DE69529300T2

DE69529300T2 - Haiknorpel extrakte,verfahren zur herstellung und verwendungen desselben

Info

Publication number: DE69529300T2
Application number: DE69529300T
Authority: DE
Inventors: Paul Brazeau; Eric Dupont; Christina Juneau; H Maes; Kenneth Marenus
Original assignee: Les Laboratories Aeterna Inc
Current assignee: Cosciens Biopharma Inc
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2015-10-31
Also published as: FI117376B; CZ245297A3; ES2188672T3; BG101870A; NZ294553A; BR9510540A; DK0806960T3; PL321678A1; NO318950B1; FI973195A0; RO117590B1; MX9705894A; DE69529300D1; KR100347880B1; IS4537A; IS1963B; CA2212010A1; CN1177927A; PL188137B1; WO1996023512A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Haiknorpelextrakts bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Krankheiten oder Störungen.
Knorpelgewebe ist ein gefäßloses Gewebe und wurde als potentielles, anti- angiogenetische Faktoren enthaltendes Versuchsobjekt untersucht. Ebenso ist es ein Gewebe, das gegenüber einer Tumorbildung relativ widerstandsfähig ist. Der mit Knorpelgewebe verbundene Tumor, Chondrosarcom, ist von den festen Tumoren derjenige, der am wenigsten mit Blutgefäßen versorgt ist. Die Angiogenese ist einer der wichtigsten Faktoren bei der Bildung eines Tumors. Einzelne feste tumorale Ansammlungen treten auf, wenn die Tumorzellen das angrenzende Gefäßnetz dazu veranlassen können, sich auszudehnen, um ihren Ernährungsbedarf zu decken. Aus diesem Grund hat man die mit der Stimulation der Angiogenese verbundenen Faktoren auf ihre Funktion bei der Tumorbildung hin untersucht, und auch anti-angiogenetische Faktoren sowie Arzneimittel mit angiogenese-hemmender Wirkung wurden als Mittel zum Steuern des Wachstums oder zum Bewirken einer Regression von Tumoren untersucht.
Man hat festgestellt, daß Schulterblattknorpelgewebe von Kälbern eine Substanz enthält, welche die Vaskularisierung von festen Tumoren hemmt (Langer et al., 1976). Aufgrund seines vielversprechenden Potentials als Antitumor-Wirkstoff suchte man nach größeren Lieferquellen von Knorpelgewebe.
Haie sind Tiere, die aufgrund der Tatsache, daß ihr Endoskelett vollkommen aus Knorpelgewebe besteht (6% ihres Körpergewichts gegenüber 0,6% bei Kälbern), eine mögliche Quelle für diese Art von Angiogenese-Hemmer sind. Ferner ist eine interessante Eigenschaft der Haie ihre geringe Neigung zur Bildung von Tumoren. Viele Hypothesen wurden entwickelt, um diese geringe Wahrscheinlichkeit einer Bildung von Tumoren bei Haien zu erklären. Marchalonis et al. (1990) haben IgM- Antikörper aufgezeigt, die in der Lage sind, jegliche aggressive Mittel ohne weiteres anzugreifen. McKinney et al. (1990) haben dargelegt, daß Haie Macrophagen haben, die in der Lage sind, normale Zellen von neoplastischen Zellen zu unterscheiden und letztere zu zerstören. Rosen und Woodhead (1980) haben die Annahme aufgestellt, daß das seltene Auftreten von Tumoren bei Elasmobranchiern (einer Gruppe, zu der Haie und Rochen gehören) auf die hohe ionische Festigkeit ihrer Gewebe zurückgeführt werden könnte, die gleichbedeutend mit einer hohen Körpertemperatur ist. Diese Autoren glauben, daß unter diesen Bedingungen das Immunsystem eine nahezu 100% Immunüberwachung ausübt. Moore et al. (1993) haben herausgefunden, daß Haie ein Amonisterol produzieren, das antibakterielle und antiprotozoale Eigenschaften hat. Schließlich haben Lee und Langer (1983) und Folkman und Klagsbrun (1987) aufgezeigt, daß Haie eine Substanz produzieren, welche die Gefäßneubildung hemmt. Lee und Langer (op. cit.) haben diese Substanz isoliert, indem sie sie unter denaturierenden Bedingungen aus Haiknorpelgewebe extrahiert haben (Guanidin-Extraktion). Dieses Extraktionsverfahren dauert jedoch sehr lange (41 Tage) und kann Extrakte erzeugen, die denaturierte Faktoren enthalten können. Während die aus Kälbern isolierte aktive Substanz ein Molekulargewicht von etwa 16 Kilodalton (kDa) hat, hat die gleiche Gruppe von Forschern keine genaue Angabe über das Molekulargewicht der aus Haien gewonnenen Substanz gemacht. Diese Substanz ist nur insofern definiert, als sie ein Molekulargewicht von über 3500 Dalton hat. Oikawa et al. (1990) haben das gleiche Extraktionsverfahren angewandt, wie es von Lee und Langer beschrieben wurde, jedoch mit einer viel kürzeren Laufzeit (zwei Tage anstelle von 41 Tagen). Die von Oikawa et al. aus Haiknorpelgewebe isolierte Substanz ist auf ein Molekül beschränkt, das ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 10000 Dalton hat. Schinitsky (US-A-4 473 551) offenbart einen Wasserextrakt aus unbehandeltem pulverförmigem Haiknorpelgewebe, dessen Fraktion von über 100,000 Dalton für sich allein oder in Kombination mit Glukosamin eine entzündungshemmende Wirkung hat. In diesem Patent findet sich kein Hinweis darauf, daß ein Bestandteil dieses Extrakts eine anti-angiogenetische Wirkung oder eine Antitumor-Wirkung hat. Kuetner et al. (US-A-4 746 729) haben einen polymorphkernigen Neutrophil (PMN)-Elastasehemmer aus Rinderknorpelgewebe isoliert. Dieser Hemmer wurde aus einem wäßrigen Extrakt von Knorpelgewebe erhalten, aus dem Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 50.000 Dalton zurückbehalten wurden. Die Fraktionierung an Sephacryl S-200 lieferte zahlreiche Fraktionen, von denen solche mit 10-40 kDa vereint wurden, nachdem sie eine Antielastase-Wirkung gezeigt hatten. Die aktive Komponente hatte einen isoelektrischen Punkt von 9,5 und kann ein Molekulargewicht von etwa 15.000 Dalton haben. Kuetner et al. (US- A-4 042 457) haben ferner gezeigt, daß Rinderknorpelgewebe eine Komponente mit einem Molekulargewicht von weniger als 50.000 Dalton hat, die eine Zellwachstumshemmwirkung hat, ohne jedoch eine Wirkung auf ein endotheliales Zellwachstum zu haben. Balassa et al. (US-A-4 822 607) haben einen Knorpelextrakt in einer wäßrigen Lösung hergestellt, wobei der Extrakt eine Antitumor-Wirkung hat. Jedoch haben wir keine anti-angiogenetische Wirkung in einem Extrakt beobachtet, das durch Reproduzieren des Verfahrens nach Balassa erhalten wurde. Spilburg et al. (US-A-4 243 582) haben zwei Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 65 kDa und einem pl von 3,8 aus Rinderknorpelgewebe isoliert (Guanidin-Extraktion), die eine Antitrypsin-Wirkung und eine Hemmwirkung auf endotheliales Zellwachstum zeigen.
Kalb- und Haiknorpelgewebe enthalten viele biologische Wirkungen, wie z. B. eine entzündungsfördernde Wirkung, eine entzündungshemmende Wirkung, eine anti- angiogenetische Wirkung, eine Lysozymwirkung, eine zellwachstumsfördernde Wirkung, eine Hemmwirkung gegen Kollagenase Typ I und IV, Elastase und andere Proteasen wie Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin. Bisher hat jedoch noch niemand einen Knorpelextrakt erhalten, der eine Ansammlung von klinisch wertvollen Wirkungen enthält.
Oikawa erläutert in Cancer Letters, Band 51, Seiten 181-186 (1990) wie eine Guanidin-Extraktion und eine Rohfraktionierung von japanischem Haiknorpelgewebe durch Ultrafiltration auf einer Molekulargewichtsbasis durchgeführt und wie die anti-angiogenetischen Wirkungen auf die Hemmungen von Tumoren und embryonaler Angiogenese getestet wurden. Man stellte eine wesentliche Hemmung der Angiogenese fest. Zur Isolierung einer anti- kollagenolytischen und einer entzündungshemmenden Wirkung wird jedoch in dem Dokument nichts erwähnt. Darüber hinaus ist das Produkt von Oikawa keine 0-500 kDa Fraktion eines Überstandes.
In Science, Band 221, Seiten 1185-1187 (1983) erläutern Lee und Langer, daß Haiknorpelgewebe Tumor-Angiogenese-Hemmstoffe enthalten.
In Fed. Proc. 45,949 (1986) erwähnt Luer Angiogenese-Hemmstoffe aus Haiknorpelgewebe. Der Extrakt von Luer enthält Antiprotease-Komponenten in Fraktionen mit einem Molekulargewicht von über 10 kDa. Aufgrund der knappen Informationen, die in der Zusammenfassung von Luer über sein proprietäres Verfahren dargelegt sind, ist es nahezu unmöglich, den Extrakt von Luer genau zu reproduzieren. Aus diesem Grund gibt es kein Anzeichen dafür, daß es Luer gelungen wäre, einen Extrakt herzustellen, der alle anti-kollagenolytischen und entzündungshemmenden Moleküle des vorliegenden Extrakts enthält.
In US-A-4 473 551 beschreibt Shinitsky entzündungshemmende Zusammensetzungen. Die erste Zusammensetzung besteht aus einem Pulver aus Haiknorpelgewebe. Die zweite Zusammensetzung besteht aus einem wäßrigen Extrakt des genannten Pulvers. Die dritte Verbindung ist eine Kombination aus einem Haiknorpelextrakt und Glucosamin. Schinitsky offenbart einen guten Wirkungsgrad, jedoch nur bei Vorhandensein von Glucosamin. Ferner zeigt Schinitsky eine entzündungshemmende Wirkung des Knorpelgewebes nur im Falle des pulverförmigen Knorpelgewebes, wobei das Knorpelgewebepulver ein reines Ausgangsmaterial ist, das gleichbedeutend mit der Verwendung von unbehandeltem Knorpelgewebe ist.
Alle der vorstehenden vier Dokumente beschreiben Verfahren, bei denen spezifische Fraktionen wiedergewonnen werden. Es ist keine Lehre vorhanden, Knorpelextrakte zu verwenden, die mehrere Fraktionen und somit eine Vielzahl von Inhaltsstoffen enthalten, die aus dem Haiknorpelgewebe stammen.
Die WO-A-95/32722 (E-Dokument) sollte ebenfalls erwähnt werden, wobei dazu angemerkt wird, daß der darin offenbarte Knorpelextrakt, der derselbe ist, wie der, der bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, zum Behandeln von Krebs, Schuppenflechte, Akne und Arthritis verwendet wird. Diese Zielkrankheiten bzw. -störungen sind ausdrücklich aus der in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verwendung ausgeschlossen.
Ein anti-angiogenetischer Bestandteil bzw. Bestandteile aus Haiknorpelgewebe wurden allgemein im Kaninchen-Hornhaut-Test (engl.: rabbit corneal pocket assay) oder im Hühner-Chorionallantoismembran(CAM)-Versuch getestet. Bislang wurde vollkommen pulverisiertes Knorpelgewebe in vivo auf seine anti- angiogenetische Wirkung direkt an Tumoren getestet, an menschlichem Melanom-Xenotransplantat, das in Nacktmäuse implantiert wurde (US-A-5 075 112), sowie in einem CAM-Versuch getestet. Auch wenn Knorpelextrakten eine Antitumor-Wirkung zugeschrieben wurde, wurde diese Wirkung häufig auf die anti-angiogenetische Komponente zurückgeführt, die dem Tumor die Blutzufuhr entzieht. Bisher gibt es keinen Beweis dafür, daß Haiknorpelgewebe eine direkte Wirkung auf Tumorzellenproliferation hat.
Einige Verfahren zum Erzeugen von Haiknorpelextrakten und Fraktionen sind bereits bekannt. Einige von ihnen erzeugen ein pulverförmiges, unbehandeltes Knorpelgewebe ohne jegliche Extraktion (US-A-5 075 112). Andere verwenden Denaturierungsmittel wie Guanidin (US-A-4 243 582). Wieder andere führen eine Vorbehandlung des Knorpelgewebes durch eine enzymatische Aufschließung durch, um jegliche das Knorpelgewebe umgebende Muskel-, Nerven- oder Gefäßstrukturen zu entfernen, wobei auf den Schritt der Vorbehandlung die Eliminierung der Fette in organischen Lösungsmitteln folgt, und daraufhin die aktiven Komponenten in einer wäßrigen Phase extrahiert werden. (Balassa et al. US-Patente Nr. 3 478 146, 4 350 682, 4 656 137 und 4 822 607). Die Wirkung einer solchen Vorbehandlung auf die Erhaltung der Integrität der biologisch aktiven Komponenten des Knorpelgewebes ist nicht bekannt. Falls dies zu kostspielig ist, kann eine enzymatische Aufschließung die aktiven Proteinkomponenten hydrolisieren; das Verfahren nach Balassa enthält keinen Fraktionierungsschritt, der die aktiven Komponenten in einem Extrakt anreichern würde. Andere erzeugen einfach wäßrige Extrakte (in Wasser (US-A-4 473 551) oder Salzlösungen (US-A-4 746 729)) von Knorpelgewebe, indem sie das nicht löslich machbare Material beseitigen. Unter den letztgenannten wurden insbesondere spezifische Fraktionen mit spezifischen Molekulargewichten für weitere Untersuchungen und zur Reinigung zurückgehalten (vgl. vorstehende Erläuterungen).
Die oben genannten Verfahren haben einige Nachteile. Einige wertvolle Komponenten können denaturiert werden. Sollte dies nicht der Fall sein, haben sie den Nachteil, daß sie zu langwierig sind, um einen praktischen Zweck zu haben. Darüber hinaus führen die langwierigen Verfahren nicht zwangsweise zu ausreichenden Mengen an aktiven Komponenten, und unter den wiedergewonnenen Komponenten werden einige überhaupt nicht wiedergewonnen oder in einer Ausbeute, die unzureichend ist, um eine erfaßbare Wirkung zu zeigen; wieder andere wurden nicht beachtet, da man sich auf den Erhalt spezifischer Wirkungen konzentrierte.
Angiogenese ist nicht nur bei der Krebsbildung beteiligt. Viele Krankheiten oder Leiden, die verschiedene physiologische Systeme (angegeben in Klammern) beeinflussen, sind von der Angiogenese abhängig. Dazu zählen die folgenden Beispiele: Arthritis und atherosklerotische Plaque (Knochen und Bänder), diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Trachom und Hornhauttransplantat-Neovaskularisation (Auge), Schuppenflechte, Sklerodermitis, Hämangiome und hypertrophe Narben (Haut), vaskuläre Verwachsungen und Angiofibrome (Blutsystem). Aus diesem Grund könnte jeder neue anti-angiogenetische "Faktor" Anwendung bei der Behandlung dieser Krankheiten sowie bei der Krebstherapie finden. Da darüber hinaus viele der oben angeführten Krankheiten oder Leiden auch eine entzündliche Komponente haben, könnte jeder neue und wirksame entzündungshemmende "Faktor" eine Anwendung bei der Behandlung dieser Krankheiten und Leiden sowie jeglichen anderen entzündlichen Krankheiten oder Leiden finden. Da Proteasen und Kollagenasen aufgrund ihrer Kollagen abbauenden Wirkung an einer großen Vielfalt von Krankheiten und Leiden, wie Krebs und vorzeitiges Altern, beteiligt sind, könnte ferner ein neuer und wirksamer anti-kollagenolytischer "Faktor" eine Anwendung bei der Behandlung von Krankheiten oder Leiden finden, die eine kollagenolytische Komponente haben. Da Angiogenese, eine Entzündung und Proteasen, wie Kollagenasen, allein oder in Kombination bei vielen verschiedenen Krankheiten oder Leiden angetroffen werden können, hätte ein Produkt, das in der Lage ist, wenigstens all diesen Wirkungen entgegenzuwirken, ohne dabei die normalen Körperfunktionen zu beeinflussen, einen hohen therapeutischen Wert.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine neue Verwendung eines Haiknorpelextrakts bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln einer Krankheit oder Störung, die Kollagenolyse oder Entzündung als Komponente hat, wie in Anspruch 1 definiert.
