiltration mithilfe von Whatman-Filterpapier Nr. 3 weiter gereinigt. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer abgeschnittenen Polysulfon-Hohlfaserkapsel mit einem Molekulargewicht von 5.000 (A/G Technology Corp., Modell UFP-5-D-4) fraktioniert. Etwa 1.200 ml Filtrat vom Ultrafiltrationsschritt wurden durch den Zusatz von 1 N NaOH auf einen pH von 9 eingestellt. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation (etwa 6000 × g, 10 min) gewonnen und durch Resuspension in Wasser gewaschen.
Nachdem der Niederschlag durch Zentrifugation (etwa 6000 × g, 10 min) aus dem Waschwasser gewonnen worden war, wurde der Niederschlag in etwa 500 ml Wasser resuspendiert und durch langsames Einstellen des pH auf 5 durch tropfenweises Zusetzen von 3 M HCl gelöst. Die Lösung wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 filtriert, um ungelöste Materialien zu entfernen, und das Filtrat wurde auf etwa 4°C abgekühlt. Zwei Volumina Ethanol (4°C) wurden zum Filtrat zugesetzt, und der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration durch einen Glasfrittenfilter gewonnen. Der Niederschlag wurde mit kaltem Ethanol gewaschen, gewonnen und bei Raumtemperatur in Vakuum gegeben, um ihn zu trocknen.
Die 1.200 ml Ultrafiltrat ergaben 3,04 g EHZ.
Beispiel 5
Hemmung von α-Amylase durch eine EHZ während einer Verflüssigung bei niedrigem pH
Eine EHZ (0 bis 200 mg/l), die wie in Beispiel 4 isoliert wurde, wurde zu 35% LO-DEX^TM 10 (pH 5,2) zugesetzt, das 50 ppm Calcium enthielt. α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc., South San Franscisco, CA, USA) wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf 5,2 eingestellt und auf diesem Wert gehalten, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems hydrolysiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen.
Tabelle 1 zeigt, dass steigende EHZ-Konzentrationen das abschließende DE von verflüssigtem LO-DEX^TM 10 verringern (anfangs DE 9,5), was auf eine verstärkte Hemmung der α-Amylase hinweist. Tabelle 1 Wirkung einer EHZ auf die α-Amylase-katalysierte Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei einem pH von 5,2

