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KR100891720B1 - 식물병에 대한 저항성을 유도하는 슈도모나스 클로로라피스ｏ6 유래 4-카바모일페닐아세트산 및 그의 용도 - Google Patents

식물병에 대한 저항성을 유도하는 슈도모나스 클로로라피스ｏ6 유래 4-카바모일페닐아세트산 및 그의 용도 Download PDF

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KR100891720B1
KR100891720B1 KR1020070093239A KR20070093239A KR100891720B1 KR 100891720 B1 KR100891720 B1 KR 100891720B1 KR 1020070093239 A KR1020070093239 A KR 1020070093239A KR 20070093239 A KR20070093239 A KR 20070093239A KR 100891720 B1 KR100891720 B1 KR 100891720B1
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pseudomonas
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plant
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김인선
김영철
박명렬
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전남대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 매개 들불병(wild fire)에 대한 저항성을 유도하는, 슈도모나스 클로로라피스 O6(Pseudomonas chlororaphis O6)로부터 유래된 4-카바모일페닐아세트산(4-carbamoylphenylacetic acid), 상기 물질을 함유하는 식물병 저항성 유도제, 및 상기 물질을 이용하는 식물병 저항성 유도방법에 관한 것이다.
슈도모나스 시린개 pv. 타바시, Pseudomonas syringae pv. tabaci, 담배 들불병, 슈도모나스 클로로라피스 O6, Pseudomonas chlororaphis O6, 4-카바모일페닐아세트산, 식물병 저항성 유도제, 식물병 예방, 식물병 방제

Description

식물병에 대한 저항성을 유도하는 슈도모나스 클로로라피스 Ｏ6 유래 4-카바모일페닐아세트산 및 그의 용도{4-carbamoylphenylacetic acid from Pseudomonas chlororaphis O6 inducing systemic resistance against plant diseases, and uses thereof}
본 발명은 식물병에 대한 저항성을 유도하는 신규 물질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 매개 들불병(wild fire)에 대한 저항성을 유도하는, 슈도모나스 클로로라피스 O6(Pseudomonas chlororaphis O6)로부터 유래된, 화학식 1의 4-카바모일페닐아세트산[(4-carbamoylphenyl)acetic acid], 상기 물질을 함유하는 식물병 저항성 유도제, 및 상기 물질을 이용하는 식물병 저항성 유도방법에 관한 것이다.
Figure 112007066521090-pat00001
식물은 생육전반에 걸쳐 병을 일으키는 다양한 미생물들의 공격에 노출되어 있다. 식물이 병에 걸리게 되면 생장 및 생육이 억제되고 여러 형태의 병징을 나타낸다. 결과적으로, 식물의 일부 또는 전체가 죽게 되는 결과를 초래하며 작물의 경우 생산성이 급격히 감소하게 된다. 화학합성 농약을 사용하지 않고 미생물학적으로 식물병을 예방 또는 치료하는 친환경적인 기술로는 항생물질을 생성하는 미생물을 이용하는 방법(문헌 [Folman, L.B. et al. (2004) Biol Control 31, 145-154]), 효소를 생성하는 미생물을 이용하는 방법(문헌 [Chae, D.H. et al. (2006) Biocontrol 51, 339-351]), 식물의 발육을 촉진시키는 방법(문헌 [Zdor, R. et al. (1992) Plant Soil 140, 99-107]) 등과 같이 다양하다. 또한, 식물병이 발생하기 전에 미리 페나진(phenazine)을 생성하는 미생물을 식물에 처리함으로써 식물로 하여금 병에 대한 저항성을 갖게 하여 병에 걸리지 않게 하는 예방법도 있다(문헌 [Pierson, L.S. et al. (1992) Mol Plant-Microbe Interact 5, 330-339]). 