Einige zusätzliche Merkmale der vorstehenden neuen Verwendung eines Haiknorpelextrakts sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung ist mit einem Verfahren zum Herstellen von Knorpelextrakten verbunden, die den Vorteil haben, daß sie eine Vielfalt von therapeutisch wertvollen Wirkungen haben. Es hat sich bestätigt, daß unter diesen anti-angiogenetische, entzündungshemmende, anti- kollagenolytische, in vivo antitumor-proliferierende und direkte in vitro antitumorproliferierende Aktivitäten in einem Haiknorpelextrakt in zufriedenstellenden Konzentrationen vorhanden sind. Die Identifizierung oder Bestätigung weiterer Aktivitäten wird erwartet. Die in Tumorzellinien gemessene Wirkung zeigte auf, daß neben einer direkten antitumor-proliferierenden Wirkung auch eine zytotoxische Wirkung vorhanden war. Alle Wirkungen wurden in einem Flüssigextrakt von Haiknorpelgewebe erhalten, und einige derselben wurden in einem Festextrakt desselben erhalten oder nachgewiesen.
Ferner ist die Verwendung der vorliegenden Erfindung mit einem Verfahren zum Herstellen eines Flüssigextrakts aus Knorpelgewebe verbunden, das einen wesentlichen Anteil der biologisch aktiven wasserlöslichen Komponenten hat, die in intaktem Knorpelgewebe vorhanden sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
a) Homogenisieren des Knorpelgewebes in einer wäßrigen Lösung bei Bedingungen, die kompatibel sind mit dem Aufrechterhalten der Integrität der genannten biologisch aktiven Komponenten bis das Knorpelgewebe auf Teilchen reduziert ist, deren Größe kleiner gleich etwa 500 um ist, mit dem Ergebnis einer Mischung aus Teilchen und einem unbehandelten Flüssigextrakt, der diese biologisch aktiven Komponenten hat,
b) Zentrifugieren des Homogenats, um Teilchen aus dem unbehandelten Flüssigextrakt abzutrennen, und
c) weiteres Abtrennen des unbehandelten Flüssigextrakts, um so ein endgültiges Flüssigextrakt zu erhalten, das Knorpelgewebe-Moleküle mit einem Molekulargewicht von kleiner gleich etwa 500 um kDa hat.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß es leicht durchzuführen und wirksam ist. Hohe Ausbeuten an Knorpelextrakt wurden erhalten, wobei dieser Extrakt, insbesondere aus Haiknorpelgewebe, wenigstens alle der oben genannten biologischen Wirkungen enthält. Es wird vorzugsweise bei einer niedrigen Temperatur (etwa 0 bis 10ºC) durchgeführt, unter nicht-denaturierenden Bedingungen (vorzugsweise in reinem Wasser), bei einem pH-Wert, der nahe dem neutralen ist (etwa 6 bis 8), um die Wahrscheinlichkeit der Gewinnung von Verbindungen unbekannter physikochemischer Eigenschaften zu maximieren. Gemäß diesem Verfahren können Knorpelgewebe-Komponenten in einer Lösung mit niedrigem Volumen extrahiert werden (nur 1 L für 1 kg Knorpelgewebe) und nach einer kurzen Homogenisierungsphase (nur 10 bis 15 Minuten). Für die Gewinnung eines Festextrakts wird das gleiche Verfahren eingesetzt, mit der Ausnahme, daß das Pellet gewonnen und gefriergetrocknet wird und der Überstand außer acht gelassen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft Knorpelextrakte, insbesondere Extrakte, die von der Gattung der Elasmobranchier stammen, und insbesondere von Haien. Der Festextrakt hat eine Wirkung gezeigt. Er kann Kollagen und nicht-wasserlösliche Komponenten enthalten. Ferner kann er eine Restwirkung von dem zeigen, was in dem gesamten flüssigen Extrakt extrahiert wurde. Der gesamte flüssige Extrakt hat eine sehr hohe Wirkung. Er kann als solcher verwendet oder konzentriert werden. Ein Konzentrationsschritt, der die Erhaltung biologischer Wirkungen begünstigt, wurde bevorzugt. Ein Zurückgreifen auf Verfahren, welche die aktiven Komponenten herabsetzen könnten, wie eine Wärmeverdampfung, wurden durch Vorsicht vermieden. Eine Ultrafiltration auf einer Membran mit einem Molekulargewicht-Cut-off-Wert von etwa 1 kDa wurde eingesetzt, um den Flüssigextrakt der vorliegenden Erfindung zu konzentrieren. Als Folge davon wurde ein konzentrierter Extrakt mit Molekülen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1 und etwa 500 kDa erhalten und getestet. Der gesamte Flüssigextrakt (0 bis 500 kDa) wurde weiter fraktioniert, um dessen aktive Komponenten zu charakterisieren. Zahlreiche Fraktionen wurden durch verschiedene Verfahren erhalten. Einige derselben, die an Tumorzellinien getestet wurden, wurden durch ihr Molekulargewicht und ihren isoelektrischen Punkt grob charakterisiert. Anderen wurde eine Wirkung, insbesondere anti-kollagenolytische oder anti-angiogenetische Wirkungen zugeschrieben. Eine vollkommene Charakterisierung und Identifizierung dieser Fraktionen steht noch aus. Deshalb wurden wertvolle Wirkungen in einem gesamten flüssigen Extrakt und Fraktionen desselben wiedergefunden, die vorteilhafterweise verwendet werden können. Anstelle einer Verabreichung einer hohen Menge an pulverförmigen Knorpelgewebe, kann nun ein besser aufnehmbarer und angereicherter Extrakt verabreicht werden.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung ist auch mit therapeutischen oder kosmetischen Zusammensetzungen verbunden, die als einen aktiven Inhaltsstoff einen der vorstehenden Knorpelextrakte enthalten. Das größte Interesse wurde auf topische Zusammensetzungen zur Verwendung in der Dermatologie und der Kosmetiklehre gelenkt. Dieses Interesse geht auf die beobachteten Wirkungen des Knorpelextrakts zurück. In dieser Hinsicht wurden die beobachteten anti- kollagenolytischen und entzündungshemmenden Wirkungen und die antagonistische Wirkung der Zelldifferenzierung vermittelt durch die Induktion von Protein Kinase C in Keratinozyten als offene Wege für die Verwendung von Haiknorpelextrakten in Zusammensetzungen und Verfahren betrachtet, und zwar für die Linderung einer Entzündung, die Regulierung von Falten- oder Hautrückbildung, die Verzögerung des vorzeitigen Alterns, die Minderung von Akne, die Verbesserung der Barrierenfunktion der Haut, die Linderung einer Entzündung oder Irritation und eine Hautglättungswirkung.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der spezifischen Ausführungsbeispiele, die in den beigefügten Figuren gezeigt sind, leichter verständlich, wobei es vielmehr deren Zweck ist, die Erfindung aufzuzeigen als ihren Schutzumfang einzuschränken.
Die Daten zu Krebs, Schuppenflechte, Akne und Arthritis sind rein für veranschaulichende Zwecke angegeben und bilden keinen Teil der Erfindung, wie sie beansprucht wird.
In den Figuren zeigen:
Fig. 1 die Hemmwirkung zunehmender Dosen von Haiknorpelgewebe (Feststoffextrakt) an ZR75-1 und MCF- 7-Zellen,
Fig. 2 Dosis-Ansprechkurven der Menge an MCF-7 Zellen, gemessen an ihrem DNA-Gehalt bei Vorhandensein zunehmender Konzentrationen an Estradiol mit oder ohne zwei Konzentrationen an Knorpelgewebe-Lyophilisat,
Fig. 3a) und 3b) einen Vergleich zwischen Leberschnitten von Ratten mit ausgebildetem Brustdrüsenkrebs, wobei den einen durch künstliche Sondenernährung eine Kombination aus Knorpelgewebe-Lyophilisat und Überstand und den anderen nur Wasser verabreicht wurde,
Fig. 4a) und 4b) einen Vergleich zwischen Nierenschnitten von Ratten mit ausgebildetem Brustdrüsenkrebs, wobei den einen durch künstliche Sondenernährung eine Kombination aus Knorpelgewebe-Lyophilisat und Überstand und den anderen nur Wasser verabreicht wurde,
Fig. 5a) und b) einen Vergleich zwischen Lungenschnitten von Ratten mit ausgebildetem Brustdrüsenkrebs, wobei den einen durch künstliche Sondenernährung eine Kombination aus Knorpelgewebe-Lyophilisat und Überstand und den anderen nur Wasser verabreicht wurde,
Fig. 6a) und b) einen Vergleich zwischen Brustdrüsenkrebsschnitten von Ratten, in denen sich ein solcher Tumor ausgebildet hat, wobei den einen durch künstliche Sondenernährung eine Kombination aus Knorpelgewebe-Lyophilisat und Überstand und den anderen nur Wasser verabreicht wurde,
Fig. 7 ein aus den Fig. 6a) und b) abgeleitetes Histogramm, das die Wirkung von Knorpelextrakt auf die Blutgefäßfläche in Tumoren aufzeigt,
Fig. 8 das elektrophoretische Profil unter nicht-denaturierenden Bedingungen von Flüssigfraktionen nach einer Rotofortrennung; Molekulargewichtsmarkierungen treten links auf, gefolgt von einem Beispiel des unbehandelten Permeats vor der Fraktionierung, zum Vergleich mit den isolierten Fraktionen,
Fig. 9a) und 9b) die deutliche Verbesserung des Zustandes von zwei an Schuppenflechte leidenden Patienten, der eine mit Hyperkeratose 9a), und der andere ohne Hyperkeratose 9b), bei Behandlung mit einer topischen Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an konzentriertem Flüssighaiknorpelextrakt enthält (untere Photographien), verglichen mit ihrem Ausgangszustand (obere Photographien).
Fig. 10 ein FPLC-Migrationsmuster von drei verschiedenen Extrakten von Haiknorpelgewebe. In Abbildung A bezeichnet DUP einen Knorpel-Flüssigextrakt gemäß der vorliegenden Erfindung. In den Abbildungen B und C bezeichnen BAL und OIK Extrakte gemäß dem Stand der Technik nach Balassa et al. bzw. nach Oikawa et al.
Fig. 11 ein HPLC-Migrationsmuster der gleichen Extrakte, wie in Fig. 11 definiert,
Fig. 12 die Ergebnisse von CAM-Tests, durchgeführt unter Verwendung von verschiedenen Protaminkonzentrationen, einer anti-angiogenetischen Referenzverbindung, bei einem Vergleich mit der Kontrolle,
Fig. 13 die Ergebnisse von CAM-Tests, die mit zwei Fraktionen des vorliegenden gesamten flüssigen Extrakts aus Haiknorpelgewebe nach unserer Erfindung (DUP) durchgeführt wurden, wobei eine ein Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton und die andere ein Molekulargewicht von über 10.000 Dalton hat,
Fig. 14 die Ergebnisse von CAM-Tests, die mit dem gesamten flüssigen Extrakt unserer Erfindung (DUP) durchgeführt wurden, bei einem Vergleich mit einer äquivalenten Konzentration eines Produktes, das nach dem Verfahren von Balassa (BAL) hergestellt wurde,
Fig. 15 die Ergebnisse von CAM-Tests, die mit dem gesamten flüssigen Extrakt unserer Erfindung (DUP) durchgeführt wurden, bei einem Vergleich mit einer Probe, die aus einer gleichen Menge an Trockenstoffgewicht eines Produktes stammt, das nach dem Verfahren von Oikawa (OIK) hergestellt wurde,
Fig. 16 die Wirkung von TPA auf Keratinozyten, beim Vergleich mit einer DMSO-Kontrolle, beide gemessen bei Vorhandensein oder bei Fehlen eines gesamten flüssigen Extrakts aus Haiknorpelgewebe, hergestellt nach der vorliegenden Erfindung,
Fig. 17 die entzündungshemmende Wirkung des gesamten flüssigen Extrakts unserer Erfindung an einem Modell einer Hautirritation,
Fig. 18 ein weiteres HPLC-Migrationsmuster einer Fraktion des gesamten flüssigen Extrakts der vorliegenden Erfindung mit einem Molekulargewicht unter 10.000 Dalton, wobei die Fraktion konzentriert und in fünf Unterfraktionen getrennt wurde,
Fig. 19 die anti-kollagenolytische Wirkung jeder in Fig. 18 gezeigten Unterfraktionen bei unterschiedlichen getesteten Volumina.
In einem spezifischen Ausführungsbeispiel wurde Knorpelgewebe aus gesunden Schwarzen Dornhaien und aus gewöhnlichen Dornhaien gewonnen. Jegliches Muskel- und Bindegewebe wurde durch Abschaben mit Skalpellen und Scheren, die mit Ethanol behandelt wurden, entfernt. Daraufhin wurde das Knorpelgewebe zum weiteren Gebrauch in Plastiktüten vakuumverpackt und auf -20º tiefgefroren. Bei dem vorliegenden Verfahren kann jede Quelle von Knorpelgewebe verwendet werden. Aus Gründen, die in dem Abschnitt HINTERGRUND dargelegt sind, haben wir Haiknorpelgewebe ausgewählt. Man glaubt, daß man ausgehend von Knorpelgewebe von Elasmobranchiern (das Haie und Rochen als Tiergattung dieser Gruppe einschließt) nahezu äquivalente Produkte erhalten würde. Höchstwahrscheinlich werden die Produkte unterschiedlich sein, wenn man Säugetiere als Quellen für Knorpelgewebe verwendet.
Jegliche Abänderung kann bei der Herstellung von Knorpelgewebe vor seiner Extraktion vorgenommen werden, solange diese die Wirkung des Produktes von Interesse nicht wesentlich beeinträchtigt (beispielsweise ein gesamter flüssiger Extrakt oder eine besondere Fraktion desselben). Einige aktive Komponenten können der proteolytischen Aufschließung standhalten, wie dies von Balassa et al. (US-Patent 4,822,607) gelehrt wird, um das Knorpelgewebe von jeglichen umgebenden Geweben zu befreien, während andere einer solchen Behandlung nicht standhalten. Eine der Wirkungen, die einer solchen Vorbehandlung anscheinend nicht standhalten, ist die anti-angiogenetische Wirkung (Fig. 15).
Wenn man einen Flüssigextrakt herstellen will, der so viele wie möglich von allen der wasserlöslichen aktiven Komponenten enthalten soll, denen getrennte Wirkungen zugeschrieben werden, sollte deshalb ein solcher Aufschließungsschritt vermieden oder sorgfältig überwacht werden, um eine übermäßige Hydrolyse oder Proteolyse zu vermeiden.

