BG63801B1

BG63801B1 - Екстракт от акулов хрущял

Info

Publication number: BG63801B1
Application number: BG101870A
Authority: BG
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau; Daniel MEAS; Kenneth Marenus
Original assignee: Les Laboratoires Aeterna Inc.
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2003-01-31
Also published as: EP0806960A1; HUT77488A; FI973195L; AU717978B2; BG101870A; ATE230272T1; CN1138550C; NO973564L; NZ294553A; JP2006290904A; AU3738895A; CZ292627B6; IS1963B; FI973195A0; DE69529300T2; DE69529300D1; RU2157695C2; RO117590B1; FI117376B; ES2188672T3

Abstract

Акуловите хрущялни екстракти имат антиангиогенна,пряка туморпролиферираща, противовъзпалителна и антиколагенолитична активност, а методът е опростени с повишена ефективност. По него се получава хомогенат от хрущял във воден разтвор. Хомогенатът сецентрофугира и по-нататък се фракционира до получаване на общ екстракт, имащ молекули с молекулно тегло от 0 до 500 KDa. Съставът на течния екстракт се изследва при по-нататъшно фракциониране до предварителното охарактеризиране на някои от неговите компоненти, определящи биологичната му активност спрямо голям брой заболявания или състояния, по-специално туморна пролиферация, ангиогенеза, възпаление и колагенолиза. Екстрактът няма неблагоприятен ефект върху нормалните функции на тялото.

Description

(54) ЕКСТРАКТ ОТ АКУЛОВ ХРУЩЯЛ

Област на техниката

Хрущялът е аваскуларна тъкан (не е снабдена с кръвоносни съдове) и е изследван като потенциален източник на ангиогенни фактори. Това също е тъкан, която е относително устойчива на развитие на тумори. Туморът, свързан с хрущяла, хондросаркома, е единственият от твърдите тумори, който е васкуларизиран. Ангиогенезата е един от важните фактори в развитието на тумора. Дискретни твърди туморни маси се появяват, ако туморните клетки могат да провокират разширяването на съседната васкуларна мрежа с оглед обезпечаване на хранителните им нужди. Поради това са изследвани факторите, включени в стимулирането на ангиогенезата с оглед ролята им за развитието на тумора. Изследвани са и антиангиогенни фактори като лекарства, притежаващи ангиогенна инхибиторна активност в качеството им на средства за контролиране развитието или повлияващи туморната регресия.

Предшестващо състояние на техниката

Открито е, че телешкият скапуларен хрущял съдържа вещество, инхибиращо васкуларизацията на твърди тумори (Langer et al., 1976). Но поради обезкуражаващите му възможности като антитуморен агент се търсят източници на по-добро снабдяване с хрущял.

Акулите са животни, които са потенциален източник на този вид ангиогенен инхибитор, тъй като техният ендоскелет е съставен изцяло от хрущял (6% от тяхното телесно тегло спрямо 0.6% в телетата). Акулите притежават също и интересна особеност, а именно - слаба склонност да развиват тумори. Създадени са много хипотези за обяснение на тази ниска вероятност за развиване на тумори в акулите. Marchalonis et al. (1990) са показали IgM антитела, способни да атакуват всеки агресивен агент. McKinney et al. (1990) са показали, че акулите притежават макрофаги, способни да отдиференцират нормални клетки от неопластични клетки и да разрушават последните. Rosen and Woodhead (1980) постулират, че редките случаи на тумори при елазмобранхиата (групата, към която принадлежат акули и скатове), могат да се дължат на високата йонна сила на техните тъкани, което е еквивалентно на висока телесна температура. Авторите вярват, че в тези условия имунната система се напряга близо до 100% (имунологичен надзор). Moore et al. (1993) са открили, че акулите продуцират аминостерол с антибактериални антипротозойни свойства. Накрая, Lee and Langer (1983) и Folkman and Klagsbrun (1987) показват, че акулите продуцират вещество, което инхибира неоваскуларизацията. Lee and Langer са изолирали това вещество чрез екстракция от акулов хрущял в денатуриращи условия (гуанидинова екстракция). Този метод на екстракция е обаче твърде дълъг (41 дни) и би могъл да генерира екстракти, притежаващи денатурирани фактори и добива на активни вещества е далече от отличния. Докато активното вещество, изолирано от телета, притежава молекулно тегло приблизително 16 kD, то същата група от изследователи не дават точното молекулно тегло на такова, възстановено в акули. Това вещество само е определено, че притежава молекулно тегло повисоко от 3500 Da. Oikawa et al. (1990) са приложили същия метод на екстракция като описания от Lee and Langer, но за по-кратко време (2 дни вместо 41 дни). Антиангиогенното вещество, изолирано от акулов хрущял от Oikawa et al., е ограничено до молекула с молекулно тегло, граничещо от 1000 до 10 000 Da. Schinitsky ( US 4 473 551) описва воден екстракт на суров разпрашен акулов хрущял, чиято фракция от повече от 100 000 Da притежава противовъзпалителна активност самостоятелно или в комбинация с глюкозамин. В този патент няма предложение за създаване на компонент на екстракта, притежаващ антиангиогенна или антитуморна активност. Kuetner et al. (US 4 746 729) са изолирали полиморфонуклеарен неутрофил (PNN) еластазен инхибитор от говежди хрущял. Инхибиторът е получен от воден екстракт на хрущял, от който са получени молекули с молекулно тегло, по-малко от 50 000 Da. Фракционирането на Sephacryl S-200 дава множество фракции, от които тези с 10-40 kd се отделят след като покажат антиеластазна активност. Активният компонент притежава изоелектрична точка 9.5 и вероятно притежава молекулно тегло около 15 000 Da. Kuetner et al. (US 4 746 729) са показали също, че говежди хрущял притежава компонент с молекулно тегло по-малко от 50 000 Da, който проявява клетъчна пролиферационна инхибиторна активност без каквато и да е активност върху ендотелния клетъчен растеж. Balassa et al (US 4 822 607) са получили хрущялов екстракт във воден разтвор, който притежава антитуморна активност. Обаче, ние наблюдавахме липса на антиангиогенна активност в екстракт, получен при възпроизвеждане метода на Balassa. Spilburg et al. (US 4 243 582) са изолирали два гликопротеина с молекулно тегло 65 kd и pl 3.8 от говежди хрущял (гуанидинова екстракция), която показва антитрипсинова активност и инхибираща развитието на ендотелните клетки активност.

Телешкият и акуловият хрущяли притежават много биологични активности, като провъзпалителна активност, антивъзпалителна активност, антиангиогенна активност, лизозимна активност, стимулираща клетъчния растеж активност, инхибиторна активност срещу колагенази от тип I и IV, еластаза, и други протеази като трипсин, химотрипсин и плазмин. Никой все още не е получил екстракт от хрущял, който да притежава ценна за клиниката активност.

Антиангиогенен компонент (и) на акулов хрущял са тествани основно в проба върху заешка корнеална камера или в проба върху пилешка хориоанталоисна мембрана (САМ). До настоящия момент, пълен разпрашен хрущял е бил тестван директно върху тумори in vivo върху човешки меланомен ксенотрансплантант, имплантиран в голи мишки (US 5 075 112), а така също и САМ тестове за техния антиангиогенен ефект. Дори на екстрактите от хрущял да е бил приписан антитуморен ефект, този ефект най-често се е считал като атрибут на антиангиогенния компонент, който лишава тумора от кръвоснабдяване. Досега няма доказателство, че акуловият хрущял притежава директен ефект върху туморната клетъчна пролиферация.

Вече са известни няколко метода за получаване на акулов хрущял. По някои от тях се получава разпрашен хрущял без каквато и да е екстракция (US 5 075 112). Други използват денатуриращи агенти като гуанидин (US 4 234 582). Други методи представят предварително третиране на хрущял посредством ензимно разграждане за освобождаване от всякакви мускулни, нервни или съдови структури, заобикалящи хрущяла, който предварителен етап е последван от отстраняване на мазнини в органични разтворители, и след това активните компоненти се екстрахират във водна фаза. (Balassa et al., US 3 478 146, 4 350 682, 4 656 137 и 4 822 607). Ефектът от такова предварително третиране за съхраняване интегритета на биологично активните компоненти на хрущяла не е известен. Ако е твърде екстензивен, едно ензимно разграждане може да хидролизира активните протеинови компоненти. Методът на Balassa не включва етап на фракциониране, който да доведе до обогатяване на екстракта с активни компоненти. Други просто продуцират водни екстракти (във вода (US 4 473 551) или солени разтвори (US 4 746 729)) на хрущяла чрез елиминиране на неразтворимия материал. Сред последните са получени специфични фракции със специфични молекулни тегла за понататъшно изследване и пречистване (виж дискусията по-горе).

Цитираните по-горе методи притежават няколко недостатъка. Те могат да денатурират някои ценни компоненти. В друг случай те могат да притежават недостатъка да са твърде дълги, за да са определено подходящи. Нещо повече, дългите методи не задължително водят до достатъчни количества от активните компоненти, и сред възстановените компоненти, някои не се възстановяват изцяло или в достатъчна степен, за да покажат забележима активност, а някои са били дисагрегирани чрез фокусиране върху получаване на специфични активности.

Ангиогенезата е включена не само в развитието на рака. Много заболявания или условия, въздействащи на различни физиологични системи (показани в уводната част на текста), са ангиогенетично зависими, сред които са следните примери: артрит и атеросклеротични плаки (кости и лигаменти), диабетична ретинопатия, неоваскуларна гла3 укома, трахома и корнеална трансплантантна неоваскуларизация (око), псориазис, склеродерма, хемангиома и ангиофиброма (кръвна система). Поради това, всеки нов и потенциален антиангионен “фактор” може да намери приложение в лечението на тези заболявания, както и в лечението на рака. Нещо повече, докато много от по-горе отбелязаните заболявания и състояния също притежават възпалителен компонент, всеки нов и потенциален антивъзпалителен “фактор” би могъл да намери приложение при лечение на заболяванията и състоянията, така както при които и да са други възпалителни заболявания или състояния. Освен това докато протеази като колагенази са включени в разнообразието от заболявания и състояния като рак и преждевременно състаряване, поради тяхната колагендеградираща активност, нов и потенциален антиколагенолитичен “фактор” би могъл да намери приложение при лечението на заболявания или състояния с колагенолитичен компонент. Поради ангиогенезата, възпаляване и протеази като колагенази могат да бъдат изброени самостоятелно или в комбинация с голямо разнообразие от заболявания или състояния, ето защо продукт, способен да се противопостави на всички тези активности, без да влияе на нормалните телесни функции, би бил с голяма терапевтична стойност.

Същност на изобретението

Изобретението предоставя нов метод за получаване на екстракти от хрущял, които имат много ценни терапевтични активности. Потвърдено, е че съществуват в задоволителни концентрации в екстракта от акула активности като антиангиогенна, противовъзпалителна, in vivo антитуморна пролиферираща и директна in vitro антитуморна пролиферираща активност. Очаква се да бъдат идентифицирани и потвърдени и други активности. Ефектът, измерен в туморни клетъчни линии показва, че освен директни антитумор пролифериращи активности, се очаква наличие на цитотоксична активност.

