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CN111944728B - 一株绿针假单孢菌及其应用 - Google Patents

一株绿针假单孢菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株绿针假单孢菌，分类命名为Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm‑1，已于2019年12月25日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20191103。本发明的绿针假单胞菌Zm‑1对花生白绢病病原菌具有拮抗作用，在大田环境下喷洒处理花生可以大大降低花生白绢病的发病比率，起到较好的生防效果，并且绿针假单胞菌Zm‑1可以在花生根际良好的定殖，使得花生可持续性的对抗花生白绢病病原菌，延长其生防效果，从而有效的提高产量。

Description

一株绿针假单孢菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种绿针假单孢菌及其在生物防止中的应用。
背景技术
花生白绢病是由花生白绢病致病菌—齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)侵染花生茎基部、果柄、果荚及根引起的是一种真菌性土传病害。花生染病后,染病部位呈褐色软腐状，表面长出白色绢丝状菌丝体。花生幼苗期染病会造成幼苗茎叶枯黄、枯死，成株期造成叶片黄化凋萎、植株死亡。近年来，花生白绢病的发生频率不断增强，严重地块病株率达到60％以上,直接影响花生的产量与品质，甚至会造成绝收。花生大田染病,扩散蔓延较快,而且一旦入侵，连年积累，很难防治和根除。
目前，对于花生白绢病病害尚缺乏有效抗病品种，病害的防治主要通过化学防治的方法，由于农药的大量使用，不仅导致花生种植成本的提高，还存在农药残留、环境污染等问题。生物防治作为一种有广泛前途的植物病害的防治方法，目前已经成为国内外研究和应用的热点。
发明公开号CN108893418A的发明专利“一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治的应用”公开了一株可以用于生物防止的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂，其液态发酵液可环境友好的在一定程度上抑制白绢病的生长，但其抑菌率仅为76.7％,需要进一步提高，另外其采用发酵液离心后得到的上清液施入作物，其沼泽红假单胞菌菌株不能在花生的根基持续性存在，抑制白绢病的持续性和稳定性就收到了限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中生物防治花生白绢病的菌株抑菌效果有待进一步提高的缺陷，提供一株绿针假单孢菌及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一株绿针假单孢菌，分类命名为Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiacaZm-1，已于2019年12月25日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20191103。
本发明的绿针假单胞菌Zm-1是从开封田间，知母草植株中分离得到的，短杆状，个体较小，两端钝圆，革兰氏阴性，接触酶实验阴性，不产生芽孢，在LB平板上菌落不透明、光滑、湿润、橙色、单极生鞭毛，该菌具有运动性，产生过氧化氢酶、吩嗪及其衍生物等可能的生防相关因子。该绿针假单孢菌及其突变体、代谢产物可以按照常规方法用于对花生白绢病的生物防治。
在盆栽实验中，将绿针假单胞菌Zm-1菌株在LB培养基中扩大培养后，制备成一定浓度的菌悬液。花生花期接种白绢病菌，每株茎基部周围放置2g麦粒沙白绢病菌培养物，并无菌保湿60h。3d后用喷壶均匀喷洒绿针假单胞菌Zm-1菌悬液。接种白绢病菌后第7d开始调查植株的发病株数及发病程度,每隔7d调查一次。在大田实验中接入白绢病菌7d后，用喷雾器喷洒方式将菌液(菌悬液浓度6×108cell.mL-1)遍淋花生茎基部。8d后进行第二次喷洒，对照喷洒等量清水。喷洒生防菌液前，第一次喷洒生防菌液20d后和收获2d前分别调查发病株数。