EHZ (mg/l) DE

0 18,7

50 17,5

100 15,8

150 13,9

200 12,9
Wie aus diesem Beispiel ersichtlich ist, verringert die Gegenwart einer EHZ die Wirksamkeit von α-Amylase bei pH 5,2 beträchtlich.
Beispiel 6
pH-Abhängigkeit der EHZ-Hemmung von α-Amylase
Eine EHZ (200 mg/l), die wie in Beispiel 4 isoliert wurde, wurde zu 35% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calcium enthielt, und der pH wurde auf etwa 6,0 oder 5,2 eingestellt. α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf entweder 5,2 oder 6,0 eingestellt und auf diesem Wert gehalten, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems hydrolysiert. Zur gleichen Zeit wie die Testproben wurden identische Kontrollen, die jedoch keine EHZ enthielten, bei einem pH von 5,2 und 6,0 durchgeführt. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wie ersichtlich ist, hängt die Hemmung von α-Amylase durch eine EHZ während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 vom pH ab. Bei einem pH von 6,0 verursachte der Zusatz von 200 mg/l EHZ lediglich eine etwa 6%ige Verringerung der DE-Entwicklung. Bei einem pH von 5,2 wurde die DE-Entwicklung um etwa 65% verringert.
Tabelle 2 Wirkung des pH auf die EHZ-Hemmung von α-Amylase während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10
Beispiel 7
Elementaranalyse einer EHZ
Eine EHZ, die wie in Beispiel 4 aus der Maisglutenfraktion isoliert wurde, wurde durch Atomadsorptionsspektroskopie (Gallbaraith Laboratories, Inc., Knoxville, TN, USA) einer Elementaranalyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3 Elementaranalyse einer EHZ
Diese Analyse stimmte mit jener eines Gemischs aus Magnesium-, Mangan-, Zink- oder Eisensalzen von Phytinsäure überein. Danach wurde die EHZ durch die in Beispiel 3 beschriebene HPLC-Analyse auf ihren Phytatgehalt untersucht. Die Analyse ergab, dass die anionische Komponente der EHZ im Wesentlichen aus Phytat bestand.
Beispiel 8
Isolierung einer EHZ aus gemahlenem Vollkorn
250 g gemahlenes Vollkorn wurden in 500 g entionisiertem Wasser suspendiert, und der pH der resultierenden Aufschlämmung wurden mit 6% HCl auf 4 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde etwa 8 h lang gerührt und dann etwa 10 h lang stehen gelassen. Die Aufschlämmung wurde durch Filtration mit Whatman-Filterpapier Nr. 3 aufgetrennt, und das Filtrat (etwa 310 g) wurde mit 1 M NaOH auf einen pH von 9 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde durch einen 0,45-m-Membranfilter filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in Wasser suspendiert, um eine Lösung zu bilden, und der pH wurde durch langsames Zusetzen von 6% HCl auf 5 eingestellt. Die Lösung wurde filtriert, um unlösliche Materialien zu entfernen, und auf etwa 4°C abgekühlt. Zwei Volumina kaltes Ethanol wurden zugesetzt, und der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit kaltem Ethanol gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet.
Aus 250 g gemahlenem Vollkorn wurden 0,772 g EHZ gewonnen. Die Gegenwart eines charakteristischen Phytats in der EHZ wurde wie in Beispiel 3 durch eine HPLC-Analyse bestätigt. Die Identifizierung der EHZ wurde durch den Zusatz der isolierten EHZ zu einem Verflüssigungsgemisch aus LO-DEX^TM 10 bei einem pH von 5,2 und die Bestimmung, ob α-Amylase gehemmt wurde, bestätigt. Eine EHZ (200 mg/l) aus gemahlenem Vollkorn wurden zu 35% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calciumionen in Form von CaCl₂·2H₂O enthielt, und der pH wurde auf etwa 5,2 eingestellt. α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf 5,2 eingestellt, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems hydrolysiert. Zur gleichen Zeit wie die Testproben wurden identische Kontrollen, die jedoch keine EHZ enthielten, bei einem pH von 5,2 durchgeführt. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen.
Die Ergebnisse der Versuche, die in Tabelle 4 zusammengefasst sind, stimmen mit jenen überein, die bei Verwendung einer aus einem oben genannten Maisglutenstrom isolierten EHZ erhalten wurden. Tabelle 4 Wirkung einer aus gemahlenem Vollkorn isolierten EHZ auf die Stabilität von α-Amylase während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2

