DE69511691T2

DE69511691T2 - Zusammensetzung und verfahren zur bekämpfung von pflanzenkrankheiten

Info

Publication number: DE69511691T2
Application number: DE69511691T
Authority: DE
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Margareta Hoekeberg; Tiiu Jerkeman; Britt-Marie Jingstroem; Lennart Johnsson
Original assignee: SVENSKA LANTMAENNEN RIKSFOERBU
Current assignee: SVENSKA LANTMAENNEN RIKSFOERBU
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2015-04-14
Also published as: NL350040I1; ES2139204T3; NL350040I2; HUT75369A; HU9602828D0; EP0756454B1; EE03414B1; NO316012B1; RU2143199C1; RO118786B1; NO964359L; SK281576B6; CZ302596A3; UA43366C2; PL316910A1; SE9401307D0; EP0756454A1; NZ284874A; KR100358671B1; PL186440B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Pflanzenschutzprodukte. Insbesondere betrifft die Erfindung einen neuen Stamm der Bakterienart Pseudomonas chlororaphis und die Verwendung von Zusammensetzungen, die diesen bakteriellen Stamm oder antibiotische Substanzen, die von diesem Stamm gebildet werden bei der Pflanzenproduktion, um Pflanzen gegen Angriffe durch phytopathogene mikrobielle Agentien zu schützen.[0001]

Stand der Technik

Mehrere Mittel mikrobieller Natur mit der Fähigkeit, Pflanzenerkrankungen zu induzieren, verursachen beträchtliche Schäden und demgemäß wirtschaftliche Verluste bei Nutzpflanzen. Viele von ihnen greifen Blätter und/oder andere Teile der Pflanze, die sich außerhalb des Bodens befinden, an und erreichen dann üblicherweise neue nichtinfizierte Nutzpflanzen durch luftübertragene Sporen. Andere werden von einer Nutzpflanzengeneration auf die nächste über das Saatgut übertragen, und mehrere wirtschaftlich wichtige krankheitsinduzierende Agentien werden über den Erdboden übertragen und befinden sich im Erdboden in einer mehr oder weniger inaktiven Form, bis eine dafür anfällige Nutzpflanze kultiviert wird.[0002]
Die Verfahren, die ausgeübt werden, um die mikrobiellen krankheitsinduzierenden Agentien bei der Nutzpflanzenproduktion zu kontrollieren, sind oft kostenaufwendig, aber bei den meisten Nutzpflanzen-Kultivierungssystemen aus wirtschaftlichen Gründen notwendig. Ein weitverbreitetes Verfahren ist die Behandlung mit biostatischen oder bioziden Chemikalien. Diese werden in den meisten Fällen als Sprühnebel auf wachsende Nutzpflanzen, in Form von Samen oder Wurzelbehandlung oder als Bodendesinfektionsmittel angewendet. Andere Standardverfahren sind das Züchten von Resistenzen und das Management des erntebringenden Systems selbst.[0003]
Diese Standardkontrollverfahren haben einige Nachteile. Das Management des erntebringenden Systems ist lediglich für bestimmte Erkrankungsprobleme effektiv oder in bequemer Weise verwendbar. Ebenso ist das Züchten von Nutzpflanzen im Hinblick auf Resistenzen lediglich in bestimmten Fällen möglich oder günstig, es kann eine lange Zeit erfordern, und die erhaltene Resistenz kann nach einiger Zeit durch das Auftauchen neuer Stämme des Pathogens durchbrochen werden. Chemische Verbindungen sind oft in hohem Maße wirksam, jedoch können sie unerwünschte Effekte in der Umwelt haben; sie benötigen eine sorgfältige Handhabung, da die meisten von ihnen für die menschliche Gesundheit riskant sind, und sie können dort, wo sich resistente pathogene Stämme entwickeln, ineffektiv werden.[0004]
Die Verwendung von biologischen Kontrollagentien oder Biopestiziden kann wirksamer oder bevorzugter sein als die Verwendung von anderen Kontrollverfahren, und aus diesem Grund wurden derartige Agentien umfassend getestet. Von mehreren bakteriellen und Pilzstämmen ist bekannt, daß sie das Wachstum verschiedener mikrobieller krankheitsinduzierender Agentien inhibieren. Um wirksam und verwendbar zu sein, müssen sie stabil sein, auf dem Feld reproduzierbare Ergebnisse ergeben, und es muß Möglichkeiten geben, sie unter Feldbedingungen anzuwenden. Bis heute haben wenige diese Anforderungen erfüllt und wurden daher nicht als kommerzielle Produkte verwendet.[0005]

