CN1138550C - 制备软骨提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及软骨提取物及其生产方法。通过改进的方法可以获得具有抗血管生成、直接抗肿瘤增殖、抗炎和抗胶原溶解活性的鲨鱼提取物。该方法包括以下步骤：将鲨鱼软骨在水溶液中形成匀浆，离心该匀浆并进一步分级分离得到全部提取物，该提取物含有分子量在0至500kDa之间的分子。然后通过不同方式对液体提取物的组合物进行了研究。进一步分级分离该提取物产生一些活性成分的初级特征。由于全部液体提取物的多种生物活性，可将其由于治疗多种疾病，例如由肿瘤增殖、血管生成、炎症和胶原溶解引起的疾病。该提取物对正常机体功能没有不良影响。因此该鲨鱼提取物很有治疗价值前景。用于提取软骨提取物的方法简单而有效。由于通过该方法获得产品具有预料不到的价值，因此该方法是新的并且是非显而易见的。

Description

制备软骨提取物的方法

                        背景技术

软骨是无血管组织，据研究它是潜在含有抗血管生成因子的物质。软骨还是对肿瘤恶化具有相对抵抗力的组织。和软骨、软骨肉瘤相关的肿瘤是最小的血管形成的实体瘤。血管生成是肿瘤恶化的重要因素之一。如果肿瘤细胞可以激发相邻血管网直至扩展到提供它们的营养需要，则会出现具体的实体肿瘤块。因此，人们已经研究了与刺激血管生成有关的因子在肿瘤恶化中的作用，并且还探究了具有抑制血管生成活性的抗血管生成因子及药物作为控制肿瘤生长或使之消退的工具。

已经发现在小牛肩胛软骨中含有抑制实体瘤血管生成的物质(Langer等，1976)。由于其具有令人鼓舞的潜在抗肿瘤剂的作用，人们一直在寻找更大的提供软骨的来源。

鲨鱼这种动物是该类型血管生成抑制剂的潜在来源，这因为它们体内骨骼完全是由软骨组成的(占其体重的6％，而小牛为0.6％)。鲨鱼还具有一个令人感兴趣的特点即不容易形成肿瘤。人们提出了许多解释鲨鱼不易形成肿瘤的假说。Marchalonis等人(1990)披露了能够容易攻击任何侵袭剂的IgM抗体。McKinney等人(1990)证实了鲨鱼具有能够从肿瘤细胞分化普通细胞并且能够摧毁前者的巨噬细胞。Rosen和Woodhead(1980)假定板鳃亚纲动物(包括鲨鱼和鹞鱼的群)中造成肿瘤的稀少可能是由于它们组织中具有高离子浓度，这种高离子浓度与高体温等价。在此状况下，这些作者相信免疫系统的免疫监视接近于100％。Moore等人(1993)公开了鲨鱼可以产生具有抗菌和抗原生动物特性的氨基甾醇。最后，Lee和Langer(1983)以及Folkman和Klagsbrun(1987)认为鲨鱼可以产生抑制新血管生成的物质。Lee和Langer( op.cit)已经在变性条件下从鲨鱼软骨中通过提取(胍提取)分离出该物质。但是这个提取过程非常长(41天)，会产生具有变性因子的提取物并且活性成分的得率很不好。从小牛中分离的活性成分具有约16千道尔顿(kd)的分子量，而同样的研究人员却不能给鲨鱼中重新得到的活性成分提供精确的分子量。这个物质仅能定义为分子量大于3500道尔顿。Oikawa等人(1990)应用了与Lee和Langer所述同样的提取方法，只是周期短得多(用2天代替41天)。由Oikawa等人从鲨鱼软骨中分离的抗血管生成物质被限制成具有1000-10,000道尔顿分子量的分子。Schinitsky(USP 4,473,551)描述了鲨鱼软骨粗粉的水提取物，其大于100,000道尔顿的部分单独或和葡糖胺结合具有抗炎活性。该专利中没有作出该提取物成分具有抗血管生成或抗肿瘤活性的意向。Kuetner等人(USP 4,746,729)从牛软骨中分离了多形核中性白细胞(PMN)弹性蛋白酶抑制剂。从软骨含水提取物中获得这种抑制剂，从中保留了分子量小于50,000。道尔顿的分子。通过在Sephacryl S-200上分馏分离得到无数馏分，将其中那些10-40KD的馏分在它们显示出抗弹性蛋白酶活性后混合起来。活性成分具有9.5的等电点且分子量可能约15,000。Kuetner等人(USP 4,042,457)还证实牛软骨具有分子量低于50,000道尔顿的成分，它对细胞增生具有抑制活性而对内皮细胞的生长无任何作用。Balassa等人(USP 4,822,607)在水溶液中获得了软骨提取物，该提取物具有抗肿瘤活性。然而，我们在通过重复Balassa方法获得的提取物中没有观察到抗血管生成的活性。Spilburg等人(USP4,243,582)从牛软骨中分离出两种分子量为65KD和PI3.8的糖蛋白(胍提取)，它们显示出抗胰蛋白酶活性和内皮细胞生长抑制活性。

小牛和鲨鱼软骨具有许多生物活性，诸如促炎(pro-inflammatory)活性、抗炎活性、抗血管生成活性、溶菌酶活性、促进细胞生长活性、对I和IV型胶原酶、弹性蛋白酶和其它蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和血浆酶的抑制活性。但是，至今尚没人获得包含许多具有临床价值活性的软骨提取物。

鲨鱼软骨的抗血管生成成分一般已经在兔角膜囊鉴定或在雏鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)鉴定中进行过测试。直到现在，软骨全粉已经直接在体内肿瘤、移植于裸大鼠中的人黑素瘤异种移植体上作过测试(USP5,075,112)，并且在CAM试验中测试其对抗血管生成的作用。即使把抗肿瘤的效果归功于软骨提取物，该效果也几乎被认为是抗效果血管生成成分阻止了对肿瘤提供血液。迄今，还没有证据表明鲨鱼软骨对肿瘤细胞的增生具有直接的影响。

已知有不少获得鲨鱼软骨提取物和馏分的方法。其中一种是不经任何提取过程而生产粉末状粗软骨(USP 5,075,112)。其它方法使用类似胍的变性剂(USP 4,243,582)。有的方法通过酶的消化作用对软骨进行预处理，以便去掉软骨周围的任何肌肉、神经或血管结构，在该预处理步骤之后用有机溶剂将脂肪消除，然后在含水相中提取活性成分(Balassa等USP 3,478,146、4,350,682和4,822,607)。这种预处理对保存软骨成分生物活性完整性的影响并不为人所知。如果消化得太广泛，酶消化作用可以水解活性蛋白成分，Balassa的方法不包括将提取物富集在活性成分中的分级分离步骤。有的方法简单地通过消除不溶物质生产软骨的含水提取物(在水中(USP 4,473,551))或盐溶液(USP 4,746,729)。在后面的这些方法中，特别要保留具有特定分子量的特定馏分，用于进一步研究和提纯(见以上所讨论的)。

上面提及的方法有很多缺陷。它们可能会使某些有价值的成分变性。即使不是这样，对实际应用来说它们也具有太冗长的缺点。此外，冗长的方法并不一定能够得到足够量的活性成分，并且在所回收的成分中，某些根本不能被回收或得率很低以致检测不到活性，或者由于是针对特定活性而使某些成分未被考虑。

血管生成不仅与癌症的发展有关。许多影响不同生理系统(括号内所指的)的疾病或症状是血管生成依赖性的，包括的实例如下：关节炎和动脉粥样硬化斑(骨和韧带)，糖尿病引起的视网膜病，新血管青光眼，沙眼和角膜移植新血管形成(眼部)，牛皮癣、硬皮病、血管瘤和肥大的瘢痕形成(皮肤)，血管粘连和血管纤维瘤(血液系统)。因此，任何新的和有效的抗血管生成“因子”均可用于这些疾病及癌症的治疗。另外，由于上述疾病和症状还有致炎成分，任何新的和有效的抗炎“因子”可以用于这些疾病或症状以及任何其它炎性疾病或症状的治疗。此外，由于像胶原酶这样的蛋白酶因其胶原蛋白降解活性造成如癌症和早衰等的多种疾病和症状，任何新的和有效的抗溶胶原“因子”可以用于具有溶胶原成分疾病或症状的治疗。因为在大量各种疾病或症状中可以单独遇到血管生成、发炎和类似胶原酶的蛋白酶或其组合形式，能够拮抗至少所有这些活性而不会影响正常机体功能的产品将具有很高的治疗价值。

                        发明描述

本发明提供一种生产软骨提取物的新方法，该提取物具有多种治疗价值活性的优点。这之中，已证实鲨鱼软骨提取物中存在足够的浓度满足抗血管生成、抗炎、抗溶胶原、体内抗肿瘤增生和直接体外抗肿瘤增生活性。其它活性等待鉴定或证实。肿瘤细胞系中测定的效果表明除了直接抗肿瘤增生的活性外，还显然存在细胞毒性活性。在鲨鱼软骨的液体提取物中获得了所有活性，而在它们的固体提取物中获得或验证了一些活性。