HERSTELLUNG VON GEFRIERGETROCKNETEM KNORPELGEWEBE

Sauberes Knorpelgewebe wurde frisch verwendet oder auf 4ºC aufgetaut. Daraufhin wurde das Knorpelgewebe zusammen mit einem gleichen Volumen an Wasser (eine gleiche Menge (Gewicht/Volumen) ist in etwa ein minimales Volumen, kann jedoch ohne Auswirkung auf die Ausbeute der Gewinnung von wertvollen Komponenten erhöht werden) mehrmals (insbesondere dreimal) durch die Öffnungen eines mit Ethanol behandelten Fleischwolfs gedreht. Man bevorzugt ein niedriges Volumen, da dieses von einem praktischen Gesichtspunkt her einfacher zu manipulieren ist als unnötig große Volumen. In der Praxis wurde Wasser durch Umkehrosmose und Filtrierung auf einem 0,1 um Filter gereinigt. Viele wäßrige Lösungen (die beispielsweise Salze enthalten) könnten anstelle von Wasser verwendet werden. Wird die Gewinnung einer Vielzahl von wasserlöslichen Wirkungen in Betracht gezogen, so wird bevorzugt mit einem pH- Wert, der nahe dem neutralen ist, und unter nicht-denaturierenden Bedingungen gearbeitet, um die Zerstörung oder die Denaturierung einiger der Knorpelgewebe- Komponenten zu vermeiden. Das Verhalten von unbekannten Proteinen in wäßrigen Lösungen ist nicht vorhersehbar; einige fühlen sich "behaglicher" bei einem sauren pH-Wert, andere bei einem basischen pH-Wert. Darüber hinaus können einige Proteine unter milden denaturierenden Bedingungen extrahierbar sein, falls eine solche Denaturierung die Renaturierung dieser Proteine in wäßrigen Lösungen nicht irreversibel beeinträchtigt. Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren hat sich deshalb das Durchführen eines Verfahrens zum Extrahieren von aktiven Komponenten von Knorpelgewebe in reinem Wasser als vernünftige Wahl herausgestellt, um mit einer sehr guten Ausbeute Komponenten zu gewinnen, die eine unbekannte Struktur und ein unbekanntes Verhalten haben.
Die Mischung aus Knorpelgewebe/Wasser wurde dann durch zehnminütiges Rühren in einem Küchenmixer auf höchster Geschwindigkeitsstufe bei 4ºC homogenisiert. Selbstverständlich können die Rührgeschwindigkeit sowie das Volumen der wäßrigen Lösung die Extraktionszeit beeinflussen. Ein vernünftiger Homogenisierungsbereich könnte deshalb von nur etwa 10 Minuten bis hin zu 24 Stunden umfassen, vorzugsweise zwischen etwa 10 und 60 Minuten. Die Temperatur sollte auf unter ca. 10ºC gehalten werden, um jegliche Zersetzung aktiver Komponenten durch endogene Enzyme zu vermeiden, wenn keine Enzymhemmer verwendet werden. Idealerweise sollte eine Temperatur nahe 0ºC gewählt werden. Da ein solcher Versuch üblicherweise in einem kalten Raum durchgeführt wird, in dem die Temperatur zwischen 4 und 10ºC gehalten werden kann, ist dieser Temperaturbereich bei dem vorliegenden Verfahren zulässig. Der Klarheit und der Kürze wegen wird die Bezeichnung "etwa 4ºC" nachstehend dazu verwendet, diesen zulässigen Temperaturbereich zu bezeichnen.
Eine Verflüssigung dieses Homogenats erhielt man ferner durch Eingeben des letztgenannten in einen Polytron-Desintegrator für 10 Minuten bei 4ºC, falls der Mixer die Größe der Teilchen nicht ausreichend reduziert hatte. Alternativ dazu kann die Mischung einfach in einem leistungsstärkeren Mischer-Desintegrator homogenisiert werden, der bei unserem Versuch den zehnminütigen Verflüssigungsschritt ersparte. Am Ende des abgeschlossenen Homogenisierungsschrittes liegt die Restteilchengröße bei weniger als 500 um. Selbstverständlich gelten ebenso die gleichen zulässigen Zeit- und Temperaturbereiche, die für den Erhalt des ersten gemahlenen Knorpelgewebes angegeben wurden. Die Größe der Teilchen nach der Homogenisierung muß nicht sehr gering sein. Die Notwendigkeit einer Pulverisierung des Knorpelgewebes vor der Extraktion kann daher vermieden werden. In der Tat kann eine Pulverisierung des Knorpelgewebes in Form eines Puders vor der wäßrigen Extraktion wertvolle Wirkungen denaturieren, wenn eine solche Pulverisierung in einem gefriergetrockneten Zustand oder in einem hitzegetrockneten Zustand durchgeführt wird.
Das Homogenat wurde bei 13600 · g für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, wobei dieser Schritt ein Weg ist, um einen Überstand auf schnelle und wirksame Weise von einem Pellet zu trennen. Eine Variation und Einstellung dieser Parameter fallen unter das Fachwissen eines Fachmannes auf diesem Gebiet und hängen rein von dem Volumen des Homogenats und der verwendeten Ausrüstung ab.
Das resultierende Pellet wurde für 24 bis 48 Stunden gefriergetrocknet. Diese erste Fraktion wird nachstehend als Lyophilisat oder Feststoffextrakt bezeichnet.
Falls erforderlich kann der Überstand auf einem 24 um Whatman-Filter gefiltert werden, um solche Teilchen zu entfernen, die die Leistung einer Ultrafiltrationssäule beeinflussen könnten. Das filtrierte Material wurde dann bei etwa 4ºC auf einer Tangentialfluß-Filtrationssäule ultrafiltriert, die eine Porosität von etwa 500 000 Dalton hat, wodurch ein erstes unbehandeltes Permeat erhalten werden kann, das wasserlösliche Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 0 und etwa 500 kDa hat. Dieser unbehandelte permeierende Extrakt wurde auf einem 0,22 um Filter sterilgefiltert und zur weiteren Verwendung in sterile Gefäße aliquotiert. Diese Fraktion wird nachstehend als das unbehandelte Permeat oder als der gesamte flüssige Extrakt bezeichnet werden.
Ein alternatives Zentrifugierverfahren mit höherer Leistung wurde entwickelt, um das Pellet und den Überstand zu erhalten. Der Schritt des Zentrifugierens bei 13600 · g für 15 Minuten, auf den eine grobe Filtration auf Whatman-Filtern folgte, wurde durch eine Zentrifugierung in einer CEPA-Zentrifuge ersetzt, die mit einer Nylon-Tasche mit einer Porosität von 30 uM ausgestattet ist, bei 3000-4000 · g. Auf diese Weise kann eine 25 kg/25 L Zubereitung innerhalb von 30 Minuten zentrifugiert werden und 29 Liter Überstand bereitstellen. Das erhaltene wäßrige Volumen ist höher als das Ausgangsvolumen an Wasser, was bedeutet, daß ein Teil des Wassergehalts des Knorpelgewebes selbst entzogen wurde. Das Lyophilisat und der gesamte flüssige Extrakt können folgende ungefähre Zusammensetzung haben, welche die von Charge zu Charge beobachteten Veränderungen grob berücksichtigt, und bei Verwendung von unterschiedlichem Material:

LYOPHILISAT:

Lipide 7,35%¹
Proteine 46,2%²
Wassergehalt 20,4%
Natrium 4,16 mg/g³
Kalium 2,64 mg/g
Kalzium 114 mg/g
Magnesium 1,49 mg/g
Zink und Eisenspuren

GESAMTER FLÜSSIGER EXTRAKT:

Lipide 0,10-0,20%¹
Proteine 8-25 mg/ml²
Wassergehalt 97-99%
Natrium 30-220 mg/100 g³
Kalium 30-40 mg/100 g
Kalzium 2,0 mg/100 g
Magnesium 1,1 mg/100 g
Zink und Eisenspuren
1,2 Gemessen nach Anweisungen gemäß AOAC Official (1984) Abschnitte 16.219-220 bzw. 2.055
³ Gemessen nach dem SAA-Verfahren
Der Proteingehalt wird durch die Kjeldahl-Methode berechnet, die eigentlich den organischen Stickstoff (N) mißt. Der organische Stickstoff wird unter Verwendung der folgenden Gleichung auf Protein-Äquivalent umgerechnet:
Da Kohlenhydrate nicht erfaßt werden können, kann man davon ausgehen, daß sie in dem einen oder dem anderen Extrakt enthalten sind, jedoch in Form von Proteoglycanen und/oder Mucopolysacchariden. Es ist möglich, daß diese Verbindungen in dem gemessenen Anteil an Wassergehalt enthalten sind. Das Lyophilisat enthält einen unerwarteten Anteil an Wassergehalt, der durch die OH- Gruppen gemessen wurde. Da der Wassergehalt von 20% nahe dem Prozentgehalt der Kohlenhydrate ist, auf die man üblicherweise in Knorpelgewebe stößt, während der Wassergehalt eines Lyophilisats nahe 0% sein sollte, bleibt diese Hypothese zu überprüfen.
Die Sterilität wurde unter Anwendung der USP XXIII-Vorschriften kontrolliert von:
1) Laboratoire de genie sanitaire du Québec Inc. 1090, I'Escarbot, Centre Industriel St-Malo, Québec G1N 4J4; und
2) Northview Laboratories Inc. 1880, Holste Road, Northbrook, IL, 60062 U.S.A. FDA Registrationsnr. 14-18028

Aktivitätsanalysen:

LYOPHILISAT:

In vitro Analysen:

Diese Analysen wurden an den hormonabhängigen Krebszellinien MCF-7 und ZR75-1 (ATCC (R)-Nummern 22-HTB bzw. 1500-CRL) durchgeführt.

ZR75-1-Zellen:

BASAL RPMI-Medium:

52 g RPMI 1640 ohne Phenolrot (Sigma R8755), 17,875 g Hepes (freie Säure; Sigma H0763), 0,55 g Natriumpyruvat (Sigma P5280) und 10 g NaHCO&sub3; wurden in 5 L reinem Wasser gemischt und mit NAOH auf einen pH-Wert von 7,40 eingestellt.
Wird sie nicht unmittelbar verwendet, muß diese Lösung vor Licht geschützt werden, um photolabile Substanzen zu bewahren. Diese Lösung wurde gefiltert, auf 500 mL sterile Flaschen verteilt und bei 4ºC für einen maximalen Zeitraum von drei Monaten aufbewahrt.

Zellkulturerhaltungsmedium:

Basal RPMI Medium wurde ergänzt mit 10% (v/v) FBS (Rinderfötenserum), 100 U Penicillin G/50 ug Streptomycinsulfat (Sigma P0906)/ml Medium, 2 mM L- Glutamin (Sigma G1517) und 1 nM E&sub2; (β-Estradiol Sigma E8875).

Versuchsmedium:

Basal RPMI Medium wurde ergänzt mit 5% FBSA (fötalem Rinderserum, adsorbiert auf Dextran-Kohle), 2 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin G/50 ug Streptomycinsulfat/ml Medium und 50 ng/mL Insulin (Sigma). Diesem Medium wurden zunehmende Konzentrationen des oben beschriebenen Lyophilisats sowie unterschiedliche Estradiol-Konzentrationen (10-12 bis -5 M) zugefügt.

MCF-7-Zellen:

BASAL DME-F12 Medium:

DME-F12 Medium (ohne Bicarbonat und ohne Phenolrot; Sigma) wurde nach den Anweisungen des Herstellers in reinem Wasser zur ursprünglichen Konzentration gelöst. Für einen Liter wurden 1,2 g Natriumbicarbonat zugefügt und mit NaOH/HCl wurde der pH-Wert auf 7,40 eingestellt. Diese Lösung wurde gefiltert, auf sterile 500 mL Flaschen verteilt und bei 4ºC für einen maximalen Zeitraum von drei Monaten aufbewahrt.

Zellkulturerhaltungsmedium:

Basal DME-F12 Medium wurde ergänzt mit 10% (v/v) FBS (fötalem Rinderserum), 100 U Penicillin 0/50 ug Streptomycinsulfat/ml Medium, 2 mM L- Glutamin (Sigma) und 1 nM E&sub2; (Estradiol).

Versuchsmedium:

Basal DME-F12 Medium wurde ergänzt mit 5% FBSA (fötalem Rinderserum, adsorbiert auf Dextran-Kohle), 2 mM L-Glutamin, 100 U Penicillin 0/50 ug Streptomycinsulfat/ml Medium und 50 ng/mL Insulin (Sigma). Wie bei den ZR75-1 Zellen beschrieben, wurden Lyophilisat und Estradiol mit gleichen Konzentrationen zugefügt.