本发明的绿针假单胞菌Zm-1对花生白绢病病原菌Sclerotium rolfsii Sau具有拮抗作用，在大田环境下以绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiacaZm-1喷洒处理花生可以大大降低花生白绢病的发病比率，起到较好的生防效果，并且可以有效的提高产量。6次重复试验平均防效为65.2％，实验平均亩产产量提高26％；另外绿针假单胞菌Zm-1可以再花生根际良好的定殖，使得花生可以持续性的对抗花生白绢病病原菌，从而延长其生防效果。本发明为花生白绢病的生防提供了一株全新的菌株，其生防效果与现有的已报到菌株效果相比非常具有竞争力，表明该菌株具备良好的应用和开发前景。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiacaZm-1的电镜图片；
图2是对峙实验测定结果；
图3是大田花生根际获得的橙色菌落的PCR鉴定结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
1、绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm-1的分离与鉴定
1.1菌株的分离
选取健康知母草，取新鲜知母草根系，自来水冲洗表面，剔除根系表面的颗粒物杂质，滤纸吸去水分，用无菌水洗涤根系表面，将洗涤后的悬液进行稀释，取稀释液涂布固体培养基平板在28—30℃培养1—2d；菌落长出后再纯化培养于4—6℃保存。
所述的培养基为改良LBS培养基，具体成分为：胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母提取物(yeast extract)2.5g、柠檬酸钠1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 14g，KH2PO46g，葡萄糖1g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
1.2 ZM-1菌株形态特征及生理生化特征测定
ZM-1菌株，菌落圆形，表面凸起，粘稠，产生橙色色素，全缘。菌体为杆状，革兰氏阴性，极生鞭毛，有运动性，无芽孢。细胞大小，0.3～0.5×1.1～1.2μm。
表1 ZM-1生理生化特征
Figure BDA0002650394120000041
2、绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm-1与病原菌的对峙实验
2.1菌株准备
将活化后的绿针假单胞菌ZM-1菌株培养物转接于LB液体培养基中，每瓶培养基装液量30ml，200rpm振荡培养，30℃，培养24h,放4℃冰箱备用。将白绢病菌接种于PDA平板上，30℃培养24h，放4℃冰箱备用。
2.2对峙实验
将活化的白绢病菌平板培养物打成菌饼，将菌饼置于PDA平板中央，在距离平板中央2cm处对称位置点种ZM-1菌株菌悬液5μL，以加等量无菌水的平板为对照；30℃培养24h，统计ZM-1菌株对白绢病菌的抑制率。
抑制率计算按以下公式进行：生防菌抑制率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。
2.3对峙实验测定结果
如图2所示，平板对峙培养后，取多个重复试验平均值，计算得出试验菌株ZM-1对小核菌的抑菌率为73％。
3、盆栽试验
3.1盆栽实验生防效果测定方法
在直径15cm的塑料花盆中装满灭菌砂质营养土,播种花生,催芽的花生仁每盆2粒,整齐顺序摆放于温室内,每天浇一次水。
绿针假单胞菌ZM-1菌悬液的制备：将活化后的ZM-1菌株培养物转接于LB液体培养基中，每瓶培养基装液量30mL，200rpm振荡培养，30℃培养24h,用细菌计数板将菌液浓度调整到3×108cellmL-1，放4℃冰箱备用。
白绢病菌接种：花生花期接种白绢病菌，每株茎基部周围放置2g麦粒沙白绢病菌培养物，并无菌保湿60h。3d后用喷壶均匀喷洒ZM-1菌悬液。接种白绢病菌后第7d开始调查植株的发病株数及发病程度,每隔7d调查一次。
3.2花生白绢病分级标准
0级：无可见症状；
1级:花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积不超过总面积25％；
2级:花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积占总面积25％～50％；
3级:花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积占总面积50％～75％；
4级:花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积超过总面积的75％，植株枯死。
病情指数＝∑(各级发病代表值×该级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％
3.3盆栽实验生防测试结果
绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm-1处理后能明显降低花生白绢病病害病情指数和发病率(表2)，6次重复试验平均防效为82.5％。