本发明涉及一种获得软骨液体提取物的新方法，该液体提取物具有在完整软骨中存在的实质部分的生物活性的水溶性成分，所说方法包括以下步骤：

a)在与保存所说生物活性成分完整性一致的条件下将软骨匀化于含水溶液中，直至软骨变成小于或等于约500μm粒径的颗粒，得到具有所说生物活性成分的颗粒和粗液体提取物的混合物；

b)离心所说的匀浆，从粗液体提取物中分离出颗粒；并且

c)进一步分离粗液体提取物，以便获得最终含有软骨分子的液体提取物，其中软骨分子的分子量为小于或等于约500千道尔顿。

这个新方法的优点是易于操作且效率高。所得软骨提取物的获得率高，提取物具体说是从鲨鱼软骨中获得的提取物至少包含所有上面提及的生物活性。优选在冷温(约0-10℃)、不变性条件(优选在纯水中)、接近中性的PH(约6-9)下进行，使未知其生理化学性质的化合物的回收概率最大。根据本方法，软骨成分的提取可以在少量体积的溶液中进行(低至每1Kg软骨用1L溶液)，并且之后在短时间的匀化(短至10-15分钟)。如果要回收固体提取物，则除了放弃上清液而只回收小沉淀并且冻干之外，其余方法相同。

本发明涉及软骨提取物，具体说涉及从板鳃亚纲动物更具体说是从鲨鱼中获得的提取物。该 固体提取物显示出活性。它可能含有胶原蛋白和不溶于水的成分。它可能还含有提取在全部液体提取物中的活性。其 全部液 体提取物的活性非常多。它可以就此使用或者可以浓缩。浓缩步骤的特点是有助于保持生物活性。注意避免使用类似热蒸发这样的会使活性成分退化的方法。使用约1KDa分子量截留值的膜进行超滤，以便浓缩本发明的液体提取物。结果获得含有分子量为约1-500KDa分子的浓缩提取物，并且将其进行测试。进一步分馏全部液体提取物(0-500KDa)来表征其活性成分。通过不同方法得到大批的馏分。通过它们的分子量和等电点来大体表征其中在肿瘤细胞系上测试的馏分。其它馏分具有活性，具体说是抗溶胶原或抗血管生成的活性。这些馏分需要彻底的表征和鉴定。因此在全部液体提取物及其馏分中回收有价值的活性，它们可以被优选使用。目前可以施用更可接受且富集的提取物，代替施用大量的软骨粉末。

本发明还涉及含有一种上述软骨提取物作为活性组分的任何治疗组合物或化妆品组合物。最值得人注意的是用于皮肤和美容的局部组合物。这么说是源于对软骨提取物活性的观察。在这方面，所观察到的抗溶胶原和抗炎活性，以及因蛋白激酶C在角化细胞中诱导引起细胞分化的拮抗作用被认为是使用组合物中鲨鱼软骨提取物的开始，也是减少炎症、调节皱纹或皮肤萎缩、延迟早衰、减少痤疮、提高皮肤屏蔽功能、减少发炎或刺激和皮肤缓解作用这些方法的开始。这些方法都属于本发明的保护范围。此外，由于鲨鱼软骨液体提取物已经成功地试验于癌症、关节炎、牛皮癣和痤疮病，用于治疗因肿瘤增生、血管生成、发炎和胶原溶解其中之一或多种因素引起的疾病或病症的组合物及方法也属于本发明的保护范围。

                         发明描述

通过描述附图所示的特定实施方案，将会更容易地理解本发明，描述实施方案的目的是解释发明而不是限制其范围。

附图简述

图1表示增加鲨鱼软骨(固体提取物)的剂量对ZR75-1和MCF-7细胞的抑制活性。

图2表示定量MCF-7细胞的剂量响应曲线，在有或没有两种浓度的软骨冻干物下增加雌二醇浓度的条件下由其DNA含量测定的。

图3a)和3b)显示患有乳腺癌的大鼠在通过管饲法结合施用软骨冻干物和上清液后与仅施用水后它们肝部切片的比较。

图4a)和4b)显示患有乳腺癌的大鼠在通过管饲法结合施用软骨冻干物和上清液后与仅施用水后它们肾部切片的比较。

图5a)和5b)显示患有乳腺癌的大鼠在通过管饲法结合施用软骨冻干物和上清液后与仅施用水后它们肺部切片的比较。

图6a)和6b)显示患有乳腺肿瘤的大鼠在通过管饲法结合施用软骨冻干物和上清液后与仅施用水后它们这个肿瘤部分切片的比较。

图7是图6a)和6b)的直方图，描述了软骨提取物对肿瘤血管区域的作用。

图8表示在非变性条件下在Rotofor上分离液体馏分的电泳图；在左侧显示分馏前粗渗透样品的分子量标记，用来和分离馏分比较。

图9a)和9b)说明用包含有效量浓缩液体软骨提取物的局部组合物治疗时(后幅图片)，患有牛皮癣的两位患者的症状明显得到改善，其中一位患者患有表皮角化病9a)，另一位没有表皮角化病9b)，与之比较的是他们原始的症状(前幅图片)。

图10显示鲨鱼软骨的三种不同提取物的FPLC迁移图。在A道中，DUP代表本发明的软骨液体提取物。B道和C道中，BAL和OIK分别代表现有技术中Balassa等人和Oikawa等人的提取物。

图11显示与图11定义的相同提取物的HPLC迁移图。

图12表示与对照样相比，使用不同浓度的鱼精蛋白进行CAM-试验的结果、鱼精蛋白是一种抗血管生成参照化合物。

图13表示使用本发明鲨鱼软骨的全液体提取物(DUP)中两种馏分进行CAM-试验的结果，其中一种馏分的分子量低于10,000道尔顿，另一种的分子量大于10,000道尔顿。

图14表示使用本发明鲨鱼软骨的全液体提取物(DUP)进行CAM-试验的结果，与之比较的是使用同等浓度的通过Balassa方法制作的产品(BAL)。

图15表示使用本发明鲨鱼软骨的全液体提取物(DUP)进行CAM-试验的结果，与之比较的是使用同等浓度的通过Oikawa方法制作的干重产品(OIK)。

图16表示与DMSO对照相比，TPA对角化细胞的作用，二者皆在有或没有根据本发明制备的全鲨鱼软骨液体提取物的存在下进行测定。

图17表示本发明全液体提取物对皮肤刺激模型的抗炎作用。

图18表示分子量低于10,000道尔顿的本发明全液体提取物的另外一种馏分的HPLC迁移图，该馏分已浓缩并为五种亚馏分。

图19表示图8所示的每种亚馏分在不同试验体积的抗溶胶原作用。

在特定的实施方案中，获得健康鲨鱼Black Spiny Dog FIsh和CommomSpiny Dog Fish的软骨。用乙醇处理过的解剖刀和剪子刮去全部肌肉和关连组织。然后将软骨真空包装在塑料袋中，并且冷冻至-20℃作为进一步使用。本方法可以适用任何来源的软骨。我们选择鲨鱼软骨的原因已在背景技术部分阐述过了。据信从板鳃亚纲动物软骨(包括鲨鱼和鹞鱼类的动物群)开始，获得的产品可能差不多相同。如果使用的是哺乳动物源的软骨，产品将有很大差异。

只要基本上不影响所关心产品(例如全液体提取物或其具体的馏分)的活性，在提取其之前各种任何制备软骨的方式都可以使用。正如Balassa等(USP 4,822,607)讲授的除掉软骨周围任何组织时，某些活性成分可能对蛋白水解消化作用耐受，而其它成分可能对这种处理不耐受。表现出对这种预处理不耐受的活性之一是抗血管生成活性(图15)。因此，如果你想要生产含有尽可能所有的水溶性活性成分的液体提取物，其具有不同活性，则这种消化步骤应当避免或者需要仔细监视以防止蛋白分解作用的广泛水解。制备冻干软骨

使用新鲜或解冻至4℃的干净软骨。然后让软骨和足够体积的水(量相等(重量/体积)，约为最小体积，但可以增加而不承担任何对回收有价值成分得率的影响)一起在乙醇处理过的切肉机孔间通过数次(具体说是三次)。从实际的观点来看，优选低体积，因为这样比并非必须的大体积更便于操作。实际当中，水要经过反相渗透并且在0.1μm滤器上过滤，达到提纯目的。许多含水溶液(例如包含盐)可以代替水使用。如果希望回收到多种水溶性活性，则优选在中性PH附近和非变性条件下操作以避免使某些软骨成分分解或变性。无法预知未知蛋白在含水溶剂中的状态；某些可能在酸性PH下更“合适”，而某些可能适于碱性PH。另外，某些蛋白可能在温和变性条件下易提取，只要这种变性并非不可逆地影响含水溶液中这些蛋白的恢复本性。因此，将所有这些因素都考虑进去，在纯水中进行软骨活性成分的提取过程不失为获得高产得率的适宜选择，能够回收到未知结构和状态的成分。