Изобретението се отнася до нов метод за получаване на течен екстракт от хрущял, притежаващ по същество част от биологично активни водноразтворими компоненти, намиращи се в интактен хрущял, който включва следните етапи:

a) хомогенизиране на хрущял във воден разтвор в условия, конкурентни със съхраняващите интегритета на посочените биологично активни компоненти, докато хрущялът се редуцира до частици, чийто размер е по-малък от или равен на около 500mm, водещо до получаване на смес от частици и суров течен екстракт, която съдържа посочените биологично активни компоненти;

b) центрофугиране на хомогената за отделяне на частиците от суровия течен екстракт; и

c) по-нататъшно разделяне на суровия течен екстракт за получаване на краен течен екстракт, съдържащ молекули на хрущяла, притежаващи молекулно тегло пониско от или равно на около 500 kDa.

Този нов процес има преимуществото да е лесно осъществим и ефективен. Получени са високи добиви от екстракти на хрущяла, който (специално полученият от акула) съдържа най-малко поне посочените погоре биологични активности. За предпочитане се осъществява при ниска температура (около 0 до 10°), в неденатуриращи условия (за предпочитане в чиста вода), при приблизително неутрално pH (около 6 до 8) за постигане максималната възможност за възстановяване на вещества с непознати физикохимични характеристики. Съгласно този метод компонентите на хрущяла могат да бъдат екстрахирани в малък обем от разтвора (приблизително 1 1 за 1 kg от хрущяла) и след кратък период на хомогенизация (приблизително 10 до 15 min). За получаването на твърд екстракт се използва същия метод, с изключение на това, че утайката се възстановява и лиофилизира, без използване на супернатантата.

Изобретението се отнася до екстракти на хрущял, по-специално екстракти от видове от разред еластобранхиата, и по-специално от акула. Твърдият екстракт показва активност. Той може да съдържа колаген и неразтворими във вода компоненти. Той може да съдържа и остатъчна активност, от която е екстрахиран в течния екстракт. Общият течен екстракт е много високо активен. Той може да бъде използван като такъв или може да бъде концентриран. Предпочита се етап на концентрация, който съх ранява биологичните активности. Методи, които биха влошили активните компоненти като изпаряване при висока температура, внимателно се избягват. Използвана е ултрафилтрация през мембрана с молекулно тегло около 1 kDa за концентриране на течният екстракт съгласно изобретението. В резултат се получава и тества концентриран екстракт, съдържащ молекули с молекулно тегло от около 1 до около 500 kDa. Общият течен екстракт (0 до 500 kDa) по-нататък се фракционира за охарактеризиране на активните му компоненти. Получени са множество фракции по различни методи. Някои от тях, тествани върху туморни клетъчни линии, са охарактеризирани с молекулното им тегло и изоелектрична точка. Други са означени с активност, по-специално антиколагенолитична или антиангигогенна активност. Тези фракции очакват пълното си охарактеризиране и идентифициране. Поради това ценни активности се възстановяват в общия течен екстракт и негови фракции, които могат да се използват с преимущество. Вместо въвеждане на големи количества разпрашен хрущял, сега може да бъде въвеждан по-подходящ и обогатен екстракт.

Изобретението се отнася също и до който и да е терапевтичен или козметичен състав, включващ като активен ингредиент един от горните хрущяли екстракти. От найголям интерес за дерматологията и козметологията са съставите за локално приложение. Този интерес идва от наблюдаваните активности на хрущялите екстракти. Наблюдаваните антиколагенолитични и антивъзпалителни активности, и антагонистичинят ефект на клетъчната диференциация, опосредствена от индукцията на протеинкиназа С в кератиноцити, се счита като отворена улица за използването на акуловите хрущялни екстракти в състави и методи за редуциране на възпаленията, регулиране на кожната атрофия, забавяне на преждевременното остаряване, редуциране на акнето, подобряване на кожната бариерна функция, редуциране на възпалителен или обривен и успокояващ кожата ефект. Подобни методи са в обхвата на изобретението. Нещо повече, доколкото акуловият течен хрущялен екстракт е успешно тестван в случаи на рак, артрит, псориазис и акне, в обхвата на изоб ретението са състави и методи за лечение на заболявания или състояния, подбрани от групата, състояща се от туморна пролиферация, възпаление и колагеноза.

Описание на настоящото изобретение

Изобретението би било по-лесно разбрано посредством специфичните варианти на изпълнение, показани на приложените фигури, чиято цел е да илюстрират изобретението, вместо да ограничат неговия обхват.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 показва инхибиторанта активност на повишаващи се дози от акулов екстракт (твърд екстракт) върху клетки ZR751 и MCF- 7.

Фигура 2 илюстрира кривите на отговарящите на съответната доза количества от MCF- 7 клетки, измерени с тяхното ДНК съдържимо в присъствие на повишаващи се концентрации от естрадиол със или без две концентрации от лиофилизат на хрущяла.

Фигура 3 а) и Ь) показват сравнение на чернодробните сектори на плъхове с развит рак на млечната жлеза, които са третирани с комбинация от лиофилизат на хрущял и супернатанта с такива, на които е приложена само вода.

Фигури 4а) и Ь) показват сравнение на бъбречните сектори на плъх с развит рак на млечната жлеза, които са третирани с комбинация от хрущялов лиофилизат и супернатанта с такива, които са третирани само с вода.

Фигура 5 а) и Ь) показват сравнение на сектори от сливици на плъхове, с развит рак на млечната жлеза, третирани с комбинация от хрущялов лиофилизат и супернатанта с такива, които са третирани само с вода.

Фигури 6 а) и Ь) показват сравнение на сектори от тумор на млечната жлеза на плъхове с развит тумор, които са третирани с комбинация от хрущялов лиофилизат и супернатанта с такива, които са третирани само с вода.

Фигура 7 е хистограма, получена от фигура 6 а и Ь), илюстрираща ефекта на хрущяловия екстракт върху кръвоснабдяващата област в тумори.

Фигура 8 представя електрофоретичният профил при денатуриращи условия в течни фракции, разделени на Rotofor; маркери на молекулното тегло се появяват отляво, последвани от проба на суров приемат преди фракциониране, за сравнение с изолираните фракции.

Фигура 9а) и Ь) илюстрират значителното подобрение на състоянието на двама пациента, страдащи от псориазис, един с хиперкератоза - 9а), а другият - без хиперкератоза 9Ь), при локално третиране със състав, съдържащ ефективно количество концентриран течен хрущялов екстракт (долните фотографии), сравнени с тяхното изходно състояние (горните фотографии).

Фигура 10 показва образци на FPLC миграция на три различни екстракта от акулов хрущял. В частта A, DUP се отнася до течен хрущялов екстракт съгласно изобретението. В части В и С, BAL и OIK се отнася до екстракти от нивото на техниката, Balassa et al. and Oikawa et al., съответно.

Фигура 11 показва HPLC образците на миграция на същите екстракти, посочени във фигура 10.

Фигура 12 показва резултатите от САМ- тестове, осъществени с помощта на различни концентрации на протамин, едно антиангиогенно вещество, сравнено с контрола.

Фигура 13 показва резултатите от САМ- тестове, осъществи с две фракции от общия течен екстракт от хрущял на акула по изобретението (DUP), едната с молекулно тегло по-ниско от 10 000 Da, другата с молекулно тегло по-високо от 10 000 Da.

Фигура 14 показва резултатите от САМ- тестовете, осъществени с общият течен екстракт съгласно изобретението (DUP), сравнен с еквивалентна концентрация от продукт, получен по метода на Balassa (BAL).

Фигура 15 показва резултатите от САМ- тестовете, осъществени с общият течен екстракт съгласно изобретението (DUP), сравнен с проба от еднакво тегловно количество сухо вещество от продукта, получен по метода на Oikawa (OIK).

Фигура 16 показва ефекта от ТРА върху кератиноцити, в сравнение с DMSO контрола, и двете измерени в присъствието или отсъствието на общ течен акулов екстракт, получен по метода съгласно изобретението.

Фигура 17 показва антивъзпалителният ефект на общия течен екстракт съгласно изобретението върху модел на кожно дразнение.

Фигура 18 показва друг образец на HPLC миграция на фракция от общия течен екстракт по изобретението, с молекулно тегло по-ниско от 10 000 Da, която фракция е концентрирана и разделена на пет субфракции.

Фигура 19 показва антиколагенолиптичният ефект на всяка субфракция, показана на фигура 18 при различни обеми за изпитване.

В специфичен вариант на изпълнение, хрущялът е получен от здрави кучешки акули - черна и обикновена (Black Spiny Dog Fish and Common Spiny Dog Fish). Отделена е мускулната и съединителна тъкан посредством остъргване с предварително обработени с етанол скалпели и ножици. Хрущялът след това се вакуумира в пластмасови торбички и се замразява до -20°С за по-нататъшна употреба. Ние избрахме акуловия хрущял по причини, посочени в раздела на описанието ниво на техниката. Счита се, че изхождайки от хрущял на еластобранхиата (която група включва животинските видове акули и скатове), може да се получат приблизително еквивалентни продукти. Продуктите най-вероятно ще са различни, ако като източник се използва хрущял на бозайник.

Може да се използват различни начини на получаване на хрущяла преди неговото използване, доколкото това по същество не влияе на активността на желания продукт (общ течен екстракт или частична негова фракция, например). Някои активни компоненти могат да бъдат устойчиви на протеолитично разграждане, както се посочва от Balassa et al. (US 4 822 607), за да се освободи хрущяла от каквито и да са заобикалящи го тъкани, докато други може да са неустойчиви на такова въздействие. Една от активностите, които очевидно не издържа подобно предварително третиране е антиангиогенната активност (фигура 15). Поради това, ако някои желае получаването на течен екстракт, съдържащ възможно всички водноразтворими активни компоненти, на които се приписват различни активности, такъв етап на разграждане следва да бъде заобиколен или внимателно наблюдаван за предотвратяване на екстензивна хидролиза или протеолиза.

Получаване на лиофилизиран хрущял

Чист хрущял се използва пресен или размразен до 4°С.

Хрущялът след това се прекарва няколко пъти (по-специално три пъти) през порите на обработена с етанол месомелачка заедно със съответен обем вода (еднакво количество (тегло/обем) е приблизително минималния обем, но може да бъде увеличено, без да влияе на добива и възстановяването на ценните компоненти). Малък обем се предпочита, доколкото е по-удобно за манипулиране в сравнение с незадължителните големи обеми, от практична гледна точка. В практиката вода се пречиства чрез обратна осмоза и филтруване през 0.1 m филтър. Биха могли да бъдат използвани много водни разтвори (съдържащи соли, например) вместо вода. При възстановяване на повечето водноразтворими активности, работейки при приблизително неутрално pH и неденатуриращи условия, се предпочита за избягване на лизиса или денатурацията на някои от хрущяловите компоненти. Поведението на непознати протеини във водни разтворители е непредсказуемо; някои могат да бъдат по - “удобни” при кисело pH, някои при неутрално pH. Нещо повече, някои протеини могат да бъдат екстрахирани при меки денатуриращи условия, ако такава денатурация не въздейства необратимо на ренатурацията на протеините във водни разтвори. Провеждането на метод за екстрахиране на активни компоненти на хрущяла в чиста вода е показано, че е разумен избор за възстановяване с много добър добив на компоненти с непозната структура и поведение.

След това сместа хрущял/вода се хомогенизира чрез разбъркване при максимална скорост в кухненски миксер при около 4°С в продължение на десет минути. Скоростта на разбъркване, както и обемът на водния разтвор, може да повлияят на времето на екстрахиране. Поради това, подходящото време за хомогенизация може да бъде от 10 min до 24 h, за предпочитане между 10 и 60 min. Температурата следва да бъде под държана под 10°С, за да се избегне каквото и да е разграждане на активните компоненти от ендогенни ензими, когато не се използват инхибитори. Идеалната температура, която следва да се търси, е 0°С. Експериментирането се провежда в студена стая, при което температурата се поддържа между 4 и 10°С, като този температурен интервал е приемлив в настоящия метод. За по-голяма яснота и краткост, терминът “около 4°С” подолу се използва за обозначаване на подходящия температурен интервал.