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biologisches Kontrollagens, das für die Kontrolle von Angriffen von Pflanzenpathogenen in kommerziellen Pflanzen nützlich und effektiv ist. Es wird ein neuer Stamm (MA 342) des Bakteriums Pseudomonas chlororaphis, der die gewünschten Eigenschaften zeigt, bereitgestellt. Das Isolat wurde bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Schottland, am 14. Februar 1994 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Zugangsnr. 40616 der NCIMB.[0006]
Die Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung zur Kontrolle von Pflanzenerkrankungen bereit, die als Wirkstoff den neuen Stamm MA 342 oder Mutanten davon mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften oder antipathogen wirkende Metaboliten oder Derivate davon bereit. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle von Pflanzenerkrankungen unter Verwendung des neuen Stammes MA 342 oder Mutanten davon mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften oder antipathogen wirksame Metaboliten oder Derivate davon bereit.[0007]

Kurze Beschreibung der Zeichnung

[0008]
Fig. 1: Diese Figur zeigt das Fettsäureprofil, das mit dem mikrobiellen Identifizierungssystem (Microbial Identification System (MIDI, Newark Ltd., USA)) des Bakterienisolats MA 342 erhalten wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

[0009] Im folgenden folgt eine Charakterisierung des neuen bakteriellen Stammes und eine Beschreibung der bevorzugten Verfahren zur Stammproliferation und für Formulierungen und Anwendungen im Feld oder im Gewächshaus. Es werden mehrere Beispiele gegeben, um das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Zusammensetzung darzustellen, nicht jedoch, um diese zu beschränken.

Charakterisierung des neuen bakteriellen Stammes MA 342

[0010] Morphologische Charakteristika: Die Morphologie der Kolonien auf TSA 10 (10 g tryptisches Sojamedium (Tryptic Soy Broth) (Difco Ltd.); 12 g technischer Agar (Oxoid Ltd.) in 1000 ml destilliertem Wasser) ist rund, weiß; es handelt sich um mäßig konvexe Kolonien, die gut sichtbare hyaline Kristalle im Agar bei hohen Zelldichten bilden. Es handelt sich um ein gramnegatives Stäbchen, das eine hellgelbe Fluoreszens auf Kings-Medium B (1,5 g K&sub2;HPO&sub4;; 1,5 g MgSO&sub4;·7 H&sub2;O; 20 g Proteose-Pepton (Difco Ltd.); 10 ml Glycerin, 15 g Bacto-Agar (Difco Ltd.) in 1000 ml destilliertem Wasser) zeigt.
[0011] Fettsäureanalyse: Das Fettsäureprofil des Bakteriums ist in Fig. 1 gezeigt. Diese Analyse wurde unter Verwendung des mikrobiellen Identifizierungssystems (Microbial Identification System (MIDI Ltd. Newark, USA)), Version 3.7 durchgeführt. Nach diesem Testprogramm ist MA 342 Pseudomonas chlororaphis mit einem Übereinstimmungsindex von 0,705 am ähnlichsten.

Biochemische Charakteristika:

[0012]
Charakteristika, die in dem API-20-NE* Schnelltest getestet wurden Reaktion des Isolates MA 342
Nitratreduktion -
Indolbildung -
Säure aus Glucose -
Arginindihydrolase +
Urease -
Esculinhydrolyse -
Gelatinhydrolyse +
B-Galactosidase -
Glucoseassimilierung +
Arabinoseassimilierung -
Mannoseassimilierung -?
Mannitassimilierung +
N-Acetylglucosaminassimilierung -
Maltoseassimilierung -
Gluconatassimilierung +
Capratassimilierung -
Adipatassimilierung -
Malatassimilierung +
Citratassimilierung +
Phenylacetatassimilierung -
Cytochromoxidase +
Charakteristika, die in zusätzlichen Tests getestet wurden
Levanbildung -
Xyloseassimilierung -?
Sorbitassimilierung +2
* API-System Ltd., France

Bevorzugte Verfahren zur Stammproliferation und für Formulierungen und Anwendungen auf dem Feld oder in Gewächshäusern