然后用家用混合积在4℃下通过10分钟的最高速搅拌使软骨/水混合物均匀。当然，搅拌速度以及水溶液的体积会影响到提取的时间。因此，匀化时间的合理范围可以低至约10分钟，高至24小时，优选约10分钟-60分钟。温度应当保持在约10℃以下，以便当没有使用酶抑制剂时避免任何内生酶对活性成分的降解。理想的情况是将温度定位到接近0℃。通常因为这种实验是在温度保持在4-10℃的冷室中进行的，所以这个范围的温度对本方法也是可以接受的。为清除和简明起见，此后使用的术语“约4℃”表示这个可接受范围的温度。

如果混合机不能足以减少颗粒的粒径，可以把匀浆放入Polytron粉碎机，在4℃下经过10分钟，从而进一步得到该匀浆的液体馏分。或者，可以附加进行混合机-粉碎机过程，将混合物简单匀化，对我们来说，可以把10分钟的液化步骤节省下来。在完成匀化步骤后，剩余的颗粒粒径小于500μm。当然，可使用获得一级研磨软骨同样可接受的时间和温度范围。匀化后的颗粒粒径无需非常小。因此，可以不用在提取之前将软骨变成粉末。事实上，在水提取之前，当这种粉碎过程以冷冻干燥状态或以热干燥状态下进行时，将软骨粉碎成粉末形式会使有价值的活性变性。

于4℃下以13,600×g将匀浆离心15分钟，这个步骤可以快速有效地把上清液和沉淀分开。技术人员完全可以依据本领域的知识，仅根据匀浆的体积和所使的设备来改变或调整这些条件参数。

将所得沉淀冻干24-48小时。以下将该第一馏分定义为冻干物或固体提取物。

如果需要，可以在24μm Whatman滤器中过滤上清液，以便除去易于影响超滤柱性能的颗粒。然后将过滤后的原料在约4℃的切线流动过滤柱中进行超滤，其孔隙度为约500 000道尔顿，这样可以获得包括分子量为0-约500KDa水溶性分子的第一粗渗透物。在0.22μm滤器中无菌过滤该粗渗透提取物，并且等分于无菌瓶中作下一步使用。该馏分将被进一步当作粗渗透物或全液体提取物。

另一方法是，开展更高效的离心过程获得沉淀和上清液。13,600×g离心15分钟的步骤之后，用装备有30μm孔隙度尼龙袋的CEPA离心机在3000-4000×g下进行离心以代替在Whatman滤器中的总过滤过程。该方式在30分钟内可以离25kg/25L的制备物并且得到29升的上清液。所得水的体积大于开始时水的体积，这说明得到了软骨本身的一部分水分。把从一批批中观察到的各种情况全部考虑进去，并且当使用不同原料时，冻干物和全液体提取物具有以下大概的组成：冻干物：

类脂类  7.35％¹

蛋白类  46.2％²

湿度    20.4％

钠      4.16mg/g³

钾      2.64mg/g

钙      114mg/g

镁      1.49mg/g

锌和铁痕量全液体提取物

类脂类  0.10-0.20％¹

蛋白类  8-25％²

湿度    97-99％

钠      30-220mg/100g³

钾      30-40mg/100g

钙      2.0mg/100g

镁      1.1mg/100g

锌和铁痕量^1，2分别根据AOAC局出版(1984)的16.219-220和2.055章节的所示进行测定；³根据SAA步骤进行测定。

利用Kjeldahl方法评价蛋白质含量，其实测定的是有机氮(N)。用以下等式将有机氮换算成等值的蛋白质：

未检测到碳水化合物，可以假设它们在以蛋白多糖和/或粘多糖形式下的一种或另外提取物中。这些化合物有可能包含在湿度的测定含量中。冻干物含有意想不到程度的湿度，其是通过有OH-基测定的。由于20％的水分含量接近于软骨中正常回恢的碳水化合物百分数，而冻干物的湿度应当接近于0％，所以这个假设得到了证明。

运用USP XXIII中的规定控制无菌状态，见：1)Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.1090，Lescarbot，Centre Industriel St-Malo，Quebec GIN 4J4；和2)Northview Laboratories Inc.1880，Holste Road，Northbrook，IL，60062 U.S.A.FDA登记号14-18028活性试验冻干物：

体外试验：

在激素依赖性癌细胞系MCF-7和ZR75-1(分别为ATCC(R)等：22-HTB和1500-CRL)上进行这些试验。ZR75-1细胞：基本RPMI培养基

5L纯水中混合52g不含酚红(σR8755)的RPMI 1640、17.875g Hepes(无酸，Sigma H07635)、0.55g丙酮酸钠(Sigma P5280)和10g NaHCO₃，并且用NaOH使PH为7.40。

如果不立即使用，该溶液必须避光保存以保护光敏物质。将该溶液过滤，置入500mL无菌瓶中，并且4℃储藏，最大期限三个月。维持细胞培养的培养基

基本RPMT培养基中补充10％(v/v)的FBS(胎牛血清)、100U青霉素G/50μg链霉素硫酸盐(Sigma P0906)/ml培养基、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G1517)和1nM E2(β-雌二醇Sigma E8875)。实验培养基

基本RPMT培养基中补充5％的FBSA(吸附在葡聚糖炭上的胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺、100U青霉素G/50μg链霉素硫酸盐/ml培养基50ng/mL胰岛素(Sigma)。往该培养基中添加提高浓度的上述冻干物以及不同浓度的雌二醇(10^-12至-5M)。MCF-7细胞：基本DME-F12培养基

按照制造商的说明在纯水中重组DME-F12培养基(不含碳酸氢盐且不含酚红，Sigma)。1升中添加1.2g碳酸氢钠并且用NaOH/HCl调节PH至7.40。将该溶液过滤，置入500mL无菌瓶中，并且4℃储藏，最长期限三个月。维持细胞培养的培养基

基本DME-F12培养基中补充10％(v/v)的FBS(胎牛血清)、100U青霉素G/50μg链霉素硫酸盐/ml培养基、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和1nM E₂(雌二醇)。实验培养基

基本DME-F12培养基中补充5％的FBSA(吸附在葡聚糖-活性炭上的胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺、100U青霉素G/50μg链霉素硫酸盐/ml培养基50ng/mL胰岛素(Sigma)。往该培养基中添加与ZR75-1细胞中所述相同浓度的冻干物和雌二醇。制备FBSA：

将胎牛血清和1％(w/v)活性炭(碳脱色碱性物质)混合。将葡聚糖T70加到活性炭-血清溶液，达到浓度0.1％(w/v)。4℃下搅拌混合物过夜。于4℃下以10,000×g离心30分钟，之后滗析血清，再次与相同比例的活性炭和葡聚糖混合，室温下搅拌3小时并且重新离心。然后在56℃下将血清热灭活20分钟，无菌过滤并且等分在无菌锥形福尔肯管。

培养ZR75-1和MCF-7细胞使之达到在24孔噬菌斑上的菌群密度为20000细胞/孔或者在6孔噬菌斑上的菌群密度为150000细胞/孔，并且在有不同浓度冻干物的存在下或者没有它的情况下进行处理，所述冻干物如上制备。为达这个效果，将冻干物重新悬浮于培养基并且无菌过滤，以便回收并试验其中的水溶性成分。所有实验皆一式三份进行。每两天撤去培养基并且换上新的培养基。细胞培养在37℃的恒湿环境培养管中，培养管环境中包含5％的CO₂，分别培养17、7、3或3天，对应于第一、二、三或四次实验。通过直接计数细胞或者检测每孔的总DNA含量来测定细胞生长的抑制性。冻干物的浓度                                细胞抑制(％)

                              MCF-7                  ZR75-1第一次实验：17天1mg/mL                           1.5                    2.005mg/mL                           14.33                  33.610mg/mL                          62.66                  90.8第二次实验：7天1mg/mL                           3.73                   0.975mg/mL                           15.7                   29.0010mg/mL                          68.37                  66.00第三次实验：3天50mg/mL                          95.8                   95.00100mg/mL                         94.6                   98.00第四次实验3天10mg/mL                          34.4                   51.520mg/mL                          62.5                   70.550mg/mL                          95.8                   95  100mg/mL                   94.6              98

以上抑制细胞生长的百分比证明冻干物可以按剂量依赖的方式抑制这两个系的细胞生长。

图1表示50和100mg/mL剂量的冻干物在处理3天之后，明显引起这些细胞系发育不全。

图2表示存在10^-12-10^-9M雌二醇的情况下，和对照细胞一样，受处理的细胞没有受到这些激素剂量使用率的刺激。然而雌二醇超过1nM时，对照细胞受到强烈刺激，且有10⁷M雌二醇存在时DNA浓度达到3.75μg(与之相应的是没有雌二醇时对照中为0.69μg)。在受30和50mg/mL冻干物处理的细胞中，最大刺激程度时测定的DNA分别为1.9μg和1.8μg。

图2表示存在30和50mg/mL的情况下，受处理细胞对雌二醇的亲和常数(Km)分别比对照细胞的Km值(11.7nM)大3倍和16倍(31.3nM和174.0nM)。这表明当存在软骨冻干固体提取物时要达到同样的细胞生长率，雌二醇的浓度就必须较高。因此，该提取物削弱了最大响应(其90％的抑制)并且增加了处理细胞对雌二醇的亲和常数。