Разреждане на хомогената може да бъде получено по-нататък чрез поставянето му в дезинтегратор Polytron в продължение на 10 min при 4°С, ако миксерът не редуцира достатъчно размера на частичките. Обратно, сместа може да бъде хомогенизирана в посилен миксер-дезинтегратор, който спестява 10 min от етапа на разреждане. В края на пълния етап на хомогенизиране, остатъчният размер на частичките е по-малък от около 500 pm. Използват се същите приемливи интервали от време и температура, обсъждани за получаването на първия натрошен хрущял. Размерът на частиците след хомогенизиране не е необходимо да бъде много малък. Необходимостта от разпрашаване на хрущяла преди екстракцията може да бъде избегната. Разпрашването на хрущяла преди водната екстракция може да денатурира ценни активности, когато такова разпрашаване се осъществява в изсушено чрез замразяване или изсушено чрез загряване състояние.

Хомогенатът се центрофугира при 13600 х g в продължение на 15 min при 4°С. Етапът е един от начините за бързо и ефективно разделяне на супернатантата от утайката. Вариантите на пригаждане на тези параметри са във възможностите на специалиста в областта, доколкото зависят от обема на хомогенната и използваното оборудване.

Получената утайка се лиофилизира за 24 до 48 часа. Тази фракция се охарактеризира по-нататък като лиофилизат или твърд екстракт.

Супернатантата може да бъде филтрувана върху филтър на Whatman, ако е необходимо, за освобождаване на частиците, които могат да се използват в ултрафилтраци онна колона. Филтрираният материал след това се подлага на ултрафилтрация при 4°С върху тангенциална филтрационна колона в поток с порьозност около 500 000 Da, което позволява получаването на първия суров пермеат, който съдържа водно разтворими молекули с молекулно тегло от 0 до 500 KDa. Този суров пермеатен екстракт се филтрува стерилно върху 0.22 цт филтър, и се разпределя в стерилни колби за по-нататъшна употреба. Тази фракция по-нататък ще се нарича суров пермеат или общ течен екстракт.

Провежда се центрофугиране на високи скорости за получаване на утайката и супернатантата. Етапът на центрофугиране при 13600 х g за 15 min, последвано от груба филтрация на Whatman филтри се замества с центрофугиране в центрофуга СЕРА, оборудвана с найлонов джоб с порьозност 30цт, при 3000 - 4000 х g. По този начин 25 kg/25 1 от продукта може да бъде центрофугиран в рамките на 30 min за получаване на 29 1 от супернатантата. Полученият воден обем е повисок от изходния обем на водата, което предполага, че е събрано част от водното съдържимо на хрущяла. Лиофилизатьт и общият течен екстракт може да имат приблизително следния състав, в който най-общо се имат предвид вариантите, наблюдавани от етап на етап, и при използване на различен материал:

ЛИОФИЛИЗАТ:
Липиди	7.35%¹
Протеини	46.2%²
Влажност	20.4%
Натрий	4.16 mg/g³
Калий	2.64 mg/g
Калций	114 mg/g
Магнезий	1.49 mg/g
Цинк и желязо -	в следи
ОБЩ ТЕЧЕН ЕКСТРАКТ:
Липиди	0.10-0.20%¹
Протеини	8-25 mg/ml²
Влажност	97-99%
Натрий	30 - 220 mg/100 g^:
Калий	30 - 40 mg/100 g
Калций	2.0 mg/100 g

Магнезий 1.1 mg/100 g

Цинк и желязо - следи ¹² - Измерено, следвайки инструкциите, публикувани в АОАС Official (1984) sections 16.219-220 и 2.055, съответно;

³ - Измерено, следвайки инструкциите за SAA процедурата.

Протеиновото съдържимо се измерва по метода на Kjeldahl, който измерва органичния азот (N). Органичният азот се превръща в еквивалентен протеин с помощта на следното уравнение;

% N х 6.25 Протеиново съдържимо (mg/ml) =---——

Въглехидратите, които не могат да бъдат установени, може да се предположи, че присъстват в един или друг екстракт, но под формата на протеогликани и/или мукополизахариди. Възможно е тези вещества да са включени в нивото на измерената влажност. Лиофилизатьт съдържа неочаквано ниво на влажност, което е измерено чрез ОНгрупите. Тъй като 20%^та водно съдържимо е близко до процента въглехидрати, обикновено възстановявано в хрущяла, докато влажността на лиофилизата следва да бъде близко до 0%, тази хипотеза остава да бъде доказана.

Стерилността се контролира, като се прилага USP XXIII спецификации чрез:

1) Laboratorie de genie sanitaire du Quebec Inc. 1090, 1, Escabot, Centre Industriel St-Malo, Quebec GIN 4J4; и

2) Northview Laboratories Inc. 1880, Holste Road, Northbrook, IL, 60062 usa FDA registration no. 14-18028.

Изследване на активността:

ЛИОФИЛИЗАТ:

In vitro проби:

Тези проби се провеждат върху хормонално зависими ракови клетъчни линии MCF-7 и ZR75- 1 ( АТСС) номера 22- НТВ и 1500 - CRL, съответно).

ZR75-1 клетки

Основна RPMI среда g RPMI 1640 без фенол ред (Sigma R8755), 17.875 g Hepes (свободна киселина; Sigma НО763), 0.55 g натриев пируват (Sigma Р5280) и 10 g NaHCO₃ се смесват в 5 L чиста вода и pH се довежда до 7.40 с NaOH.

Ако не се използва незабавно, този разтвор трябва да бъде защитен от светлината за съхраняване на чувствителните на светлина компоненти. Разтворът се филтрира, разпределя се в 500 ml стерилни проби и се съхранява при 4°С за максимален период от време 3 месеца.

Среда за съхраняване на клетъчните култури:

Основна RPMI среда се замества с 10% (v/v) FBS (зародишен телешки серум), 100 U пеницилин G/50 g стрептомицин сулфат (Sigma РО906)/ ml среда, 2 тМ L-глутамин (Sigma G1517) и пМ Е2 (β -естрадиол Sigma Е8875).

Експериментална среда:

Основна RPMI среда се замества с 5% FBSA (зародишен телешки серум, абсорбиран върху декстран- активен въглен), 2 mMLглутамин, 100 U пеницилин G/50μg стрептомицин сулфат/ ml среда и 50 ng/ml инсулин (Sigma). Към тази среда се добавят повишаващи се концентрации от по-горе описания лиофилизат, а така също и различни концентрации на естрадиол (10’^12д°’⁵М).

MCF-7 клетки

Основна DME-E12 среда

DME-E12 среда (без бикарбонат и без фенол ред; Sigma) се възстановява съгласно инструкциите на производителя в чиста вода. За един литър се добавят 1.2 g натриев бикарбонат и pH се довежда до 7.40 с NaOH/HCl. Разтворът се филтрира, разпределя се в 500 ml стерилни колби и се съхранява при 4°С за максимален период от 3 месеца.

Среда за съхраняване на клетъчните култури

Основна DME-E12 среда се допълва с 10% BS (зародишен телешки серум), 100 U пеницилин G/50 g стрептомицин сулфат/ ml среда 2 пМ L-глутамин (Sigma) и1 nM 1¾ (естрадиол).

Експериментална среда:

Основна DME- F12 среда се допълва с

5% FBSA (зародишен телешки серум, адсорбиран върху декстран- активен въглен), 2 mM L- глутамин, 100 U пеницилин G/50 g стрептомицин сулфат/ ml среда и 50 ng/ml инсулин (Sigma). Както е описано за ZR75-1 клетките, лиофилизат и естрадиол, се добавят при същите концентрации.

Изготвяне на FBSA:

Зародишен телешки серум се смесва с 1% (т/о) дървесен въглен (въглерод, избистрящ алкални). Разтвор на декстран Т70 се добавя към въглерод- серумният разтвор за достигане на концентрация 0. 1% (т/о). Сместа се бърка в продължение на една нощ при 4°С. След центрофугиране при 4С за 30 min при 10 000 х g, серумът се отдекантира, смесва се отново в същите пропорции на въглен и декстран, разбърква се при стайна температура в продължение на 3 h и отново се центрофугира. Серумът след това се инактивира чрез нагряване до 56°С за 20 min, филтрува се стерилно и се разпределя в стерилни конични фалконови епруветки.

Клетки ZR75- 1 и MCF- 7 се култивират за достигане на плътност на популацията 20 000 клетки/ ямка върху 24-ямкови плаки или 150 000 клетки/ямка върху 6-ямкови плаки, и се третират в присъствие или отсъствие на различни концентрации лиофилизат, както е изготвен по-горе. Лиофилизатът се ресуспендира в културална среда и се филтрира стерилно, така че да се възстановят водноразтворимите компоненти и да се тестват. Всички експерименти се провеждат трикратно. Културалната среда се отделя и замества с прясна хранителна среда всеки 2 дни. Клетките се култивират в инкубатор в атмосфера с постоянна влажност, съдържаща 5% СО₂, при 37°С, за 17, 7, 3 или 3 дни, съответстващи на първи, втори, трети или четвъртите експеримент, съответно. Инхибирането на клетъчния растеж се измерва чрез директно изброяване на клетките или чрез измерването на общото ДНК съдържимо в една ямка.

Концентрация на	Клетъчно инхибиране (%)
лиофилизата	MCF-7	ZR75- 1
1^Ви експеримент: 17дни
1 mg/ml	1.5	2.00
5 mg/ml	14. 33	33.6
10 mg/ml	62. 66	90.8

1 mg/ ml	3. 73	0. 97
5 mg/ml	15.7	29.00
10 mg/ ml	68. 37	66.00
З^ти експеримент: 3 дни
50 mg/ ml	95.8	95.00
100 mg/ml	94.6	98.00
4^mu експеримент: 3 дни
10 mg/ml	34.4	51.5
20 mg/ ml	62.5	70.5
50 mg/ml	95.8	95
100 mg/ ml	94.6	98

Посоченият процент на инхибиране на клетъчния растеж показва, че лиофилизатът може да инхибира в зависимост от дозата растеж на клетките от тези две клетъчни линии.

Фигура 1 показва, че дозите от 50 и 100 mg/ml от лиофилизата ясно провокират хипоплазия на тези клетъчни линии, след 3 дни от третирането.

Фигура 2 показва, че в присъствието на 10¹² до ΙΟ’⁹ М естрадиол, третираните клетки отговарят като контролни клетки, които не са стимулирани в тези хормонални граници. Независимо от това, над 1 пМ, контрол ните клетки силно се стимулират, и концентрацията на ДНК достига 3. 75 ug в присъствие на 10⁷ М естрадиол (срещу 0.69 ug в контролата без естрадиол). В клетки, третирани с 30 и 50 mg/ml лиофилизат, измерената при максимално стимулиране ДНК е

1.9 и 1.8 pg, съответно.

Фигура 2 показва, че афинитетната константа (Km) на третираните клетки за естрадиол е 3 и 16 пъти по-висока (31.3 пМ и 174.0 пМ), в сравнение със стойността на Km от контролните клетки (11.7 пМ), в присъствието на 30 и 50 mg/ml, съответно. Това означава, че по-високи концентрации на ес традиол са необходими за достигане на същия ръст на клетките, когато се използва лиофилизиран твърд екстракт на хрущял. Поради това този екстракт понижава максималният отговор (90% инхибиране) и пови- 5 шава афинитетната константа на третираните клетки спрямо естрадиола.