[0013] Größere Mengen des aktiven Stammes werden am besten mittels eines Fermentationsprozesses erhalten, der das Inokulieren einer Probe einer Reinkultur des Stammes in eine flüssige Schüttelkultur oder in einen Fermenter, der ein geeignetes Fermentierungsmedium enthält, umfaßt. Der Stamm kann auch auf einer sterilen Oberfläche, z. B. einer Agaroberfläche kultiviert werden, und wenn er gewachsen ist, können die Zellen in Wasser oder in anderen, dem Fachmann bekannten flüssigen Medien suspendiert werden. Das Wachstumsmedium kann prinzipiell jegliches Bakterien-Wachstumsmedium sein, das dem Fachmann bekannt ist. Die Fermentierung wird durchgeführt, bis eine ausreichende Konzentration von Zellen, z. B. etwa 5 bis 10&sup9; cfu (koloniebildende Einheiten)/ml für Flüssigkulturen erhalten wird. Das so erhaltene Fermentierungsmedium oder die so erhaltene bakterielle Suspension kann als solche zur Verwendung beim Pflanzenschutz verwendet werden, oder es/sie kann vor der Verwendung behandelt oder formuliert werden.
[0014] Bei einer Art der Behandlung können die bakteriellen Zellen in Fermentierungsmedium getötet werden, z. B. durch Erhitzen, oder abzentrifugiert werden, und das entstandene Medium oder der entstandene Überstand, der die bakteriellen Metaboliten enthält, kann zum Zwecke des Pflanzenschutzes mit oder ohne vorherige Reinigung und/oder Konzentrierung verwendet werden. Bakterielle Suspensionen und Fermentierungsmedien können ebenso mit einer Verbindung oder mehreren Verbindungen oder Gruppen von Verbindungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, homogen gemischt werden, mit der Maßgabe, daß derartige Verbindungen mit den bakteriellen Stämmen oder ihren antipathogen wirksamen Metaboliten oder deren Derivaten kompatibel sind. Geeignete Verbindungen können pulverförmige Additiva oder feste Träger, wie z. B. Talkum, Kaolin, Bentonit oder Montmorrilonit, benetzbare Pulver, die dem Fachmann bekannt sind, Kohlenstoffquellen-Nährstoffe (wie z. B. Glucose, Saccharose und Fructose) oder komplexe bakterielle Nährstoffe (wie z. B. Hefeextrakt, bakteriologisches Pepton und Trypton), Metallsalze, Fettsäuresalze, Fettsäureester, ionische oder nichtionische grenzflächenaktive Mittel, Pflanzennährstoffe, Pflanzenwachstumsregulatoren, Fungizide, Insektizide, Bakterizide und dergleichen sein. Bakterielle Suspensionen und Fermentationsmedien können auch getrocknet oder gefriergetrocknet werden, vor oder nachdem sie mit geeigneten Verbindungen gemischt werden, und die entstandenen Produkte können für den Pflanzenschutz verwendet werden. Ein geeigneter Trocknungsweg ist z. B. das Lufttrocknen von Vermikulit, das mit dem vom bakteriellen Fermentierungsmedium geliefert wird.
[0015] Bakterielle Präparationen und Metabolitenpräparationen können auf jegliche Art und Weise angewendet werden, wie für die Behandlung von Samen, vegetativen Vermehrungseinheiten, Pflanzen und Erde mit bakteriellen Stämmen bekannt ist. Sprühen, Atomisieren, Vernebeln, Ausstreuen, Pelletieren, Eintauchen oder Gießen kann gemäß dem angestrebten Ziel und der vorherrschenden Umstände ausgewählt werden. Normalerweise liegen die vorteilhaften Anwendungsmengen im Bereich von 10¹¹ bis 10¹² cfu/ha oder eine entsprechende Menge von bakteriellen Metaboliten bei der Samenbehandlung und im Bereich von 10 bis 10¹&sup4; cfu/ha oder eine entsprechende Menge von bakteriellen Metaboliten beim Sprühen.

Beispiel 1

Isolierung des Mikroorganismus MA 342

[0016] Die ausgegrabenen Wurzeln der Pflanze Empetrum nigrum wurden in sterilem Leitungswasser gewaschen, um daran heftende Erde zu entfernen. Aus einer jungen Wurzel wurde ein 2 bis 3 cm langes Stück ausgeschnitten und unter sterilen Bedingungen gehandhabt. Das Stück wurde aus dem Bereich oberhalb des Wurzelspitzenbereichs entnommen. Es wurden mit einem abgeflammten Skalpell kleine Schnitte in das Wurzelstück gemacht. Das Wurzelstück wurde dann an der Oberfläche von TSA-10-Agar gerieben. Nachdem Bakterien herangewachsen waren, wurde MA 342 aufgenommen und auf TSA-10 wurde eine Reinkultur hergestellt.

Beispiel 2

Konservierung des Mikroorganismus MA 342

[0017] Die Reinkultur wurde in kleinen Ampullen bei -70ºC tiefgefroren. Als Gefrierschutzmittel wurde 10% Glycerin in Leitungswasser, dessen pH nach dem Autoklavieren auf einen Wert von 7,15 eingestellt würde, verwendet. Nach dem Einfrieren bei -70ºC wurden die Ampullen bei -20ºC gelagert.
[0018] Für eine Konservierung für einen längeren Zeitraum wurde das Isolat gefriergetrocknet. Nach einem Kultivieren während 48 Stunden auf TSA-10-Agar wurde die Bakterienschicht von der Agaroberfläche abgekratzt, mit einem Gefriertrocken-Schutzmittel (50 g Dextran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd.); 50 g Na-L-Glutamat (Kebo AB) in 1000 ml destilliertem Wasser gemischt) in kleine Ampullen gegossen (20 ml) und in einem Hetosicc- Gefriertrockner (Heto Ltd., Dänemark) während 24 Stunden gegeben. Nach dem Gefriertrocknen wurden die Ampullen mit Gummistopfen gasdicht verschlossen und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 3