体内试验

让400只40天龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Co.处购买，St-Constant，魁北克)适应12天环境。管饲法将20mg DMBA/1mL玉米油(Sigma Chemical Co.处购买的9，10-二甲基-1，2-苯并蒽)施用给大鼠。经此处理三个月后，挑选240只已患有乳腺癌的大鼠并分成两组。第一个组的大鼠分成5个小组。给4个处理组的大鼠日服在3mL水中增加浓度的冻干提取物，服用8个星期，对照组接受相同体积的水。第二个组的大鼠分成4个小组。给3个处理组的大鼠也日服于3mL水中的冻干物，结合上清液一起服用或者不结合上清液，服用10周，对照组接受同样体积的水。用浓度为3000mg/Kg/天冻干物和3mL上清液处理的第二组大鼠的仅一个小组的大鼠还要腹膜内(i.p.)注射较少剂量的上清液(1mL水中约8mg蛋白)。

两个实验开始时大鼠的体重为151-175g并且任意接受食物和水。第一组大鼠的肿瘤为平均直径0.9cm，而第二组大鼠的肿瘤为平均直径0.6cm。结果概述如下：管饲法施用软骨提取物的日剂量     肿瘤生长抑制％(肿瘤直径和对照相

                                            比的减少程度)第一组实验：8周500mg/Kg/天                                     2％1000mg/Kg/天                                    4％3000mg/Kg/天                                    14％5000mg/Kg/天                                    15％第二组实验：10周3000mg/Kg/天                                    12％3000mg/Kg/天+3mL上清液                          18％3000mg/Kg/天+3mL上清液                          20％

          +1mL腹膜内注射的上清液

该结果证明冻干物含有可被肠胃管道吸收并且对肿瘤大小起作用的活性成分。这个作用可能是对肿瘤细胞的直接作用，也可能是抗血管形成介导的作用。

结果还表明上清液具有额外减少肿瘤大小约5％的活性。

以上结果还证实冻干物可能含有不溶水的活性成分和/或它可能含有其它的水溶性活性成分。因此，如果仍能提高得率的话，最不可能的事情是考虑将沉淀在含水溶液中重新提取，以便最大可能地回收水溶性成分。病理组织学

为了评价软骨提取物活性分子的无毒性，将上面体内实验中使用的动物通过断头致死，并取以下组织进行分析：肝、肺、肾、心、脑、肌和乳腺。在布安(Bouin)液中固定两天后，剔除这些组织的脂肪。在乙醇中脱水，之后将固定了的组织埋入石蜡中。得到它们的切片并且安装在载玻片上，用苏木精染色并在显微镜下观察。

组织学实验说明当单独使用最大剂量的冻干物(没有出示数据)或者当和上清液结合使用冻干物时(见图3a、3b、4a、4b、5a、5b)没有见到有害的结果。

这说明冻干物和上清液具有选择性肿瘤大小消退的活性。

在癌性乳腺(见图6a和b)中，观察到血管区域有显著的减少。通过如图7示例并总结的结果证明这些活性分子具有抗血管生成作用。

图7表示当结合使用(指图6a和b)冻干物(p.o.)-上清液(p.o.+i.p.)时，在肿瘤中观察到血管区域降低55％。

肿瘤大小的减少可能是由于其形成血管能力的显著降低，也可能是由于对肿瘤细胞的直接作用，或者两方面都有。上面已经充分叙述了这些提取物的抗血管生成效果。在体外观察到对激素依赖性细胞发育不良的直接效果，这一点还需要在体内得到证实。

由于上述结果表明上清液已经提高了冻干物对ZR75-1细胞的作用，所以其中的成分需要进一步研究。获得含有活性分子的液体馏分

按与上述同样的方式获得并加工鲨鱼软骨。离心后，抛弃沉淀并按上述同样方式加工上清液直至在0.22μm滤器上无菌过滤。

此后将上清液称为粗渗透物，即超滤后的产物。

将这样获得的粗渗透物通过FPLC(快速蛋白液相色谱)。

FPLC条件：

柱：Hiload 26mm×60cm Sephacryl S-300

FPLC系统：来自Pharmacia

在装载柱之前将所有样品在0.22μm滤器上无菌过滤。洗脱液是经过过滤和脱气15分钟的磷酸缓冲盐水(PBS)。载样体积一般为3.2mL(可以到13mL)。流速1mL/分钟。收集10mL馏分。通过其紫外吸光度(280nm)检测洗脱下来的化合物。使用Sigma的MW-GF-1000校准包获得校准图，其中的校准样与用于分析的载样体积相同(3.2mL)。从校准包化合物分子量对其洗脱体积减去柱空白体积的绘制曲线中推算出样品的洗脱体积。空白体积是通过葡聚糖蓝(M.W.＝2,000,000)获得的。

在ZR75-1细胞上测试馏分的活性。鉴定有用的馏分并且通过进一步研究(下面)确证它们的特性。

在Rotofor(Biorad 170-2950；见等电点聚焦)上进行渗透物活性成分的其它特征鉴别，并且在具不同截留值的Amicon滤器上获得分子量为10-30KD、30-100KD和100KD以上的馏分。等电点聚焦

使用膜光谱孔L#7 MWCO 3500 KD(光谱132110)将鲨鱼软骨制备物(46mL的渗透物1Kg/L)在4升含有5％甘油的纯水中于4℃下过夜进行透析。透析溶液和2.75mL两性电解质(Pharmacia #80-1125-87)PH3.5-10.0和0.5gCHAPS(SigmaC3023；3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵]-1-丙烷-磺酸盐)混合。用纯水将体积补到55mL。将溶液装载到Rotofor上。在12瓦特恒定功率(3000xi功率提供Biorad 165-0554)和4℃温度以及条件下进行等电点聚焦。在分离的开始阶段，电压为380伏恒温水循环保证温度的电流31mA。当电流稳定时(14mA)，电压至870伏。停止等电点聚焦并收集20份馏分。

  馏分                  体积(mL)                PH

   1                      3.7                  3.56

   2                      2.1                  4.01

   3                      2.2                  4.18

   4                      2.3                  4.31

   5                      2.2                  4.63

   6                      2.1                  5.03

   7                      2.5                  5.30

   8                      2.1                  5.50

   9                      2.4                  5.81

   10                     2.5                  6.26

   11                     2.3                  7.00

   12                     2.4                  7.29

   13                     2.4                  7.64

   14                     2.5                  7.94

   15                     2.3                  8.32

   16                     2.5                  8.62

   17                     2.4                  8.94

   18                     2.9                  9.30

   19                     3.1                  9.88

   20                     3.6                  10.71

在电泳凝胶(Laemmli，U.K(1970)Nature(Lond.) 227：680)上估价它们的分子量，以便鉴定这些蛋白质。

用缓冲液(见Laemmli)四倍稀释这些馏分并且在非还原条件下将8μL等分馏分进行电泳。图8显示了等电点聚焦前每个馏分和物质的电泳分布。

在分层流动通风条件下将所有馏分通过孔隙度为0.22μm的无菌Millipack-60滤器，使其无菌装入瓶中。

通过Lowry剂量法测定馏分的蛋白含量。在培养基中不同浓度的ZR75-1细胞上测试1Kg/2L溶液(表示为每升渗透物的粗软骨重量)。结果总结如下：

第一个试验

将渗透物冻干，重新悬浮于PBS，并且进行FPLC。没有检测到发育不良活性(没有数据未显示)。

第二个试验

在Rotofor馏分(蒸发浓缩的渗透物)上进行测试：蛋白鉴定

  鉴定的馏分       等电点         中间值          分子量

  7-8-9-10         5.30 to 6.26    5.78          29±1KD

  7-8-9            5.30 to 6.26    5.68          60±1KD

  12-13-14         7.29 to 7.94    7.62          48±1KD

  13-14            7.64 to 7.94    7.79          35±1KD

第三个试验

在FPLC馏分(蒸发浓缩的渗透物)上进行测试：

  馏分                     分子量

  6和7                     1-2.5KD

第四个试验

在通过Amicon分子筛获得的100μL馏分(蒸发浓缩渗透物)上进行测试

  试验浓度              分子量               Zr75-1细胞培

                                             养物的抑制

 100μg/mL            MW＞100KD                 64％

 100μg/mL            30KD＜MW＜100KD           114％

 100μg/mL            10KD＜MW＜30KD            127％

 400μg/mL            MW＜10KD                  149％

FPFC馏分6和7含有分子量非常小的活性成分：1-2.5KD。

馏分的发育不良作用可以最多33 000倍高于用冻干粉观察到的效果。以上结果表明冻干过程显然会引起洗脱物所包含的蛋白丧失了一些其直接抗肿瘤的活性，而在固体提取物冻干时没有出现这种情况。这证实了包含在软骨颗粒中的活性成分显然是处于某种环境，以致于对冻干过程的变性效果很不敏感。由于发育不良活性对冻干是敏感的，当在水中重新得到时，在冻干之前往全提取物或含有该活性的特定馏分中添加稳定剂或保护剂才可保存其活性。洗脱物活性成分的进一步鉴定：