In vivo изпитване:

Четиристотин 40-дневни женски плъхове от порода Sprague-Dawley (закупени от 10 Charles River Co., St- Constant, Quebec) ce адаптират към околната среда за 12 дни. Към това време се дават 20 g DMBA/1 1 царевично масло (9, 10-диметил- 1,2-бензантрацен, закупен от Sigma Chemical Co.). Три месеца 15 след това третиране се подбират 240 плъха с развит рак на млечната жлеза и се разпределят в две групи. Първата група се състои от 5 подгрупи плъхове. На плъховете от третираните групи се дават дневни дози с по- 20 вишаващи се концентрации от лиофилизиДавани дневни дози хрущялни екстракти

1^и експеримент: продължителност седмици

500 mg/kg/дневно

1000 mg/kg/дневно 3000 mg/kg/дневно 5000 mg/kg/дневно

2^ри експеримент: продължителност седмици

3000 mg/kg/дневно 3000 mg/kg/дневно супернатанта 3000 mg/kg/дневно супернатанта супернатанта

Тези резултати показват, че лиофилизатът съдържа активна компонента, която се абсорбира в гастроинтестиналния тракт и която влияе на размера на тумора. Това въздействие би могло да бъде директно върху туморните клетки или опосредстващо антиангигогенезиса въздействие. Тези резултати също показват, че супернатантата притежава активност, която се отразява на допълни рания екстракт в 3 ml вода за 8 седмици, докато контролната група получава същия обем вода. На плъховете от третираните групи се дава също дневна доза от лиофилизата в 3 ml вода, комбиниран със или без супернатантата, за 10 седмици, докато контролната група получава същия обем вода. Само на една подгрупа от втората група плъхове, третирани с концентрация 3 000 mg/kg дневно от лиофилизата и 3 ml от супернатантата, също се прилага интраперитонеална (i.p) инжекция на малка доза от супернатантата (около 8 mg протеин в 1 ml вода).

В началото на двата експеримента плъховете тежат 151-175 g и получават храна и вода ad libitum. Първата група плъхове имат тумори със среден диаметър 0.9 cm, докато втората група притежава тумор със среден диаметър 0.6 cm.

Резултатите са обобщени, както следва:

% инхибиране на туморен растеж (намаляване диаметъра на тумора спрямо контролата)

2%

4%

14%

15%

12% + 3 ml 18% + 3 ml 20% + 1 ml inj. I.p.

телното редуциране на туморния размер, възлизащо на около 5%.

Тези резултати показват също, че лиофилизатът може да съдържа активни компоненти, които не са водно разтворими и/ или че може да съдържа остатъчна разтворимост във вода. Поради това, като последна възможност, може да се приеме, че утайката би могла да бъде реекстрахирана във воден разтвор за възстановяване на водно разтворими компоненти максимално, ако добивът може още да бъде подобрен.

ХИСТОПАТОЛОГИЯ

За оценка на нетоксичността на активните молекули от хрущялния екстракт, животните, използвани в горните in vivo експерименти се умъртвява чрез декапитация и за анализ се взимат следните тъкани: черен дроб, сливици, бъбреци, сърце, мозък, мастна и млечна жлези. Масти се взимат извън тези тъкани, след като се фиксират за два дни в течност на Bouin. След дехидратиране в етанол, фиксираните тъкани се монтират на стъклени слайдове, оцветяват се с хематоксилин и се визуализират под микроскоп.

Хистологичното изследване показва, че не се наблюдава ефект на унищожаване при използване на по-големи дози лиофилизат самостоятелно (данни не са показани) или при използване на лиофилизата в комбинация със супернатантата (виж фигури За и Ь, 4а и Ь, и 5а и Ь).

Това предполага, че лиофилизатът и супернатантата имат селективна туморрегресивна активност.

В тумори на млечна жлеза (виж. фигури 6а и Ь) се наблюдава значимо намаляване на областта на кръвоносните съдове. Антиангиогенният ефект на тези активни молекули след това се потвърждава от резултатите, както се илюстрирани и обобщени на фигура 7.

Фигура 7 показва, че когато се използва комбинация на лиофилизат (р.о)- супернатанта (р.о + i.p) (отнеси се до фигури 6а и в) наблюдава се 55%-но намаление на областта от кръвоносни съдове в тумора.

Намаляването на размера на тумора може да се дължи на значително понижение на васкуларизацията му, на директно въздействие върху туморните клетки, или на комбинация от двата феномена. Антиангиогенният ефект на тези екстракти е добре описан по-горе. Директният хипоплазен ефект се наблюдава in vitro върху хормонално зависими клетки, което остава да бъде потвърдено in vivo.

Тъй като посочените по-горе резултати показват, че супернатантата има повишен ефект над и повече от ефекта на лио филизата върху ZR75- 1 клетки, неговите компоненти се изследват по-нататък.

ПОЛУЧАВАНЕ НА ТЕЧНИ ФРАКЦИИ, СЪДЪРЖАЩИ АКТИВНИ МОЛЕКУЛИ

Събира се акулов екстракт и се обработва, както е посочено по-горе. След центрофугиране утайката се отстранява и супернатантата се обработва по същия начин, както е описано до етапа на стерилна филтрация върху 0.22 μπι филтър.

Супернатантата по-нататък ще бъде отнасяна като суров пермеат, т.е. продукта след ултрафилтрация.

Така полученият суров пермеат се подлага на течна хроматография - FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).

Условия на провеждане на FPLC

Колона: Hiload 26 х 60 cm Sephacryl S- 300 FPLC система: от Фармация

Всички проби се филтруват върху 0.22рш филтър преди натоварване върху колоната. Еулационният буфер е фосфатен буферен разтвор (PBS), филтриран и дегазиран в продължение на 15 min. Обемът на натоварената проба обикновено е 3.2 ml (може да е до 13 ml). Скоростта на потока е 1 ml/min. Фракциите от по 10 ml се събират. Елуираните вещества се откриват по тяхната UV абсорбция (280 nm). Калибрационната крива се получава с MW-GP- 1000 калибрационен кит от Sigma, като тази калибрационна проба притежава същия обем, както натоварената проба за анализ (3.2 ml). Елуационният обем на пробата се извежда от съпоставяне на молукелното тегло на веществата от калибрационния кит с техния елуационен обем, от които се изважда празния обем на колоната. Празният обем се получава чрез инжектиране на декстран блу (M.W - 2000 000).

Фракциите се изпитват върху ZR75-1 клетки за тяхната активност. Желаните фракции се идентифицират и техните характеристики се установяват чрез по-нататъшно изследване.

Допълнително охарактеризиране на активните компоненти на пермеата се осъществява върху Rotofor (Biorad 170-2950; виж изоелектрофокусиране по-долу) и върху филтри Amicon с различни стойности на порите за получаване на фракции с молекулно тегло между 10-30 KD, 30-100 KD и повече от 100 KD.

И зоелектрофокусиране:

Препарат на акулов хрущял (46 от пермеата 1 kg/m) се диализира в продължение 5 на една нощ срещу 4 литра чиста вода, съдържаща 5% глицерин при 4°С с помощта на мембрана Spectra pore # 7 MWCO 3500 KD (Spectrum 132110). Диализираният разтвор се смесва с 2.75 ml амфолити (Phrmacia 10 # 80- 1125-87) pH 3.5- 10.0 и 0.5 g CHAPS (Sigma С3023; 3- [ (3-холамидопропил) -диметиламино] -1-пропан-сулфонат). Обемът се допълва до 55 ml с чиста вода. Разтворът се натоварва на Rotofor. Изоелектрофокусирането се провежда при 4°С, при постоянна сила на тока 12 W (3000 xi сила- Biorad 1650554), при постоянна водна циркулация за осигуряване на постоянна температура. В началото на разделянето, волтажът е 380 V, а ампеража- 31 mA. Когато амперажът се стабилизира при (14 mA), волтажът достигна 870 V. Изоелектрофокусирането спира и се събират 20 фракции.

ФРАКЦИЯ	ОБЕМ (mL)	pH
1	3.7	3. 56
2	2. 1	4. 01
3	2.2	4. 18
4	2.3	4.31
5	2.2	4. 63
6	2. 1	5. 03
7	2.5	5. 30
8	2. 1	5. 50
9	2.4	5. 81
10	2.5	6. 26
11	2.3	7.00
12	2.4	7. 29
13	2.4	7. 64
14	2.5	7.94
15	2.3	8. 32
16	2.5	8.62
17	2.4	8. 94
18	2.9	9. 30
19	3. 1	9. 88
20	3.6	10. 71

Идентифицирането на тези протеини се осъществява чрез изпитване на тяхното молекулно тегло върху гел за електрофореза (Laemmly, U.K. (1980) Nature (bond.) 227:680).

Тези фракции се разреждат четирик- 5 ратно с буфер (виж Laemmli) и 8 μΐ равни части се подлагат на електрофореза в нередуциращи условия.

Фигура 8 показва електрофоретичния профил на всяка фракция и на материала 10 преди изоелектрофокусирането.

Всичките фракции се бутилират стерилно в ламинарен поток чрез прекарването им през стерилен Millipack- 60 филтър с размер на порите 0. 22 pm. 15

Протеиновото съдържимо на фракциите се определя по метода на Lowry. Разтвори от 1 kg/2 1 (изразено като тегло на суров хрущял за литър от пермеата) се изпитват върху клетки ZR75- 1 при различни концентрации в културална среда.

Резултатите са обобщени както следва:

ри тесу

Пермеатът се лиофилизира, ресуспендира в PBS, и се прекарва през FPLC. Не се наблюдава ефект на хипоплазия (данни не са показани).

2^ри тест.

Изпитванията се осъществяват на Rotofor фракции (Пермеатът се концентрира чрез изпаряване): Идентифициране на протеин

Идентифицирани фракции	Изоелектрична точка	Средни стойности	Молекулно тегло
7-8-9-10	5.30 до 6.26	5.78	29 ± 1 Kd
7-8-9	5.30 до 6.26	5.68	60 ± 1 KD
12-13-14	7.29 до 9.24	7.62	48 ± 1 KD
13-14	7.64 до 7.94	7.79	35 ± 1 KD

3™ Тест, осъществен на FPLC фракции. Пермеатът е концентриран чрез изпаряване.

4™ тест, осъществен на 100 μΐ фракции, получени на молекулни филтри Amicon.

Фракции и 7

Молекулно тегло

-2.5 KD

Изпитвани концентрации	Молекулно тегло	Инхибиране на ZR75 1 клетъчни култури
100 pg/ml	MW > 100 KD	64%
100 pg/ml	30 KD < MWC100 KD	114%
100 pg/ml	10 KD < MW < 30 KD	127%
400 pg/ml	MW < 10 KD	149%

FPLC фракции 6 и 7 съдържат активни компоненти с много малко молекулно тегло 1 до 2.5 KD.

Ефектът на хипоплазия на фракциите може да бъде до 33 000 пъти по-голям от 5 този, наблюдаван с лиофилизата. Посочените резултати показват, че лиофилизацията вероятно провокира известна загуба на пряка антитуморна активност на протеините, съдържащи се в елуата, докато такова уни- 10 щожаване не се наблюдава с лиофилизата на твърдия екстракт. Това предполага, че активните компоненти, включени в хрущялните частици, очевидно са в такава окръжаваща ги среда, че те са по-малко чувстви- 15 телни и денатуриращия ефект на лиофилизацията. Тъй като хипоплазната активност

Фракции 20 - 21

Фракция 22

Фракции 29 - 32

Фракции 34-35

Фракции 38 - 39

Специфичност 40

За оценка спецификата на активността върху туморни клетки, полученият след ултрафилтрацията пермеат се изпитва върху произхождащи от мезенхима клетки, човешки TENON фибробласти (HTFs), които 45 са нормалните фибробласти.

