DE69419919T2

DE69419919T2 - Technetium-99m markierte peptide zur bilderzeugung der entzuendung

Info

Publication number: DE69419919T2
Application number: DE69419919T
Authority: DE
Inventors: Richard Dean; Brian Moyer
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1993-06-07
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2014-05-26
Also published as: ATE182795T1; ZA943984B; ES2135585T3; JPH08509001A; EP0702570A1; US5561220A; GR3031351T3; JP2941060B2; DK0702570T3; DE69419919D1; EP0702570B1; CA2164707A1; US5714579A; WO1994028942A1; AU684294B2; CA2164707C; SG44702A1; AU7045394A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen, bei denen es sich um radiomarkierte szintigraphische Abbildungsmittel handelt, Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung solcher radiomarkierter Zusammensetzungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Technetium-99m markierte szintigraphische Abbildungsmittel, die Zusammensetzungen eines polysulfatierten Glykans oder Gemisches davon und einer Verbindung, die eine mehrbasige, mit einer mit Technetium-99m (Tc-99m) radiomarkierten Radiomarkierung bindenden Komponente kovalent verknüpfte Komponente umfaßt, sind. Verfahren und Kits zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung derartiger Zusammensetzungen, um Infektions- und Entzündungsorte in einem Säugetierkörper abzubilden, werden ebenfalls bereitgestellt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Es besteht ein klinisches Bedürfnis, in der Lage zu sein, die Lokalisierung und/oder das Ausmaß von Orten fokaler oder lokalisierter Infektion und Entzündung zu bestimmen. Bei einer erheblichen Anzahl von Fällen gelingt es mit herkömmlichen Diagnoseverfahren (wie etwa physische Untersuchung, Röntgenstrahlen, CT und Ultrasonographie) nicht, derartige Orte (z. B. einen Abszeß) zu identifizieren. Obwohl man von Biopsie Gebrauch machen könnte, ist es bevorzugt derartige invasive Prozeduren zu vermeiden, zumindest so lange, bis sie zur Identifizierung des für einen Abszeß an einer bekannten Stelle verantwortlichen Pathogens diagnostisch eingesetzt werden können. Die Identifizierung des Ortes einer derartigen "verborgenen" Infektion ist wichtig, da eine rasche Lokalisierung und Identifizierung des Problems für effektive therapeutische Gegenmaßnahmen kritisch ist.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin können bestimmte pathologische Zustände lokalisiert werden oder kann das Ausmaß solcher Zustände bestimmt werden durch Abbilden der inneren Verteilung von verabreichten radioaktiv markierten Nachweisverbindungen (d. h. Radiotracern oder Radiopharmazeutika), die sich spezifisch an dem pathologischen Ort anreichern. Es ist eine Vielzahl von Radionukliden bekannt, die zur Radioabbildung geeignet sind, umfassend &sup6;&sup7;Ga, 99mTc (Tc-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb und ¹&sup8;&sup6;Re.
Ein Abszeß kann jedoch durch ein beliebiges von vielen möglichen Pathogenen verursacht werden, so daß ein für ein bestimmtes Pathogen spezifischer Radiotracer von beschränkter Nutzbarkeit wäre. Andererseits ist Infektion fast ausnahmslos von Entzündung begleitet, was eine allgemeine Körperantwort auf Verletzung von Gewebe ist. Es würde daher erwartet werden, daß ein für Entzündungsorte spezifischer Radiotracer zur Lokalisierung von Orten einer durch ein beliebiges Pathogen hervorgerufenen Infektion sowie zur Lokalisierung von anderen Entzündungsorten geeignet wäre.