按以下分子量范围重新得到活性馏分(ZR75-1细胞上测试)，用上述FPLC和Rotofor步骤，使用另一类型提纯方式，由同一渗透物开始，在10mm直径×30cm长的Superose-12柱上进行测定。选择1mL/分钟的流速。收集4 5份1mL的馏分。馏分20-21  馏分中活性相应于分子量70-120KD馏分22     馏分中活性相应于分子量60-70KD馏分29-32  馏分中活性相应于分子量35-46KD馏分34-35  馏分中活性相应于分子量29KD馏分38-39  馏分中活性相应于分子量1-2.5KD特异性

为了评价活性对肿瘤细胞的特异性，将超滤之后获得的渗透物在其它间质源细胞、人腱纤维细胞(HTFs)上进行试验，它们都是普通的纤维细胞。B.体外

a.患者

只使用来自两位患者的(一位患有新血管青光眼，NVG，另一位患有初期开角青光眼，POAG)HTFs。

b.HTFs的传代培养和维持

用0.5ml 0.05％胰蛋白酶/0.5mLEDTA(Gibco 610-5 300AG)把每个融合的培养基都经过洗涤并且在37℃下分离5-10分钟。然后添加1.5mL含有15％胎牛血清(FBS)的DME/F-12培养基以便中和胰蛋白酶/EDTA。

研磨并且转移到25cm² T-烧瓶中制成缔合的细胞，其中补充添加含有10％FBS的培养基。达到融合之后，将HTFs转移到75cm²最后到180cm² T-烧瓶中。当获得足够的细胞时，使用其中的一些细胞作如下描述的实验，同时将其它细胞冷冻保存，同样为进一步实验用。

c.实验方案

当达到融合时，在两个或三个相同180cm² T-烧瓶中生长的来源一位患者的细胞按上述步骤解离。经过短时间低速离心后，用装有256-Channelyzer的ZMI Coulter计数器216013对它们进行计数。

为了进行以后所有的体外实验，将大约五万个细胞接种到1mL含有1％FBS的DEM/F-12培养基中，放入16mm皿和12-池平板中。接种17小时后，添加1mL新的用1％FBS补充的相同培养基(“绝对”对照)。根据实验设计(见上和下)，用GFs(生长因子)或不用GFs或者用渗透物1Kg/2L(软骨重量/水体积)溶液补充1％FBS培养基并且无菌过滤。同一天(0天)还要对某些样品的细胞进行计数以便测定平皿接种的效率(应当等于或大于95％)。

开始实验后48小时，冲洗细胞并且通过前述的步骤进行解离，然后再次计数。细胞敏目表示为“绝对”对照中获得细胞数的百分数。

每个“绝对”或阳性对照分别含有1％或5％的FBS，而且用1％FBS和单独用GF或软骨渗透物补充的每个实验组由三份样品组成。

每个实验同时在一位或两位患者的细胞上进行，且至少重复两次。

比较由生长因子(GF)或软骨渗透物对纤维细胞增生的刺激和由5％FBS对其的刺激。

这些实验中，分别添加的是于1％FBS中浓度为10-100ng/mL的GFs、猪血小板衍生生长因子(pPDGF)和人重组基本纤维细胞生长因子(hrbFGF)(由Farmitalia Carlo Erba，Milan，Italy赠给Dr.P.Brazeau)。实验开始48小时后，通过胰蛋白酶-EDTA分散细胞并且在Coulter计数器上计数。下示的所有三份的值(1、2和3栏)都等于每孔计数的1/20。-------------------------------------------------------------------------------------

  患者B：G1aucoma           性别：男          年龄：53

HTF

天-1：                  每孔细胞数：46170

            DME/F12-1％ FBS-1％ Pen.Strep

天0：                   每孔细胞数：65214

            DME/F12-1％ FBS-1％ Pen.Strep

天1：                   每孔细胞数：62548

            DME/F12-1％ FBS-1％ Pen.Strep

天2：                   每孔细胞数：

            DME/F12-1％ FBS-1％ Pen.Strep                  nb cell/count

              样品/平板      1      2      3     平均      SEM      ％

                                                                   对照

                                                                   生长

                 DME/F12

平板 #1     1      天0     3,019  2,862  2,853   65,214    71

FBS              1％ FBS

            2     天 +1    2,711  2,973  2,6 93  62,548    1,655

                 1％ FBS-------------------------------------------------------------------------------------

            3     天 +2    2,284  2,400  2,191   51,333    1,655   100

                 1％ FBS

            4     天 +2    3,084  2,834  3,115   67,446    1,627   131

                 5％ FBS                                          

------------------------------------------------------------------------------------

平板#2           DME/F12

PDGF        5     对照     2,558  2,181  2,216   51,931    2,199   100

                (1％FBS)

            6   1ng/ml     2,425  2,580          56,056    1,228   108

                1％ FBS

            7   10ng/ml    4,080  3,975  4,282   92,116    1,648   177

                1％ FBS                                           

            8   100ng/ml   4,625  4,356  4,450   100,285   1,442   193

                1％ FBS                                            -------------------------------------------------------------------

平板#3              DME/F12

b-FGF

             9     对照       2,915  2,533  2,502  59,360  2,429  100

                   (1％ FBS)

             10    1ng/ml     2,744  2,554  2,761  60,174  1,213  101

                   1％ FBS

             11    10ng/ml    3,606  3,143  3,193  74,234  2,683  125

                   1％ FBS

             12    100ng/ml   4,064  3,033  3,026  75,585  6,307  127

                   1％ FBS-------------------------------------------------------------------------------------

平板#4             DME/F12

软骨AGE      13   对照1       2,826  2,566  2,486  58,822  1,877  100

(1Kg/2L)          (1％FBS)

(过滤)       14   1μl/ml     2,729  2,576  2,575  58,837  936    100

                  1％ FBS

             15   10μl/ml    2,643  2,493  2,584  57,643  798    98

                  1％ FBS

             16   100μl/ml   2,918  2,883  2,766  58,483  2,461  99

                  1％ FBS-------------------------------------------------------------------------------------  p＜0.02

P＜0.01                测定  Student-Fisher Test

当细胞于存在软骨渗透物(1Kg/2L)的条件下生长时，可观察到如PDGF和bFGF生长因子会表现得对HTFs有刺激活性、没有作用、阳性或阴性效果。观察不到发育不良的影响。这说明渗透物具有普通细胞所检测不到的而对肿瘤细胞有专一的发育不良或细胞毒性作用。同样的软骨提取物对其它类型的纤维细胞、HSF(人皮肤纤维细胞；没有数据显示)没有作用。尽管没有测试，可以假定冻干物对普通细胞也没有影响。与现有技术产物的比较

由于不是我们第一个对软骨提取物有很大的兴趣，所以我们用与现有技术描述或推测的两种产物，即用Balassa(USP 4,822,607)和Oikawa等(在所引书中)方法制备的产物的并列比较试验，确定用本发明方法制备的鲨鱼软骨液体提取物的特有特征。

Oikawa等描述了得到两种主要馏分的方法，一种馏分的分子量在1-10KDa之间，第二种含有大于10KDa的组分。他们确定只有第一种馏分有抗血管生成特性，在CAM试验中，另一馏分则没有任何抗血管生成活性。为了充分比较Oikawa的产物，我们将我们的总液体提取物分离成两种相应的馏分，我们保留了1-10KDa的馏分。由于Balassa描述了提取总液体提取物的方法，我们将我们的总液体软骨提取物(1-500KDa)与重复Balassa的方法，用鲨鱼软骨代替小牛软骨作为起始材料而制备的产物进行了比较。我们认为，如果Balassa和Oikawa描述了相等的方法，则在FPLC和HPLC上得到的图谱应基本上重叠，而且当用CAM试验检测产物时，应与我们的产物有相似的活性。在FPLC和HPLC层析前，将所有样品的终浓度制成12μg/ul(干重/溶液体积)。由于含有不可溶物质，所以在层析前将Oikawa的产物离心并过滤。

A)FPLC条件：Superose 12(Pharmacia)；凝胶渗透柱。

B)HPLC条件：CS-S-Hexyl柱5μm，5×0.94cm，CSC#059-085；反相柱。

按如下标记(每体积溶液估计的干重)用三种方法提取的鲨鱼软骨样品：

1)DUP是本发明的制品，含有1-500KDa的分子(12μg/ul)；

2)BAL是重复Balassa等方法制备的制品(12μg/ul)；

3)OIK是Oikawa馏分3的制品(270μg/ul)。在进行任何分析前，将所有样品的终浓度制成12μg/ul(干重/体积)。OIK样品有很多不可溶物质，但通过以13200RPM离心或通过0.2μm膜过滤很容易沉淀。过滤或浓缩不可溶物质主要应在FPLC和HPLC(A，B)前。

A)FPLC结果概述

使样品在Superose 12(10/30)凝胶渗透柱上跑，用磷酸缓冲盐水(PBS)作为洗脱剂，流速为0.5ml/分(记录纸速＝0.25cm/分)。在注射前，通过0.2μm膜过滤100ul浓度调整后的样品。监测OD280。