В. In vitro

а. Пациенти

Използвани са само HTFs от двама пациента (един с неоваскуларна глаукома, NVG, 50 и другият с първична open angle глаукома, POAG).

е чувствителна на лиофилизация, когато се възстановява във вода, вероятно добавянето на стабилизатори или защитни агенти към общите екстракти или към определена фракция, съдържаща тази активност преди лиофилизацията, би съхранила активността.

По-нататъшно идентифицираен на активните компоненти от елуата:

Активните фракции (изпитвани върху ZR75- 1 клетки) се възстановяват в следния интервал от молекулни тегла, определени с друг тип на пречистване, започвайки със същия пермеат (1 kg/Ι) върху Сефароза- 12 колона с 10 mm диаметър х 30 cm дължина с помощта на FPLC и ротофорни процедури, описани по-горе. Скоростта на потока се подбира на 1 ml/min.

Събират се 45 фракции от 1 ml.

активност във фракции, съответстващи на молекулно тегло 70 до 120 KD активност във фракции, съответстваща на молекулно тегло от 60 до 70 KD активност в припокриващи се фракции, съответстващи на молекулно тегло от 35 до 46 KD активност във фракции, съответстващи на молекулно тегло 29 KD активност, съответстваща на молекулно тегло от 1 до 2.5 KD.

Ь. Субкултивиране и съхранение на HTFs

Всяка слята култура се пасира чрез промиване и отделяне с 0,5 ml 0,05% трипсин/ 0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) за 5 min при 37°С. 1. 5 ml DME/F-12 среда, съдържаща 15% фетален телешки серум (FBS) след това се добавят за неутрализиране на трипсин/EDTA.

Асоцииране на клетките се прави чрез стриване и прехвърляне в 25 cm³ Т-колби, в които се добавя допълнителна среда, съдържаща 10% (FBS). След като се достигне сливането, HTFs се прехвърлят в 72 ш² и евентуално, в 180 cm² Т-колби. Когато бъдат получени достатъчно клетки, някои от тях се използват за експерименти, както е описано по-долу, като едновременно с това други се замразяват за съхраняване на идентични пасажи за бъдещи експерименти.

С. Експериментални протоколи

Когато се достигне сливане, клетки от един пациент, развивали се в две или три идентични 180 cm² Т-колби се дисоциират по методите, описани по-горе. След кратко центрофугиране на ниска скорост, те се преброяват с ZM1 Coulter Counter 216013, снабден с 256-Channelyzer.

За всички последвали in vitro експерименти, приблизително петдесет хиляди клетки се инокулират в 1 ml DME/F-12 среда, съдържаща 1 % FBS във всяка 16 mm паничка и 12кладенчова пластина. Седемнадесет часа (hrs) след посяването, се добавя 1 ml прясна идентична среда, заместена с 1 % FBS (“абсолютни” контроли). В зависимост от вида на експеримента (виж по-горе и по-долу), 1 % -та FBS среда се замества или не с GFs (Growth Factors) или с разтвор на пермеат 1 kg/21 (тегло хрущял/обем на водата) и се филтрува стерилно. На този ден (ден 0) някои клетки също се преброяват за определяне достатъчно ефективно ли е осъществено покриването (което следва да бъде еднакво или по-голямо от 95%.

h след поставянето на експериментите, клетките се промиват и дисоциират по по-рано описаните процедури и отново се преброяват. Броят на клетките се изразява като процент от получените в “абсолютните” контроли.

Всяка абсолютна или позитивна контрола, съдържаща 1% или 5% FBS, съответно, и всяка експериментална група, заместена с 1 % FBS и с отделен GF или хрущялен пермеат, се състои от тройни проби.

Всеки експеримент се провежда върху клетки от един или двама пациента едновременно, и се повтаря поне два пъти.

Стимулирането на фибробластната пролиферация чрез растежни фактори (GFs) или хрущялен пермеат се сравнява със стимулирането му с 5% FBS.

В тези експерименти GFs, се добавят свински растежен фактор (pPDGF) и човешки рекомбинантен основен фактор на растежа (hr bFGF) (подарък от Dr. Р. Brazeau om Farmitalia Carlo Erba, Milan, Italy) в концентрации от 10 до 100 ng/ml в 1% FBS, съответно. 48 h след поставянето на експеримента, клетките се диспергират с TripsinEDTA и се преброяват на брояч Coulter. Всички тройни стойности (колони 1, 2 и 3) се равняват на 1/12 част от преброеното в една ямка.

Пациент В: Глаукома Пол: Мъжки Възраст: 53

HTF

Ден-1: брой на клетките за една ямка: 46170

DME/F12 -1% FBS -1% Пениц. Стрепт.

Ден 0: брой на клетките за една ямка: 65214

DME/F12 - 1% FBS - 1% Пениц. Стрепт.

Ден 1: брой на клетките за една ямка: 62548

DME/F12 -1% FBS -1% Пениц. Стрепт.

Ден 2: брой на клетките за една ямка:

		DME/F12 -1% FBS - 1% Пениц. Стрепт.	Брой клетки/ изброено
		проба/	1	2	3	AVE	SEM	%
		плака						контро
								Λ
								на
								растеж
		DME/
		F12
Пласт. 1	1	ДенО	3. 019	2. 862	2.853	65. 214	71
FBS		1% FBS
	2	Ден+1	2. 711	2. 973	2. 693	62. 548	1. 655
		1% FBS
	-			.	.
	3	Ден +2	2. 284	2.400	2. 191	51. 333	1.655	100
		1% FBS
	4	Ден +2	3.084	2. 834	3. 115	67.446	1.627	131
		5% FBS						η
			.		-	-	-	-
Пласт.2		DME/
PDGF		F12
	5	Контр	2.558	2. 181	2. 216	51. 931	2.199	100
		(1%FBS
	6	lng/ml	2.425	2. 580		56.056	1.228	108
	•	1%FBS
	7	10ng/ml	4.080	3. 975	4.282	92.116	1.648	177
		1%FBS						TTt
	8	100	4.625	4.356	4.450	100.285	1.442	193
		ng/ml						ТТТ
		1%FBS

			•			-
Пласт. 3		DME/
b-FGF		F12
	9	Контр	2. 915	2.533	2. 502	59. 360	2.429	100
		1%FBS
	10	1 ng/ml 1%FBS	2. 744	2.554	2.761	60.174	1. 213	101
	11	10 ng/ml 1%FBS	3.606	3.143	3. 193	74. 234	2.683	125-
	12	100ng/m 1 1% FBS	4.064	3.033	3. 026	75. 585	6. 307	127

Пласт.4	DME/
Хрущял		F12
1kg/21	13	Контр.
филтру		1% FBS
Ban
	14	1 μ]/ ml
	15	10 μΐ/ml
	16	100

μΙ/ml

2. 826	2. 566	2.486
2. 729	2.576	2. 575
2. 643	2.493	2.584
2.918	2.883	2. 766

58. 822	2.877	100
58. 837	936	100
57 643	798	98
58.483	2.461	99

1% FBS

T t P < 0,02

111 P < 0,01 Определено по теста на Student-Fisher.

Докато растежни фактори като PDGF и bFGF показват стимулираща активност върху HTFs, не е наблюдаван ефект, положителен или отрицателен, когато тези клетки се култивират в присъствието на хрущялов пермеат (1 kg/21). Не може да бъде наблюдаван ⁴θ и ефектът на хипоплазия. Това предполага, че пермеатът притежава хипоплазен или цитотоксичен ефект, който е специфичен за туморните клетки, който не може да бъде открит в нормални клетки. Същият хрущялов екстракт не оказва въздействие върху друг тип фибробластни клетки, HSF-човешки кожни фибробласти (Human Skin Fibroblasts; данни не са показани). Макар и да не е тестван, предполага се че лиофилизатът също не προявява въздействие върху нормални клетки.

Сравнение с продукти от нивото на техниката

Уникалният характер на течния екстракт се потвърждава от акулов хрущял, изготвен чрез настоящия метод в сравнителни тестове с два продукта, описани или изведени от нивото на техниката, наречени продукти, изготвени по методи на Balassa (US 4 822 607) и Oikawa et al. (op. cit.). Oikawa et al. описват метод, чрез който се получават две основни фракции, една с молекулни с мол.тегла от 1 до 10 kDa, а другата с компоненти, по-тежки от 10 kDa. Те посочват антиангиогенни свойства само за първата фракция, а за другата се казва, че е лишена от каквато и да е антиангиогенна активност в САМ теста. За адекватно сравняване на продуктите на Oikawa ние фракционирахме нашия общ течен екстракт в две съответстващи фракции и получихме едната с 1 до 10 kDa. Balassa описва метод за екстрахиране на общ течен екстракт, съгласно изобретението е сравнен общ течен хрущялов екстракт (1 до 500 kDa) с продукта, изготвен чрез възпроизвеждане метода на Balassa, замествайки телешкия хрущял с акулов хрущял като изходен материал. Приема се, че ако Balassa и Oikawa описват еквивалентен процес, образците, получени върху FPLC и HPLC следва съществено да се препокриват, и че продуктите, когато са тествани в САМ теста, следва да покажат сходна активност съгласно изобретението. Всички проби са направени до крайна концентрация от 12 pg/ pl (сухо тегло) преди FPLC и HPLC хроматографиите. Продуктът на Oikawa се центрофугира и филтрува преди хроматографирането, тъй като той съдържа неразтворим материал.

A) Условия за FPLC: Супероза 12 (Pharmacia); гел проникваща колона.

B) Условия за HPLC: колона CS-S-хексил 5рт, 25 х 0,94 cm, CSC#059-085; обратно-фазова колона.

Пробите от акулов хрущял, екстрахирани по три метода, се бележат (с изпитано сухо тегло за един обем от разтвора) както следва:

1) DUP е продуктът по настоящото изобретение, фрикциониран да съдържа молекули между 1 до 500 kDa (12 pg/μΙ);

2) BAL е продуктът съгласно рецептата на Balassa et al. (12pg/pl);

3) OIK е продуктът на фракция 3 съгласно Oikawa et al. (270 pg/pl). Всички проби се довеждат до крайна концентрация от 12pg/p 1 (сухо тегло/за един обем) преди всеки анализ. Пробата OIK има голямо количество неразтворим материал, който може да бъде утаен чрез центрофугиране при 13 200 RPM или чрез филтруване през 0,2рт мембрана. Филтруването или центрофугирането на неразтворим материал бе от съществено значение преди FPLC и HPLC (А, В).

А) Обобщени FPLC резултати Пробите се пропускат през Superose 12 (10/30) гел проникваща колона с фосфатно буфериран разтвор (PBS) като елуент при ниска скорост на потока от 0,5 ml/min (скорост 0,25 cm/min). Аликватни части от по 100 μΐ от проби с коригирана концентрация се филтруват през 0,2 pm мембрана преди инжектирането. Наблюдава се OD280.

Колоната се калибрира със следните стандарти (MW в далтони): каталаза (232 000), алдолаза (158 000), албумин (56 000), овалбумин (44 000), химотрипсин (25 000), рибонуклеаза (13 000), инсулин (5 700), инсулин В верига (3 500), инсулин А верига (2 500), бацитрацин (1450), витамин В-12 (1355). Молекулните тегла на големите пикове са изчислени по следното уравнение: Log₁₀MW=7,52-0,212xRT, където RT = на елуационния обем в mL.R²=0,976. Общият обем на колоната (V_T) е 21,93 ml, както е определено с помощта на цитидин (246 Da). Празната проба (V_o) е определена на 8,38 mL с декстраново синьо (2 n 10⁶Da).