Probe DE

200 mg/l EHZ 9,5

Kontrolle 16,3
Eine HPLC-Analyse einer aus gemahlenem Vollkorn isolierten EHZ wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt. 100 μl einer 15-mg/l-Lösung einer EHZ wurde in die HPLC-Säule injiziert, und das Material ergab nur einen anionischen Peak, der durch die Elutionszeit als Phytat identifiziert wurde. Das HPLC-Profil stimmte im Wesentlichen mit jenem überein, das für eine aus der Maisglutenfraktion isolierten EHZ erhalten wurde.
Beispiel 9
Isolierung einer EHZ aus Maisquellflüssigkeit
Schwere Maisquellflüssigkeit, das in einer Mais-Nassmahlanlage gewonnen wurde, d. h. ein eingedampftes Quellflüssigkeitskonzentrat, mit einer Dichte von etwa 19 Bé wurde durch Zentrifugation gereinigt. Der pH von 1 l gereinigter Flüssigkeit wurde durch den Zusatz von 5 M NaOH von 4,2 auf 8,1 erhöht. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation erhalten, in Wasser suspendiert, um den Nieder schlag zu waschen, und erneut durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde dann in etwa 400 ml Wasser suspendiert, und der pH der Aufschlämmung wurde durch den langsamen Zusatz von 6% HCl auf etwa 4 eingestellt. Nachdem sich der Niederschlag aufgelöst hatte, wurde die Lösung durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 filtriert, um unlösliche Materialien zu entfernen, und das Filtrat wurde auf etwa 4 °C abgekühlt. Eine EHZ wurde durch den Zusatz von 2 Volumina eiskaltem Ethanol aus der Lösung ausgefällt und durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit kaltem Ethanol gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet.
Aus 1 l schwerer Maisquellflüssigkeit wurden 23,3 g einer EHZ gewonnen. Die Identifizierung der EHZ wurde durch eine Bewertung von α-Amylase-Inaktivierung während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei einem pH von 5,2 und durch HPLC-Analyse für Phytat bestätigt.
Um die Wirkung einer EHZ aus Maisquellflüssigkeit auf eine Verflüssigung unter Verwendung von α-Amylase zu bestimmen, wurden 200 mg/l zu 35% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calciumionen in Form von CaCl₂·2H₂O enthielt, und der pH wurde auf etwa 5,2 eingestellt. α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf 5,2 eingestellt, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems hydrolysiert. Zur gleichen Zeit wie die Testproben wurde zum Vergleich eine identische Kontrolle, die jedoch keine EHZ enthielt, bei einem pH von 5,2 durchgeführt. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen. Eine identische Kontrolle, zu der jedoch keine EHZ zugesetzt worden war, wurde bei einem pH von 5,2 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Diese Ergebnisse stimmen mit jenen überein, die unter Verwendung einer aus dem oben genannten Maisglutenstrom isolierten EHZ erhalten wurden. Tabelle 5 Wirkung einer aus Maisquellflüssigkeit isolierten EHZ auf die Stabilität von α-Amylase während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2

Probe DE

200 mg/l EHZ 10,9

Kontrolle 14,9
Eine HPLC-Analyse einer aus Maisquellflüssigkeit isolierten EHZ wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt. 100 μl einer 200-mg/l-Lösung einer EHZ wurde in die HPLC-Säule injiziert, und das Material ergab nur einen anionischen Peak, der durch die Elutionszeit als Phytat identifiziert wurde. Das HPLC-Profil stimmte im Wesentlichen mit jenem überein, das für eine aus der Maisglutenfraktion isolierten EHZ erhalten wurde.
Beispiel 10
Identifizierung einer EHZ in Maisstärkegranulat
Eine Maisstärkegranulataufschlämmung aus einer Mais-Nassmühle wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 filtriert, um das Wasser von den Stärkekörnchen zu trennen. Das Stärkegranulat wurde in entionsiertem Wasser resuspendiert und erneut filtriert, um wasserlösliche Komponenten aus der unlöslichen Stärke zu entfernen. Das Stärkegranulat wurde dann in Wasser resuspendiert und auf 35% Feststoffgehalt verdünnt. α-Amylase (12 LU/g Kohlenhydrate) aus B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) und Calcium (50 ppm) wurden zugesetzt, und die Stärkegranulataufschlämmung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bei einem pH von 5,2 verflüssigt.
Das durch die erste Filtration der Maisstärkeaufschlämmung erhaltene Wasser wurde verwendet, um LO-DEX^TM 10 zu lösen und eine Lösung mit 35% Feststoffgehalt herzustellen. α-Amylase (12 LU/g Kohlenhydrat) und Calciumionen in Form von CaCl₂·2H₂O (50 ppm) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bei einem pH von 5,2 verflüssigt. Zur gleichen Zeit wurde eine Kontrolle, die nicht in Filtratwasser von der Maisstärkeaufschlämmung, sondern in entionisiertem Wasser gelöstes LO-DEX^TM 10 enthielt, verflüssigt.
Im Filtratwasser von der Stärkegranulataufschlämmung wurde keine EHZ detektiert, wenn diese durch HPLC auf ihren charakteristischen Phytatgehalt untersucht wurde. Bei einer HPLC-Analyse eines bei pH 6 verflüssigten Maisstärkegranulats wurde jedoch ein Elutionspeak detektiert, der auf die Gegenwart einer mit der in Beispiel 4 aus Maisgluten isolierten EHZ identischen Substanz hinwies. Eine HPLC-Analyse zeigte die Gegenwart von zwischen 30 und 40 mg Phytat pro Liter verflüssigtem Stärkegranulat mit 30 Gew.-% Feststoffen. Ein Vergleich der Verflüssigungsergebnisse von α-Amylase in Maltodextrin, vermischt mit Stärkegranulatfiltratwasser, und α-Amylase in LO-DEX^TM 10, vermischt mit entionisiertem Wasser, bestätigte, dass die im Stärkegranulat enthaltene EHZ durch Waschen nicht entfernt wurde. Demgemäß lassen die Ergebnisse dieser Versuche, die in der folgenden Tabelle 6 zusammengefasst sind, vermuten, dass eine EHZ, die für die α-Amylase-Inaktivierung während der Stärkeverflüssigung verantwortlich ist, mit den Stärkekörnchen verbunden ist und nicht frei in Lösung vorliegt. Tabelle 6 Verflüssigung mit Filtratwasser von gewaschenen Maisstärkekörnchen