Eines der Hauptphänomene in Zusammenhang mit Entzündung ist die Lokalisierung von Leukozyten (weißen Blutzellen), üblicherweise von Monozyten und Neutrophilen, am Entzündungsort. Ein Leukozyten-spezifischer Radiotracer wäre für eine Bestimmung von Leukozyten am Ort einer lokalisierten Infektion geeignet. Derzeit anerkannte nuklearmedizinische Verfahren zur Abbildung von Infektionsorten verwenden entweder Indium-111 markierte Leukozyten (¹¹¹In-WBC) (siehe z. B. Peters, 1992, J. Nucl. Med. 33: 65-67) oder Gallium-67 (&sup6;&sup7;Ga) -Citrat (siehe z. B. Ebright et al., 1982, Arch. Int. Med. 142: 246-254). Ein größerer Nachteil einer Verwendung von "'In-markierten WBCs besteht darin, daß die Herstellung des Radiotracers eine Reihe von technischen Schritten erfordert: sterile Entnahme von autologem Blut, sterile Isolierung der Leukozyten aus dem Blut, sterile Markierung der Leukozyten unter Bedingungen, welche die Zellen nicht beschädigen (da beschädigte WBC bei Reinjektion durch das retikuloendotheliale System aufgenommen werden) und sterile Rückführung (Reinjektion) der (nun markierten) Leukozyten in den Patienten. Weiterhin kann eine 12- bis 48-stündige Verzögerung zwischen Injektion und Abbildung erforderlich sein, um optimales Abbilden zu erhalten. Obwohl Tc-99m markierte Leukozyten verwendet wurden, um diesen Verzögerungszeitraum zu verkürzen (siehe z. B. Vorne et al., 1989, J. Nucl. Med. 30: 1332-1336), ist immer noch eine Markierung außerhalb des Körpers erforderlich. Ein bevorzugter Radiotracer wäre einer, der entweder Leukozyten in Gesamtblut markieren würde, oder der eine Entfernung und Manipulation von autologen Blutkomponenten ex corpora nicht erfordern würde.
Alternativ kann &sup6;&sup7;Ga-Citrat durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Diese Verbindung ist jedoch für Infektions- oder Entzündungsorte nicht spezifisch. Weiterhin ist oftmals eine Verzögerung von bis zu 72 Stunden zwischen Verabreichung des Radiotracers und dem Abbilden erforderlich. Zusätzlich sind die γ-(gamma) Emissionsenergien von &sup6;&sup7;Ga für herkömmliche gamma-Kameras nicht gut geeignet.
Radiomarkierte monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen human- Leukozyten (umfassend Monozyten, Neutrophile, Granulozyten und andere Zelltypen) gerichtet sind, sind entwickelt worden. Monoklonale, Tc-99m markierte anti-Granulozyten Antikörper (siehe z. B. Lind et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 417-473) und ¹¹¹In-markiertes nicht spezifisches human-Immunglobulin (siehe z. B. LaMuraglia et al., 1989, J. Vasc. Surg. 10: 20-28) wurden für eine Bestimmung von durch eine Infektion verursachten Entzündungen getestet. ¹¹¹In-markiertes IgG weist die Nachteile von ¹¹¹In-markierten WBC auf, indem 24-48 Stunden zwischen Injektion und optimalem Abbilden erforderlich sind. Zusätzlich sind radiomarkierte Antikörper schwierig herzustellen, und müssen langwierige Zulassungsverfahren durchmachen, da sie von Genehmigungsbehörden routinemäßig als biologische Stoffe klassifiziert werden.
Kleine, einfach zu synthetisierende Moleküle sind zur routinemäßigen Verwendung als Radiopharmazeutika bevorzugt. Es besteht klar ein Bedarf für kleine synthetische Moleküle, die entweder zur Markierung von Leukozyten in Gesamtblut (d. h. ohne die Erfordernis, die Leukozyten von den anderen Komponenten aus Gesamtblut zu isolieren) verwendet werden können, oder die einem Patienten direkt injiziert werden können und durch Lokalisierung an Orten, an denen sich Leukozyten angereichert haben, Infektions- und Entzündungsorte abbilden.
Eine Art eines kleinen, einfach zu synthetisierenden Moleküls, das in solchen Anwendungen geeignet ist, sind Peptide. Die Empfindlichkeit von Abbildungsverfahren unter Verwendung von radioaktiv markierten Peptiden ist erheblich höher als andere in der Technik bekannte Techniken, da die spezifische Bindung des radioaktiven Peptids das radioaktive Signal über den interessierenden Bereich, beispielsweise einen Entzündungsort, konzentriert. Zusätzlich sind chemische Syntheseverfahren mit hoher Ausbeute für kleine Peptide in der Technik gut bekannt.
Radioaktiv markierte Peptide, und insbesondere Formyl-Methionyl-Leucyl- Phenylalanyl(fMLF)-enthaltende Peptide, sind im Stand der Technik beschrieben worden.
Zoghbi et al., 1981, J. Nucl. Med. 22: 32 (Zusammenfassung), offenbaren aus Bakterien stammende chemotaktische Formylpeptidfaktoren (fMLF), die an ¹¹¹In- markiertes Transferrin gekoppelt sind.