Wirkung von MA 342 gegen Microdochium nivale in primärem Gewächshaus- Untersuchungen

[0019] Das Bakterium wurde auf die Samen von Weizen wie folgt gegeben: 24 Stunden alte Kulturen auf TSA 10, bei 15ºC kultiviert, wurden von der Agar-Oberfläche einer 9-cm- Petrischale abgekratzt und mit 40 ml Nährmedium (SNB: 18 g Saccharose; 5 g bakterielles Pepton (Oxoid Ltd.); 2 g Hefeextrakt (Oxoid Ltd.); 0,5 g K&sub2;HPO&sub4; und 0,25 g MgSO&sub4;. 7 H&sub2;O in 1000 ml destilliertem Wasser mit einem pH, der auf einen Wert von 7,2 bis 7,4 eingestellt wurde) und 40 ml einer 2%(Gew./Vol.)-Lösung von Natriumcarboxymethylcellulose (CMC) in sterilem destilliertem Wasser gemischt. Das Gemisch wurde über die Samen gegossen. Nach 20 Minuten wurde überschüssiges Gemisch abgegossen, und die Samen wurden unter einem Gebläse über Nacht getrocknet.
[0020] Bei jeder Behandlung bei dieser Gewächshaus-Durchmusterung wurden in zwei Töpfen jeweils SO Samen ausgesät. Die Töpfe besaßen einen Durchmesser von 18 cm und eine Höhe von 4 cm und waren zu zwei Dritteln mit einem nichtsterilisierten kommerziellen Torfgemisch (Enhetsjord K Normal) mit 20% (Vol./Vol.) Sandgemisch gefüllt.
[0021] Die Winterweizensamen (Zuchtsorte: "Kosack") wurden künstlich mit M. nivale vor der Behandlung mit Bakterien infiziert. Das Pathogen wurde für 7 Tage in Kartoffeldextrosemedium (24 g Kartoffeldextrosemedium (Difco Ltd.) pro 1000 ml destilliertes Wasser) bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Die enstandene Aufschlämmung wurde mit einem Küchenmixer homogenisiert und über die Samen gegossen. Nach 30 Minuten wurde die Flüssigkeit abgegossen, und man ließ die Samen unter einem Gebläse über Nacht trocknen. Derartig infizierte Samen wurden dann mit MA 342 behandelt und wie oben beschrieben in Töpfe ausgesät.
[0022] Nach dem Aussäen wurden die Töpfe mit Glasdeckeln bedeckt und bei 6ºC in die Dunkelheit gegeben. Nach 5 Tagen wurden die Deckel entfernt, jeder Topf wurde mit 100 ml Wasser gewässert und in einen 5-Liter-Plastiksack gegeben, der von zwei Holzstäben getragen wurde. Die Töpfe wurden dann für 8 Tage bei 12 bis 15ºC in einem Gewächshaus aufbewahrt.
[0023] Die folgenden Samenbehandlungen wurden ausgetestet:
1. P. chlororoaphis-Stamm MA 342, mit SNB/CMC gemischt, auf M. nivale-infizierten Samen
2. M. nivale-infizierte Samen als Erkrankungskontrolle
3. Unbehandelte Samen als gesunde Kontrolle
[0024] Der krankheitsunterdrückende Effekt wurde als Prozentsatz der aufgehenden gesunden (= ohne Myzelien) Pflanzen, bezogen auf die ausgesäten Pflanzen, festgehalten. Die Ergebnisse einer typischen M. nivale primären Durchmusterung sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Wirkung von MA 342 auf das Aufgehen und die Krankheitsentwicklung in Winterweizen, der aus M. nivale-infizierten Samen gezogen wurde.

Beispiel 4

Wirkung von MA 342 gegen Drechslera teres in sekundären Gewächshaus- Untersuchungen

[0025] Für diese Durchmusterungen wurde das MA 342-Isolat für 48 Stunden in halbstarkem (15 g/l) tryptischem Sojamedium (tryptic soy broth) (Difco Ltd.) auf einem Rotationsschüttler in Dunkelheit bei 18 bis 20ºC kultiviert. Samen der Gerstenzudtsorte "Golf", die natürlicherweise mit D. teres infiziert waren, wurden dann mit 300 ml der resultierenden bakteriellen Suspension je kg Samen in einem Plastikbeutel gemischt, und nach dem Mischen wurde der Beutel während etwa 4 Minuten geschüttelt. Die so behandelten Samen wurden unter einem Gebläse bei Raumtemperatur während eines Tages getrocknet und dann wie in Beispiel 3 beschrieben in Töpfe ausgesät.
[0026] Die besäten Töpfe, drei je Behandlung, wurden zuerst im Dunkeln bei 6ºC für sieben Tage aufbewahrt und dann wie in Beispiel 3 beschrieben in ein Gewächshaus bei etwa 20ºC gegeben. Um die Behandlungswirksamkeit zu beurteilen, wurde die Häufigkeit gekeimter Pflanzen und die Häufigkeit von Pflanzen mit primärem Krankheitsauftreten im ersten Blatt gezählt. Die bakterielle Wirkung wurde in Bezug zu einer nichtbehandelten Kontrolle und in Bezug zu Samen, die mit dem Fungizid Panoctin Plus 400 (Guazatin 150 g/l + Imazalil 10 g/l), Rhone-Poulenc Ltd., in einer Dosierung von 4 ml pro kg Samen behandelt worden waren, gesetzt. Tabelle 2 Wirkung von MA 342 und Panoctin Plus 400 gegenüber D, teres in Gerste in einem typischen Gewächshaus-sekundären Durchmustern