На фигура 10а) проба DUP има първи голям пик (1), който елуира при 18,76 mL, което дава молекулно тегло от 3 500 Da. Последващите пикове при 22,7 (2) и при 27,3 ml (3) са след общия обем на колоната (21,93 ml, както е определено с цитидин). Тези пикове изглежда имат известен афинитет към матрикса на колоната.

На фигура 10 Ь) пробата на Balassa BAL има малък пик (1), елуиращ в близост до V_o от колоната (8,4 ml), пик (2) при 18,5 ml (4000 Da) и два пика, елуиращи след V_t, (3) 22,6 min и (4) 28,2 ml.

На фигура 10 с пробата на Oikawa OIK също ш*а малък пик (1) при V_o, пик (2) при

18,9 ml (3300 Da), пик (3) при 21,5 ml (1000 Da) и малък пик (4) при 27,3 ml.

При сравняване на пробите се забелязва, че извън пика 3300 Da не се наблюдава същата интензивност на големите ивици от DUP пробата в другите проби. Очевидно OIK пробата има малко количество от 27,3 ml пик. BAL пробата притежава пик, мигриращ при 28,2 ml, който може да корелира с един от малките пикове в DUP пробата.

В) Обобщени резултати от HPLC

За HPLC върху хексил-обратнофазова колона, OD210 и OD280 се наблюдават едновременно. 50 μΐ аликвотни части от центрофугираните проби (всички при 12pg/ml) се натоварват и елуират със 100% вода. Пи ковете за всяка хроматограма, белязани съгласно OD210 (eg. 1) и съответните OD280 пикове се отбелязват с “(eg. 1)”. V_o на тази колона е 5,5 ml (1,4 min).

На фигура 11а) DUP има 3 големи пи- 5 ка, които се наблюдават чрез OD210 (1, 2, 3) и 2 малки пика (4, 5). Извън пик 1 се наблюдават 2 странични пика, отбелязани като 1а и lb. Значително OD280 адсорбиране се свързва с пикове 1, la, lb и 3. За сравнение, 10 съответстващата OD280 адсорбция за пик 2 е твърде малка спрямо OD210.

На фигура lib) BAL показва повече OD210 пика, но интензивностите са по-ниски в сравнение с DUP пиковете. Доколкото 15 припокриването на пиковете би могло да даде индикация за идентичността на молекулите, само пикове 3 и 7 в пробата на Balassa очевидно корелира с времето на съхраняване на пиковете в DUP пробата (пик 1а и lb и 20 пик 4, съответно).

На фигура lie) са наблюдавани само три големи пика (1, 2, 3) в OIK екстракта. Пикове 1 и 3 могат да съответстват на пикове 1 и 3 от проба DUP, но не са наблюдава- 25 ни странични пикове от 1 в OIK хроматограмата. Височината на пиковете в проба OIK е по-ниска от тази на DUP. Дори образците на FPLC и HPLC да са характерни за различни продукти, ние доказахме антиангио- 30 гениите активности на трите продукта в САМ тестове.

САМ тест:

САМ тестовете са първите, проведени с помощта на различни концентрации про- 35 тамин (37, 75 и 150 g). Метилцелулозен диск, съдържащ вода и друг диск, съдържащ протамин като позитивна контрола, се поставят върху хориоалантоисната мембрана на пилешки ембрион (п = брой на анализираните 40 ембриони). Върху всеки диск се поставя Опръстен за улесняване на тяхната локализация. На следващият ден нивото на васкуларизация във всеки О-пръстен се отчита от двама учени по обичайната сляпа проба. Ска- 45 лата за определяне за CAM-теста се базира на деления 1-2-3 (едно деление = 3). Нормалната васкуларизация, сравнена с противоположния хоризонтален квадрант или квадранта за маркиране на контролния зародиш; 50 (деление = 2). Кръвоносните съдове влизат в О-пръстена, но изчезва при направление сред но. Големи кръвоносни съдове пресичат Опръстена, но тяхната траектория е повлияна. Понижено разклоняване, намалена васкуларна област на квадранта в близост до О-пръстена; (деление 1). Няма кръвоносни съдове или изкривени кръвоносни съдове вътре в О-пръстена. Кръвоносни съдове не се развиват зад О-пръстена, ако те го заобикалят и отиват зад него. Васкуларната област на квадранта ясно намалява в близост до О-пръстена. На фигура 12 стойностите над всяка колона показват крайното отчитане на всяка проба. Статистическият тест на Wilcoxon се определя за сравняване значимостта на разликите между двата диска, поставени на едно и също яйце. Наблюдаваните съотношения на зависимите от дозата отговори са такива, каквито се очаква.

По-ниските и по-високи от 10 kDa фракции на DUP екстрактите са тествани при същите условия. Те показват еднакви възможности (фигура 13) за инхибиране на неоваскуларизацията.

Общият DUP екстракт е сравнен с продукта, изготвен по метода на Balassa. В продукта на Balassa няма значително възстановяване на антиангиогенната активност (фигура 14).

Суровият екстракт DUP е сравнен с фракцията в Oikawa OIK DUP и OIK са почти еквивалентни (фигура 15). Независимо от това Oikawa et al. се отличават от настоящото изобретение, тъй като те споменават, че не откриват активност във фракцията с молекулно тегло по-високо от 10 kDa, което е в противоречие с резултатите съгласно настоящото изобретение, показани на фигура 13.

Поради това, освен сходствата между метода на Balassa и нашия, получените продукти определено не са еднакви.

Двата продукта от нивото на техниката, сравнявани с нашия, вече се считат като класически методи за получаване на хрущялни екстракти. Резултатите по-горе показват, че настоящият метод предоставя продукти с неочаквано добра активност, що се отнася до антиангиогенната активност. Тъй като други активности ще бъдат потвърдени по-долу, ние можем да предположим, че настоящият метод е наистина успешен с оглед възстановяване множестве ността на водноразтворимите активности в един отделен екстракт.

Клинични изпитвания

Преди началото на предварителни клинични изпитвания, суровият пермеат, получен след центрофугиране, се подлага на двуи 20-кратно концентриране, като по този начин се осигурява пермеат с повишена активност. Тези нива на концентрация са получени на тангенциална филтрационна колона в поток, притежаваща порьозност 1000 Da, което редуцира обема на елуата 2 и 30 пъти. Концентрираният пермеат се филтрува върху милипоров филтър с порьозност 0,22 цт. Когато хрущялът е получен по алтернативен центрофужен метод (с помощта на СЕЗА центрофуга с мембрана с порьозност 30 μΜ), десеткратно концентриране води до получаване на концентриран екстракт с помощта на почти същото протеиново ниво като погорния 20-кратно концентриран екстракт, напр. около 12-25 mg/ml (подобрен метод). Стерилният 10 х концентриран пермеат се разпределя по 7 ml в стерилни колби (около 85 mg от протеина), замразява се при -80°С за една нощ и по-нататък се съхранява при -20°С до използването му. Голямата разлика между суровите и концентрираните пермеати е тяхната концентрация на протеините. Използваният метод за определяне на протеиновото съдържимо измерва общите азотни съединения и не само протеини (метод на Kjeldal). Това може да обясни защо концентрацията на протеините не се повишава пропорционално на с нивото на обема концентрация, както това е обикновения случай, когато протеиновото съдържимо се определя по метода на Lowry. Етапът на концентриране по този начин се предполага, че позволява проникването на вода, а така също и на азотните съединения с ниско молекулно тегло.

Антиангиогенен ефект Концентрираният пермеат се използва за лечение на ангиогенно зависими заболявания. В практиката са тествани три различни типа ангиогенно зависими заболявания у хора; първият тип е рак (на простатната жлеза), вторият тип са дерматологични неразположения (псориазис), а третият тип - артрит. Примерите по-долу ще илюстрират и индикират поне антиангиогенната активност на течния екстракт.

Сред дерматологичните заболявания са подбрани случаите на псориазис. Сред тестваните случаи на псориазис няма съществена разлика между случаите на псориазис, усложнени от хиперкератоза и такива без допълнителни усложнения. Кератозисният компонент е формирането на вроговена обвивка под формата на плака. Подобна плака е физическа бариера, която препятства ефективното проникване на активните ингредиенти през кръвоносните съдове.

Пациент, страдащ от рак на простата, доброволно е опитал 10-кратно концентриран хрущялен пермеат. Този пациент е претърпял серия от успешни конвенционални лечения, които са били обаче с временен успех. Напоследък, след като неговият рак е започнал да рецидивира, той започнал да консумира хрущялен екстракт.

Други доброволци, страдащи от артрит и приемали преди това лекарство (преднизолон) или не, са започнали да консумират концентриран хрущялен екстракт. Тяхното състояние се е подобрило, което се потвърждава от намаляване на болката и подобряване гъвкавостта на ставите.

Резултатите, показани по-долу, са твърде окуражаващи и се предполага приложимостта на суровия пермеат и неговите фракции за лечение на всички ангиогеннозависими заболявания, не само на изпитваните. Доколкото дадено заболяване има ангиогенен ефект, предполага се, че хрущялният екстракт от настоящото изобретение би бил ефективен в това отношение, осигуряващ навлизането на състав, съдържащ ефективно количество от него и че този състав е в подходяща форма за приложение. Настоящото изобретение не се ограничава до следните специфични състави за приложение при лечението на ангиогенни заболявания, доколкото даден специалист в областта ще бъде в състояние да получи множество състави, където изборът се ръководи от начина на приложение върху пациента и от заболялата тъкан. Съставите могат да бъдат използвани за лечение по различни начини, например локално, орално, сублингвално, ректално, интравенозно, интрамускулно, чрез дифузия и т.н.

Поради рибения вкус и мирис на хру щялния екстракт, към тези състави могат да се добавят оцветители и ароматизатори, които да намалят оплакванията на пациентите.

Псориазис

За потвърждаване въздействието върху пациенти, страдащи от псориазис, са изготвени следните дерматологични състави:

- EMULGADE™ CLB 29% (w/w)

- 20Х суров пермеат 69,5% (W/W)

- GERMABEN™ II 1 % (W/W) и

- Lavandula Angustifolia 0,5% (W/W)

EMULGADE™ CLB, смес от стеаратни естери, мастни алкохоли и нейонни емулгатори (закупени от Henkel Canada Ltd.), се нагрява на 65-70°С при разбъркване. Нагряването се стопира, докато разбъркването продължава по време на съхранението. Когато температурата на сместа достигне 45’С, се добавят есенциалните масти Lavandula Angusti_folia и консервантите GERMABEN™ II (диазонидилуреа 30%, метилпарабен 3% и пропилея гликол 56%; закупени от Sutton Laboratories, NJ, USA). Когато температурата на сместа достигне 30°С, се добавя хрущялният екстракт. Полученият състав е хомогенен и немазен крем; чрез вариране процента на EMULGADE™ могат да бъдат получени други форми на дерматологични състави с различен вискозитет, в съответствие с инструкциите на производителя (мляко, лосион, масло). Могат да бъдат използвани и други вехикулуми или носители за получаване на пасти, гелове и каквато и да е друга форма на трансдермални продукти.