Jiang et al., 1982, Nuklearmedizin 21: 110-113, offenbaren ein mit ¹²&sup5;I radiomarkiertes chemotaktisches, formyliertes Peptid (fMLF).
Fischman et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 482-491, betrifft Konjugate von chemotaktischem Formylpeptid (fMLF) - ¹¹¹In-markierter DTPA.
EPC 90108734.6 betrifft Konjugate von chemotaktischem Formylpeptid (fMLF) - ¹¹¹In-markierter DTPA.
US-Patent Nr. 4,986,979 betrifft die Verwendung von radiomarkierten, chemotaktischen Formylpeptiden (fMLF) zur Radiomarkierung von Leukozyten außerhalb des Körpers über eine Photoaffinitätsmarkierung.
PCT WO90/10463 betrifft die Verwendung von radiomarkierten, chemotaktischen Formylpeptiden (fMLF) zur Radiomarkierung von Leukozyten außerhalb des Körpers über eine Photoaffinitätsmarkierung.
Die im vorstehend erwähnten Stand der Technik bekannte Verwendung von markierten fMLF-Peptiden weist den schwerwiegenden Nachteil auf, daß dieses Peptid ungünstige physiologische Reaktionen wie etwa eine Freisetzung von Superoxid aus Neutrophilen verursacht (Niedel und Cuatrecasas, 1980, Formyl Peptide Chemotactic Receptors of Leucocytes and Macrophages, in Curr. Top. Cell Reg. 17: 137-170), und in ausreichenden Dosierungen können diese Verbindungen Leukopenie verursachen (Jiang et al., 1982, Nuklearmed. 21: 110-113).
Eine andere Quelle für Entzündungsort-spezifische Peptide ist Plättchenfaktor 4, ein natürlich vorkommendes chemotaktisches Peptid, das aus 70 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von 7.800 Dalton aufweist, und von dem im Stand der Technik bekannt ist, daß es an Neutrophile und Monozyten, bekanntermaßen in vivo mit Entzündungs- und Infektionsorten assoziierte Zelltypen, bindet. Von Interesse in bezug auf die vorliegende Erfindung bindet der Carboxylterminus von PF4 bekanntermaßen an polysulfatierte Glykane wie etwa Heparin (Loscalzo et al., 1985, Arch. Biochem. Biophys. 240: 446-455). Zusätzlich besteht ein Vorteil von PF4 gegenüber den im Stand der Technik bekannten fMLF-Verbindungen darin, daß er sogar bei Konzentrationen von 20 uM keine Freisetzung von Superoxid aus Neutrophilen verursacht (Bebawy et al., 1986, J. Leukocyte Biol. 39: 423-434).
Thorbecke & Zucker, 1989, europäische Patentanmeldung Nr. 88111962.2, offenbaren Zusammensetzungen und Verfahren zur Modulierung von Immunreaktionen, umfassend das Verabreichen einer immunmodulierenden Menge von Plättchenfaktor 4 oder davon abgeleiteten Peptiden.
Deuel et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2256-2258, offenbaren die Aminosäuresequenz von human-Plättchenfaktor 4.
Deuel et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4584-4587, offenbaren, daß Plättchenfaktor 4 in vitro für Neutrophile und Monozyten chemotaktisch ist.
Osterman et al., 1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 107: 130-135, offenbaren, daß das Carboxy-terminale Tridecapeptid von Plättchenfaktor 4 chemotaktische Eigenschaften hat.
Holt & Niewiarowski, 1985, Sem. Hematol. 22: 151-163, stellen einen Überblick über die Biochemie von Plättchen-α-Granula-Proteinen, einschließlich Plättchenfaktor 4, bereit.
Goldman et al., 1985, Immunol. 54: 163-171, zeigen, daß fMLF-Rezeptor-vermittelte Aufnahme in human-Neutrophile durch Plättchenfaktor 4 und ein Carboxy-terminales Dodecapeptid davon inhibiert wird.
Loscalzo et al., a. a. O., beschreiben die biochemische Wechselwirkung zwischen Plättchenfaktor 4 und Glucosaminoglykanen wie etwa Heparin.
Bebawy et al., a. a. O., beschreiben die Plättchenfaktor 4-vermittelte chemotaktische Reaktion von Neutrophilen in vitro.
Maione et al., 1989, Science 247: 77-79, offenbaren, daß Gefäßbildung durch rekombinanten human-Plättchenfaktor 4 und Peptidfragmente davon inhibiert wird.