페나진 이외에도 아시벤졸라-S-메틸(acibenzolar-S-methyl)(문헌 [Kunz W. et al. (1997) J Pestic Sci 50, 275-282]), 2,6-디클로로이소니콘틴산(문헌 [Metraux J.P. et al. (1991) Mol Plant-Microbe Interact 1, 432-439]), 살리실산(문헌 [Sticher L. et al. (1997) Annu Rev Plant Pathol 35, 235-270]), 프로베나졸(probenazole)(문헌 [Watanabe T. (1997) J Pestic Sci 2, 394-404]), 베타-아미노부티르산(문헌 [Tosi et al. (1998) J Phytopathol 146, 259-280]) 등도 식물병에 대한 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자는 토양으로부터 식물 병원균에 대한 전신 저항성과 가뭄에 대한 내성을 유도하는 능력을 가지는 식물 근권 미생물인 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주(수탁번호 KACC 91054)를 분리·동정해내고, 균주 자체와 상기 균주를 이용하여 식물 병원균, 특히 고추 세균성 시들음병균, 오이 갈반병균, 세균성 점무늬병균, 오이 모자이크 바이러스, 담배 무름병균, 담배 들불병균, 묘시들음병균, 토양 곰팡이에 대한 전신 저항성을 유도하는 방법에 대해 출원번호 제2003-62692호로 특허출원하여 등록번호 제521,744호로 특허를 받은 바 있다. 슈도모나스 클로로라피스 O6는 식물이 병에 대한 저항성을 갖게 하여 그 병을 예방하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있으며(문헌 [Spencer, M., et al. (2003) Physiol Mol Plant Pathol 63, 27-34]), 페나진과 같은 기존의 식물병 저항성 유도물질 생성과는 무관하게 식물병 저항성을 유도하는 것으로 보고되어 있다(문헌 [Han, S.H., et al. (2006) Moi Plant-Microbe Interact 19, 924-930]). 그러나 지금까지 슈도모나스 클로로라피스 O6의 어떠한 대사물질이 담배 들불병 저항성을 유도하는 기능을 하는지에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 들불병은 담배 병해의 하나로서, 슈도모나스 시린개 pv. 타바시라고 하는 세균의 기생에 의해서 일어난다. 잎에 수침상(水浸狀)의 작고 짙은 황색의 반점이 생기고 후에 병반(病斑) 둘레에 뚜렷한 황색의 무리가 생긴다. 병반은 옆의 병반과 이어지면서 커져 결국 잎은 갈래갈래 찢어진다. 이 병은 특히 폭풍우가 지난 후에 마치 들불이 퍼지듯 급속히 번져서 큰 피해를 주므로 들불병이라고 불린다.
본 발명자들은 상기 슈도모나스 클로로라피스 O6의 어떤 대사물질이 들불병 저항성 유도에 관여하는지를 규명하기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 신규 물질인 4-카바모일페닐아세트산이 식물병 저항성을 유도하는 활성 물질임을 밝혀내고 상기 물질이 실제로 담배 들불병에 대한 저항성을 유도하는 활성을 나타냄을 생물학적으로 검증함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병에 대한 저항성을 유도하는, 슈도모나스 클로로라피스 O6로부터 유래된 신규 물질, 4-카바모일페닐아세트산을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 4-카바모일페닐아세트산을 함유하는, 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병에 대한 저항성 유도제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 4-카바모일페닐아세트산을 이용하여, 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병에 대한 저항성을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
첫째, 본 발명은 화학식 1의 4-카바모일페닐아세트산에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112007066521090-pat00002
상기 물질은 식물병, 특히 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병에 대한 저항성을 유도하는, 슈도모나스 클로로라피스 O6로부터 유래된 신규 물질이다.
둘째, 본 발명은 유효성분으로서 4-카바모일페닐아세트산을 함유하는, 식물병에 대한 저항성 유도제에 관한 것이다. 상기 식물병은 바람직하게는 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병이다.
셋째, 본 발명은 식물체 뿌리에 4-카바모일페닐아세트산을 처리하는 단계를 포함하는, 식물병에 대한 저항성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 식물병은 바람직하게는 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병이다.