Формата се дава два пъти дневно по време на 12 седмичен период на група от 9 пациента (локално приложение), страдащи от псориазис, който се е оказал твърде упорит за конвенционални лечения, и болестното състояние след малко се е възстановило. За това изследване пациентите са подбрани за сходен и симетричен обхват на псориазис за членовете от двете страни. Тези лечения се провеждат в двойно сляп маниер, без пациента или дерматолога да знаят коя страна от обхвата е лекувана със състав, съдържащ хрущялен екстракт, коя - с контролния състав. Значимо подобрение се наблюдава в пет пациента, чийто псориазис не е усложнен от хиперкератоза; за онези с хиперкератоза, резултатите са сравнително добри. Снимки на части от телата на двама пациента са показани на фигури 9а) и 9Ь). На фигура 9а), е показано, че пациент, поразен от псориазис с хиперкератоза, независимо от всичко, показва значително редуциране на еритема, свързано със сърбеж, само след месец от прилагане на лечението. Снимки на втория пациент, страдащ от псориазис, неусложнен с хиперкератоза (фигури 9Ь), показват по-висока степен на подобрение след тримесечно лечение. Доколкото псориазисът се явява многофакторно заболяване, предполага се, че отговорът на пациентите зависи от важността на допълнително включените компоненти като ангиогенезис и възпаление в установяването и постоянството на това състояние. Ангиогенната активност в действителност присъства в нашия екстракт, както се вижда у третирани с DMBA плъхове и CAM-тестове. Противовъзпалителната активност също е потвърдена (дискусията подолу). Много е възможно да бъдат получени по-добри резултати, ако този вид лекарствена форма бъде допълнена с други лекарствени средства, адресирани към други фактори, като кератолитични агенти, допълнителни противовъзпалителни агенти, антихистаминни агенти, имуносупресори и др.

Това допълване може да доведе до такова изменение на лекарствената форма, че тя да включва ефективно количество кератолитичен агент, например. Това може да бъде постигнато също чрез отделно въвеждане на такива допълнителни лекарствени средства, конкурентни или редуващи се с прилагането на настоящата форма на локално приложение. Допълнителното лекарствено средство може да не е необходимо да бъде прилагано по същия начин.

Посочената форма не показва системен ефект (ефектът е ограничен до лекуваните области) и няма вторичен ефект, въпреки високите съотношения в хрущялния екстракт.

Рак

Пациент, страдащ от рак на простатната жлеза е опитал 10-кратно концентриран пермеат. Аденокарциномът е диагностициран през 1986 г. По това време е приложена радиотерапия. През 1991 г. нивото на PSA (простатичен серумен антиген), е 138 pg/l, докато нормално високият лимит на възприемане е 4 p.g/l. След това на пациента е приложено напълно различно лечение чрез кастриране, комбинирано с антиандрогенна терапия (EUFLEX™). Това лечение е ефективно в продължение на три години, след което нивото на PSA отново започва да нараства. От 1994 г. този пациент консумира 10 х пермеат (дневна сублингвална доза от около 75 mg протеини/7 ml от екстракта, еквивалентни на около 1-1,5 mg/kg телесно тегло за ден). Макар значително количество от тази доза да се поглъща, тя вероятно се абсорбира в гастроинтестиналния тракт в значително отношение, ако някой се основава на резултатите, получени при третиране на животни с DMBA (виж по-горе). PSA нивата намаляват постепенно от 12 до 0,9 μ-g/I, например добре в рамките на нормалното ниво на PSA, последните получени резултати са получени през май 1995. Този режим на дозите може също да бъде модифициран в съответствие с пътя на приложение, биологичната достъпност на активните ингредиенти и желаната агресивност, с която патологията следва да бъде контролирана. По това време нетоксичността е потвърдена при плъхове (виж горните примери) и при хора (данни не са показани).

В други експерименти in vivo, осъществени върху третирани с DMBA плъхове, стойностите на дозите от течния екстракт е около 190-220 mg протеини/kg телесно тегло, което вероятно има голямо значение за намаляване на областта от ракови кръвоносни съдове (55%, когато са комбинирани с много по-големи количества протеин от лиофилизата). Ето защо се предполага, че доза от около 0,1 до около 200 mg/kg телесно тегло за ден е приблизително приемлив интервал от средните дози (ED_J0) за лечение на рак, поне частично чрез редуциране или елиминиране на ангиогенезиса.

Артрит

Пациенти, страдащи от артрит, са опитали в качеството на доброволци по една до две единици дневно от 7 ml тотален течен извлек в продължение на няколко месеца. Тези пациенти намират състоянието си постепенно подобряващо се на базата на възстановяване на функциите на ставите, а така също и намаляване на болката и възпалението (до около 60%). Доколкото артритът има ангиогенни и възпалителни компоненти, посоченият ефект може да бъде причислен към атрибутите на антиангиогенните и противовъзпалителни активности на хрущялния екстракт.

Неантиангиогенен ефект

Акне

Макар акнето да не влиза в обсега на познанията на изобретателя, класифицирано като заболяване или неразположение, притежаващо ангиогенна компонента, независимо от това, то е подложено на опит за тестване въздействието на хрущялен екстракт. За експериментиране въздействието на екстракта от хрущял върху пациенти с акне е създадена следната, гелна форма:

CARBOPOL™ 1,2%

Пречистена вода 77,2%

NaOH 0,3%

PHENOXETOL™ 0,3%

TWEEN 80™ 0,3% х екстракт от хрущял 20,0% х екстракт от алое 0,5%

Хрущялният екстракт 2х съдържа 912 mg/ml протеини. Тази форма показва значително подобрение на състоянието на кожата на пациенти, поразени повече или помалко от различни форми на акне (възпалително акне или кистозно акне; данни не са показани).

Тези резултати могат да се дължат на антиангиогенен ефект, като по този начин показва ангиогенна компонента на акнето, или да се дължи на активните ингредиенти, които имат въздействие, различно от антиангиогенното (противовъзпалителен ефект, например, виж дискусията по-долу).

Всички тези резултати, получени при посочените клинични изпитвания, показват големия потенциал на хрущялния течен екстракт при лечението на ангиогенетично зависими и/или възпалителни заболявания. Количеството на хрущялния екстракт, а така също и на неговите лекарствени форми, могат да варират така, че да задоволят специфичните нужди.

На базата на протеиновото съдържимо съставите за локално и други видове приложение, може да съдържат широк обхват от дози на хрущялния екстракт. Измежду трите специфични категории от изпитани случаи се използват много различни дози и/или форми. За всички предсказани приложения (от очни капки до лекарствени форми за дерматологични и ракови заболявания), предполага се че минималните крайни протеинови концентрации на тоталния течен екстракт би- 5 ха били много ниски (от около 0,1 mg/ml). Този нисък обхват на дозите зависи от достъпността и проницаемостта на активните ингредиенти в мястото на действието, а така също и върху ефективното улавяне на те- 10 зи ингредиенти и чувствителността или отговора на тъканта на ангиогенните инхибитори. По-високия лимит на крайната протеинова концентрация във формите за някои приложения понастоящем е неизвестен. Най- 15 високата изпитана крайна концентрация е около 9 mg/ml протеин във формите за случаите на псориазис и около 12 mg/ml в дозите от по 7 ml, прилагани в случаите на рак на простатата. 20

Както е отбелязано по-горе, течният екстракт от акулов хрущял може да загуби някои от техните активности при лиофилизация във воден разтвор. Добавянето на стабилизатори или защитни средства, известни 25 в областта, преди лиофилизацията може да съхранят чувствителните активности и да съдействат за прилагането на по-високи дози от хрущялен екстракт в сухо състояние.

Хрущялен екстракт като антагонист на 30 медиирани от протеинкиназа С (РКС) събития

Последните публикации показват, че РКС активирането води до това нормалните кератоцити да продуцират повишени коли- 35 чества интерлевкин-8 (IL-8), медиатор на възпаление (Chabot-Fletcher et al. (1994) J. Invest. Dermatol. 103: 509-515). Нещо повече, псориазните кератиноцити продуцират много високи количества IL-8, които по-нататък сти- 40 мулират неоваскуларизацията в псориазните плаки (Nickoloff et al. (1994) Am. J. Pathol. 144: 820-828). Докато хрущялният екстракт се проявява като многообещаващ при лечението на псориазис, неговият ефект е изпи- 45 тан в кератиноцити, чиято РКС се активира от трифорбол ацетат (ТРА), известен агонист на тази клетъчна трансдукция.

Фигура 16 показва, че нивото на диференциация на кератиноцитите е повише- 50 но петкратно с ТРА. Акуловият екстракт сам по себе си няма въздействие върху фор мирането на вроговена обвивка. Добавянето на екстракт от акулов хрущял инхибира формирането на ТРА-индуцираната вроговена обвивка с повече от около 60%. Ние не знаем дали ТРА-трансдукцията имитира псориазните кератиноцити. Ако е такъв случая, тези резултати предполагат, че хрущялът може да няма въздействие върху нормалните кератиноцити in vivo, но да има влияние върху псориазните кератиноцити. Инхибирането на продуктите на IL-8 н ТРАактивираните кератиноцити, а така също и в псориазните плаки или кератиноцити с хрущялния извлек, остава да бъде доказано. Понижените IL-8 нива биха били стойностно потвърждение на противовъзпалителния и антиангиогенния ефект на този екстракт. Противовъзпалителната активност е далече от антиангиогенната активност в екстракт от акулов хрущял

Докато ангиогенезата често се свързва с възпаление в множество заболявания, желателно е да се посочи такава активност отделно в екстракта от хрущял. За тестване извлека за противовъзпалителна и успокояваща активност е избран модел на кожни възпаления, където не се очаква проявление на ангиогенеза. За изследването са избрани девет доброволци с история на кожна чувствителност спрямо балсама на Peru. Веществата за теста са следните:

1. 1х Акулов хрущял 50% в среда D-MEM

2. 1х Акулов хрущял 20% в среда D-MEM

3. 1х Акулов хрущял 10% в среда D-MEM

4. Cola nitida (Indena) 10% вода:алкохол 1:1.

Четирите вещества се прилагат на вантралната предмишница на участниците в групата. Материалът се оставя да се абсорбира за двадесет минути и след това на тестваните места се прилага балсамът на Peru, един дразнещ агент. Кожното зачервяване се измерва с оглед на повишаване на кожното дразнене. Степента на дразнене се измерва с хромометър на Minolta и се сравнява с позитивните и негативни контроли. Позитивна контрола е цвета на кожата, третирана с балсама на Peru самостоятелно, а негативната контрола е кожен участък, третиран с разтвор на кола и провокиран като тестпродуктите. Статистически значимите стойности се изчисляват чрез

Т-тест с две възможности. Фигура 17 показва, че кола с 10% е 70% активна. Акуловият хрущял е 58% и 60% като противодразнещ агент при 20% и 10% концентрации, съответно. Няма ефект, зависещ от дозата. Тези резултати предполагат, че извлекът от хрущял съдържа противовъзпалителна и болкоуспокояваща активност, която е далече от един антиангиогенен ефект.

Антиколагенолитична активност

HPLC хроматография

980 ml проба от течен извлек (DUP) се филтрува през 10 kDa мембрана в тангенциално ултрафилтрационно устройство (PELLICON™ Millipore). Устройството се промива най-напред с 1 1 Н₂О. Крайният добив е 480 ml от > 10 kDa фракцията и 1,8 1 от <10 kDa фракцията. Последната се концентрира чрез cold-finger изпаряване до 180 ml (<10-10Х). Осем пъти 100 μΐ равни части от <10-1 ОХ се натоварват върху CDC-S Hexyl, 5 pm HPLC колона (25 х 0,94 cm) и се елуира най-напред със 100% Н₂О при 4 ml/min; след това при 8,5 ml/min със 100% МеОН. Съответстващите на пиковете до OD_2I4 фракции се събират.

