CN103614312B - 一株有效控制玉米纹枯病并促进玉米生长的绿针假单胞菌 - Google Patents
一株有效控制玉米纹枯病并促进玉米生长的绿针假单胞菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株有效控制玉米纹枯病并促进玉米生长的绿针假单胞菌，属于微生物技术领域。该菌株为绿针假单胞菌（Pseudomonas chloroaphis）PSJ1，分离自小麦根际，其保藏编号为CGMCC NO.7932。该菌不仅对玉米植株有促生作用，还可抑制玉米纹枯病菌的生长，减轻纹枯病的发生。
Description
技术领域
本发明属微生物领域，涉及一种绿针假单胞菌及应用，特别是涉及一种有效抑制立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)并能促进玉米生长的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。
背景技术
玉米(Zea mays)是我国主要粮食、饲料作物及重要的工业原料，在我国国民经济和农业生产上占有重要地位，玉米生产直接关系着我国粮食战略安全。近年来玉米纹枯病、小斑病和弯孢霉叶斑病等病害发生愈来愈普遍，危害日益加重，严重制约了玉米生产的发展。
在农业病虫害的综合防治中，化学防治占据重要地位，但是化学农药的长期不合理大量使用不仅污染环境，破坏生态平衡，同时对人畜的健康带来不利影响。随着社会的进步和生活水平的提高，人们对环境质量和绿色无公害食品的要求越来越高。
土壤中存在着各种各样的微生物，其中包括细菌、真菌、放线茵、原生动物和藻类等。其中有些微生物对植物病原菌有良好的抑制作用，在植物病害防治中有重要的应用价值。假单胞菌属中的许多菌株，特别是荧光假单胞菌群分布广、数量多，营养需求简单、繁殖快、竞争定殖力强，可产生多种抗生素和活性物质，能诱导某些植物产生系统性而备受关注。
本发明从小麦根际分离到一株绿针假单胞菌(Pseudomonas choloeaphis)，命名为PSJ1。该菌株能有效抑制立枯丝核菌的生长，降低玉米纹枯病的发生，并能够促进玉米植株生长。
发明内容
本发明目的是提供一株拮抗玉米纹枯病菌的绿针假单胞菌(Pseudomonas chloroaphis）PSJ1菌株，其在玉米纹枯病等的生物防治、促进作物增产等方面有非常好的效果。
本发明是采用如下技术方案实现的：菌株PSJ1分离自山东泰安麦田。通过室内平板对峙实验和温室防效测定，筛选出具有良好防病作用的拮抗菌株，命名为PSJ1。通过对该菌16SrRNA序列测定和系统进化分析将其鉴定为绿针假单胞菌(Pseudomonas choloeaphis)。
本发明涉及的菌株对多种玉米病原真菌具有拮抗作用。室内拮抗实验显示该菌株对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani）、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata Boedijn)等均有较好的抑制效果。
播种时用浓度为108CFU/ml的PSJ1菌悬液进行浇灌，待玉米长至2-3叶期，再用上述菌悬液对植株进行叶片喷施，14d后测量PSJ1对玉米的促生效果。同对照相比，用PSJ1处理可显著促进玉米植株生长，植株地上、地下鲜重分别增加54%和43%。
温室防效实验表明，用生防菌PSJ1处理的玉米植株，在接种玉米纹枯病原菌后同对照相比，病斑扩展受到抑制，达到显著水平（p<0.05），防病效果明显。
保藏信息
保藏时间：2013年7月16日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC
保藏编号：CGMCC NO.7932
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名:绿针假单胞菌（pseudomonas chloroaphis）
附图说明
图1绿针假单胞菌PSJ1对病原真菌的拮抗作用
A为玉米纹枯病菌，B为小麦赤霉病菌，C为玉米小斑病菌。左侧为蘸有PSJ1菌液的滤纸片，右侧为清水。
图2菌株PSJ116S rDNA基因的扩增产物
图3用NJ法根据16S rDNA序列构建的系统进化树
图4玉米叶鞘接种纹枯病菌后7天后植株发病情况
A为农大108，B为郑单958
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1：根际促生菌的分离和初筛
根际促生菌的分离采用方中达（1979）的方法。取采集到的土样10g，加入到盛有90mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置摇床上，180r/min振荡20min，制成土壤悬液。将制备好的土壤悬液静置5min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5，每个浓度吸取200μL于NA平板上，涂布均匀，每个浓度重复三次。然后将涂好的NA平板于28℃恒温培养箱中培养24h。
待NA平板上出现细菌菌落时，将白地霉(Geotrichum candidum)孢子悬液（105个孢子/mL）均匀喷施于已经长出菌落的NA平板上。喷布要均匀，每皿大约200μL。喷施的量不要过多，以防止形成水流把长好的菌落冲散。
选取周围出现明显抑菌圈的菌落，用移菌环挑取菌体，在NA平板上划线，将平板放入28℃培养箱中培养12h。待长出单菌落后再次挑取菌落划线，重复三次，得到纯的细菌。用牙签挑取筛选得到的菌落放入盛有5mL液体LB培养基的试管中，28℃振荡培养14-16h。取1mL菌液，加入到2mL的离心管中，然后再加入15%甘油混匀，于-80℃冰箱中保存。
实施例2：根际促生菌抑菌谱的测定
采用对峙培养法（Sijam等，2005）。在直径为90mm的PDA平板中央接直径为9mm的玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani、小麦赤霉病菌Gibberella zeae和玉米小斑病菌Bipolaris maydis的菌饼，然后用封口膜封好平板，放入28℃培养箱中培养2天。将直径为6mm的灭菌滤纸片蘸取准备好的细菌菌液（108cfu/mL），移到距离病原菌边缘15mm处，对称放置，对照只接病原菌菌饼，封口，最后放入28℃培养箱中培养。每个处理重复3次。3d后测量接细菌处病原菌菌落直径和对照病原菌菌落直径，计算抑制率。