Herstellung von FBSA:

Fötales Rinderserum wurde mit 1% (w/v) Holzkohle (Entfärbungskohle, alkalisch) vermischt. Eine Lösung aus Dextran T70 wurde zur Kohlen-Serum-Lösung zugefügt, um eine Konzentration von 0,1% (w/v) zu erhalten. Die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC gerührt. Nach einer Zentrifugation bei 4ºC für 30 Minuten bei 10.000 · g wurde das Serum dekantiert, erneut mit den gleichen Verhältnissen von Holzkohle und Dextran vermischt, bei Raumtemperatur für drei Stunden gerührt und erneut zentrifugiert. Über einen Zeitraum von 20 Minuten und bei 56ºC wurde das Serum dann hitzeinaktiviert, daraufhin sterilgefiltert und auf sterile konische Falcon-Röhrchen aliquotiert.
ZR75-1 und MCF-7 Zellen wuchsen bis zu einer Populationsdichte von 20 000 Zellen/Vertiefung auf 24-Well-Platten oder 150 000 Zellen/Vertiefung auf 6-Well- Platten und wurden bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von unterschiedlichen Konzentrationen von Lyophilisat, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, behandelt. Dazu wird das Lyophilisat erneut in einem Kulturmedium suspendiert und sterilgefiltert, so daß die wasserlöslichen Komponenten desselben gewonnen und getestet werden. Alle Versuche wurden dreifach durchgeführt. Kulturmedien wurden entfernt und alle zwei Tage durch frische Medien ersetzt. Die Zellen wuchsen in einem Inkubator unter einer konstant befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bei 37ºC für 17, 7, 3 oder 3 Tage, entsprechend dem ersten, dem zweiten, dem dritten bzw. dem vierten Versuch. Die Zellwachstumshemmung wurde durch direktes Zählen der Zellen oder durch Messen des gesamten DNA-Gehaltes einer Vertiefung gemessen.
Die oben angeführte Prozentsätze betreffend die Hemmung des Zellenwachstums zeigt, daß das Lyophilisat in einer dosisabhängigen Weise das Wachstum der Zellen dieser zwei Zellinien hemmen kann.
Fig. 1 zeigt, daß Dosierungen zwischen 50 und 100 mg/mL Lyophilisat nach drei Behandlungstagen eindeutig eine Hypoplasie an diesen Zellinien hervorrufen.
Fig. 2 zeigt, daß bei Vorhandensein von 10&supmin;¹² bis 10&supmin;&sup9; M Estradiol behandelte Zellen wie Kontrollzellen reagieren, indem sie von diesen Hormondosierungsraten nicht stimuliert werden. Über 1 nM werden die Kontrollzellen jedoch stark stimuliert, und die DNA-Konzentration erreicht 3,75 ug bei Vorhandensein von M Estradiol (im Gegensatz zu 0,69 ug in Kontrollzellen ohne Estradiol). Bei Zellen, die mit 30 und 50 mg/mL Lyophilisat behandelt wurden, betrug die gemessene DNA bei maximaler Stimulation 1,9 bzw. 1,8 ug.
Fig. 2 zeigt, daß die Affinifätskonstante (Km) der behandelten Zellen zu Estradiol 3- und 16-mal höher (31,3 nM und 174,0 nM) ist, als der Wert Km der Kontrollzellen (11,7 nM) bei Vorhandensein von 30 bzw. 50 mg/mL. Dies bedeutet, daß höhere Estradiolkonzentrationen notwendig sind, um das gleiche Wachstum der Zellen zu erreichen, wenn gefriergetrockneter Haiknorpelfeststoffextrakt vorhanden ist. Deshalb reduziert dieser Extrakt die maximale Reaktion (90% Hemmung davon) und erhöht die Affinitätskonstante der behandelten Zellen zu Estradiol.

In-vivo-Versuche:

Vierhundert 40 Tage alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten (gekauft von Charles River Co., St-Constant, Québec) wurden 12 Tage lang an ihre Umgebung gewöhnt. Danach wurde ihnen mittels Sondenernährung 20 mg DMBA/1 mL Maisöl (9, 10-Dimethyl-1, 2-Benzanthracen; gekauft von Sigma Chemical Co.) verabreicht. Drei Monate nach dieser Behandlung wurden 240 Ratten, bei denen sich Brustdrüsenkrebs ausgebildet hatte, ausgewählt und in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe bestand aus fünf Untergruppen von Ratten. Den Ratten der behandelten Gruppen wurde eine tägliche Dosis zunehmender Konzentrationen des Lyophilisatextrakts in 3 mL Wasser für einen Zeitraum von acht Wochen verabreicht, während die Kontrollgruppe das gleiche Volumen an Wasser erhielt. Die zweite Gruppe bestand aus vier Untergruppen von Ratten. Den Ratten der behandelten Gruppen wurde ebenfalls eine tägliche Dosis Lyophilisat in 3 mL Wasser, in Kombination mit dem Überstand oder nicht, über einen Zeitraum von zehn Wochen verabreicht, während die Kontrollgruppe das gleiche Volumen an Wasser bekam. Nur einer Untergruppe der zweiten Gruppe von Ratten, die mit einer Konzentration von 3000 mg/Kg/Tag an Lyophilisat und 3 mL Überstand behandelt wurden, wurde ferner eine intraperitoneale (i.p.) Injektion einer kleineren Dosis des Überstandes verabreicht (etwa 8 mg Protein in 1 mL Wasser).
Zu Beginn der beiden Versuche wogen die Ratten 151-175 g und erhielten Futter und Trinkwasser ad libitum. Die erste Gruppe Ratten hatte Tumore mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,9 cm, während die zweite Gruppe Ratten einen Tumor mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,6 cm hatte.
Die Ergebnisse werden wie folgt zusammengefaßt:
Tagesdosis an Knorpelextrakt, die mittels Sonderernährung verabreicht wurde
% an Tumorwachstums¬ hemmung (Abnahme des Tumordurchmessers gegen¬ über der Kontrollgruppe)

1. Versuch: Dauer 8 Wochen

500 mg/Kg/Tag 2%
1000 mg/Kg/Tag 4%
3000 mg/Kg/Tag 14%
5000 mg/Kg/Tag 15%

2. Versuch: Dauer 10 Wochen

3000 mg/Kg/Tag 12%
3000 mg/Kg/Tag + 3 mL Überstand 18%
3000 mg/Kg/Tag + 3 mL Überstand 20% + 1 mL i.p.-Injektion Überstand
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Lyophilisat eine aktive Komponente enthält, die im Magen-Darm-Trakt absobiert wird und eine Wirkung auf die Größe des Tumors hat. Diese Wirkung kann eine direkte Wirkung auf Tumorzellen oder eine Wirkung mittels Anti-Angiogenese sein.
Ferner zeigen diese Ergebnisse, daß der Überstand eine Wirkung hat, die sich in einer zusätzlichen Verringerung der Tumorgröße von etwa 5% wiederspiegelt.
Diese Ergebnisse lassen ferner vermuten, daß das Lyophilisat aktive Komponenten enthalten kann, die nicht wasserlöslich sind und/oder daß es wasserlösliche Reste enthalten kann. Als letzte Möglichkeit könnte man daher in Betracht ziehen, daß das Pellet erneut in einer wäßrigen Lösung extrahiert werden könnte, um wasserlösliche Komponenten auf maximale Weise zu gewinnen, falls die Ausbeute noch verbessert werden kann.

HISTOPATHOLOGIE

Zur Beurteilung der Ungiftigkeit der aktiven Moleküle des Knorpelextrakts wurden die in den oben genannten in vivo-Versuchen eingesetzten Tiere durch Dekapitation getötet, und die folgenden Gewebe wurden analysiert: Leber, Lunge, Nieren, Herz, Gehirn, Muskel und Brustdrüse. Das Fett wurde aus diesen Geweben entfernt, und danach wurden sie für zwei Tage in einer Bouin'schen Flüssigkeit fixiert. Nach einer Dehydration in Ethanol, wurden die fixierten Gewebe in Paraffin eingelegt. Schnitte wurden hergestellt und auf Objektträger aus Glas angebracht, mit Hematoxylin eingefärbt und unter dem Mikroskop sichtbar gemacht.
Die histologische Untersuchung zeigte, daß keine schädliche Wirkung sichtbar war, wenn die höchsten Dosierungen von Lyophilisat für sich (Daten nicht gezeigt) oder wenn Lyophilisat in Kombination mit dem Überstand (vgl. Fig. 3a und b, 4a und b, und 5a und b) verwendet wurden.
Dies läßt vermuten, daß das Lyophilisat und der Überstand eine selektive rückbildende Wirkung auf die Tumorgröße haben.
In krebsbefallenen Brustdrüsen (vgl. Fig. 6a und b) wurde eine bedeutende Verringerung der Fläche von Blutgefäßen beobachtet. Die anti-angiogenetische Wirkung dieser aktiven Moleküle wird dann durch die Ergebnisse bestätigt, wie sie in Fig. 7 gezeigt und zusammengefaßt sind:
Fig. 7 zeigt, daß bei Verwendung einer Kombination aus Lyophilisat (p.o. = peroral)- Überstand (p.o. + i.p.) (vgl. Fig. 6a und b) eine Verringerung um 55 % der Fläche von Blutgefäßen in dem Tumor beobachtet wurde.
Die Reduzierung der Tumorgröße könnte auf eine bedeutende Abnahme seiner Vaskularisation, auf eine direkte Wirkung auf Tumorzellen oder auf eine Kombination von beiden Phänomenen zurückzuführen sein. Die anti- angiogenetische Wirkung dieser Extrakte ist oben gut dargestellt. Die direkte Hypoplasie-Wirkung wurde in vitro an den hormonabhängigen Zellen beobachtet und muß noch in vivo bestätigt werden.
Da die oben erwähnten Ergebnisse zeigten, daß der Überstand zusätzlich zu der Wirkung des Lyophilisats an ZR75-1 Zellen eine zunehmende Wirkung hatte, wurden dessen Bestandteile weiter untersucht.

HERSTELLUNG VON FLÜSSIGFRAKTIONEN, DIE AKTIVE MOLEKÜLE ENTHALTEN

Haiknorpelgewebe wurde gesammelt und wie oben beschrieben verarbeitet. Nach der Zentrifugierung wurde das Pellet beiseite gelegt und der Überstand wurde auf gleiche Weise wie oben beschrieben bis zur sterilen Filtration auf einem 0,22 um Filter verarbeitet.
Der Überstand wird nachstehend als unbehandeltes Permeat bezeichnet, z. B. als das Produkt nach der Ultrafiltration.
Das so erhaltene unbehandelte Permeat wurde einer FPLC-Technik (Fast Protein Liquid Chromatography) unterzogen.

FPLC-Bedingungen:

Säule: Hiload 26 mm · 60 cm Sephacryl S-300
FPLC-System: aus Pharmacia
Alle Proben wurden auf einem 0,22 um Filter gefiltert, ehe sie auf die Säule geladen wurden. Der Elutionspuffer war eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), die gefiltert und entgast wurde, und zwar fünfzehn Minuten lang. Das Volumen der geladenen Probe war üblicherweise 3,2 mL (konnte bis zu 13 mL betragen). Die Durchflußrate betrug 1 mL/Minute. Fraktionen von 10 mL wurden gesammelt. Die eluierten Verbindungen wurden durch ihr UV-Absorptionsmaß (280 nm) erfaßt. Unter Verwendung der Kalibrierausrüstung MW-GF-1000 von Sigma wurde ein Kalibrierdiagramm erstellt, wobei die Kalibrierprobe das gleiche Volumen hatte wie die geladene zu analysierende Probe (3.2 mL). Das Elutionsvolumen einer Probe wurde von dem Plot des Molekulargewichts der Verbindungen der Kalibrierausrüstung, aufgetragen gegen ihr Elutionsgewicht abgeleitet, von dem das Hohlraumvolumen der Säule abgezogen wurde. Das Hohlraumvolumen wurde durch Injizieren von Blue Dextran (M.W. = 2.000.000) ermittelt.
Die Fraktionen wurden an ZR75-1-Zellen auf ihre Aktivität hin getestet. Die interessanten Fraktionen wurde identifiziert, und ihre Eigenschaften wurden durch weitere Untersuchungen bestätigt (siehe unten).
Die weitere Charakterisierung der aktiven Bestandteile des Permeats wurde auf einem Rotofor-System (Biorad 170-2950; siehe unten unter "Isoelektrische Fokussierung") und auf Amicon-Filtern mit unterschiedlichen Cut-off-Werten durchgeführt, um Fraktionen mit einem Molekulargewicht zwischen 10-30 kDa, 30- 100 kDa und über 100 kDa zu erhalten.

Isoelektrische Fokussierung:

Eine Zubereitung aus Haiknorpelgewebe (46 mL Permeat 1 Kg/L) wurde über Nacht gegen 4 Liter reines Wasser mit 5% Glyzerin bei 4º dialysiert, wobei eine Spectra/Por 7-Membran, 3500 kDa MWCO (Spectrum 132110) verwendet wurde. Die dialysierte Lösung wurde mit 2,75 mL Ampholyten (Pharmacia #80-1125-87), pH-Wert 3,5-10,0, und 0,5 g CHAPS (Sigma C3023; 3-[(3-Cholamidopropyl)¬ dimethylammonio]-1-propansulfonat) vermischt. Das Volumen wurde mit reinem Wasser auf 55 mL gebracht. Die Lösung wurde auf das Rotofor-System geladen. Die isoelektrische Fokussierung wurde bei 4º mit einer konstanten Energie von 12 Watt (3000 xi Biorad Power Supply 165-0554) unter konstanter Zirkulation von Wasser durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Temperatur beibehalten wird. Zu Beginn der Trennung betrug die Spannung 380 Volt und die Stromstärke 31 mA. Nachdem die Stromstärke stabilisiert war (bei 14 mA), lag die Spannung bei 870 Volt. Die isoelektrische Fokussierung wurde angehalten, und 20 Fraktionen wurden genommen.
Die Identifizierung dieser Proteine erfolgte, indem ihr Molekulargewicht auf einem Elektrophoresegel geschätzt wurde (Laemmli, UK (1970) Nature (Lond.) 227: 680).
Diese Fraktionen wurden mit einem Ladungspuffer (siehe Laemmli) vierfach verdünnt, und 8 uL Aliquote wurden der Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen.
Fig. 8 zeigt das elektrophoretische Profil jeder Fraktion und das des Materials vor der isoelektrischen Fokussierung.
Alle Fraktionen wurden unter einer Laminarströmungshaube steril abgefüllt, indem sie durch einen sterilen Millipack-60-Filter mit einer Porosität von 0,22 um geleitet wurden.
Der Proteingehalt der Fraktionen wurde anhand des Lowry-Dosierverfahrens ausgewertet. Lösungen von 1 Kg/2 L (ausgedrückt als das Gewicht des unbehandelten Knorpelgewebes je Liter Permeat) wurden an ZR75-1-Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen in Kulturmedium getestet. Die Ergebnisse werden wie folgt zusammengefaßt:

1. Versuch:

Das Permeat wurde gefriergetrocknet, erneut in PBS suspendiert und der FPLC- Technik unterzogen. Keine Hypoplasie-Wirkung war erfaßbar (Daten nicht gezeigt).