본 발명은 식물병(예를 들어, 담배 들불병)에 대한 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있었으나 그 기작 및 활성물질은 밝혀져 있지 않았던 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주가 4-카바모일페닐아세트산을 생성함으로써 식물병에 대한 저항성을 유도하는 것을 최초로 규명한 것으로서, 4-카바모일페닐아세트산은 기존에 밝혀진 식물병 저항성 유도물질과 상이한 신규 물질이다. 본 발명을 이용하면, 식물(예를 들어, 담배)이 식물병(예를 들어, 슈도모나스 시린개 pv. 타바시 매개 들불병)에 대한 저항성을 갖게 함으로써 상기 식물병을 예방하는 효과를 나타내는 바, 기존에 밝혀진 식물병 저항성 유도물질과 더불어 식물병 예방 및 방제제로 효과적으로 사용될 수 있으며, 농작물 재배에 적용 시 농작물의 생산성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 물질은 화학적으로 합성된 것이 아닌 생물학적으로 얻어진 것으로서, 친 환경 농업에서 식물병 방제 및 예방을 위해 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는, 식물병(예를 들어, 담배 들불병)에 대한 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있었던 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주가 생산하는 대사산물을 분리·동정하고, 이 물질이 실제로 식물병 저항성을 유도하는 활성을 갖는지를 검증하였다. 즉, 슈도모나스 클로로라피스 O6의 배양액을 여러 용매를 이용하여 추출 및 크로마토그래피 정제하고, 용매 및 크로마토그래피 정제 분획별 담배 들불병 저항성 유도활성을 시험하였다. 분리된 활성물질의 화학구조를 질량분석기와 핵자기공명분석기를 이용하여 분석하여 4-카바모일페닐아세트산으로 동정하고, 상기 물질이 실제로 들불병 저항성 유도활성을 갖는지를 생물학적으로 검증하였다.
본 발명에서 담배 들불병 저항성 유도활성을 보이는 대사물질은 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주의 배양액의 부탄올 추출물에 함유되어 있다. 상기 부탄올 추출물은 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주의 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 수용액 층을 얻고, 이 수용액 층을 pH 2~4.5, 특히 pH 2 조건에서 부탄올로 추출하여 얻어질 수 있다. 상기 대사물질은 상기 추출물을 ODS 칼럼 크로마토그래피법으로 정제한 경우 40% 메탄올을 함유한 수용액 용출액에 함유되어 있다. 이로 인해 상기 추출물 및 용출액도 담배 들불병 저항성 유도활성을 나타낸다.
또한, 상기 대사물질은 상기 칼럼 크로마토그래피 정제 후 C-18 고상 칼럼이 부착되고 PDA 검출기가 장착된 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 파장 270 ㎚에서 트리플루오로아세트산이 첨가된 pH 2 조건의 20% 아세토니트릴 수용액 혼합 이동상으로 용리하여 분석하여 나타난 주요 크로마토그램을 대상으로 분획한 추출물에 함유되어 있다. 이로 인해 이 분획물도 담배 들불병 저항성 유도활성을 나타낸다.
본 발명에서는, 상기의 반복적인 액체크로마토그래피 분석에서 얻어진 크로마토그램을 각각 분획하여 단일물질로 단리한 후, 단리된 물질별로 담배 들불병 저항성 유도활성 시험을 수행하였으며, 담배 들불병 저항성 유도활성을 보인 단리 물질을 질량분석기와 핵자기공명분석기를 통해 4-카바모일페닐아세트산으로 동정하였다.
본 발명에서는, 상기 물질이 실제로 담배 들불병 저항성을 유도하는지를 알아보기 위해 단리된 순수 물질을 담배의 뿌리에 처리한 다음 들불병균을 감염시킨 후 담배의 병징을 조사하였다. 또한, 기존에 담배 들불병에 대한 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있는 참조 화합물(reference chemical)인 살리실산과 나노실리카를 비교 대상으로 선정하여 들불병 저항성 유도활성을 조사하였다.
본 발명에 따른 4-카바모일페닐아세트산은 물에 용해하여 68 mM 수준으로 담배의 뿌리에 미리 처리한 후 들불병원균인 슈도모나스 시린개 pv. 타바시를 처리한 경우, 80% 이상의 들불병 발병 억제활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 효과는 참조 화합물로 사용된 살리실산과 나노실리카와 유사한 수준의 효과이다. 따라서 본 발명의 4-카바모일페닐아세트산은 담배로 하여금 들불병에 대한 저항성을 갖게 하여 들불병을 예방하는 효과를 나타낼 수 있다. 4-카바모일페닐아세트산 은 물을 비롯한 수용성 용매에 용해하여 50~100 mM 수준으로 담배나 그의 서식지에 처리할 수 있으며, 바람직하게는 담배 뿌리에 관주하여 처리할 수 있다.