Събрани са пет фракции (фиг. 18) Frl, Fr2,Fr3. Fr4 и Fr5. Първите три фракции включват поне големия пик.

Колагеназни изпитвания

Колагеназните изпитвания се провеждат в тези проби с помощта на рекомбинантна кожна колагеназа, тип 1 (ММР1) с помощта на флуорогенен пептиден субстрат (проба 1) и колагенен субстрат (проба 2).

Изпитване 1

Това изпитване е описано от Knight et al. (1992) FEBS Let. 296, 263-266. Методът използва флуорогенен пептиден субстрат (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂), имитиращ активната част на металопротеинази. Този субстрат притежава флуоресцентна група (Мса) в единия край и флуоресцентна (Dpa) група в другия. В интактния субстрат групата Dpa ефективно маскира флуоресценцията. При ензимното разграждане на субстрата, флуоресценцията в тестепруветката се повишава.

Колагеназното активиране е описано от Weingarten et al. (1985) Biochemistry 24, 6730. 1 pg се разрежда до 100 μΐ с 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaClj. pH 7,5, 1 μΐ при 10 mg/ml разтвор на трипсин (в 1 mM НС1) се добавят и инкубират за 15 min при 20°С. Активирането завършва чрез добавяне на 10μ1 инхибитор на соев трипсин (SBTI, 5 mg/ml). Към всяка микрокювета се добавят:

или 50 μΐ инхибитор (доведен до 50 μΐ с Н₂);

μ] 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl₂, pH 7,5 μΐ активирана колагеназа (67 ng); и μΐ субстрат (1 mM разтвор в DMSO, 20 μΜ)

Флуоресценцията се провежда при λ = 328 , λ = 393 nm.

ex nm’ _era

Резултатите показват, че Frl е найактивната фракция за инхибиране на колагеназата (фиг. 19). По-ниско ниво на активност се наблюдава във всички останали фракции. При тестване на колагеназа от попова лъжичка (vertebrata), ензимът е значително инхибиран от извлека на акулов екстракт (ЕС50 от около 10-20 pg/ml).

Изпитване 2

Това изпитване е описано от Welgus et al. (1970) JBC 256, 9511-9516. Методът използва SDS-PAGE за изследване разграждането с колагеназа, тип 1 (ММР1). Колагеназата тип 1 срязва на едно място в нативната колагенова молекула, при което се получават два фрагмента с размер 75% и 25% от оригиналния колаген. След разграждане за няколко часа, реакцията се наблюдава чрез разделяне на продуктите от субстрата със SDS-PAGE. Съотношението между разградения и неразграден колаген се преценява визуално след оцветяване на теловете с Comassie blue (или сребърно оцветяване).

ng от активираната колагеназа (виж изпитване 1) се добавят към 5 g от телешки кожен колаген (Worthington) +/- инхибитор в краен обем от 20 μΐ. Реакционната смес се инкубира в продължение на 16 h при 35°С, след което се прекъсва чрез добавяне на SDSPAGE с 40 mM EDTA, кипната и натоварена върху 8% гел.

Резултатите са обобщени на следната таблица:

Проба

Колаген оцветяване

Колагенов фрагмент Оцветяване

Само колаген	+44+	-
С + Ензим	+	+++
С + Ензим + EDTA	++++	-
С + Ензим + DUP	+	-н-
С + Ензим + Frl	++++	-
С + Ензим + Fr2	+++	+
С + Ензим + Fr3	+++	+
С + Ензим + Fr4	+++	+
С + Ензим + Fr5	+++	+
С + Ензим + > 10 KDa	+	+++

EDTA 40 инхибира колагеназа. Тоталният течен извлек DUP показва ниска анти- 2θ колагенолитична активност. Фракции 1 до 5 са активни; най-активна е фракция 1. Фращията с молекулно тегло, по-високо от 10 kDa, не показва значителна инхибиторна активност.

Козметични приложения и състави 25

Посочените тестове и изпитвания показват, че хрущялният извлек съгласно изобретението може да намери множество медицински приложения. Сред разнообразието от активности в този екстракт, антиколагенолитичният, противовъзпалителен и инхибиторен ефект върху РКС-индуцирана диференциация са особено желани в козметичните приложения. Доколкото хрущялният екстракт съгласно изобретението показва ан- ^5 тагонистичен ефект върху РКС-медиирани клетъчни събития, и доколкото подобен антагонистичен ефект е предположен в нивото на техниката за повишаване кожната бариерна възстановяваща функция, в обхвата на изобретението е включен метод за подобряване кожната бариерна възстановяваща функция у бозайници, включващ етапа на прилагане върху кожата на състав, съдържащ хрущялен извлек и фармацевтично приемлив носител. Други или подобни състави могат също да бъдат замислени с оглед използване в метод за успокояване на кожата или за намаляване на възпаление на кожата на бозайници. Възпалението може да бъде причинено от различни агенти, като химични дразнители, физични абразии и излагане на ул травиолетова радиация. Състави и методи за инхибиране на колагеназа в кожата също се имат предвид. Колагеназата и възпалението се свързват с нарастване преди достигане на зряла възраст (деградация на колагена) , и поради това антагонистичните активности, възстановени в хрущялния екстракт, могат също да бъдат причислени към съдействащите в съставите и методите за забавяне на растежа, и за регулиране набръчкването или атрофията на кожата на бозайниците. Като причинители на бръчки или атрофия се изброяват например, възрастта, излагането на ултравиолетова радиация или на замърсители на околната среда. Съставите за локално приложение могат да съдържат ефективно количество акулов хрущял, което да бъде определено за всяко специфично приложение. Тези състави могат да съдържат от около 0,1 до около 75% тегл. от течен 1х до 20х хрущялен екстракт и от около 50 до 99,9% тегл. от фармацевтично приемлив вехикулум. Тази състави могат да съдържат антиоксидант като агент, който предотвратява формирането на липидна пероксидаза в кожата. Примери за подобен антиоксидант са токоферол, негови производни, аскорбинова киселина, нейни производни и БНТ. Съставите могат да бъдат допълнени с противовъзпалителни агенти като инхибитори на фосфолипаза А2 или получена по биологичен път противодразнеща кола и извлек от зелен чай. Съставите за локално приложение могат да приемат разнообраз26 ни форми като разтвори, суспензии, лосиони, тинктури, гелове, кремове, емулсии, стикове, масла или липозоми (поне част от течният хрущялен извлек е включен в липозоми) .

Изводи

По метода съгласно изобретението се осигурява получаване на хрущялен извлек с висока клинична стойност. Извлекът от акулов хрущял, продуциран чрез метода, съдържа множество активности, които се възстановяват в добър добив. Хрущялните извлеци, по-специално течният извлек и неговите производни, имат голям потенциал, доколкото те са нетоксични за нормалните клетки и същевременно са ефективни при различни болести или състояния.

Необходим материал

- Охладители

- хирургични инструменти

- Месомелачка

- Пластмасови торбички

- Промишлен миксер (3-скоростен миксер на Waring от Fisher Scientific)

- Система да пречистване на вода (обратна осмоза и 0,1 μΐ филтрация; Continental Water System, model PRE 2202, сериен номер 91089, Modulab Bioscience RO/Polishing System, и двата от Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Тази система обезпечава апирогенна вода с високо качество.

- Прецизен баланс Mettler, серия АЕ, закупена от Fisher Scientific

- Центрофуга Sorvall RC-285, закупена от Du Pont Canada

- Автоклав (автоматичен паров стерилизатор Sanyo, модел MAC 350Р)

- Nalgene 500 ml контейнери, стерилизирани на 132⁾С за 10 min и изсушени за 35 min

- Конични филтри от 24 pm порьозност Watman Reeve Angel

- Ултрафилтрационна колона (Разрешителна способност за молекулно тегло: 500 kDa и 1 kDa, когато е възможно; Повърхност: 35 квадратни фута; Скорост: 130 Ι/min; Налягане на вход: 30 psi; Налягане на изхода: 5 psi; закупена от Koch Membrane Systems Inc., Wilmington, MA, USA).

- санитарна центрофужна помпа (Monarch Industries, model ACE-S100 тип A) за осигуряване на поток със скорост 130 1/min

- Стерилен бокс (laminar flow hut Nu-

Aire, закупен от Ingram & Bell)

- Millipack-60 0,22 pm стерилни филтри

- Стерилни колби от чисто или тъмно стъкло

- Концентратор DC-10 Amicon

- Rotor Biorad 170-2950

- Филтри Amicon SIOYIO, SIOY30, SIOY100 c възможности за преминаване 10, 30 и 100 kD, съответно

- FPLC Pharmacia 216007 (компютър Фармация 216014)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Лиофилизатор Labcono 10273 A

Изобретението, описано по-горе, се счита, че е във възможностите и знанията на специалиста в областта, който без да се отдалечава от същността на описанието, да въведе модификации чрез заместване на някои елементи от изобретението, с техни еквиваленти, с които ще се постигне същата цел. Приема се, че тези задължителни варианти се покриват от настоящото описание.

Патентни претенции

Claims

1. Състав за лечение на заболяване или нарушение с компонент, избран от колагенолиза и възпаление, с ограничението, че това заболяване или нарушение не е раково, псориазис, акне или артрит, включващ като активна съставка екстракт от акулов хрущял, характеризиращ се с това, че екстрактът от акулов хрущял е фракция от супернатантата, получена след центрофугиране на воден хомогенат на цялостен акулов хрущял, с последващо фракциониране върху мембрана, отделяща молекули с молекулни тегла 500 kDa и изолиране на екстракта, съдържащ молекули с молекулно тегло под 500 kDa, който притежава антиколагенолитична и противовъзпалителна активност.

2. Състав съгласно претенция 1, който е концентриран върху мембрана, върху която отпадат молекулите с молекулни тегла под 1 kDa, при което получаваният концентриран екстракт е обогатен с молекули с молекулни тегла от 1 до 500 kDa.

3. Състав съгласно претенция 1 или 2, който е за външно приложение.

4. Състав съгласно претенция 1, 2 или

3, който включва освен това и антиоксидант.

5. Състав съгласно претенция 4, в който антиоксидантът е подбран от токоферол, производни на токоферола, аскорбинова ки- 5 селина, производни на аскорбиновата киселина и ВНТ.

6. Състав съгласно всяка от претенциите от 3 до 5, който включва освен това противовъзпалително средство.

7. Състав съгласно претенция 6, в който противовъзпалителното средство е противодразнещо средство, получено от растения.

8. Състав съгласно претенция 7, в който противовъзпалителното средство е подбра- 15 но от кола и екстракт от зелен чай.

9. Състав съгласно претенция 6, в който противовъзпалителното средство е инхибитор на фосфолираза А2.

10. Състав съгласно всяка от претен- 20 циите от 3 до 9, при който лекарството може да бъде под формата на разтвори, суспензии, лосиони, тинктури, гелове, кремове, спрейове, емулсии, стикове или мазила.

11. Състав съгласно всяка от претенциите от 3 до 10, при който екстрактът е включен в липозоми.

12. Състав съгласно всяка от претенциите от 3 до 11, при което болестта или нарушението е възпаление на кожата.

13. Състав съгласно претенция 12, при което възпалението на кожата е причинено от физическа абразия.

14. Състав съгласно претенция 12, при което възпалението на кожата е причинено от химическо дразнене.

15. Състав съгласно претенция 12, при което възпалението на кожата е причинено от излагане на ултравиолетова радиация.