Beispiel 5

Wirkung von MA 342 auf Pflanzenpathogene bei Feldexperimenten

[0027] Feldexperimente, die als randomisierte Blocks mit drei bis acht Wiederholungen ausgestaltet wurden, hatten Parzellengrößen, die zwischen den Experimenten von 0,15 m² (ein T. caries-Experiment) bis etwa 15 m² (die meisten Experimente) variierten. Die Experimente wurden an verschiedenen Orten in Schweden durchgeführt und zwar in den meisten Fällen auf lehmigem Boden mit einem Humusgehalt von etwa 3 Prozent.
[0028] Die Behandlung von Samen mit Bakterien und mit Panoctin Plus 400 erfolgte wie in Beispiel 4 oben beschrieben. Nachdem die behandelten Samen mit einem Gebläse getrocknet worden waren, wurden sie bei Raumtemperatur während verschiedener Zeitspannen gelagert, bevor sie in Feldparzellen ausgesät wurden. Alle Samen, mit Ausnahme von denjenigen, die mit T. caries infiziert waren, waren natürlicherweise mit den verschiedenen getesteten Erkrankungen befallen oder infiziert. Samen von Winterweizen (Zuchtsorte: "Kosack") wurden künstlich mit T. caries-Sporen durch Vermischen von 2 g zerquetschtem T. caries-Ähren mit 1 kg Weizensamen infiziert.

Wirkung von MA 342 auf Tilletia caries

[0029] Die Wirkung wurde als Häufigkeit infizierter Ähren zum Zeitpunkt des Reifens beurteilt. Ergebnisse, die in zwei Untersuchungen in den Jahren 1991/92 und zwei Untersuchungen in den Jahren 1992/93 erhalten wurden, sind in der Tabelle 3 gezeigt. Der Unterschied zwischen der bakteriellen Behandlung und der Fungizidbehandlung ist 1992/93 signifikant. Tabelle 3 Wirkung von MA 342 bakterieller Suspension gegenüber samenvermittelter Tilletia caries-Infektion
* Panoctin 400 (Guazatin 150 g/l), Rhone Poulenc Ltd.
Wirkung von MA 342 auf Drechslera teres. D. Graminea. D. avenae und Ustilago avenae
[0030] Bei den Feldexperimenten mit diesen Pathogenen wurde die Anzahl gekeimter Pflanzen pro m² und die Anzahl infizierter Pflanzen je m² gemessen und zusätzlich wurde bei den meisten Experimenten außerdem i) die Kornausbeute, ii) das Tausend-Korn-Gewicht und iii) das Gewicht je Hektoliter gemessen.
[0031] Wirkung auf Drechsela teres: Die Ergebnisse von Feldexperimenten, die in den Jahren 1991 bis 1993 durchgeführt wurden und bei denen die Wirkung gegen eine D. teres- Infektion in Gerste getestet wurde, sind in den Tabellen 4, 5 und 6 gezeigt. Tabelle 4 Ergebnisse aus vier Feldexperimenten mit Gerste, die mit Drechslera teres 1991 infiziert wurde. Mittelwerte aus vier Experimenten, die bei Alnarp, Lanna, Strängnäs und Ultuna durchgeführt wurden. Tabelle 5 Ergebnisse aus vier Feldexperimenten mit Gerste, die mit Drechslera teres 1992 infiziert wurde. Mittelwerte aus Experimenten, die bei Svalöf, Nygard, Kölbäck, Ultuna und Röbäcksdalen durchgeführt wurden. Tabelle 6 Ergebnisse aus zwei Feldexperimenten mit Gerste, die mit Drechslera teres 1993 infiziert wurde. Mittelwerte aus Experimenten, die bei Kölbäck und Ultuna durchgeführt wurden.
[0032] Wirkung auf Drechslera graminea: Die Ergebnisse von Experimenten mit D. graminea-infizierten Samen, die in den Jahren 1991 bis 1993 durchgeführt wurden, sind in Tabellen 7, 8 und 9 gezeigt. Tabelle 7 Ergebnisse aus einem Feldexperiment, das 1991 in Uppsala mit Gerste, die mit D. graminea infiziert war, durchgeführt wurde. Tabelle 8 Ergebnisse aus fünf Feldexperimenten mit Gerste, die mit D. graminea 1992 infiziert wurde. Mittelwerte aus Experimenten, die bei Svalöf, Nygard, Kölbäck, Ultuna und Röbäcksdalen durchgeführt wurden Tabelle 9 Ergebnisse aus zwei Feldexperimenten mit Gerste, die mit D. graminea 1993 infiziert wurde. Mittelwerte aus Experimenten, die bei Kölbäck und Ultuna durchgeführt wurden
[0033] Wirkung auf Drechslera avenae: Die Ergebnisse von Experimenten mit D. avenae-infizierten Hafersamen, die in den Jahren 1991 bis 1993 durchgeführt wurden, sind in den Tabellen 10, 11 und 12 gezeigt. Tabelle 10 Ergebnisse von einem Feldexperiment, 1991, durchgeführt in Uppsala mit Hafer ("Puhti"), der mit. avenae infiziert war. Tabelle 11 Ergebnisse aus vier Feldexperimenten mit Hafer ("Puhti" und "Vital"), der mit D. avenae 1992 infiziert wurde. Mittelwerte aus Experimenten, die bei Svalöfund Ultuna durchgeführt wurden. Tabelle 12 Ergebnisse von einem Feldexperiment, 1993 durchgeführt in Uppsala mit Hafer ("Vital"), der mit D. avenae infiziert war.
[0034] Wirkung auf Ustilago avenae: Im Feldexperiment mit II. avenae wurden die Weizensteinbrandähren pro m² oder der Prozentsatz von Weizensteinbrandähren zum Zeitpunkt des Reifens bestimmt. Der Kornertrag wurde nicht gemessen. Die Ergebnisse von drei Experimenten, die in den Jahren 1991 bis 1993 durchgeführt wurden, sind in der Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13 Ergebnisse von drei Feldexperimenten, die 1991 bis 1993 in Uppsala mit Hafer, der mit Ustilago avenae infiziert war, durchgeführt wurden.
1) 300 ml 1991 und 1992; 200 ml 1993