Die Verwendung von Chelatbildnern zur Radiomarkierung von Polypeptiden, und Verfahren zur Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit Tc-99m sind im Stand der Technik bekannt (vgl. beispielsweise WO93/17719).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt szintigraphische Abbildungsmittel bereit, bei denen es sich um Zusammensetzungen, umfassend radioaktiv markierte Reagenzien und polysulfatierte Glykane, handelt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen reichern sich in vivo an Entzündungsorten an. Die Reagenzien, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten sind, bestehen selbst aus mehrbasigen Verbindungen, die zu einer spezifischen Lokalisierung an Infektions- oder Entzündungsorten fähig sind, oder Komponenten davon, wobei die Verbindungen kovalent mit Komponenten verknüpft sind, die ein Radioisotop, bevorzugt Technetium-99m, binden.
Es wurde unerwarteterweise herausgefunden, daß die Kombination aus einer Tc- 99m radiomarkierten mehrbasigen Verbindung und einem polysulfatierten Glykan, wie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, vorteilhaft den Erhalt szintigraphischer Abbildungen von fokalen Infektions- und Entzündungsorten in vivo ermöglicht. Eine Verabreichung dieser Kombination führt zu einem höheren Lokalisierunsgrad des Tc-99m radioaktiven Signals am Infektionsort, verglichen mit einer Verabreichung von lediglich der Tc-99m markierten mehrbasigen Verbindung. Als ein Ergebnis sind solche szintigraphischen Abbildungen, die durch diese Kombination erzeugt worden sind, den Abbildungen überlegen, die unter Verwendung Tc-99m markierter szintigraphischer Abbildungsmittel, welche lediglich die radioaktiv markierte mehrbasige Verbindung umfassen, erhalten wurden (siehe Beispiel 3 und Tabelle II, hierin nachstehend). Es werden auch höhere Verhältnisse der nachgewiesenen Radioaktivität am Infektionsort zu Blut und am Infektionsort zu Normalgewebe bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, verglichen mit lediglich den radiomarkierten Verbindungen, festgestellt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung radiomarkierte Zusammensetzungen bereit, die sich in vivo an Entzündungsorten anreichern, Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung derartiger radiomarkierter Zusammensetzungen zur Abbildung von Infektions- und Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden szintigraphische Abbildungsmittel für die Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers bereitgestellt, umfassend Zusammensetzungen, die ein Technetium-99m markiertes Reagenz mit einem Molekulargewicht von 500 Dalton bis 15.000 Dalton und mit mindestens 5 Resten, die bei physiologischem pH basisch sind, umfassen, das kovalent mit einer Technetium-99m bindenden Komponente verknüpft ist, wobei die Zusammensetzung ferner ein polysulfatiertes Glykan mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 1.000 Dalton umfaßt, wobei das Reagenz mit Technetium-99m radioaktiv markiert ist, und wobei die Zusammensetzung in der Lage ist, sich an Entzündungsorten in vivo anzureichern. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reagenz ein Peptid aus 5 bis 100 Aminosäuren, welches Plättchenfaktor 4 oder ein Fragment oder Analogon davon ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das polysulfatierte Glykan Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat oder Derivate davon.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung werden Tc-99m markierte Reagenzien als Komponenten der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel bereitgestellt, wobei die Reagenzien aus einer polybasigen Verbindung, bevorzugt einem von Plättchenfaktor 4-abgeleiteten Peptid oder Fragment davon, bestehen, die kovalent mit einer Radiomarkierung bindenden Komponente der Formel
I.
Cp(aa)Cp
wobei Cp ein geschützter oder ungeschützter Cysteinrest ist und (aa) eine Aminosäure darstellt, verknüpft ist, und wobei die Radiomarkierung bindende Komponente kovalent mit den mehrbasigen Verbindungen verknüpft ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Radiomarkierung bindende Komponente über etwa eine bis etwa 20 Aminosäuren mit der mehrbasigen Verbindung verknüpft.
Gemäß einem dritten Aspekt sind eine Komponente der durch die Erfindung bereitgestellten szintigraphischen Abbildungsmittel Reagenzien, umfassend eine mehrbasige Verbindung, bevorzugt ein Plättchenfaktor 4-abgeleitetes Peptid oder Fragment davon, die kovalent verknüpft ist mit einer Radiomarkierung bindenden Komponente mit der folgenden Struktur:
II.