2. Versuch:

Versuche, die an Rotofor-Fraktionen durchgeführt wurden (Das Permeat wurde durch Verdampfung konzentriert): Proteinidentifizierung

3. Versuch durchgeführt an FPLC-Fraktionen (Das Permeat wurde durch Verdampfung konzentriert):

Fraktionen Molekulargewicht
6 und 7 1-2,5 kDa 4. Versuch, durchgeführt an 100 uL Fraktionen, die auf Amicon-Molekularfiltern erhalten wurden:
Die FPLC-Fraktionen 6 und 7 enthalten aktive Komponenten mit sehr geringem Molekulargewicht: 1 bis 2,5 kDa.
Die Hypoplasie-Wirkung der Fraktionen kann bis zu 33 000 mal höher sein als diejenige, die bei dem Lyophilisat beobachtet wurde. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Gefriertrocknung anscheinend eine Abnahme der direkten Antitumor-Wirkung der in dem Eluat enthaltenen Proteine verursacht, während eine derartige Aufhebung nicht auftrat, wenn der Feststoffextrakt gefriergetrocknet wurde. Dies läßt vermuten, daß die in den Knorpelgewebe- Teilchen enthaltenen aktiven Komponenten anscheinend in einer solchen Umgebung sind, in der sie gegenüber der denaturierenden Wirkung der Gefriertrocknung weniger empfindlich sind. Da die Hypoplasie-Aktivität empfindlich gegenüber einer Gefriertrocknung ist, wenn sie in Wasser gewonnen wird, ist es wahrscheinlich, daß das Zufügen von Stabilisatoren oder Schutzstoffen zu dem Gesamtextrakt oder zu einer besonderen Fraktion, die diese Wirkung enthält, vor der Gefriertrocknung die Wirkung im wesentlichen aufrechterhalten würde.

Weitere Identifizierung der aktiven Komponenten des Eluats:

Die aktiven Fraktionen (an ZR75-1-Zellen getestet) werden in dem nachfolgenden Bereich von Molekulargewichten gewonnen, der von einer anderen Art der Reinigung definiert ist, ausgehend von dem gleichen Permeat (1 Kg/L) auf einer Superose-12 Säule mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Länge von 30 cm, wobei die oben beschriebenen FPLC- und Rotofor-Verfahren eingesetzt wurden. Eine Durchflußrate von 1 mL/Minute wurde gewählt. 45 Fraktionen von je 1 mL wurden genommen.
Fraktionen 20-21 Aktivität in Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 70 bis 120 kDa entsprechen
Fraktion 22 Aktivität in Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 60 bis 70 kDa entsprechen
Fraktionen 29-32 Aktivität in überlappenden Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 35 bis 46 kDa entsprechen
Fraktionen 34-35 Aktivität in Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 29 kDa entsprechen
Fraktionen 38-39 Aktivität entsprechend einem Molekulargewicht von 1 bis 2, 5 kDa

SPEZIFITÄT

Um die Spezifität der Wirkung auf Tumorzellen auszuwerten, wurde das nach der Ultrafiltration erhaltene Permeat an anderen Zellen mesenchymer Herkunft getestet, nämlich humanen Tenon-Fibroblasten (HTF), die normale Fibroblaste sind.

B. In Vitro

a. Patienten

Es wurden nur die humanen Tenon-Fibroblasten (HTF) zweier Patienten (einer mit neovaskulärem Glaukom, NVG, und der andere mit primärem Weitwinkelglaukom, POAG) verwendet.

b. Abimpfung und Erhalten der HTF

Jede konfluierende Kultur wurde durch Waschen und Ablösen mit 0,5 ml von 0,05%-igem Trypsin/0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) durchlaufen, und zwar für eine Dauer von 5 bis 10 Minuten bei 37ºC. Dann wurden 1,5 mL DME/F-12 Medium mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) zugefügt, um das Trypsin/EDTA zu neutralisieren.
Die Assoziation der Zellen erfolgte durch Pulverisieren und Überführen in 25 cm² T-Kolben, in die zusätzliches Medium mit 10% FBS zugegeben wurde. Nachdem Konfluenz erreicht worden war, wurden die HTF in 75 cm² und schließlich in 180 cm² T-Kolben überführt. Wenn genug Zellen vorhanden waren, wurden einige Zellen für die unten beschriebenen Experimente verwendet, während die anderen gleichzeitig eingefroren wurden, um für zukünftige Versuche identische Durchläufe zu bewahren.

c. Versuchsprotokolle

Wenn Konfluenz erreicht war, wurden Zellen eines Patienten, die in zwei oder drei identischen 180 cm² T-Kolben gewachsen waren, durch das oben beschriebene Verfahren dissoziiert. Nach kurzem Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit wurden sie mit einem ZMI Coulter Counter 216013 gezählt, der mit einem 256- Channelyzer ausgestattet war.
Für alle folgenden in vitro-Versuche wurden ungefähr 50.000 Zellen in 1 mL DME/F-12-Medium mit 1% FBS in jede 16 mm-Schale und eine 12-Well-Platte geimpft. Siebzehn Stunden (h) nach dem Impfen wurde 1 mL frisches identisches Medium, ergänzt mit 1% FBS ("absolute" Kontrollen) zugefügt. Je nach Versuchsablauf (siehe oben und unten), wurde das 1%-ige FBS-Medium mit Wachstumsfaktoren (GF) ergänzt oder nicht, oder es wurde mit der 1 Kg/2L- Permeatlösung (Gewicht des Knorpelgewebes/Wasservolumen) ergänzt und sterilgefiltert. An diesem Tag (Tag 0) wurden einige Zellproben auch gezählt, um festzustellen, ob die Plattenkultur wirksam angelegt wurde (die Effizienz sollte gleich oder größer 95% sein).
Achtundvierzig Stunden nach Beginn der Versuche, wurden die Zellen gewaschen und durch das oben erwähnte Verfahren dissoziiert und erneut gezählt. Die Zahl der Zellen wurde als ein Prozentgehalt der Zahl angegeben, die in den "absoluten" Kontrollen erhalten wurde.
Jede "absolute" oder positive Kontrolle mit 1% bzw. 5% FBS und jede Versuchsgruppe, ergänzt mit 1% FBS und mit einem individuellen Wachstumsfaktor oder Knorpelgewebe-Permeat bestand aus dreifachen Proben.
Jeder Versuch wurde an den Zellen eines oder zweier Patienten gleichzeitig durchgeführt und mindestens zweimal wiederholt.
Die Stimulation von Fibroblastenproliferation durch Wachstumsfaktoren (GF) oder Knorpelgewebe-Permeat wurde mit der Stimulation desselben durch 5% FBS verglichen.
Bei diesen Versuchen wurden Wachstumsfaktoren, Schweine-PDGF (pPDGF) und humaner rekombinanter basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (hr bFGF) (ein Geschenk der Farmitalia Carlo Erba, Mailand, Italien an Dr. P. Brazeau) jeweils in Konzentrationen von 10 bis 100 ng/ml in 1% FBS zugefügt. Achtundvierzig Stunden nach Beginn des Versuchs wurden die Zellen durch Trypsin-EDTA dispergiert und auf dem Coulter-Zähler gezählt. Alle der unten aufgeführten Dreifachwerte (Säulen 1, 2 und 3) sind ein Zwanzigstel der Zählwerte je Vertiefung.
P < 0,02
P < 0,01 ermittelt im Student-Fisher Versuch
Während Wachstumsfaktoren wie PDGF und bFGF eine stimulierende Wirkung auf HTF zeigen, wurde keine Wirkung, weder positiv noch negativ, beobachtet, wenn diese Zellen bei Vorhandensein von Knorpelgewebe-Permeat (1 Kg/2L) gezüchtet wurden. Es wurde keine Hypoplasie-Wirkung beobachtet. Dies legt die Vermutung nahe, daß das Permeat eine Hypoplasie-Wirkung oder zytotoxische Wirkung hat, die für Tumorzellen spezifisch ist und auf normale Zellen keine erfaßbare Auswirkung hat. Der gleiche Knorpelextrakt hatte auch keine Wirkung auf eine andere Art von Fibroblastenzellen, nämlich HSF (Human Skin Fibroblasts; humane dermale Fibroblasten; Daten nicht gezeigt). Zwar wurde dies nicht getestet, doch nimmt man an, daß das Lyophilisat ebenfalls keine Wirkung auf normale Zellen zeigt.

VERGLEICH MIT PRODUKTEN AUS DEM STAND DER TECHNIK

Da wir nicht die ersten sind, die ein großes Interesse an Knorpelextrakten zeigen, haben wir die einzigartige Eigenschaft des Haiknorpel-Flüssigextrakts, der durch das vorliegende Verfahren hergestellt wurde, überprüft, und zwar in nebeneinander durchgeführten Vergleichstests mit zwei Produkten, die im Stand der Technik beschrieben oder daraus abgeleitet werden können, nämlich mit Produkten, die durch das Verfahren nach Balassa (US-Patent 4,822,607) und Oikawa et al. (op. cit.) hergestellt wurden.
Oikawa et al. beschreiben ein Verfahren, durch das zwei Hauptfraktionen erhalten werden, von denen die erste Moleküle mit Molekulargewichten zwischen 1 und 10 kDa und die zweite Komponenten enthält, die schwerer als 10 kDa sind. Anti- angiogenetische Eigenschaften schreiben sie nur der ersten Fraktion zu, wohingegen die andere als frei von jeglicher anti-anigogenetischer Wirkung im CAM-Test gilt. Für einen adäquaten Vergleich mit den Produkten von Oikawa haben wir unseren gesamten Flüssigextrakt in zwei entsprechende Fraktionen fraktioniert und diejenige mit 1 bis 10 kDa einbehalten. Da Balassa ein Verfahren zum Extrahieren eines gesamten flüssigen Extrakts beschreibt, haben wir unseren gesamten Flüssig-Knorpelextrakt (1 bis 500 kDa) mit dem Produkt verglichen, das durch Reproduzieren des Verfahrens von Balassa hergestellt wurde, wobei das Kälberknorpelgewebe als Ausgangsmaterial durch Haiknorpelgewebe ersetzt, wurde. Wir nehmen an, daß für den Fall, daß Balassa und Oikawa ein äquivalentes Verfahren beschreiben, die mit der FPLC-Technik und mit der HPLC- Technik erhaltenen Muster sich im wesentlichen überschneiden sollten, und daß die Produkte beim Durchführen eines CAM-Tests eine der unseren ähnliche Wirkung zeigen sollten. Alle Proben wurden auf eine Endkonzentration von 12 um/uL (Trockengewicht/Volumenlösung) gebracht, ehe sie der FPLC- und der HPLC-Chromatographie unterzogen wurden. Das Produkt von Oikawa wurde vor der Chromatographie zentrifugiert und gefiltert, da es unlösliches Material enthielt.
A) FPLC-Bedingungen: Superose 12 (Pharmacia); Gelpermeationssäule.
B) HPLC-Bedingungen: CS-S-Hexyl Säule 5 um, 25 · 0,94 cm, CSC #059-085; Umkehrphasensäule.
Haiknorpelgewebe-Proben, die durch die drei Verfahren extrahiert wurden, wurden wie folgt bezeichnet (mit geschätztem Trockengewicht pro Lösungsvolumen):
1) DUP ist die Zubereitung der vorliegenden Erfindung, die fraktioniert wurde, so daß sie Moleküle zwischen 1 und 500 kDa (12 ug/ul) enthielt;
2) BAL ist die Zubereitung nach dem Rezept nach Balassa et al. (12 ug/ul);
3) OIK ist die Zubereitung der Fraktion 3 gemäß Oikawa et al. (270 ug/ul). Alle Proben wurden auf eine Endkonzentration von 12 ug/ul (Trockengewicht/Volumen) gebracht, ehe sie in irgendeiner Form analysiert wurden. Die OIK-Probe hatte einen hohen Anteil an unlöslichem Material, der leicht durch Zentrifugieren bei 13.200 U/min oder Filtern durch eine 0,2 um Membran pelletiert werden konnte. Eine Filtration oder Konzentration von unlöslichem Material war vor der FPLC- und der HPLC-Technik (A, B) unbedingt erforderlich.

A) FPLC-Ergebniszusammenfassung

Proben durchliefen eine Superose 12 (10/30) Gelpermeationssäule mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als Eluent mit einer Durchflußrate von 0,5 ml/min (Schreibergeschwindigkeit 0,25 cm/min). Vor der Injektion würde ein 100 ul Aliquot der konzentrationsangepaßten Proben durch eine 0,2 um Membran gefiltert. OD280 wurde überwacht.
Die Säule wurde mit den folgenden Standardsubstanzen kalibriert (MG in Dalton): Katalase (232.000), Aldolase (158.000), Albumin (56.000), Ovalbumin (44.000), Chymotrypsin (25.700), Ribonuclease (13.700), Insulin (5.700), Insulin-B-Kette (3500), Insulin-A-Kette (2500), Bacitracin (1450), Vitamin B-12 (1355). Molekulargewichte der Hauptpeaks wurden durch folgende Gleichung berechnet: Log&sub1;&sub0; MG = 7,52 - 0,212 · RT, wobei RT = Elutionsvolumen in mL. R² = 0,976. Das Gesamtvolumen der Säule (VT) betrug 21,93 mL, wie dies unter Verwendung von Cytidin (246 Da) bestimmt wurde. Das Hohlraumvolumen (V&sub0;) wurde mit Dextran Blue (2 · 106 Da) auf 8,38 mL festgelegt.
In Fig. 10a) hatte unsere Probe DUP einen ersten Hauptpeak (1), der bei 18,76 mL eluierte und ein Molekulargewicht von 3500 Da ergab. Nachfolgende Peaks bei 22,7 (2) und 27,3 mL (3) waren außerhalb des Gesamtvolumens der Säule (21,93 mL, wie durch Cytidin bestimmt). Diese Peaks scheinen eine gewisse Affinität zur Säulenmatrix zu haben.
In Fig. 10b) hatte die Probe BAL von Balassa einen kleinen Peak (1), der nahe dem V&sub0; der Säule (8,4 mL) eluierte, einen Peak (2) bei 18,5 mL (4000 Da) und zwei Peaks, die nach dem VT eluierten, nämlich (3) 22,6 mL und (4) 28,2 mL.
In Fig. 10c hatte auch die Probe OIK von Oikawa einen kleinen Peak (1) bei dem V&sub0;, einen Peak (2) bei 18,9 mL (3300 Da), einen Peak (3) bei 21,5 mL (1000 Da) und einen kleinen Peak (4) bei 27,3 mL.
Beim Vergleich dieser Proben fällt auf, daß abgesehen von dem 3300 Da Peak, die Hauptbänder der DUP-Probe nicht mit der gleichen Intensität in den anderen Proben beobachtet wurden. Die OIK-Probe schien einen kleinen Anteil des 27,3 mL Peaks zu haben. Die BAL-Probe hatte einen Peak, der bei 28,2 mL wanderte, der mit einem der kleineren Peaks in der DUP-Probe korrelieren könnte.