Probe 90 min DE

gewaschene Stärkekörnchen ~0

LO-DEX^IM 10 in entionsiertem Wasser 17,9

LO-DEX^IM 10 in Filtratwasser einer Stärkeaufschlämmung 18,1
Beispiel 11
Phytaseninaktivierung einer EHZ
20 ml einer wie in Beispiel 4 isolierten EHZ wurden 30 min lang bei pH 2,5 und 37 °C mit 500 Einheiten Phytase (von A. ficuum, Sigma Chemical Company, P 7992) behandelt. 10 ml der behandelten EHZ wurden zu LO-DEX^TM 10 zugesetzt, um 1 l einer 35% LO-DEX^TM-10-Lösung zu erhalten, die 50 ppm Calciumionen, die in Form von CaCl₂·2H₂O zugesetzt wurden, und 200 mg/l EHZ enthielt. α-Amylase, die von B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) stammte, wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und die Lösung wurde bei pH 5,2 unter Verwendung des im obigen Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems und Verfahrens verflüssigt. Kontrollen aus LO-DEX^TM 10, zu denen keine EHZ zugesetzt wurde, und LO-DEX^TM 10, die 200 mg/ml unbehandelte EHZ enthielten, wurden gleichzeitig verflüssigt. Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, inaktiviert eine Phytasebehandlung eine EHZ, wodurch ihr die Fähigkeit, α-Amylase zu hemmen, genommen wird. Tabelle 7 Phytasebehandlung bei EHZ-Inaktivierung von α-Amylase