그밖에도, 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주는 고추 세균성 시들음병균, 오이 갈반병균, 세균성 점무늬병균, 오이 모자이크 바이러스, 담배 무름병균, 묘시들음병균, 토양 곰팡이에 대한 전신 저항성과 가뭄에 대한 내성을 유도하는 활성을 갖는 바, 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주로부터 유래된 4-카바모일페닐아세트산은 이러한 병원균에 대한 저항성을 유도하여 그에 의해 매개되는 식물병의 예방 및 방제와, 가뭄에 의한 작물 피해 경감에도 사용가능할 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물의 배양, 및 배양액의 추출 및 정제
슈도모나스 클로로라피스 O6 균주(수탁번호 KACC 91054)를 루리아 브로스(LB) 및 항생제 암피실린과 스트렙토마이신이 각각 100 ㎎/ℓ가 포함된 액체 배지에서 27 ℃, 150 rpm에서 60 시간 배양하였다.
상기에서 얻은 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주 배양액을 8000 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 상징액을 상징액의 두배 부피에 해당하는 에틸아세테이트로 용매추출을 실시하였다. 얻어진 수용액 층을 1 N 염산(HCl) 으로 pH를 2로 보정한 후 두배 부피에 해당하는 부탄올로 추출하였다. 부탄올 층을 수거하여 감압 농축한 후 30% 메탄올에 재용해하고, ODS 겔(와코실(Wakosil) C18, 일본) 칼럼크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였다. ODS 겔을 유리 칼럼(5 ㎝×50 cm, 가로×세로)에 메탄올로 슬러리 충진시킨 후, 물-메탄올 용매계를 이동상으로 하여 메탄올 비율을 10%씩 증가시키는 방법으로 용출 및 분획하였다. 40% 메탄올 용출분획에서 얻어진 분획을 다시 C-18 고상 칼럼과 PDA 검출기가 장착된 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 활성물질의 분리 및 분취를 실시하였다. 고속액체크로마토그래피의 분취 및 분석 조건은 다음과 같았다.
① 기기모델: 디오넥스(Dionex) p680 HPLC
② 검출기: PDA-100 포토다이오드 어레이 디텍터(Photodiode Array Detector)
③ 분석파장: 270 nm
④ 분취칼럼: 워터스μ-본다팩™ 프렙 칼럼(Watersμ-Bondapak™ prep column)(C18 10 ㎛ 125 Å 19×300 mm)
⑤ 이동상: 트리플루오로아세트산이 함유된 pH 2 조건의 20% 아세토니트릴/물
⑥ 이동상 유속: 4 ㎖/분
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 고속액체크로마토그래피 분석을 통해 최종적으로 분리한 물질은 단일물질로 나타났다.
실시예 2: 단리물질의 구조 결정
실시예 1에서 얻은 단일 물질의 화학구조를 고해상도 질량분석, 액체크로마토그래피 질량분석, 핵자기공명분석 방법을 통해 규명하였다.
고해상도 질량분석 결과 분리한 물질의 분자량은 179.0602였으며, 분자식은 C7H10O2N2로 추정되었다. 액체크로마토그래피 질량분석 결과 (M+H)+값이 180이었으며 이는 163, 136, 119의 딸이온을 생성하였다. 딸이온의 질량분석 경향은 각각 m/z 163은 C2H7O3, m/z 136은 C7H6NO, m/z 119는 C8H7O2를 의미하였다(도 2).
또한, 핵자기공명분석 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
Figure 112007066521090-pat00003
표 1에 나타낸 바와 같이, 1H-NMR(500 MHz, CD3OD)의 분석결과, δ2.15(s, 3H), δ7.65(d, 2H), δ7.95(d, 2H)에서 신호를 관찰하였다. 13C-NMR(500 MHz, CD3OD)을 통하여 7개의 탄소 신호를 관찰하였고, SP 3 탄소 1종(δ22.14), 카보닐 탄소 1종(δ172.11), 4차 탄소 2종(δ127.51, δ144.52), 올레핀 메틴 탄소 2종(δ120.18, δ 131.90)으로 구성된 화합물임을 확인하였다.
이상의 질량분석 및 핵자기공명분석 결과로부터 분리한 물질은 4-카바모일페닐아세트산으로 확인되었고(도 3), 이는 지금까지 보고되지 않는 신규 화합물이었다.