B) HPLC-Ergebniszusammenfassungen

Für ein HPLC-Verfahren auf einer Hexyl-Umkehrphasensäule wurden OD210 und OD280 gleichzeitig überwacht. 50 ul Aliquote der zentrifugierten Proben (alle bei 12 ug/ul) wurden geladen und mit 100% H&sub2;O eluiert. Peaks für jedes Chromatogramm werden gemäß OD210 (eg. 1) bezeichnet und entsprechende OD280 Peaks werden mit '(eg. 1)' bezeichnet. Das V&sub0; dieser Säule betrug 5,5 mL (1,4 min).
In Fig. 11a) hatte die DUP-Probe 3 Hauptpeaks, die über OD210 (1, 2, 3) beobachtet wurden, sowie zwei kleinere Peaks (4, 5). Zwei Seitenpeaks wurden außerhalb des Peaks 1 beobachtet und mit 1a und mit 1b bezeichnet. Bedeutende OD280 Absorptionen waren die zugehörigen Peaks 1, 1a, 1b und 3. Im Vergleich dazu ist die entsprechende OD280 Absorption für den Peak 2 relativ zu dem OD210 viel kleiner.
In Fig. 11b) zeigte die BAL-Probe mehr OD210 Peaks, jedoch waren die Intensitäten relativ zu den DUP-Peaks niedriger. Insofern als eine Überlappung von Peaks ein Anzeichen für eine Identität von Molekülen sein könnte, scheinen nur die Peaks 3 und 7 in der Balassa-Probe mit den Durchlaufzeiten der Peaks in der DUP-Probe zu korrelieren (Peak 1a oder 1b bzw. Peak 4).
Gemäß Fig. 11c) wurden nur drei Hauptpeaks in dem OIK-Extrakt beobachtet (1, 2, 3). Die Peaks 1 und 3 könnten mit den Peaks 1 und 3 der DUP-Probe korrelieren, aber es wurden in dem OIK-Chromatogramm keine Seitenpeaks von 1 beobachtet. Die Höhe der Peaks in der OIK-Probe war niedriger als in der DUP- Probe. Obgleich die FPLC- und HPLC-Muster charakteristisch für unterschiedliche Produkte sind, haben wir die anti-anigogenetischen Wirkungen der drei Produkte in CAM-Tests verifiziert.

CAM-Test:

CAM-Tests wurden zunächst unter Verwendung von unterschiedlichen Protamin- Konzentrationen durchgeführt (37, 75 und 150 ug). Eine Wasser enthaltende Methylcellulose-Scheibe und eine weitere Protamin enthaltende Scheibe als positive Kontrolle wurden auf die Chorionallantoismembran eines Hühnerembryos aufgebracht (n = Anzahl der analysierten Embryos). Ein O-Ring wurde auf jede Scheibe gelegt, um ihre Lokalisierung zu erleichtern. Am nächsten Tag wurde die Vaskularisationshöhe in jedem O-Ring von zwei Wissenschaftlern auf die übliche blinde Art ausgewertet. Die Evaluationsskala für den CAM-Test basierte auf dem 1-2-3 Score: (Score = 3) Normale Vaskularisation bei einem Vergleich mit dem entgegengesetzten horizontalen Quadranten oder dem dazu passenden Quadranten eines Kontrollembryos (Score = 2) Blutgefäße treten in den O-Ring ein, verschwinden aber auf halber Strecke. Große Blutgefäße durchkreuzen den O-Ring, ihre Bahn ist jedoch deutlich beeinträchtigt. Verringerte Verzweigung, verringerte vaskuläre Fläche des Quadranten in der Nähe des O-Rings; (Score 1) Keine Blutgefäße oder abgelenkte Blutgefäße innerhalb des O-Rings. Die Blutgefäße wachsen nicht über den O-Ring hinaus, außer wenn sie den letztgenannten umgehen und über diesen hinausgehen. Die vaskuläre Fläche des Quadranten ist in der Nähe des O-Rings deutlich vermindert. In Fig. 12 zeigen die Werte über jeder Säule den endgültigen Score für jede Probe. Das statistische Testverfahren nach Wilcoxon wurde verwendet, um die Bedeutung der Unterschiede zwischen den beiden auf das gleiche Ei aufgebrachten Scheiben zu vergleichen. Wie erwartet wird ein Dosis-Reaktion-Verhältnis beobachtet.
Die Fraktionen des DUP-Extrakts, die niedriger und höher als 10 kDa waren, wurden unter den gleichen Bedingungen getestet. Bei der Verhinderung der Neovaskularisation zeigten sie die gleiche Wirkung (Fig. 13).
Unser Gesamtextrakt DUP wurde mit dem Produkt BAL verglichen, das nach dem Verfahren von Balassa hergestellt wurde. In dem Produkt von Balassa wurde keine bedeutende anti-angiogenetische Wirkung gefunden (Fig. 14).
Der unbehandelte Extrakt DUP wurde mit der Fraktion 3 in OIK von Oikawa verglichen. DUP und OIK waren nahezu äquivalent (Fig. 15). Nichtsdestotrotz weicht die Lehre von Oikawa et al. von der vorliegenden Erfindung ab, da sie erwähnten, daß in der Fraktion mit einem Molekulargewicht von mehr als 10 kDa keine Wirkung erfaßbar war, und dies steht im Gegensatz zu unseren Ergebnissen in Fig. 13.
Trotz Ähnlichkeiten zwischen dem Verfahren nach Balassa und unserem Verfahren sind deshalb die durch beide Verfahren hergestellten Produkte eindeutig unterschiedlich.
Die beiden Produkte nach dem Stand der Technik, die mit unseren verglichen wurden, werden dennoch als klassische Verfahren zum Herstellen von Knorpelextrakten angesehen. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das vorliegende Verfahren in Hinblick auf eine anti-angiogenetische Wirkung Produkte mit unerwartet guter Wirkung bereitstellt. Da andere Wirkungen nachstehend verifiziert werden, können wir davon ausgehen, daß das vorliegende Verfahren bei der Gewinnung einer Vielzahl von wasserlöslichen Aktivitäten in einem einzigen Extrakt in der Tat erfolgreich ist.

KLINISCHE STUDIEN:

Bevor zu ersten klinischen Studien übergangen wurde, wurde das nach der Ultrafiltration erhaltene unbehandelte Permeat 2- und 20-fach konzentriert, was ein angereichertes aktives Permeat ergab. Diese Konzentrationen wurden auf einer Filtersäule mit Tangentialströmung mit einer Porosität von 1000 Dalton erreicht, die das Volumen des Eluats um das 2- und 20-fache reduzierte. Das konzentrierte Permeat wurde auf einem Milliporenfilter mit einer Porosität von 0,22 um gefiltert. Wenn das Knorpelgewebe mit dem anderen Zentrifugenverfahren (unter Verwendung der CEPA-Zentrifuge mit einer Membran mit einer Porosität von 30 uM) verarbeitet wurde, erhielt man mit einer zehnfachen Konzentration einen konzentrierten Extrakt mit nahezu dem gleichen Proteingehalt wie bei dem oben genannten 20-fach konzentrierten Extrakt, z. B. etwa 12-25 mg/mL (verbessertes Verfahren) statt etwa 8-12 mg/mL (Verfahren im Labormaßstab). Das sterile 10-fach konzentrierte Permeat wurde in 7 mL Aliquote (ungefähr 85 mg Proteine) in sterile Kolben aufgeteilt, bei -80ºC über Nacht eingefroren und bei -20ºC bis zur Weiterverwendung aufbewahrt. Der Hauptunterschied zwischen dem unbehandelten und dem konzentrierten Permeat ist deren Proteinkonzentration. Man wird erkennen, daß das zum Bestimmen des Proteingehalts eingesetzte Verfahren die gesamten Stickstoffverbindungen und nicht nur Proteine mißt (Verfahren nach Kjeldahl). Dies könnte erklären, warum die Proteinkonzentration nicht proportional mit dem Grad der Volumenkonzentration ansteigt, wie es gewöhnlich der Fall ist, wenn der Proteingehalt mit dem Verfahren nach Lowry bestimmt wird. Daher wird angenommen, daß der Konzentrationsschritt die Permeation von Wasser sowie von Stickstoffverbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zuläßt.

ANTI-ANGIOGENETISCHE WIRKUNG

Das konzentrierte Permeat wurde zur Behandlung von Angiogenese-abhängigen Krankheiten verwendet. Drei verschiedene Arten, die für die Angiogenese- abhängigen Krankheiten repräsentativ sind, wurden in der Praxis am Menschen getestet; die erste Art ist Krebs (Prostatakrebs), die zweite Art sind Hautkrankheiten (Schuppenflechte), und die dritte Art ist Arthritis. Die nachstehenden Beispiele werden wenigstens die anti-angiogenetische Wirkung des Flüssigextrakts veranschaulichen und aufzeigen.
Bei den Hautkrankheiten wurden Fälle von Schuppenflechte ausgewählt. Bei den im Versuch behandelten Fällen von Schuppenflechte sollte die Unterscheidung zwischen Fällen von Schuppenflechte, die durch Hyperkeratose verkompliziert sind, und nicht verkomplizierten Fällen beachtet werden. Die Keratosekomponente ist die Bildung einer verhornten Hülle in Form einer Plaque. Eine solche Plaque ist eine physikalische Barriere, welche das wirksame Eindringen der aktiven Inhaltsstoffe in Richtung der Blutgefäße verhindert.
Ein Patient mit Prostatakrebs unterzog sich freiwillig einem Versuch mit einem 10- fach konzentrierten Knorpelgewebe-Permeat. Dieser Patient hatte eine Reihe von aufeinanderfolgenden herkömmlichen Therapien durchgemacht, die vorübergehend erfolgreich waren. Nachdem sein Krebs einen Rückfall zeigte, begann er kürzlich mit der Einnahme von Knorpelextrakt.
Andere Freiwillige, die an Arthritis leiden, haben zuvor Arzneimittel (Prednison) eingenommen oder noch nicht angefangen, einen konzentrierten Knorpelextrakt zu konsumieren. Ihr Zustand hat sich gebessert, wie durch den Rückgang der Schmerzen und der Steifigkeit in den Gelenken verifiziert wurde.
Die im folgenden gezeigten Ergebnisse sind sehr ermutigend und sollen die Nützlichkeit des unbehandelten Permeats und seiner Fraktionen bei der Behandlung aller Angiogenese-abhängigen Krankheiten und nicht nur der speziell getesteten vorhersagen. Sofern eine Krankheit eine angiogenetische Komponente hat, geht man davon aus, daß der Knorpelextrakt der vorliegenden Erfindung in dieser Hinsicht wirkungsvoll ist, vorausgesetzt es liegt eine Zusammensetzung mit einem wirksamen Anteil desselben vor und vorausgesetzt diese Zusammensetzung liegt in geeigneter Form für die richtige Verabreichung vor.
Daher ist die vorliegende Erfindung selbstverständlich nicht auf die folgenden speziellen Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von angiogenetischen Krankheiten beschränkt, da der Fachmann in der Lage wäre, zahlreiche Zusammensetzungen abzuleiten, wobei die Auswahl von der Art ihrer Verabreichung und dem zu behandelnden erkrankten Gewebe geleitet wird. Zusammensetzungen können auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden, z. B. topisch, oral, sublingual, rektal, intravenös, intramuskulär, durch Diffusion etc.
Da der Knorpelextrakt nach Fisch schmeckt und riecht, können diesen Zusammensetzungen Geschmacksverbesserer oder Aromen zugefügt werden, um den Patienten zur Einnahmebefolgung zu ermutigen.