Probe 90 min DE

EHZ-freie Kontrolle 15,4

200 mg/l EHZ 9,5

200 mg/l phytasebehandelte EHZ 14,4
Beispiel 12
Phytasebehandlung von Maisstärkegranulat
Phytase (von A. ficuum, 5 ml von 250 Einheiten/ml, von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, Produkt-Nr. P9792) wurde zu 1 l 34% Maisstärkegranulat zugesetzt, das etwa 50 ppm Calciumionen enthielt, die in Form von CaCl₂·2H₂O zugesetzt wurden, und das Ganze wurde 5 h lang bei 37°C und pH 4,0 inkubiert. Nach der In kubation wurde der pH der Stärkegranulataufschlämmung auf pH 5,2 eingestellt, und 12 LU/g Kohlenhydrat α-Amylase von B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) wurden zur Stärkegranulataufschlämmung zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems verflüssigt. Eine Kontrollverflüssigung bei pH 5,2 unter Verwendung einer 34% Maisstärkegranulataufschlämmung, die nicht mit Phytase behandelt worden war, wurde zur gleichen Zeit durchgeführt.
In einem zweiten Durchlauf wurde Phytase (von Weizen, Sigma Chemical Company P1259, 160 Einheiten) 6 h lang bei 55°C und pH 5,15 mit 1 l 35% Maisstärkegranulataufschlämmung inkubiert, die etwa 50 ppm als CaCl₂·2H₂O zugesetzte Calciumionen enthielt. Nach der Inkubation wurde der pH der Stärkegranulataufschlämmung auf 5,5 eingestellt, und 12 LU/g Kohlenhydrat von α-Amylase, die von B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) stammte, wurde zur Aufschlämmung zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Systems und Verfahrens verflüssigt. Eine Kontrollverflüssigung bei pH 5,5 unter Verwendung von 35% Maisstärkegranulataufschlämmung, die nicht mit Phytase behandelt worden war, wurde zur gleichen Zeit durchgeführt.
Wie aus Tabelle 8 ersichtlich ist, erhöht eine Phytasebehandlung von Maisstärkegranulat vor der Verflüssigung die Fähigkeit von α-Amylase, Stärke bei niedrigem pH zu hydrolysieren.
Tabelle 8 Wirkung von Phytase auf die Stabilität von α-Amylase während einer Verflüssigung bei niedrigem pH
Beispiel 13
Wärmefiltration einer maltodextrinhältigen EHZ
Eine wie in Beispiel 4 isolierte EHZ (200 mg/l) wurde zu 35 Gew.-% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das etwa 50 ppm Calcium enthielt, das in Form von CaCl₂·2H₂O zugesetzt wurde, und der pH wurde auf etwa 5,2 eingestellt. Die Lösung wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde auf etwa 100°C erhitzt und sofort in heißem Zustand durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 vakuumfiltriert. Der zweite Teil wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 vakuumfiltriert, als er Raumtemperatur erreichte (z. B. 20 bis 25°C). α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis und im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zu den einzelnen Lösungen zugesetzt, und der pH der einzelnen Lösungen wurde auf 5,2 eingestellt, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurde. Jede Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems und Verfahrens hydrolysiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen. Proben beider Lösungen, die vor der Hydrolyse entnommen worden waren, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben auf Phytat untersucht.
Wie aus Tabelle 9 ersichtlich ist, werden durch die Filtration von EHZ-hältigem LO-DEX^TM 10 etwa 75% der EHZ aus der Lösung entfernt. Folglich wurde bei Verflüssigung bei pH 5,2 weniger α-Amylase inaktiviert, und das DE des resultierenden Hydrolysats war wesentlich größer.
Tabelle 9 Wirkung von Heißfiltration auf die EHZ-Inaktivierung von α-Amylase während einer Verflüssigung bei niedrigem pH
Beispiel 14
Isolierung einer EHZ aus braunem Reis
Brauner Basmatireis (im Handel erhältlich von Lundburg Mills) wurde unter Verwendung einer kleinen Kaffeemühle zu Mehl gemahlen. 200 g des gemahlenen Reises wurden zu 500 ml entionisiertem Wasser zugesetzt, und der pH wurde mit 6% HCl auf etwa 3 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde 30 h lang unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen und dann durch Vakuumfiltration durch Whatman-Filterpapier Nr. 3 fraktioniert.
Der pH des Filtrats wurde durch den Zusatz von 1 M NaOH auf 9 eingestellt, und der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit Wasser gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und in Wasser resuspendiert. Der pH der Suspension wurde langsam durch tropfenweises Zusetzen von 6% HCl auf etwa 5 eingestellt, und die Suspension wurde gerührt, um den Niederschlag aufzulösen. Ungelöstes Material wurde durch einen 5 m-Membranfilter abfiltriert, und das Filtrat wurde auf etwa 4°C abgekühlt. Zwei Volumina kaltes Ethanol wurden zum Filtrat zugesetzt, und der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit kaltem Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet.
200 g gemahlener Reis ergaben 0,3571 g EHZ. Die Identifizierung der EHZ wurde durch Bewertung der α-Amylase-Inaktivierung während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2 und durch eine HPLC-Analyse für Phytat bestätigt.
Eine EHZ (200 mg/l) aus gemahlenem Reis wurde zu 35% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calciumionen enthielt, die in Form von CaCl₂·2H₂O zugesetzt wurden, und der pH wurde auf etwa 5,2 eingestellt. α-Amylase, die von B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) stammte, wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf 5,2 eingestellt, indem je nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurde. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems und Verfahrens hydrolysiert. Eine identische Kontrolle, die jedoch keine EHZ enthielt, wurde bei pH 5,2 zur gleichen Zeit wie die Testprobe durchgeführt. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Tabelle 10 Wirkung einer aus gemahlenem Reis isolierten EHZ auf die Stabilität von α-Amylase während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2