실시예 3: 담배 들불병 저항성 유도활성의 생물학적 검증
담배 종자를 70% 에탄올과 하이포아과염소산(HClO4)을 이용하여 표면 소독한 후, 비타민, 당 및 영양 물질이 포함된 배양 접시에서 3 일 동안 배양한 후 종자를 발아시켰다. 배양액 조성은 다음과 같다.
비타민 함유 무라시게 & 스쿠그(Murashige & Skoog) 배지 4.4 g/ℓ
2-모르폴리노에탄설폰산 일수화물 0.5 g/ℓ
슈크로스 30 g/ℓ
파이토젤 아가 5 g/ℓ
발아된 종자를 조직 배양접시로 옮겨 심은 후, 명조건과 암조건이 각각 14 시간 및 10 시간 되는 장소에서 담배를 배양하였다. 약 2 주일 후 담배 잎이 5~6개까지 생장하였을 때 실시예 2에서 분리된 들불병 저항성 유도물질, 4-카바모일페닐아세트산을 물에 용해한 다음 68 mM 수준으로 담배 뿌리에 관주처리하였다. 처리 5일 후 담배 들불병원균 슈도모나스 시린개 pv. 타바시를 1.0×108 세포 수준으로 담배 잎에 처리하였다. 병원균 처리 3 일 후 담배 잎에서 관찰되는 들불병 발병을 조사하였다. 대조구에는 증류수를 처리하였으며, 참조구에는 1 mM 농도의 살리실산과 80 mM의 나노실리카를 처리하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 4-카바모일페닐아세트산은 대조구에 비해 약 80% 수준의 담배 들불병 발병 억제효과를 나타내었다. 이는 참조화합물인 실리실산과 나노실리카의 발병 억제효과와 유사한 수준이었다. 즉, 단일물질을 분리하기 전 슈도모나스 클로로라피스 O6 배양원액을 처리한 경우에도 들불병 발병율은 대조구에 비해 현저하게 억제되었으며, 이 배양액으로부터 순수 분리된 4-카바모일페닐아세트산처리 시에도 현저한 들불병 발병 억제효과를 나타내었다. 이는 참조화합물 처리 시와 유사한 효과였다.
상기 결과는 본 발명의 4-카바모일페닐아세트산이 담배에서 슈도모나스 클로로라피스 O6가 식물병 저항성 유도활성을 나타내게 하는 주요 대사물질임을 의미하는 것이다.
도 1은 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주 배양액에서 분리한 식물병 저항성 유도물질 4-카바모일페닐아세트산의 액체크로마토그래피 분석 결과를 보여주는 도면이고;
도 2는 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주 배양액에서 분리한 식물병 저항성 유도물질 4- 카바모일페닐아세트산의 액체크로마토그래피 질량분석 결과를 보여주는 도면이며;
도 3은 슈도모나스 클로로라피스 O6 균주 배양액에서 분리한 식물병 저항성 유도물질 4- 카바모일페닐아세트산의 화학구조를 보여주는 도면이며;
도 4는 생물학적 검정 실험에서 식물병 저항성 유도물질 4- 카바모일페닐아세트산의 식물병 발병 억제효과를 나타낸 그래프이고;
도 5는 식물병 저항성 유도물질 4- 카바모일페닐아세트산을 처리한 후 담배의 식물병원균 감염 정도를 보여주는 사진이다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 하기 화학식 1의 4-카바모일페닐아세트산을 유효성분으로 함유하는, 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 매개 들불병에 대한 저항성 유도제.
    [화학식 1]
    Figure 112008054044458-pat00010
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 4-카바모일페닐아세트산은 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis) O6(KACC 91054) 균주의 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 수용액 층을 얻고, 이 수용액 층을 pH 2~4.5 조건에서 부탄올로 추출하여 얻은 부탄올 층에 함유되어 있는 것인 저항성 유도제.
  5. 담배 또는 그의 서식지에 하기 화학식 1의 4-카바모일페닐아세트산을 처리하는 단계를 포함하는, 담배의 슈도모나스 시린개 pv. 타바시(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 매개 들불병에 대한 저항성을 유도하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112008054044458-pat00011
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 4-카바모일페닐아세트산은 슈도모나스 클로로라피스 O6(KACC 91054) 균주의 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 수용액 층을 얻고, 이 수용액 층을 pH 2~4.5 조건에서 부탄올로 추출하여 얻은 부탄올 층에 함유되어 있는 것인 저항성 유도방법.
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