用下列标准校对所述柱(以道尔顿计MW)：过氧化氢酶(232000)，醛缩酶(158000)，白蛋白(56000)，卵清蛋白(44000)，胰凝乳蛋白酶(25700)，核糖核酸酶(13700)，胰岛素(5700)，胰岛素B链(3500)，胰岛素A链(2500)，杆菌素(1450)，维生素B-12(1355)。用下列等式计算主峰的分子量：Log₁₀MW＝7.52-0.212×RT，其中，RT＝以ml计的洗脱体积。R²＝0.976。用胞苷(246Da)确定的总体积(V_T)为21.93ml。用蓝葡聚糖(2×10⁶Da)确定空白体积(V₀)为8.38ml。

在图10a)中，我们样品DUP有以18.76ml洗脱的第一主峰(1)，分子量为3500Da。随后在22.7(2)和27.3ml(3)的峰超出总体积(21.93ml，用胞苷确定的)。这些峰对柱基质显示出一些亲和性。

在图10b)中，Balassa样品BAL有一在柱V₀附近洗脱的小峰(1)，一个在18.5ml(4000Da)洗脱的峰和两个在V_t22.6ml(3)和28.2ml(4)后洗脱的峰。

在图10c)中，Oikawa的样品OIK在V₀也有小峰(1)，在18.9ml有一个峰(2)(3300Da)，在21.5ml(1000Da)的峰(3)和在27.3ml的小峰(4)。

在比较样品时，注意到在3300Da外，在其它样品的相同强度，观察不到DUP样品的主带。OIK样品显然有小量27.3ml的小峰。BAL样品在28.2ml有一迁移峰，这可能与DUP样品中的小峰有关。B.HPLC结果概述

在已基一反相柱上进行HPLC，同时监测OD210和OD280。负载50μl离心样品(均为12μg/ul)，然后用100H₂O洗脱。用“(例1)”注明按照OD210标记的各层析谱峰(例1)和相应的OD280峰。该柱的V₀为5.5ml(1.4分钟)。

在图11a)中，DUP有3个通过OD210观察到的主峰(1，2，3)，和2个小峰(4，5)。在离开峰1的地方观察到两个侧峰，标为1a和1b。显著的OD280吸收值与峰1，1a，1b和3有关。在比较时，OD280峰2的吸收值比OD210的小很多。

在图11b)中，BAL有更多的OD210峰，但强度比DUP峰的低。就峰重叠可以作为分子标志而言，在Balassa样品中，只有峰3和7看起来与DUP样品中的峰滞留时间(分别为峰1a或1b和峰4)有关。

在图11c)中，在OIK提取物中只观察到3个主要峰(1，2，3)。峰1和3可能与DUP样品中的峰1和3有关，但在OIK层析谱中未观察到1的侧峰。OIK样品中峰的高度比DUP的低。尽管FPLC和HPLC图谱是区别产物的特征，但我们还用CAM试验确定了三种产物的抗血管生成活性。CAM试验：

首先用不同浓度的鱼精蛋白(37，75和150μg)进行CAM试验。将含水的甲基纤维素盘和含鱼精蛋白的另一盘(作为阳性对照)放在鸡胚胎的chorloallantoic膜上(n＝分析的胚胎数)。将一O环放在各盘以便容易确定其位置。第二天，以通常双盲方式，由两个科学家记录在各O环中的血管形成水平。以1-2-3分为基础，评估CAM试验的程度：〔分＝3〕当与对照胚胎相反水平象限或匹配象限比较时，有正常血管形成；(分＝2)血管进入O环，但在中途消失。多数血管跨过了O环，但其轨迹显然受到影响。在O环附近的象限分支减少，象限血管面积减少；(分1)在O环内没有血管或偏离的血管。没有血管生长到O环之外，除非如果他们绕过了后者并超过其范围。在O环附近，象限的血管面积显然减小。在图12中，上述各柱的值表明了各样品的最终分数。用Wilcoxon统计学试验比较在相同卵上两个盘差异的显著性。正如预期的，观察到剂量反应关系。

用相同的条件试验低于和高于DUP提取物的10kDa的馏分。表明他们在抑制新血管形成方面有相等的潜力(图13)。

将我们的总提取物DUP与Balassa方法制备的产物BAL进行比较。在Balassa产物中，没有明显抗血管生成活性恢复(图14)。

将DUP粗提取物于Oikawa中馏分3OIK进行比较。DUP和OIK几乎相等(图15)。不过，Oikawa等对本发明没有任何指导，因为他们注意到，在分子量高于10kDa的馏分中，检测不到活性，这正与在我们图13的结论相反。

因此，尽管Balassa的方法和我们的方法有相似性，但用两种方法得到的产物显然不同。

已经与我们的产物比较过的两种现有技术产物仍可被认为是制备软骨提取物的典型方法。上述结果表明，就所涉及的抗血管生成活性而言，本发明方法提供了有意想不到的良好活性的产物。由于下面证明了其它活性，因此我们可以认为，本发明确实成功地在一种提取物中回收了多种水可溶活性。临床试验

在进行一期临床试验前，将超滤后得到的粗渗透物浓缩2和2-20倍，以便富集活性渗透物。在孔隙率为1000道尔顿的切流过滤柱上，得到了这些浓度水平，这样将洗脱物的体积减少了2-20倍。用孔隙率为0.22μm的微孔过滤器过滤浓缩的渗透物。当用其它离心方法(用孔隙率为30μm的膜进行CEPA离心)加工软骨时，浓缩10倍得到的浓缩提取物与上述20倍的浓缩提取物有几乎相同的蛋白质浓度，例如约12-25mg/ml(改进的方法)而不是约8-12mg/ml(实验室规模方法)。在消毒烧瓶中，将灭菌10X浓缩渗透物分成7ml的等分样(约85mg蛋白质)，于-80℃冷冻过夜，然后再于-20℃贮存直到使用。粗和浓缩渗透物的主要区别是其蛋白质浓度不同。应注意，用于确定蛋白质含量的方法可测量总氮混合物，而不仅仅是蛋白质(Kjeldahl方法)。这可以解释蛋白质浓度为什么不随体积浓缩的水平成比例增加，而这是用Lowry方法确定蛋白质含量时的常见情况。因此认为浓缩步骤可以允许水和低分子量氮化合物渗透。抗血管生成效果

用浓缩的渗透物治疗血管生成依赖性疾病。在实践中，治疗人中的三种代表性的血管生成依赖性疾病；第一种是癌(前列腺癌)，第二种是表皮失调(牛皮癣)，第三种是关节炎。下列实施例将至少说明并表明液体提取物的抗血管生成活性。

在皮肤疾病中，选择牛皮癣病例。在试验的牛皮癣病例中，要注意因角化过度症并发的和非并发的牛皮癣之间的区别。角化病组成是以斑的形式形成了角化的膜(envelope)。所述斑是妨碍活性成分向血管有效渗透的物理障碍。

患前列腺癌的患者自愿尝试10倍浓缩的软骨渗透物。该患者经历了一系列暂时成功的连续的常规治疗。在其癌症表明是累犯后，他最近开始试用软骨提取物。

患关节炎并以前施用过药物(强的松)或未施用过药物的其它自愿者开始试用浓缩的软骨提取物。正如因疼痛减少和关节强直减轻所证明的，他们的疾病得到了改善。

下列结果是非常令人鼓舞的，而且可以断言了粗渗透物和其馏分在治疗所有血管生成依赖性疾病，而且不限于具体试验的中的用途。在一种疾病有血管生成原因的情况下，可以认为本发明的软骨提取物在此方面是有效的，只要它进入含有效量所述提取物的组合物中，而且所述组合物可以适当的形式和适当的方式施用。因此，应理解本发明在用于治疗血管生成疾病方面不限于下列具体组合物，因为本领域专业人员可以配制出许多组合物，其中可根据施用方式和靶疾病组织进行选择。可以通过不同途径，如局部，口服，舌下，直肠，静脉内，肌肉内，扩散等施用组合物。

因为软骨提取物的鱼味道和气味，可以将矫味剂或香料加到这些组合物中以促进患者接受。牛皮癣：

制备下列皮肤组合物并证明其在患牛皮癣患者中的效力：

-EMULGADE^TM CLB29％(W/W)

-20X粗渗透物 69.5％(W/W)

-GERMABEN^TMII 1％(W/W)，和

-Lavandula Angustifolia 0.5％(W/W)在65-70℃，搅拌下，将EMULGADE^TMCLB，硬脂酸酯，脂肪醇和非离子乳化剂(购自Henkel Canada Ltd.)加热。停止加热，但继续搅拌化合物。当混合物达到45℃时，加入香精油Lavandula Angustifolia和防腐剂GERMABEN^TMII(重氮脲30％，对羟基苯甲酸甲酯11％，对羟基苯甲酸丙酯3％和丙二醇56％；购自Sutton实验室，NJ，美国)。当混合物的温度达到30℃时，加入软骨提取物。所得的组合物是光滑且不含脂的乳膏；按照制造商的说明通过改变EMULGADE^TM的百分比，可以得到各种粘度的皮肤组合物(奶液，洗液，软膏)。还可以用其它载体或赋形剂以得到膏剂，凝胶和任何其它形式的可透过皮肤的制剂。