Probe DE

Kontrolle 16,3

200 mg/l EHZ 11,7
Eine HPLC-Analyse einer aus gemahlenem Reis isolierten EHZ wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 100 μl einer 15-mg/l-Lösung einer EHZ wurden in die HPLC-Säule injiziert, und die Probe ergab nur einen anionischen Peak, der durch die Elutionszeit als Phytat identifiziert wurde. Das HPLC-Profil stimmte im Wesentli chen mit jenem überein, das für eine aus der Maisglutenfraktion isolierten EHZ erhalten wurde.
Beispiel 15
Isolierung einer EHZ aus Vollkornmehl
200 g handelsübliches Vollkornmehl (erhältlich von Arrowhead Mills) wurden zu 500 ml entionsiertem Wasser zugesetzt, das 12 mM D,L-Dithiothreit (Sigma Chemical Co.) enthielt. Der pH der Aufschlämmung wurde mit 6% HCl auf etwa 3 eingestellt, und die Aufschlämmung wurde etwa 30 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei gelegentlich gerührt wurde. Die Aufschlämmung wurde durch Zentrifugation fraktioniert.
Der pH des Filtrats wurde durch den Zusatz von 1 M NaOH auf 9 eingestellt, und der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit Wasser gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und in Wasser resuspendiert. Der pH der Suspension wurde durch tropfenweises Zusetzen von 6% HCl langsam auf etwa 5 eingestellt, und die Suspension wurde gerührt, um den Niederschlag aufzulösen. Ungelöstes Material wurde durch einen 5-m-Membranfilter abfiltriert, und das Filtrat wurde auf etwa 4°C abgekühlt. Zwei Volumina kaltes Ethanol wurden zum Filtrat zugesetzt, und der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wurde ein Mal mit kaltem Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet.
200 g Vollkornmehl ergaben 0,385 g EHZ. Die Identifizierung der EHZ wurde durch die Bewertung von α-Amylase-Inaktivierung während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2 und durch eine HPLC-Analyse für Phytat bestätigt.
Eine EHZ (150 mg/l) aus Vollkornmehl wurde zu 35% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calcium enthielt, und der pH wurde auf etwa 5,2 eingestellt. α-Amylase, die von B. licheniformis (SPEZYME^® AA20, im Handel erhältlich von Genencor Interna tional, Inc.) stammte, wurde mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zugesetzt, und der pH der Lösung wurde auf 5,2 eingestellt, indem je nach Bedarf 2,5 % NaOH oder 6% HCl zugesetzt wurde. Die Lösung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reaktorsystems und Verfahrens hydrolysiert.
Zum Vergleich wurde eine Kontrolle, die jedoch keine EHZ enthielt, unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der zweiten Phase durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 11 Wirkung einer aus Vollkornmehl isolierten EHZ auf die Stabilität von α-Amylase während der Hydrolyse von LO-DEX^TM 10 bei pH 5,2