Beispiel 6

Anwendung von MA 342 auf Samen und andere Pflanzenteile

[0035] Anwendung wäßriger Gemische, die MA 342 enthalten auf Samen. Bakterielle Suspensionen, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurden oder die wie in Beispiel 4 oben beschrieben hergestellt wurden, wurden mit jeder der folgenden Substanzen oder Verbindungen gemischt:
Talkum-Puder (Kebo Lab AB), 48 g/l bakterieller Suspension
Bakteriologisches Pepton (Oxoid, Ltd.), 5 g/l bakterieller Suspension
Tween 20 (Merck Ltd.), 20 ml/Liter bakterieller Suspension
Metocel (Celluloseether, Sveda Kemi AB), 12 g pro Liter bakterieller Suspension
Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd.), 1 g pro Liter bakterieller Suspension
Bond (Newman Agrochemicals Ltd.), 1 g pro Liter bakterieller Suspension
[0036] In anderen Experimenten wurden die bakteriellen Suspensionen bei 10.000 · g während etwa 10 min zentrifugiert, und die entstandenen Pellets wurden in entweder 0,1 M MgSO&sub4; oder in Peptonwasser (5 g bakteriologisches Pepton (Oxoid, Ltd.) je Liter Leitungswasser) resuspendiert.
[0037] Nach gründlichem Mischen wurden die entstandenen Suspensionen auf Samen, wie in Beispiel 4 für nichtgemischte bakterielle Suspensionen beschrieben, angewendet.
[0038] Anwendung gefriergetrockneter Bakterien auf Pflanzensamen: MA 342- Bakterien, die in einer Schüttelkultur, wie in Beispiel 4 oben beschrieben, kultiviert wurden, wurden zentrifugiert, und das entstandene Pellet wurde in einer Lösung entrahmter Milch (200 g entrahmtes Milchpulver, Semper AB, Schweden, je Liter sterilisiertes destilliertes Wasser) als Gefriertrocknungsschutzmittel resuspendiert. Das Gemisch wurde in Glasgefäßen rollschichtgefroren und dann in diesen Gefäßen während etwa 48 Stunden in einen Hetosicc-Gefriertrockner (Heto Ltd., Dänemark) gefriergetrocknet. Das entstandene Pulver wurde bei 4ºC in Plastikbeuteln oder in Plastikflaschen mit einem Schraubverschluß bis zur Verwendung gelagert. Für eine Anwendung auf Samen wurde das Pulver entweder in Wasser oder in anderen wäßrigen Lösungen gemischt und dann, wie in Beispiel 4 für bakterielle Suspensionen beschrieben, auf Samen aufgetragen, oder es wurde mit Samen in einem trockenen Zustand durch gründliches Schütteln des Pulvers und der Samen (etwa 10 g Pulver je kg Samen) in einem Plastikbehälter gemischt.
[0039] Pelletieren von Samen. die mit MA 342 behandelt wurden. MA 342-Bakterien, die in einer Schüttelkultur, wie in Beispiel 4 oben beschrieben, kultiviert wurden, wurden in 1 : 1-Volumenteilen mit einem Haftmittel (2% Gew./Vol. wäßrige Lösung von Natriumcarboxymethylcellulose oder 50% Gew./Vol. wäßriger Lösung von Gummi arabicum) gemischt. Die Samen wurden mit diesem Gemisch wie in Beispiel 4 oben behandelt. Eine überschüssige Menge an Bentonit (Dresser Minerals Inc.) oder Talkumpulver (Kebo Lab AB) wurde dann zu dem Plastikbeutel gegeben, der Beutel wurde aufgeblasen und kräftig während einiger Minuten geschüttelt. Danach wurden die Samen auf große Schalen unter einem Gebläse ausgebreitet, und man ließ sie bei Raumtemperatur trocknen.
[0040] Besprühen von Pflanzenschößlingen mit bakteriellen Suspensionen. MA 342- Bakterien, die in einer Schüttelkultur wie in Beispiel 4 oben beschrieben kultiviert wurden, wurden in Plastikhandsprüher oder in Pulversprüher gefüllt und dann auf Pflanzenblätter und -schößlinge aufgesprüht. Bei anderen Behandlungen wurden die Bakterien zuerst bei etwa 10.000 · g während zehn Minuten zentrifugiert, das Pellet wurde in Leitungswasser resuspendiert, und diese entstandene bakterielle Suspension wurde zum Besprühen von Pflanzenblättern und -schößlingen verwendet.