在12个星期的时间内将上述制剂每天给环牛皮癣的患者(局部施用)施用两次，这些患者对常规治疗有反应，但经过一段时间后，所述治疗对这些患者不太有效。为了进行该项研究，选择在两侧有相似和对称程度牛皮癣的患者。用双盲方式完成这些试验，皮肤学家和患者均不知道用含软骨提取物的组合物治疗哪一侧，用对照组合物治疗哪一侧。在其牛皮癣并非因角化过度症并发引起的5名患者中，观察到显著改善；对于有角化过度症的患者，结果有中等程度的改善。在图9a)和9b)中出示了两个患者身体的部分照片。在图9a)中，表明患角化过度症牛皮癣的患者，仅在治疗一个月后，其与瘙痒无关的红斑有很显著的减少。但角化过度症仍很严重。第二个患有无角化过度症并发的牛皮癣患者的照片(图9b)表明三个月的治疗后有更好的改善。由于牛皮癣是多因素疾病，所以认为患者的反应取决于在该病的形成和持续中象血管生成和炎症的指症的严重程度。如DMBA-处理的大鼠和CAM试验中所表明的，在我们的提取物中确实存在抗血管生成活性。还证明了抗炎活性(下文将讨论)。如果这种制剂用所涉及的其它因素有关的其它治疗剂(角化层分离剂，其它抗炎剂，抗组胺药物，免疫抑制剂等)互相补充，可能会得到更好的结果。

这种互相补充可以采用改善制剂的形式例如包含有效量的角化层分离剂。通过与本发明的局部制剂分开施用所述互补治疗剂，同时或交替施用也可达到所述目的。此外，不必经相同的途径施用互补药物。

已经表明上述制剂没有全身作用(所述作用被限制在治疗区)，而且尽管在软膏提取物中的比例高，也没有第二作用。癌症

让一个患前列腺癌的患者试用10倍浓度的渗透物。在1986年诊断出腺瘤。那时，进行了放射性治疗。1991年，PSA9前列腺血清抗原(水平为138μg/L)，正常可接受水平的上限为4μg/L。然后对患者通过阉割与抗雄激素治疗(EUFLEX^TM)相结合而进行了完全不同的治疗。所述治疗在三年内是有效的，此后PSA水平又开始上升。自1994年，该患者消费了10X渗透物(每天约75mg蛋白质/7ml提取物的舌下剂量，等于约1-1.5mg/kg体重/天)。即使吞下显著量的该剂量，也可以以相当的比例在胃肠道内吸收，如果人们依据DMBA处理动物所得到的结果的话(见上文)。PSA水平逐渐从12降到0.9μg/L，完全在PSA正常水平范围内(在1995年得到的最新结果)。也可以根据给药途径，活性成分的生物利用度和待控制治疗方法的所希望的攻击性来改变所述剂量方案。此时，已在大鼠(见上述实施例)和人(数据未列出)中证明了非毒性。

在DMBA处理大鼠上进行的另一体内试验中，液体提取物的剂量率为约190-220mg蛋白质/Kg体重，该剂量可能对减小癌症血管的面积有更大的作用(当与更大蛋白质量的冻干物结合时，是55％)。因此，认为约0.1-200mg/Kg体重/天的剂量是治疗癌症的近似合理的中等剂量(ED₅₀)范围，至少可部分减少或消除血管生成。关节炎

在自愿的基础上，患关节炎的患者每天试用共7ml的液体提取物数月。这些患者通过关节恢复功能，疼痛和炎症减轻(高达约60％)而发现疾病逐渐改善。由于关节有血管生成和炎症因素，所述作用可以归因于软骨提取物的抗血管生成和抗炎症活性。非抗血管生成作用：痤疮：

尽管痤疮不在本发明人分成具有血管生成成因的疾病或失调的知识范围内，但仍试图在这类患者中试验液体软骨提取物。为了在患痤疮的患者中试验软骨提取物，制备下列凝胶制剂：

CARBOPOL^TM     1.2％

纯化水          77.2％

NaOH            0.3％

PHENOXETOL^TM   0.3％

吐温80^TM       0.3％

2X软骨提取物    20.0％

40X芦荟提取物   0.5％

2X软骨提取物含9-12mg/ml的蛋白质。该制剂使患严重或不太严重痤疮的患者的皮肤有显著的改善(炎性痤疮和包囊(kystic)痤疮；数据未列出)。

这些结果可以归因于有抗血管生成作用(因此表明了痤疮中的血管生成成因)，或归因于有除抗血管生成作用以外之作用(如抗炎作用，参见下文讨论)的活性成分。

在上述临床试验中得到的所有结果均表明了软骨液体提取物在治疗血管生成依赖性和/或炎症疾病方面的潜力。软骨提取物的量以及其制剂可以依所满足的具体需要而不同。

人们可注意到，以蛋白含量为基础，局部和所有其它组合物均可含有大范围剂量的软骨提取物。在试验的三种具体病例中，使用了差别很大的剂量和/或制剂。为了所有预期的应用(从滴眼液到皮肤和癌症药物制剂)，认为总液体提取物的最小的最终蛋白质浓度可以很低(从约0.1mg/ml)。该较低剂量范围取决于活性成分向作为位点的可进入性和渗透性，并取决于这些成分的有效吸收和组织对血管生成抑制剂的敏感性或反应。目前尚不知道在用于某些应用的制剂中，最终蛋白质浓度的上限。在用于牛皮癣的制剂中，所试验的最高的最终浓度为约9mg/ml蛋白质，在前列腺癌症所用的7ml剂量单位中，为约12mg/ml。

如上所述，当以水溶液形式冻干时，鲨鱼软骨液体提取物可能失去一些活性。但是，将本领域已知的稳定剂或保护剂加到冻干物中可以保持高剂量软骨提取物在干燥状态的敏感性并提供了在干燥状态施用高剂量软骨提取物的可能。软骨提取物作为蛋白质激酶C(PKC)-介导之过程的拮抗剂：

最近的文献已经表明PKC激活使正常角质化细胞产生增加量的白细胞介素-8(IL-8)，炎症的介导物(Chabot-Fletcher等，(1994)皮肤研究期刊，103：509-515)。此外，牛皮癣角质化细胞产生很大量的IL-8，IL-8促进了牛皮癣斑中新血管的形成(Nickoloff等，(1994)美国病理学期刊，144：820-828)。由于已经表明软骨提取物在治疗牛皮癣方面很有前途，所以已经在用乙酸三佛波醇酯(TPA)激活的PKC的角质化细胞中试验了其作用，TPA是已知所述细胞传导途径的激动剂。

图16表明用TPA，角质化细胞的分化水平提高了5倍。鲨鱼软骨本身对角化被膜的形成没有作用。但是，加入鲨鱼软骨提取物抑制了60％以上的TPA-诱导角质化被膜形成。我们不知道TPA诱导是否能够模拟牛皮癣角质化细胞。如果可以的话，这些结果表明软骨对体内正常的角质化细胞没有作用，而对牛皮癣(或激活的)角质化细胞有影响。在TPA激活的角质化细胞和牛皮癣斑或角质化细胞中，软骨提取物对IL-8生产的抑制作用仍有待证明。IL-8水平的降低可以确定所述提取物的抗-炎和抗血管生成作用。在鲨鱼软骨提取物中抗炎活性

由于在许多疾病中，血管生成常常与炎症有关，所以需要分开确定在软骨提取物中各自的活性。就此而言，选择没有血管生成发生的皮肤刺激模型以试验所述提取物的抗炎和和减轻痛苦的活性。选择有皮肤对秘鲁香脂敏感史的9名自愿者进行研究。试验化合物如下：

1  在D-MEM培养基中的1X鲨鱼软骨50％

2  在D-MEM培养基中的1X鲨鱼软骨20％

3  在D-MEM培养基中的1X鲨鱼软骨10％

4  可乐果(nitida)(Indena)10％羟基一醇(Hydro-alcohol)1∶1。

将4种试验化合物用于panelist的腹前臂。将所述物质吸附20分钟，然后将秘鲁香脂，一种刺激剂，用于试验位点。从皮肤红色的增加来测量皮肤刺激。用Minolta测色仪测量红色的程度，然后与阳性和阴性对照进行比较。阳性对照是单独用秘鲁香脂处理的皮肤颜色，阴性对照是用可乐果溶液处理的并象试验产物一样攻击的皮肤位点。通过两个拖尾可能性T试验计算统计学显著性。图17表明10％的可乐果有70％的活性。鲨鱼软骨作为抗刺激剂，分别在20％和10％的浓度有58％和60％的活性。没有剂量反应作用。这些结果表明软骨提取物含不同于抗血管生成作用的抗炎和缓解痛苦的活性。抗胶原溶解活性：HPLC色谱