SCHUPPENFLECHTE:

Die folgende dermatologische Zusammensetzung wurde hergestellt und erprobt, um ihre Wirksamkeit bei an Schuppenflechte leidenden Patienten zu verifizieren:
- Emulgade CLB 29% (w/w)
- 20-faches unbehandeltes Permeat 69,5% (w/w)
- GERMABEN II 1% (w/w) und
- Lavandula Angustifolia 0,5% (w/w)
EMULGADE CLB, eine Mischung aus Stearatestern, Fettalkoholen und nichtionischen Emulgatoren (bei Henkel Canada Ltd. gekauft) wurde bei 65-70ºC unter Rühren erhitzt. Das Erhitzen wurde eingestellt, während die Mischung weiter gerührt wurde. Sobald die Mischung eine Temperatur von 45ºC erreichte, wurden das ätherische Öl Lavandula Augustifolia und die Konservierungsmittel GERMABEN II (Diazonidylharnstoff 30%, Methylparaben 11%, Propylparaben 3% und Propylenglycol 56%; bei Sutton Laboratories, NJ, USA gekauft) zugefügt. Sobald die Temperatur der Mischung 30ºC erreichte, wurde der Knorpelextrakt zugefügt. Die so hergestellte Zusammensetzung war eine glatte, nicht fettende Creme. Durch Variieren des prozentualen Anteils an EMULGADE können andere Formen dermatologischer Zusammensetzungen unterschiedlicher Viskosität hergestellt werden, je nach den Vorgaben des Herstellers (Milch, Lotion, Salbe). Andere Trägersubstanzen oder Bindemittel könnten verwendet werden, um Pasten, Gels und jegliche andere Form einer transdermalen Zubereitung herzustellen.
Die oben beschriebene Formulierung wurde einer Gruppe von neun Patienten mit Schuppenflechte, die zwar auf die herkömmlichen Therapien ansprachen, jedoch nach einiger Zeit immun dagegen wurden, über einen Zeitraum von zwölf Wochen hinweg zweimal täglich verabreicht (topische Anwendung). Für diese Studie wurden Patienten ausgewählt, die beidseitig eine ähnliche und symmetrische Ausbreitung von Schuppenflechte an den Gliedmaßen hatten. Diese Studien wurden in doppelt-blinder Art und Weise durchgeführt, wobei weder der Hautarzt noch die Patienten wußten, welche der erkrankten Seiten mit der Zusammensetzung behandelt wurde, die den Knorpelextrakt enthielt, und welche mit einer Kontrollzusammensetzung behandelt wurde. Bei fünf Patienten, deren Schuppenflechte nicht durch Hyperkeratose verkompliziert war, wurde eine beträchtliche Besserung festgestellt; bei solchen mit Hyperkeratose waren die Ergebnisse mäßig gut. Photographien von Körperteilen zweier Patienten sind in den Fig. 9a) und 9b) gezeigt. In Fig. 9a) wird gezeigt, daß bei einem Patienten mit Schuppenflechte mit Hyperkeratose dennoch nach nur einem Monat Behandlung ein starker Rückgang der Hautreizung zu beobachten ist, die nicht mit einem Juckreiz verbunden ist. Die Hyperkeratose war jedoch immer noch stark vorhanden. Photographien des zweiten Patienten mit Schuppenflechte, die nicht durch Hyperkeratose verkompliziert war (Fig. 9b) zeigen eine deutlichere Besserung nach dreimonatiger Behandlung. Da Schuppenflechte offenbar eine multifaktorielle Krankheit ist, wird angenommen, daß die Art, wie die Patienten auf die Behandlung ansprechen, davon abhängt, wie bedeutend die Rolle von Komponenten wie Angiogenese und Entzündung sowohl bei der Erzeugung als auch bei der Fortdauer dieses Zustands ist. In der Tat ist die anti-angiogenefische Wirkung in unserem Extrakt vorhanden, wie bei mit DMBA behandelten Ratten und in CAM-Tests gezeigt. Ebenso wurde die entzündungshemmende Wirkung verifiziert (nachstehende Erläuterungen). Möglicherweise könnten bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn diese Art von Formulierung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen ergänzt wird, die auf andere beteiligte Faktoren ausgerichtet sind (keratolytische Wirkstoffe, zusätzliche entzündungshemmende Wirkstoffe, Antihistamine, immunsuppressive Wirkstoffe, etc.).
Diese Ergänzung kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Formulierung durch Aufnahme einer wirksamen Menge eines keratolytischen Wirkstoffs verändert wird. Sie könnte aber auch erreicht werden, indem ein derartiger ergänzender therapeutischer Wirkstoff zusammen oder im Wechsel mit der Anwendung der vorliegenden topischen Formulierung getrennt verabreicht wird. Auch muß das ergänzende Medikament nicht auf dem gleichen Weg verabreicht werden.
Trotz der hohen Anteile an Knorpelextrakt hat die oben genannte Formulierung keine systemische Wirkung (da die Wirkung auf die behandelten Flächen begrenzt ist) und keine Nebenwirkung gezeigt.

KREBS:

Ein Patient mit Prostatakrebs testete das 10-fach konzentrierte Permeat. 1986 wurde ein Adenokarzinom diagnostiziert. Damals wurde eine Strahlentherapie durchgeführt. 1991 lag der PSA (prostataspezifisches Antigen)-Wert bei 138 ug /L, wobei die normale annehmbare Obergrenze bei 4 ug/L liegt. Dann unterzog sich der Patient einer völlig anderen Therapie durch Kastration in Verbindung mit einer Anti-Androgen-Therapie (EUFLEX ). Diese Behandlung war für drei Jahre erfolgreich, doch danach stieg der PSA-Wert erneut an. Seit Juni 1994 nimmt dieser Patient das 10-fach-Permeat ein (eine tägliche sublingual verabreichte Dosis von ungefähr 75 mg Proteinen/7 mL Extrakt, entsprechend ungefähr 1-1,5 mg/kg Körpergewicht/Tag). Obwohl eine beträchtliche Menge dieser Dosis geschluckt wird, wird sie möglicherweise in wesentlichen Anteilen im Magen- Darm-Trakt absorbiert, wenn man sich auf die Ergebnisse verläßt, die bei mit DMBA behandelten Tieren erzielt wurden (siehe oben). Die PSA-Werte gingen allmählich von 12 auf 0,9 ug/mL zurück, z. B. gut innerhalb des normalen PSA- Wertes (letzte Ergebnisse aus Mai 1995). Diese Dosis kann ferner beliebig modifiziert werden, abhängig von dem Weg der Verabreichung, der biologischen Verfügbarkeit der aktiven Bestandteile und der gewünschten Aggressivität, mit der die Pathologie zu steuern ist. Zum jetzigen Zeitpunkt wurde die Ungiftigkeit bei Ratten (siehe obige Beispiele) und Menschen (Daten nicht gezeigt) verifiziert.
Bei dem anderen in vivo-Versuch an mit DMBA behandelten Ratten betrug die Dosierungsrate des Flüssigextrakts ungefähr 190-220 mg Proteine/Kg Körpergewicht, was wahrscheinlich stark zur Reduktion der Fläche von Krebsblutgefäßen beitrug (55% in Kombination mit viel größeren Proteinmengen von Lyophilisat). Daher wird angenommen, daß eine Dosis von ungefähr 1 bis ungefähr 200 mg/Kg Körpergewicht pro Tag einen approximativen vernünftigen Bereich mittlerer Dosen (ED&sub5;&sub0;) zur Behandlung von Krebs darstellt, wenigstens teilweise durch Reduzieren oder Ausschalten von Angiogenese.

ARTHRITIS:

Patienten mit Arthritis haben auf freiwilliger Basis täglich eine bis zwei Einheiten von 7 mL gesamten flüssigem Extrakt für mehrere Monate ausprobiert. Diese Patienten konnten eine allmähliche Verbesserung ihres Zustandes durch Zurückgewinnen der Gelenkfunktion, Schmerzlinderung und Entzündungsrückgang (bis zu etwa 60%) erkennen. Da Arthritis angiogenetische und entzündliche Komponenten hat, kann die vorstehende Wirkung den anti- angiogenetischen und entzündungshemmenden Wirkungen des Knorpelextrakts zugeschrieben werden.

NICHT-ANTI-ANGIOGENETISCHE WIRKUNG

AKNE:

Obgleich Akne, soweit die Erfinder wissen, nicht als Krankheit oder krankhafte Störung mit einer angiogenetischen Komponente klassifiziert ist, war es dennoch verlockend, den Knorpel-Flüssigextrakt an Akne-Patienten zu testen. Zum Testen des Knorpelextrakts an Akne-Patientien wurde die folgende Gelformulierung hergestellt:
CARBOPOL 1,2%
Gereinigtes Wasser 77,2%
NaOH 0,3%
PHENOXETHOL 0,3%
TWEEN 80 0,3%
2-facher Knorpelextrakt 20,0%
40-facher Aloe-Extrakt 0,5%
Der 2-fach Knorpelextrakt enthält 9-12 mg/mL an Proteinen. Diese Formulierung zeigt eine beträchtliche Verbesserung des Erscheinungsbildes der Haut von Patienten mit mehr oder weniger schweren Formen der Akne (entzündliche Akne oder Akne cystica; Daten nicht dargestellt).
Diese Ergebnisse können auf einer anti-angiogenetischen Wirkung beruhen (und somit eine angiogenetische Komponente bei Akne aufdecken), oder sie können von aktiven Bestandteilen herrühren, die einen anderen Effekt als den anti- angiogenetischen haben. (beispielsweise einen entzündungshemmenden Effekt, vgl. nachstehende Ausführungen).
Alle bei den klinischen Versuchen erhaltenen Ergebnisse zeigen das große Potential des Knorpel-Flüssigextrakts bei der Behandlung von Angiogenese- abhängigen Krankheiten und/oder Entzündungskrankheiten. Der Anteil an Knorpelextrakt sowie die Formulierung davon kann beliebig variiert werden, um speziellen Bedürfnissen zu entsprechen.
Es ist zu erkennen, daß die topischen und alle anderen Zusammensetzungen, auf Basis des Proteinanteils, einen breiten Bereich von Dosen des Knorpelextrakts enthalten können. Bei den drei spezifischen Kategorien von getesteten Fällen wurden sehr unterschiedliche Dosierungen und/oder Formulierungen verwendet. Für alle vorgesehenen Anwendungen (von Augentropfen bis zu Formulierungen für Haut- und Krebsarzneimittel) wird angenommen, daß eine minimale endgültige Proteinkonzentration des gesamten flüssigen Extrakts sehr niedrig sein könnte (ab etwa 0,1 mg/mL). Dieser untere Dosierungsbereich ist abhängig von der Zugänglichkeit und der Permeation der aktiven Bestandteile zu dem Behandlungsort sowie von der effizienten Aufnahme dieser Bestandteile und der Empfindlichkeit oder der Reaktion des Gewebes gegenüber bzw. auf angiogenetische Inhibitoren. Der obere Grenzwert der endgültigen Proteinkonzentration in Formulierungen für einige Anwendungen ist derzeit nicht bekannt. Die höchsten getesteten endgültigen Konzentrationen betrugen ungefähr 9 mg/mL Proteine in den Formulierungen für die Fälle von Schuppenflechte und ungefähr 12 mg/mL in der 7 mL-Dosiseinheit, die in dem Fall von Prostatakrebs verabreicht wurde.
Wie oben erwähnt kann der Haiknorpel-Flüssigextrakt einige seiner Wirkungen verlieren, wenn er in wäßrigen Lösungen gefriergetrocknet wird. Die Zugabe von Stabilisatoren und Schutzstoffen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, vor der Gefriertrocknung kann jedoch empfindliche Aktivitäten aufrechterhalten und die Verabreichung von höheren Dosen von Knorpelextrakt im Trockenzustand möglich machen.

KNORPELEXTRAKT ALS ANTAGONIST VON PROTEIN-KINASE C (PKC)- VERMITTELTEN FÄLLEN:

Neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, daß die PKC-Aktivierung normale Keratinozyten dazu veranlaßt hat, erhöhte Mengen an Interleukin-8 (IL-8), einem Vermittler von Entzündungen, herzustellen (Chabot-Fletcher et al. (1994) J.Invest.Dermatol. 103: 509-515). Darüber hinaus produzieren psoriatische Keratinozyten sehr hohe Mengen an IL-8, welche die Neovaskularisation in psoriatischen Plaques weiter fördert (Nickoloff et al. (1994) Am.J.Pathol. 144: 820- 828). Da sich der Knorpelextrakt als sehr vielversprechend bei der Behandlung von Schuppenflechte gezeigt hat, wurde seine Wirkung in Keratinozyten getestet, wobei die PKC durch Tri-Phorbolacetat (TPA) aktiviert wird, ein bekannter Agonist dieses zellularen Transduktionsweges.
Fig. 16 zeigt, daß der Differenzierungsgrad der Keratinozyten durch TPA um das fünffache erhöht wurde. Haiknorpelgewebe allein hatte keine Wirkung auf die Bildung einer verhornten Hülle. Jedoch hemmte die Zugabe von Haiknorpelextrakt die TPA-induzierte Bildung einer verhornten Hülle um mehr als 60%. Wir wissen nicht, ob die TPA-Induktion psoriatische Keratinozyten nachahmt. Wenn dies der Fall ist, lassen diese Ergebnisse vermuten, daß Knorpelgewebe in vivo keine Wirkung auf normale Keratinozyten hat, während es eine Wirkung auf psoriatische (oder aktivierte) Keratinozyten haben kann. Die Hemmung der Produktion von IL-8 in TPA-aktivierten Keratinozyten sowie in psoriatischen Plaques oder Keratinozyten durch das Knorpelextrakt muß noch verifiziert werden. Herabgesetzte IL-8-Werte wären eine wertvolle Bestätigung der entzündungshemmenden und anti-angiogenetischen Wirkungen dieses Extrakts.

EINE ENTZÜNDUNGSHEMMENDE WIRKUNG IST UNABHÄNGIG VON EINER ANTI-ANGLOGENETISCHEN WIRKUNG IN HAIKNORPELEXTRAKT:

Da Angiogenese bei zahlreichen Krankheiten häufig mit Entzündung verbunden ist, wäre es wünschenswert, jede Wirkung in dem Knorpelextrakt getrennt zu bestimmen. Diesbezüglich wurde ein Hautirritationsmodell, bei dem nicht angenommen wird, das eine Angiogenese auftritt, ausgewählt, um den Extrakt auf seine entzündungshemmende und lindernde Wirkung zu testen. Neun Freiwillige mit einer Krankengeschichte von Hautempfindlichkeit gegenüber Perubalsam wurden für die Studie ausgewählt. Die Versuchsverbindungen waren wie folgt:
1. 1-fach konzentriertes Haiknorpelgewebe 50% in D-MEM Medien
2. 1-fach konzentriertes Haiknorpelgewebe 20% in D-MEM Medien
3. 1-fach konzentriertes Haiknorpelgewebe 10% in D-MEM Medien
4. Colanuß (Indena) 10% Hydroalkohol 1 : 1
Die vier Versuchsverbindungen wurden auf die ventralen Vorderarme der Versuchsteilnehmer aufgebracht. Man ließ das Material zwanzig Minuten lang absorbieren und anschließend wurde Perubalsam, ein Reizmittel, auf die Versuchsstellen aufgetragen. Hautirritationen wurden auf der Grundlage einer verstärkten Hautröte gemessen. Der Grad der Röte wurde mit einem Minolta Chromameter gemessen und mit den positiven und den negativen Kontrollen verglichen. Die positive Kontrolle war die Farbe der Haut, die nur mit Perubalsam behandelt wurde, und die negative Kontrolle war eine Hautstelle, die mit Colalösung behandelt und wie die anderen Testprodukte gefordert wurde. Die statistische Bedeutung wurde mittels des T-Testes mit zweiseitiger Wahrscheinlichkeit berechnet. Die Fig. 17 zeigt, daß bei 10% Cola eine Aktivität von 70% hatte. Bei Konzentrationen von 10% bzw. 20% hatte Haiknorpelgewebe eine Aktivität von 58% und 60% als Anti-Reizmittel. Ein Dosis-Reaktions-Effekt trat nicht auf. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß der Knorpelextrakt eine entzündungshemmende und lindernde Aktivität hat, die nicht mit einer anti-angiogenetisehen Wirkung zusammenhängt.