结果表明，PSJ1对供试病原菌有非常好的抑制效果（图1）。PSJ1对Rhizoctonia solani、Gibberella zeae、Bipolaris maydis的抑制率分别为71.1％、82.4％和85.5％。
实施例3：菌株16S rRNA序列的获得
以绿针假单胞菌(Pseudomonas choloaphis)基因组为模板，通过PCR扩增其16S rDNA。所用上游和下游引物分别为16S-F:5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'，16S-R:
5'-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应程序为94℃3min；94℃30s，54℃45s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。反应结束后，将PCR产物置于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析。参照美国AXYGEN公司PCR纯化回收试剂盒回收PCR产物，在16℃水浴中与pMD18-T连接过夜。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase buffer1μL，pMD18-T（50ng/μL）0.3μL，目的DNA7.7μL，T4DNA Ligase（350U/μL）1μL。
利用热激法将连接产物转化感受态细胞。具体方法为：将100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻搅动以混匀，将混合物于冰上放置20min，然后42℃水浴热激90S，迅速冰上放置5min，然后加800μL LB液体培养基（不含抗生素），混匀，37℃，220r/min振荡45min。6000rpm离心5min，取出上清至剩余200μL，重悬菌体，将菌体均匀涂在含有氨苄青霉素的抗生素平板上，然后将平板正向放置30min，37℃倒置培养16-20h，至长出单菌落。
碱裂解法提取质粒DNA（韩志勇等，2000）。将提取的质粒置于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，以空pUC18质粒作为对照。如果电泳泳动率与pUC19相同，说明无外源片段插入；如果比pUC19的电泳泳动速率慢，说明在pMD18-T中已经插入外源片段。选择泳动速率慢的质粒进行PCR鉴定。所用PCR程序：94℃3min；94℃30s，54℃45s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，将PCR产物置于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析。鉴定好的含有重组质粒的菌株，以菌液形式送上海博尚公司测序。每个菌液样品2个克隆。将测序结果用BLAST软件与GenBank中的相关属种的16S rDNA序列进行比对，利用Mega软件构建进化树。
电泳检测表明，从PSJ1基因组中扩增到了大约1.3kb的片段（图2）。经过测定，PSJ1菌株16SrDNA含有1287bp，具体序列如SEQ.NO.1所示。
在根据16SrDNA序列构建的系统树中，PSJ1与针假单胞菌聚类到一起，说明PSJ1属于绿针假单胞菌（图3）。
实施例4：PSJ1菌株对玉米的室内促生试验
选取大小一致的郑单958玉米种子进行表面消毒，将消毒完全的玉米种子用无菌水浸泡催芽10h，每隔2-3小时换一次水。催芽后的种子进行温室盆栽实验，在装有灭菌土的花盆（190mm×160mm）中每盆点播4粒，每个处理6盆，三次重复。
用无菌水调整PSJ1菌浓度为108CFU/ml，每盆浇灌40ml；待玉米长至2-3叶期，叶面均匀喷施菌浓度为108CFU/ml的PSJ1菌悬液，对照组喷施等量清水。处理14d后测量株高（土面以上至植株最高处）、根数、根长，以及地上和地下部分的鲜重。结果见表1。
表1PSJ1对玉米生长性状的影响
从表1中可以看出，用PSJ1菌悬液处理可显著促进玉米植株的生长及根的生长。同时，PSJ1处理促进了植株鲜重的增加，同对照相比地上和地下鲜重分别增加54%和43%。
实施例5：PSJ1菌株对玉米纹枯病的防效效果
选取大小一致的玉米种子进行表面消毒，将消毒完全的玉米种子用无菌水浸泡催芽10h，每隔2-3小时换一次水。催芽后的种子进行温室盆栽实验，在装有灭菌土的花盆（190mm×160mm）中每盆点播4粒，每个处理6盆，三次重复。用无菌水调整PSJ1菌浓度为108CFU/ml，每盆40ml进行浇灌。待玉米长至两叶一心期，用菌悬液进行灌根处理，每盘40ml（108CFU/ml）每隔两天灌根一次，连续三次，以清水处理为对照。第三次灌根后一周分别接种强致病力玉米纹枯病菌（YWK-100）于根际，适当保湿，观察玉米发病与病斑扩展情况并进行统计。结果见图4和表2。
表2根际接种YWK-100植株病斑扩展长度及植株发病率
从表中可以看出，处理植株上病斑扩展长度要显著低于对照，而且PSJ1处理郑单958和农大108都能显著提高植物抗病性。
以上所述，仅是本发明的个别实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一株绿针假单胞菌，其特征在于命名为绿针假单胞菌PSJ1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC；保藏号：CGMCC NO.7932；其16SrRNA核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一株绿针假单胞菌PSJ1在防治玉米纹枯病中的应用，其中病原菌是Rhizoctonia solani。
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