用切线流超滤装置(PELLICON^TM，Millipore)，通过10kDa截留膜过滤980ml的液体提取物。首先用1L水冲洗所述装置。最终产率为＞10kDa的馏分是480ml，＜10kDa的馏分是1.8L。通过指型冷蒸发将＜10kDa的馏分浓缩到180ml(＜10-10X)。将8倍＜10-10X的100μl样品负载到CDC-S Hexyl，5μm HPLC柱(25×0.94cm)上，先以4ml/分的流速用100％水洗脱；然后用100％MeOH以8.5ml/分洗脱。收集相应于OD₂₄₀峰的馏分。

收集5组馏分(图18)：馏分1，馏分2，馏分3，馏分4和馏分5。前三个馏分至少含一个主峰。胶原酶试验

用重组人皮肤胶原酶，1型(MMP1)，用荧光肽底物(试验1)和胶原底物(试验2)对这些样品进行胶原酶试验。试验1

Knight等(1992)FEBS Let.296，263-266描述了该试验。该方法使用模拟金属蛋白酶活性位点的荧光肽底物(Mca-Pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH₂)。该底物在一端有荧光基团(Mca)，在另一端有荧光终止基团(Dpa)。在完整的底物中，终止基团有效地遮蔽了荧光。酶裂解底物后，试验管中的荧光增加。

Weingarten等(1985)生物化学24，6730描述了胶原酶激活。用50mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，pH7.5，将1μg稀释到100μl，加入1μl 10mg/ml的胰蛋白酶溶液(在1mM HCl中)，20℃培育15分钟。通过加入10μl大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI，5mg/ml)来终止激活。向各微杯中加入：

25或50μl抑制剂(用H₂制到50μl)；

40μl 50mM Tris-HCl，200mMNaCl，10mM CaCl₂，pH7.5；

8μl激活的胶原酶(最后67ng)；和

2μl的底物(在DMSO中1mM的原种溶液，最后为20μm)。

在λ_em＝328nm，λ_em＝393nm处记录荧光。

结果表明馏分1是抑制胶原酶的最有活性的馏分(图19)。在所有其它馏分中存在的活性水平较低。当对蝌蚪脊椎动物胶原酶进行试验时，鲨鱼软骨提取物显著抑制了该酶(EC50约10-20μg/ml)。试验2

Welgus等(1979)JBC 256，9511-9516中描述了该试验。该方法用SDS-PAGE以检测胶原酶1型(MMP1)的裂解。1型胶原酶在天然胶原分子有一个切割位点，占原胶原75％和25％的两个片段。裂解数小时后，用SDS-PAGE通过将产物与底物分开来监测反应。用考马斯蓝染色(或银染色)凝胶后，肉眼评估裂解或未裂解胶原的比例。

将21ng激活的胶原酶(见试验1)加到终体积为20μl的5μg小牛皮肤胶原(Worttington)+/-抑制剂中。将反应在35℃保温16小时，然后通过SDS-PAGE和40mM EDTA来终止反应，煮沸，然后负载到8％凝胶上。

在下表中总结了结果。

  样品                   胶原染色              胶原片段染色

  反胶原(C)              ++++                  -C+Enz                        +                     +++C+Enz+EDTA                   ++++                  -

  C+Enz+DUP                 +             ++

  C+Enz+Fr1                 ++++          -

  C+Enz+Fr2                 +++           +

  C+Enz+Fr3                 +++           +

  C+Enz+Fr4                 +++           +

  C+Enz+Fr5                 +++           +

  C+Enz+＞10KDa             +             +++

40mM EDTA抑制胶原酶。总液体提取物DUP有低抗胶原溶解活性。馏分1-5是有活性的；活性最大的是馏分1。分子量大于10kDa的馏分没有明显的抑制活性。化妆品应用和组合物：

上述试验表明本发明的软骨提取物有许多医学应用。在该提取物中回收的不同活性中，在化妆品应用中特别需要的是抗胶原溶解，抗炎和对PKC诱导之分化的抑制作用。由于本发明的软骨提取物有PKC-介导的细胞过程的拮抗作用，而且由于所述拮抗作用在本领域中是作为改善皮肤障碍修复功能而被说明的，因此，改善哺乳动物障碍修复功能的方法包括将含软骨提取物和可药用载体的组合物用于皮肤，所述组合物在本发明的范围内。也可以构想用于减轻哺乳动物皮肤疼痛或减轻炎症之方法中所用的其它或相似组合物。炎症可以是因各种因素引起的，如化学刺激剂，物理摩擦和暴露于紫外线辐射。还包括抑制皮肤胶原酶的组合物和方法。胶原酶和炎症与早衰(胶原降解)有关，因此可以将在软骨提取物中回收的拮抗活性用于延缓哺乳动物皮肤早衰和用于调节皱纹或萎缩的组合物和方法中。皱纹或萎缩的原因例如是衰老，暴露于紫外线辐射或环境污染物。局部组合物可以含有有效量(为用于各具体应用而待确定的)的鲨鱼软骨。一般讲，这些组合物可含有约0.1-约75％(重)的液体1X-20X软骨提取物，和约50-99.9％(重)的可药用载体。这些组合物可含有抗氧化剂，如防止皮肤中脂过氧化物形成的试剂。所述抗氧化剂的例子是维生素E，维生物E衍生物，抗坏血酸，抗坏血酸衍生物和BHT。所述组合物可以含有抗炎剂如磷酸脂酶A2抑制剂或植物衍生的抗刺激剂可乐和绿茶提取物。局部组合物可采用不同形式如溶液，悬浮液，乳液，酊剂，凝胶，乳膏，喷雾剂，乳液，棒状物，膏剂或脂质体(在脂质体中至少有部分液体软骨提取物)。结论：

本发明方法已表明是一种生产有极大临床价值的软骨提取物的方法。用所述新方法生产的鲨鱼软骨提取物有许多以良好产率回收的活性。由于其对正常细胞无毒，而对许多不同疾病又有效，因此软骨提取物，特别是液体提取物和其馏分有极大的潜力。所需的材料：-冷却剂-外科仪器-绞肉机-塑料袋-工业搅拌器(从Fisher Scientifi c购买的3-速搅拌器)-纯化水的系统(反渗透和0.1μm过滤；Continental Water System，PRE 2202型，91089系列，从Montreal，Quebee，Fisher Scientific购买的Modulab Bioscience RQ/Polishing System，Montreal，Quebec)。该系统提供高质量的不生热的水。-精确平衡Mettler的AE系列，从Fisher Scientific购买-从加拿大杜邦购买的Centrifuge Sorvall RC-285-Centrifuge CEPA-孔隙度为30μm的尼龙袋-高压消毒锅(三洋自动蒸汽消毒器，MAC 350P型)-在132℃消毒10分钟，然后干燥35分钟的Nalgene 500ml容器-24μm孔隙度的Whatman Reeve Angel的锥滤器-超滤柱(分子量截断：可用时500kDa-1KD；表面：25平方英尺；流速：130L/分；入口压力：30psi；出口压力：5psi；购自Koch MembraneSystems Inc.，wilmington，MA，美国)-Sanitary离心泵(onarch Industries，ACE-S100型，A类)以提供130L/分的流速-消毒盒(从Ingram & Bell购买的层流盒NuAire)-Millipack-60 0.22μm灭菌滤器-消毒透明的或琥珀玻璃瓶-浓缩仪DC-10 Amicon-Rotofor Biorad 170-2950-截留值分别为10，30和100KD的Amicon滤器SIOY10，SIOY30和SIOY100-FPLC Pharmacia 216007(计算机Pharmacia 216014)-Hilstand S-300 26mm/60cm(Pharmacia)-Superose S-12 10mm/30cm(Pharmacia)-冻干仪Labconco 10273A以上对本发明进行了描述，而且应当理解，在不偏离本发明教导的前提下，本领域专业人员有足够的能力和知识通过用等同物代替本发明的某些内容来进行修改并达到同样的目的。认为这些显而易见的改变也被本申请所覆盖。

Claims (7)

1.获取液体软骨提取物的方法，所述提取物含有存在于完整软骨中的生物活性成分的实质部分，该方法包括下列步骤：

a)在避免生物活性成分变性的条件下将软骨在水溶液中匀浆，直至将软骨粉碎为粒度低于或等于500μm的固体颗粒；

b)将所述生物活性成分提取至所述水溶液，使所述水溶液变成一种固体颗粒和含有所述生物活性成分的粗液体提取物的混合物；

c)将所述粗液体提取物和所述固体颗粒分离；和

d)进一步分离粗液体提取物以获得最终液体提取物，所述液体提取物含有分子量低于500千道尔顿(KDa)的软骨分子；

条件是，软骨不是鲨鱼软骨。

2.如权利要求1所定义的方法，其中所述条件包括操作温度在0至10℃之间。

3.如权利要求1所定义的方法，其中所述条件包括所述水溶液的操作pH在大约6至8之间。

4.如权利要求1所定义的方法，其中所述水溶液是纯化水。

5.如权利要求1所定义的方法，其中所述软骨和水溶液的比例为1公斤对1升或更多的水溶液体积。

6.如权利要求1所定义的方法，其中步骤b)的实施时间在15分钟至24小时之间。

7.如权利要求6所定义的方法，其中步骤b)的实施时间在15分钟至1小时之间。

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