表2盆栽生防防效
Figure BDA0002650394120000051
注：表中数据为6次重复实验平均值，其后有相同字母的表示差异不显著(P＝0.05)。
4、田间试验
4.1大田生防实验方法
小区实验设计：随机排列，3次重复，每区面积10m2，单行双粒均匀点播，花生仁播种量20-25g/m2。中等肥力栽培,花生培土迎针时进行追肥。
白绢病菌接种：花生播种后花期接种白绢病菌，在植株茎基部周围放置5g麦粒沙白绢病菌培养物。
生防菌悬液喷施设计：接种白绢病菌7d后，用喷雾器喷洒方式将菌液遍淋花生茎基部，绿针假单胞菌ZM-1菌悬液浓度为6×108cell.mL-1。喷洒生防菌液前调查统计各试验小区发病株数，8d后进行第二次喷洒，对照喷洒等量清水。第一次喷洒生防菌液后20d和收获前2d调查发病株数。花生白绢病分级标准同盆栽实验。
4.2田间生防实验测试结果
表3田间防效
Figure BDA0002650394120000061
表4田间试验产量
Figure BDA0002650394120000062
每实验小区面积10m2，每亩地面积约667m2
结果表明：在大田环境下以绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphissubsp.aurantiaca Zm-1喷洒处理花生可以大大降低花生白绢病的发病比率，起到较好的生防效果，并且可以有效的提高产量。6次重复试验平均防效为65.2％，实验平均亩产产量提高26％。
5、绿针假单胞菌ZM-1在花生根部的定殖情况测定
将田间防效大田处理的小区采取五点取样(5个小区共25个取样点)，每个取样点选取10株花生，分别于喷洒菌液前和收获前一天取土样。取土样时，利用无菌不锈钢打孔器靠近花生幼苗根际打孔取样，孔深度为3cm，每株苗打三孔，取出土样后分别装入无菌离心管中。二分法取土样，将10g土样溶入盛有100mL无菌水的三角瓶内，室温摇床200rpm震荡20min后，经梯度稀释涂布PDA平板，30℃培养24h，绿针假单胞菌ZM-1在PDA培养基上能产生橙色色素，形成橙色菌落，统计平板上橙色菌落数，计算单位土样的菌落形成单位。实验重复三次。
经对土样处理分析，测定了ZM-1菌株在大田小区条件下在花生根际的定殖能力。结果显示没有喷洒ZM-1菌株的土壤菌落计数时，平板上没有橙色菌落的菌株生长。喷洒ZM-1菌株的土壤样品，经检测每克土壤该菌株保持在105菌落形成单位(CFU)。利用PCR方法对橙色菌落进行特异性扩增，证明其为施用的ZM-1菌株。说明ZM-1菌株能在花生根际良好的定殖。如图3所示，橙色菌落的PCR鉴定，两泳道的CK为ZM-1菌株扩增出的两个特征性片段，泳道A-D和A/-D/为PCR鉴定随机挑选的4个菌落。
本发明绿针假单胞菌Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm-1是从大田知母植株上分离得到，温室盆栽及大田实验结果显示该菌株对花生白绢病有良好的防效，为花生白绢病的生防提供了更多的选择。其生防效果表明改菌株具备良好的应用和开发前景。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.绿针假单孢菌在防治花生白绢病中的应用，其特征在于，应用的方法如下：
S1、绿针假单胞菌ZM-1菌悬液的制备：将活化后的ZM-1菌株培养物转接于液体培养基中培养获得发酵液，将发酵液的菌体菌浓度调整到1～6×108cellmL-1，放4℃冰箱备用；
S2、用喷雾器喷洒方式将菌悬液遍淋花生茎基部，
所述的绿针假单孢菌分类命名为Pseudomonas cholroraphis subsp.aurantiaca Zm-1，已于2019年12月25日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20191103；其细胞大小为0.3～0.5×1.1～1.2μm，菌体为杆状，革兰氏阴性，极生鞭毛，有运动性，无芽孢；菌落圆形，表面凸起，粘稠，产生橙色色素，全缘。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，该菌株采用改良LBS培养基培养，具体成分为：胰蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、柠檬酸钠1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 14g，KH2PO4 6g，葡萄糖1g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
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