Beispiel 7

Wirkung gereinigter MA 342-Metaboliten gegenüber Erkrankungen, die durch Drechslera teres verursacht werden, in Gewächshausexperimenten.

[0041] Das MA 342-Isolat wurde für 48 Stunden in halbstarkem (15 g/l) tryptischem Sojamedium (tryptic soy broth) (Difco Ltd.) auf einen Rundschüttler in der Dunkelheit bei 18 bis 20ºC kultiviert. Die entstandene bakterielle Suspension wurde bei 48.000 g während 30 min zentrifugiert, und Metaboliten im Überstand wurden dann mit Sep-pak-C-18-Kartuschen (Waters Associates) wie folgt gereinigt:
1. 80 ml Überstand wurde zu Sep-pak, das mit 10 ml Methanol aktiviert wurde, gegeben.
2. Das Sep-pak wurde zuerst mit 5 ml 30% Ethanol und dann mit 5 ml 40% Ethanol gewaschen.
3. Die Metaboliten wurden mit 5 ml 70% Ethanol eluiert.
4. Das 70%-Ethanoleluat wurde in einem Rotationsverdampfer verdampft, bis etwa 1,5 ml Wasserlösung zurückblieben. Es wurde dann mit Leitungswasser bis zu einem Volumen von 6,5 ml verdünnt.
[0042] Samen der Gerstenzuchtsorte "Golf", die natürlicherweise mit D. teres infiziert waren, wurden in diese 6,5 ml Wasserlösung des Metaboliten für 30 Minuten getaucht und wurden dann in Töpfe mit 50 Samen je Topf ausgesät. Die Töpfe wurden mit Glasdeckeln bedeckt und bei 6ºC im Dunkeln aufbewahrt. Nach 9 Tagen wurden die Deckel entfernt, und die Töpfe wurden in ein Gewächshaus bei 15 bis 22ºC für etwa 2 Wochen gegeben. Gekeimte Pflanzen und Krankheitsangriffe wurden dann wie in Beispiel 4 oben erfaßt. Als Kontrolle wurden 1) unbehandelte Samen und 2) Samen, die mit einem Überstand, der nicht mit Sep-pac gereinigt wurde und MA 342-Zellen enthielt, verwendet. Tabelle 14 Wirkung gereinigter Metaboliten von MA 342 und Überstand, der MA 342-Zellen enthält, gegenüber D. teres in Gerste in einer typischen Gewächshaus-Austestung

Beispiel 8

Die Ergebnisse von Vergleichstests von MA 342-Isolat und 11 anderen Isolaten von Pseudomonas chlororaphis, die von verschiedenen Kultursammlungen erhalten wurden

[0043] Elf verschiedene nicht-schwedische Pseudomonas chlororapis-Isolate mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Bezeichnungen wurden zusammen mit MA 342-Isolat verwendet, um die Wirkung gegenüber der Blattfleckerkrankung in der Gerste zu bestimmen und um Umsetzungen in biochemischen Tests gemäß dem API-20-NE-Testsystem zu induzieren. Zusätzlich wurden die Isolate im Hinblick auf das Aussehen der Kolonien und der Kristallbildung auf Agarplatten verglichen. Die 11 nicht-schwedischen Isolate stammen von verschiedenen Ländern und sind in vier verschiedenen anerkannten Kultursammlungen hinterlegt (Tabelle 1).