Probe DE

Kontrolle 16,3

150 mg/l EHZ 14,2
Eine HPLC-Analyse einer aus Vollkornmehl isolierten EHZ wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 100 μl einer 15-mg/l-Lösung einer EHZ wurden in die HPLC-Säule injiziert, und die Probe ergab nur einen anionischen Peak, der durch die Elutionszeit als Phytat identifiziert wurde. Das HPLC-Profil stimmte im Wesentlichen mit jenem überein, das für eine aus der Maisglutenfraktion isolierten EHZ erhalten wurde.
Beispiel 16
Ausfällung einer EHZ durch Erhitzen auf 95°C
Eine wie in Beispiel 4 isolierte EHZ (200 mg/l) wurde zu 35 Gew.-% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calciumionen (zugesetzt als CaCl₂·2H₂O) enthielt, und der pH wurde mit 2,5% NaOH auf 5,2 eingestellt. Die LO-DEX^TM-10-Lösung wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde etwa 6 min lang auf 95°C erhitzt, indem die Lösung durch den in Beispiel 2 beschriebenen Reaktor geleitet wurde. Nachdem sie durch den Reaktor geleitet worden war, wurde α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis und im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zur Lösung zugesetzt. Dann wurde die Lösung 90 min lang bei 95°C inkubiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der 90-minütigen Inkubation durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen.
Der zweite Teil der EHZ-hältigen Maltodextrinlösung wurde mit α-Amylase (12 LU/g Kohlenhydrat, SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis und im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) dosiert und wie in Beispiel 2 beschrieben durch das Reaktorsystem geschickt, mit der Ausnahme, dass die Temperatur 95°C betrug. Dann wurde die Lösung 90 min lang bei 95°C inkubiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der 90-minütigen Inkubation durch ein Dextroseäquivalent (DE} gemessen. Eine identische Kontrolle, die jedoch eine EHZ enthielt, wurde zum Vergleich zur gleichen Zeit bei pH 5,2 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Versuche, die in Tabelle 12 zusammengefasst sind, belegen, dass die Fähigkeit einer EHZ, α-Amylase während einer Verflüssigung zu inaktivieren, durch Erhitzen verringert werden kann. Tabelle 12 Wirkung des Erhitzens auf die EHZ-Inaktivierung von α-Amylase

Probe DE

Kontrolle 17,6

EHZ + α-Amylase 14,0

EHZ + α-Amylase, zugesetzt nach dem Erhitzen 17,5
Beispiel 17
Ausfällung einer EHZ aus Maltodextrin durch Erhitzen auf 105,5°C
Eine wie in Beispiel 4 isolierte EHZ (200 mg/l) wurde zu 35 Gew.-% LO-DEX^TM 10 zugesetzt, das 50 ppm Calciumionen (zugesetzt als CaCl₂·2H₂O) enthielt, und der pH wurde mit 2,5% NaOH auf 5,2 eingestellt. Die LO-DEX^TM-10-Lösung wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde etwa 6 min lang auf 105,5°C erhitzt, indem die Lösung durch den in Beispiel 2 beschrieben Reaktor geleitet wurde. Nachdem sie durch den Reaktor geleitet worden war, wurde α-Amylase (SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis und im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) mit einer Geschwindigkeit von 12 LU/g Kohlenhydrat zur Lösung zugesetzt. Dann wurde die Lösung 90 min lang bei 95°C inkubiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der 90-minütigen Inkubation durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen.
Der zweite Teil der EHZ-hältigen Maltodextrinlösung wurde mit α-Amylase (12 LU/g Kohlenhydrat, SPEZYME^® AA20, hergestellt durch B. licheniformis und im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) dosiert und wie in Beispiel 2 beschrieben durch das Reaktorsystem geschickt, und zwar bei einer Temperatur von 105,5°C. Dann wurde die Lösung 90 min lang bei 95°C inkubiert. Der Hydrolysegrad des LO-DEX^TM 10 wurde direkt nach der 90-minütigen Inkubation durch ein Dextroseäquivalent (DE) gemessen. Eine identische Kontrolle, die jedoch keine EHZ enthielt, wurde zum Vergleich zur gleichen Zeit bei pH 5,2 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Versuche, die in Tabelle 13 zusammengefasst sind, belegen, dass die Fähigkeit einer EHZ, α-Amylase während einer Verflüssigung zu inaktivieren, durch Erhitzen vor dem Zusatz von α-Amylase verringert werden kann. Tabelle 13 Wirkung des Erhitzens auf die EHZ-Inaktivierung von α-Amylase während einer Verflüssigung bei niedrigem pH

Probe DE

keine EHZ-Kontrolle 15,0

EHZ + α-Amylase 10,2

EHZ + α-Amylase nach dem Erhitzen 17,5
Es wird angenommen, dass die Gegenwart einer EHZ im LO-DEX^TM 10 für die Steigerung des DE verantwortlich ist, das nach dem Zusetzen der EHZ und der Wärmebehandlung im Vergleich zur Kontrolle ohne EHZ-Zusatz und ohne Wärmebehandlung zu beobachten ist.
Natürlich versteht sich, dass die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform zahlreiche Veränderungen und Modifikationen zulässt. Daher versteht sich, dass die obige detaillierte Beschreibung nur durch die beiliegenden Ansprüche begrenzt ist, welche den Schutzumfang dieser Erfindung definieren.