ANTI-KOLLAGENOLYTISCHE AKTIVITÄT:

HPLC-Chromatopraphie

Eine 980 ml Probe Flüssigextrakt (DUP) wurde in einer Ultrafiltrationseinheit mit Tangentialfluß durch eine Membran mit einem Cutoff von 10 kDa gefiltert (PELLICON , Millipore). Die Einheit wurde zunächst mit 1 L H&sub2;O gewaschen. Endgültige Ausbeuten waren 480 mL > 10 kD Fraktion und 1,8 L < 10 kDa Fraktion. Die < 10 kDa Fraktion wurde durch die sogenannte "cold finger"- Verdampfung auf 180 mL konzentriert (< 10-10-fach konzentriert). Acht 100 ul Allquote von < 10-10-fach wurden auf eine CDC-S Hexyl, 5 um HPLC-Säule (25 · 0,94 cm) geladen und zunächst mit 100% H&sub2;O bei 4 mL/min eluiert; daraufhin mit 100% MeOH bei 8,5 mL/min. Fraktionen wurden entsprechend den OD&sub2;&sub1;&sub4;-Peaks entnommen.
Fünf Fraktionen wurden entnommen (Fig. 18): Fr1, Fr2, Fr3, Fr4 und Fr5. Die ersten drei Fraktionen enthalten wenigstens einen Hauptpeak.

Kollagenase-Versuche

Die Kollagenase-Versuche wurden unter Verwendung von rekombinanter humaner Haut-Kollagenase, Typ 1 (MMP1), unter Verwendung eines Fluorogen- Peptid-Substrates (Versuch 1) und eines Kollagensubstrates (Versuch 2) an diesen Proben durchgeführt.

Versuch 1

Dieser Versuch ist in Knight et al. (1992) FEBS Let. 296, 263-266 beschrieben. Das Verfahren verwendet ein Fluorogen-Peptid-Substrat (Mca-pro-leu-glu-leu- Dpa-ala-arg-NH&sub2;), das die aktive Stelle von Metalloproteinasen nachahmt. Dieses Substrat hat an einem Ende eine Fluoreszenzgruppe (Mca) und an dem anderen Ende eine Fluoreszenzlöschungsgruppe (Dpa). In dem intakten Substrat blockiert die Löschungsgruppe wirksam die Fluoreszenz. Bei Enzymspaltung des Substrates nimmt die Fluoreszenz in dem Teströhrchen zu.
Die Aktivierung von Kollagenase ist in Weingarten et al. (1985) Biochemistry 24, 6730 beschrieben. 1 ug wurde mit 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&sub2; zu 100 ul verdünnt. 1 ul, pH-Wert 7,5 bei 10 mg/ml Trypsinlösung (in 1 mM HCl) wurde zugefügt und für 15 Minuten bei 20ºC inkubiert. Die Aktivierung wurde durch Zugabe von 10 ul Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (SBTI, 5 mg/ml) abgeschlossen. Jeder Mikroküvette wurden zugefügt:
25 oder 50 ul Inhibitor (mit H&sub2; auf 50 ul gebracht);
40 ul 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH-Wert 7,5;
8 ul aktivierte Kollagenase (67 ng Endgewicht); und
2 ul Substrat (1 mM Vorratslösung in DMSO, 20 uM Endgewicht).
Eine Fluoreszenz wurde bei λex = 328 nm, λem = 393 nm registriert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Fr1 die aktivste Fraktion ist, um die Kollagenase zu hemmen (Fig. 19). In allen anderen Fraktionen ist eine niedrigere Aktivität vorhanden. Bei einem Test an Kaulquappen-Vertebraten-Kollagenase wurde das Enzym durch den Haiknorpelextrakt stark gehemmt (EC&sub5;&sub0; von etwa 10-20 ug/mL).

Versuch 2

Dieser Versuch ist in Welgus et al. (1979) JBC 256, 9511-9516 beschrieben. Das Verfahren verwendet SDS-PAGE, um die Spaltung durch Kollagenase, Typ 1 (MMP1) zu untersuchen. Kollagenase Typ 1 macht einen einzigen Schnitt in dem unveränderten Kollagenmolekül und ergibt zwei Fragmente mit einer Größe von 75% und 25% des ursprünglichen Kollagens. Nach einer mehrstündigen Spaltung wird die Reaktion durch Lösen der Produkte von dem Substrat mittels SDS-PAGE überwacht. Das Verhältnis von gespaltenem zu nicht gespaltenem Kollagen wird visuell beurteilt, nachdem die Gels mit Comassie Blue (oder Silberfärbung) eingefärbt worden waren.
21 ng aktivierte Kollagenase (vgl. Versuch 1) wurden zu 5 ug Kälberhautkollagen (Worthington) +/- Inhibitor in einem Endvolumen von 20 ul zugefügt. Die Reaktionen wurden für 16 Stunden bei 35ºC inkubiert, dann durch Zugabe einer SDS-PAGE-Probe mit 40 mM EDTA gestoppt, gekocht und auf ein 8% Gel geladen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
EDTA 40 mM gehemmte Kollagenase. Der gesamte flüssige Extrakt DUP zeigte eine niedrige anti-kollagenolytische Aktivität. Die Fraktionen 1 bis 5 waren aktiv;
die Fraktion 1 war die aktivste. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht von über 10 kDa zeigte keine bedeutsame Hemmwirkung.

KOSMETISCHE ANWENDUNGEN UND ZUSAMMENSETZUNGEN:

Die vorstehenden Tests und Versuche haben gezeigt, daß der Knorpelextrakt der vorliegenden Erfindung zahlreiche medizinische Anwendungen finden kann. Unter den verschiedenen Aktivitäten, die in diesem Extrakt entdeckt wurden, sind die anti-kollagenolytischen und die entzündungshemmenden Wirkungen sowie die Hemmwirkung auf PKC-induzierte Differenzierung bei kosmetischen Anwendung besonders wünschenswert. Da der Knorpelextrakt der vorliegenden Erfindung eine antagonistische Wirkung auf PKC-vermittelte zellulare Fälle gezeigt hat, und da eine solche antagonistische Wirkung im Stand der Technik als eine Wirkung vorgeschlagen wird, die die Wiederherstellungsfunktion der Hautbarriere verbessert, umfaßt der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Verbessern der Barrierenherstellungsfunktion von Säugetierhaut, das den Schritt des Auftragens einer Zusammensetzung auf die Haut einschließt, wobei die Zusammensetzung aus dem Knorpelextrakt und einem pharmazeutisch zulässigen Träger besteht, sowie eine derartige Zusammensetzung. Andere oder ähnliche Zusammensetzungen können auch zur Verwendung in einem Verfahren zur Hautberuhigung oder zum Mindern einer Entzündung von Säugetierhaut ins Auge gefaßt werden. Eine Entzündung kann durch verschiedene Wirkstoffe, wie z. B. chemische Reizmitte, physikalische Abschürfung und UV-Strahlung, hervorgerufen werden. Ferner werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Hemmen von Kollagenase in der Haut in Betracht gezogen. Kollagenase und Entzündungen sind mit vorzeitigem Altern verbunden (Abbau von Kollagen), und aus diesem Grunde könnten die antagonistischen Aktivitäten, die im Knorpelextrakt entdeckt wurden, einen Beitrag in Zusammensetzungen und Verfahren zum Verzögern von vorzeitigem Altern sowie zum Regulieren von Falten oder von Atrophie in Säugetierhaut leisten. Als Ursachen für Falten und Atrophie werden beispielsweise das Alter, UV-Strahlung oder Umweltverschmutzungen angeführt. Topische Zusammensetzungen können eine wirksame Menge an Haiknorpelgewebe enthalten, die für jede spezifische Anwendung festgelegt werden muß. Im allgemeinen können diese Zusammensetzungen etwa 0,1 bis etwa 75 Gewichtsprozent eines flüssigen 1- fach bis 20-fach konzentrierten Knorpelextrakts und etwa 50 bis 99,9 Gewichtsprozent eines pharmazeutisch zulässigen Trägers enthalten. Diese Zusammensetzungen können ein Antioxidationsmittel enthalten, wie z. B. einen Wirkstoff, der die Bildung von Lipidperoxiden in der Haut verhindert. Beispiele solcher Antioxidationsmittel sind Tocopherol, Tocopherol-Derivate, Ascorbinsäure, Ascorbinsäure-Derivate und BHT. Die Zusammensetzungen können durch entzündungshemmende Werkstoffe ergänzt werden, wie z. B. Phospholipase A2- Inhibitor oder die pflanzlichen Antireizstoffe Cola und Grünteeextrakt. Topische Zusammensetzungen können verschiedene Formen annehmen, wie z. B. Lösungen, Suspensionen, Lotionen, Tinkturen, Gels, Cremes, Sprays, Emulsionen, Stifte, Salben oder Liposome (wenigstens ein Teil des Flüssig- Knorpelextrakts ist in Liposomen vorhanden).

SCHLUSSFOLGERUNGEN:

Es hat sich herausgestellt, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Knorpelextrakten mit hohem klinischen Wert ermöglicht. Die Haiknorpelextrakte, die durch dieses neue Verfahren hergestellt werden, enthalten eine Vielzahl von Aktivitäten, die in hohen Ausbeuten gewonnen wurden. Die Knorpelextrakte, insbesondere der Flüssigextrakt und Fraktionen desselben haben ein großes Potential, da sie ungiftig gegenüber normalen Zellen sind, während sie bei vielen verschiedenen Krankheiten und Zuständen wirksam sind.

ERFORDERLICHES MATERIAL:

- Kühlgeräte
- Chirurgische Instrumente
- Fleischwolf
- Plastiktüten
- Industriemischer (Waring Mischer mit 3 Geschwindigkeitsstufen von Fisher Scientific)
- System zum Reinigen von Wasser (Umkehrosmose und 0,1 um Filtration; Continental Water System, Modell PRE 2202, Seriennummer 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing System von Fisher Scientific, Montreal, Québec). Dieses System liefert apyrogenes Wasser hoher Qualität.
- Präzisionswaage Mettler, Serie AE von Fisher Scientific
- Zentrifuge Sorvall RC-285 von DuPont Canada
- Zentrifuge CEPA
- Nylontasche mit einer Porosität von 30 uM
- Autoclav (automatischer Dampfsterilisator Sanyo, Modell MAC 350P)
- Nalgene 500 mL-Behälter, bei 132ºC für 10 Minuten sterilisiert und für 35 Minuten getrocknet
- Konische Filter mit einer Porosität von 24 um, Whatman Reeve Angel
- Ultrafiltrationssäule (Molekulargewichtsgrenze: 500 kDa und 1kDa (falls erforderlich); Fläche: 25 Quadratfuß; Durchflußrate: 130 L/Minute; Einlaßdruck: 30 psi; Auslaßdruck: 5 psi; von Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, MA, USA)
- Sanitärzentrifugalpumpe (Monarch Industires, Modell ACE-S100, Typ A) zum Bereitstellen einer Durchflußrate von 130 L/Minute
- Sterile Haube (Laminarströmungshaube NuAire von Ingram & Beil)
- Millipack-60 0,22 um sterile Filter
- sterile Flaschen aus weißem oder braunem Glas
- Konzentrator DC-10 Amicon
- Rotofor Biorad 170-2950
- Amicon-Filter SIOY10, SIOY30 und SIOY100 mit Cut-off-Werten von 10, 30 bzw. 100 kDa
- FPLC Pharmacia 216007 (Computer Pharmacia 216014)
- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)
- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmcia)
- Lyophilisator Labconco 10273 A
Die vorliegende Erfindung wurde vorstehend beschrieben, und es sei darauf hingewiesen, daß es innerhalb des Könnens und Wissens des Fachmanns liegt, Modifizierungen einzubringen, ohne von den Lehren der vorliegenden Offenbarung abzuweichen, indem einige Elemente der vorliegenden Erfindung bei der praktischen Ausführung durch äquivalente Elemente ersetzt werden, die den gleichen Zweck erfüllen würden. Solche offensichtlichen Änderungen werden als von der vorliegenden Anmeldung abgedeckt erachtet.

Claims

1. Verwendung eines Haiknorpelextrakts bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln einer Krankheit oder Störung, die Kollagenolyse oder Entzündung als Komponente hat, unter dem Vorbehalt, daß diese Krankheit oder Störung nicht Krebs, Schuppenflechte, Akne oder Arthritis ist, wobei der Knorpelextrakt eine Fraktion eines Überstands ist, der nach Zentrifugieren eines wäßrigen Homogenats von ganzem Haiknorpel erhalten wird, wobei der Überstand auf einer Filtrationssäule mit einer Porosität von ungefähr 500 kDa fraktioniert wurde, wodurch der Extrakt Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 0 und ungefähr 500 kDa enthält und wobei der Extrakt antikollagenolytische Wirkung und entzündungshemmende Wirkung hat.

2. Verwendung eines Haiknorpelextrakts bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln einer Krankheit oder Störung, die Kollagenolyse oder Entzündung als Komponente hat, unter dem Vorbehalt, daß diese Krankheit oder Störung nicht Krebs, Schuppenflechte, Akne oder Arthritis ist, wobei der Knorpelextrakt eine Fraktion eines Überstands ist, der nach Zentrifugieren eines wäßrigen Homogenats von ganzem Haiknorpel erhalten wird, wobei der Überstand auf einer Filtrationsmembran mit einem Molekulargewicht- Grenzwert von 1 kDa konzentriert wurde, wodurch ein konzentrierter Extrakt erhalten wird, der reicher an Molekülen mit einem Molekulargewicht von 1 bis 500 kDa ist.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Arzneimittel ein Mittel zur äußeren Anwendung ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Arzneimittel ferner ein Antioxidationsmittel enthält.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Antioxidationsmittel aus Tocopherol, Tocopherolderivaten, Ascorbinsäure, Ascorbinsäurederivaten und BHT gewählt ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Arzneimittel zusätzlich einen entzündungshemmenden Wirkstoff enthält.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff ein aus Pflanzen gewonnener reizhemmender Stoff ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff Kolanuß- oder Grüntee-Extrakt ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der entzündungshemmende Wirkstoff ein Phospholipase A2-Inhibitor ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Arzneimittel eine Lösung, eine Suspension, eine Lotion, eine Tinktur, ein Gel, eine Creme, ein Spray, eine Emulsion, ein Stift oder eine Salbe ist.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei der Extrakt in Liposomen enthalten ist.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Krankheit oder Störung Hautentzündung ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hautentzündung durch physikalisches Abschürfen hervorgerufen ist.

14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hautentzündung durch einen chemischen Reizstoff hervorgerufen ist.

15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hautentzündung durch Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen hervorgerufen ist.