Test der erkrankungsinhibierenden Fähigkeit im Gewächshaustest

[0044] Die Tests wurde mit Drechslera teres infizierter Gerste wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, und alle Isolate wurden gleichzeitig getestet, um einen adäquaten Vergleich zu erhalten. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigen die Ergebnisse, daß MA 342 in klarer Weise in der Hinsicht einzigartig ist, daß kein anderes hier getestetes Isolat die Eigenschaft von MA 342 bei dieser Testart besitzt, d. h. die Fähigkeit, die Infektion durch Drechslera teres zu inhibieren. Tabelle 1 Bezeichnungen, Herkunftsland und Wirkung von MA 342 und 11 anderen P. chlororaphis- Isolaten gegenüber einer D. teres-Infektion in Gerste in Gewächshaus-Tests

Induktion von Reaktionen in biochemischen Tests nach dem API-20-NE- Testsystem

[0045] Die Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Sie zeigen, daß MA 342 auch in dieser Hinsicht einzigartig ist und von den anderen elf getesteten Isolaten unterschieden werden kann. Nach diesen Test können einige der getesteten Isolate nicht als zentral innerhalb der Spezies Pseudomonas chlororaphis betrachtet werden. Tabelle 2 Induzierte Reaktionen durch die verschiedenen Isolate, getestet in einer Reihe von biochemischen Tests nach dem API-20-NE-Testsystem. Ein "+" bedeutet eine positive Reaktion und ein "-" bedeutet keine/negative Reaktion. Tabelle 2 (Fortsetzung) Induzierte Reaktionen durch die verschiedenen Isolate, getestet in einer Reihe von biochemischen Tests nach dem API-20-NE-Testsystem. Ein "+" bedeutet eine positive Reaktion und ein "-" bedeutet keine/negative Reaktion.

Vergleich des Aussehens der Kolonien und der Kristallbildung auf Agarplatten

[0046] Die Isolate wurden in Petrischalen auf TSA 10, wie oben beschrieben, kultiviert. Es wurden geringe Unterschiede in Bezug auf das Aussehen der Kolonien zwischen allen verschiedenen Isolaten beobachtet, doch konnten nicht alle Isolate auf diese Weise unterschieden werden. Jedoch war das MA 342-Isolat das einzige Isolat, das typische Hyalinkristalle im Agar bildet und das deshalb aufgrund dieser Eigenschaft von allen anderen Isolaten unterschieden werden kann.

Claims

1. Pseudomonas chlororaphis-Stamm, hinterlegt bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Schottland, mit der NCIMB-Zugangsnummer 40616 oder biologisch reine Kulturen davon mit der Fähigkeit, antipathogen aktive Metaboliten zu bilden, oder Mutanten davon, die im wesentlichen die gleichen Charakteristika aufweisen wie der Elternstamm.

2. Zusammensetzung zur Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen, die durch pathogene Pilze hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff den in Anspruch 1 beanspruchten Mikroorganismus oder Kulturmedium davon, das antipathogen aktive Metaboliten davon enthält, enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daßdas Pathogen der Pilz Drechslera teres ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pathogen der Pilz Drechslera graminea ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pathogen der Pilz Drechslera avenae ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daßdas Pathogen der Pilz Microdochium nivale ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daßdas Pathogen der Pilz Tilletia caries ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daßdas Pathogen der Pilz Ustilago avenae ist.

9. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff im Gemisch mit einer Trägerzusammensetzung vorliegt, die für die landwirtschaftliche Verwendung annehmbar ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff im Gemisch mit einem flüssigen Träger vorliegt.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daßder Wirkstoff in einem festen porösen Material imprägniert ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter Additiva enthält, die als Haftmittel dienen.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiter eine Nährstoffquelle enthält.

14. Verfahren zur Bekämpfung von Pilzkrankheiten, die durch pathogene Pilze hervorgerufen werden, umfassend das Einbringen einer wirksamen Dosis eines Wirkstoffs in die Umgebung, in welcher das krankheitserzeugende Agens inhi biert werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff der in Anspruch 1 beanspruchte Mikroorganismus oder Kulturmedium davon, das antipathogen aktive Metaboliten oder Derivate davon enthält, ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff auf Samen angewendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff auf vegetative Vermehrungseinheiten von Pflanzen angewendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff auf Pflanzen angewendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff einem Wachstumsmedium zugesetzt wird, in dem eine Pflanze wächst oder wachsen soll.