Claims

Verfahren zum Verflüssigen von Stärke, folgende Schritte umfassend: a) das Behandeln von Stärkegranulat oder Stärkelösung, um eine in der Stärke vorhandene Enzym-hemmende Zusammensetzung zu inaktivieren und/oder zu entfernen, um behandelte Stärke zu bilden; b) das Zugeben von α-Amalyse zur Stärke; und c) das Umsetzen der behandelten Stärke für eine Zeit und bei einer Temperatur, die wirksam sind, die behandelte Stärke zu verflüssigen, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) vor Schritt (b) stattfindet, und weiters dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) bei einem pH von 4,5 bis 6,0 stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (a) das Erhitzen der Stärke auf eine Temperatur zwischen 80°C und 150°C umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, weiters umfassend das Entfernen der Enzymhemmenden Zusammensetzung durch Zentrifugieren.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Zentrifugieren nach oder gleichzeitig mit dem Anheben der Temperatur der Stärke durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (c) bei einem pH zwischen 4,5 und 5,7 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (c) bei einem pH zwischen 4,5 und 5,2 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin vor Schritt (a) der Stärke α-Amylase bei einer Temperatur zwischen etwa 60°C und etwa 90°C zugegeben wird, um die Enzym-hemmende Zusammensetzung aus der Stärke freizusetzen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin Schritt (a) die Wärmebehandlung nach der Zugabe der α-Amylase umfasst, um die Enzym-hemmende Zusammensetzung von der Stärke für eine Zeit und bei einer Temperatur freizusetzen, die ausreichen, um die Enzym-hemmende Zusammensetzung zu inaktivieren.
Verfahren zum Verflüssigen von Stärke, folgende Schritte umfassend: a) das Behandeln von Stärkegranulat oder einer Stärkelösung, um eine in der Stärke vorhandene Enzym-hemmende Zusammensetzung zu inaktivieren und/oder zu entfernen, um behandelte Stärke zu bilden; b) das Zugeben von α-Amylase zur Stärke; und c) das Umsetzen der behandelten Stärke für eine Zeit und bei einer Temperatur, die wirksam sind, die behandelte Stärke zu verflüssigen, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird, und weiters dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) das Zugeben eines Enzyms umfasst, das Phytat-Abbauwirkung umfasst, und noch weiter dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) bei einem pH von 4,5 bis 6,0 stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Enzym, das Phytat-Abbauwirkung umfasst, gleichzeitig mit der α-Amylase zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Enzym, das Phytat-Abbauwirkung umfasst, in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und etwa 100 Phytaseeinheiten pro Gramm Stärke zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 9, worin Schritt (c) bei einem pH zwischen 4,5 und 5,7 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, worin Schritt (c) bei einem pH zwischen 4,5 und 5,2 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, worin vor Schritt (a) α-Amylase der Stärke bei einer Temperatur zwischen etwa 60°C und etwa 90°C zugegeben wird, um die Enzym-hemmende Zusammensetzung aus der Stärke freizusetzen.
Stoffzusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus α-Amylase und wässriger Stärke mit einem pH von weniger als 5,0, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Enzym-hemmender Zusammensetzung ist.
Verwendung eines Enzyms, das Phytat-Abbauaktivität umfasst, um vor dem oder gleichzeitig mit dem Verflüssigen einer Stärke enthaltenden Zusammensetzung Phytat zu entfernen, wobei der Verflüssigungsschritt das Zugeben von α-Amylase zur Zusammensetzung und das Umsetzen der Zusammensetzung für eine Zeit und bei einer Temperatur umfasst, die bewirken, dass die Stärke verflüssigt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke Stärkegranulat oder eine Stärkelösung ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Enzym Phytase oder Säure-Phosphatase ist.