A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X
wobei A H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4; ist;
B H, SH oder -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; ist;
Z H oder R&sup4; ist;
X SH oder -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; ist;
R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander H oder einen niederen, unverzweigten oder verzweigten oder zyklischen Alkylrest bedeuten;
n 0, 1 oder 2 ist; und
(1) wenn B gleich -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, X gleich SH ist und n gleich 1 oder 2 ist;
(2) wenn X gleich -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, B gleich SH ist und n gleich 1 oder 2 ist;
(3) wenn B gleich H oder R&sup4; ist, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)- OOC ist, X gleich SH ist und n gleich 0 oder 1 ist;
(4) wenn A gleich H oder R&sup4; ist, dann wenn 8 gleich SH ist, X gleich -NHR³ oder -(R³)-(Peptid) ist, und wenn X gleich SH ist, B gleich -NHR³ oder -N(R³)- (Peptid) ist;
(5) wenn X gleich H oder R&sup4; ist, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)- OOC ist und B gleich SH ist;
(6) wenn Z gleich Methyl ist, X gleich Methyl ist, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)- NHOC, (Peptid)-OOC ist, und B gleich SH ist und n gleich 0 ist,
und worin die Thiol-Komponente in der reduzierten Form vorliegt.
In einer anderen Ausführungsform werden Komponenten der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel bereitgestellt, umfassend ein Reagenz, das aus einer mehrbasigen Verbindung, bevorzugt einem Plättchenfaktor 4-abgeleiteten Peptid oder Fragment davon, besteht, die kovalent verknüpft ist mit einer Radiomarkierung bindenden Komponente der Formel:
[für diese Erfindung werden Radiomarkierung bindende Komponenten mit dieser Struktur als Komponenten auf Basis von Picolinsäure (Pica) bezeichnet]
oder
[für diese Erfindung werden Radiomarkierung bindende Komponenten mit dieser Struktur als Komponenten auf Basis von Picolylamin (Pica) bezeichnet],
worin X H oder eine Schutzgruppe ist, (Aminosäure) eine beliebige Aminosäure ist, die Radiomarkierung bindende Komponente kovalent mit dem Peptid verknüpft ist und der Komplex aus der Radiomarkierung bindenden Komponente und der Radiomarkierung elektrisch neutral ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin und X ist eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die mehrbasige Verbindung über eine Aminosäure, am meisten bevorzugt Glycin, kovalent mit der Radiomarkierungbindenden Komponente verknüpft, und die Radiomarkierung ist Technetium-99m.
In einer nochmals anderen Ausführungsform der Erfindung werden Komponenten der erfindungsgemäßen radiomarkierten szintigraphischen Abbildungsmittel bereitgestellt, bei denen es sich um Reagenzien handelt, die eine mehrbasige Verbindung, bevorzugt ein Plättchenfaktor 4-abgeleitetes Peptid oder Fragment davon, und eine kovalent mit der mehrbasigen Verbindung verknüpfte Radiomarkierung bindende Bisamino-Bisthiol Komponente umfassen. Die Radiomarkierung bindende Bisamino-Bisthiol Komponente in dieser Ausführungsform der Erfindung hat eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; sein kann; jedes (pgp)S unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H sein kann; m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind; A lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon ist; und X Peptid ist;
worin jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder mit Niederalkyl oder Niederalkoxy substituiertes Phenyl ist; m, n und p unabhängig voneinander 1 oder 2 sind; A lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon ist; V H oder -CO-Peptid ist; R&sup6; H oder Peptid ist, mit der Maßgabe, daß wenn V H ist, R&sup6; Peptid ist, und wenn R&sup6; H ist, V Peptid ist [In dieser Erfindung werden Radiomarkierung bindende Gruppen mit diesen Strukturen als "BAT"- Gruppen bezeichnet]. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mehrbasige Verbindung über eine Aminosäure, am meisten bevorzugt Glycin, kovalent mit der Radiomarkierung bindenden Komponente verknüpft.
Die Erfindung umfaßt auch Kits zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Verfahren zur Radiomarkierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m und Verfahren zur Verwendung der radiomarkierten Zusammensetzungen zur Abbildung von Infektions- oder Entzündungsorten in einem Säugetierkörper mittels gamma-Szintigraphie.
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, bei denen es sich um szintigraphische Abbildungsmittel handelt, die Komplexe der Radiomarkierungbindenden Komponente der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m umfassen. Verfahren zur Radiomarkierung dieser Reagenzien mit Te-99m werden ebenfalls bereitgestellt. Radiomarkierte Komplexe, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, werden gebildet durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m in der Gegenwart eines Reduktionsmittels. Bevorzugte Reduktionsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Dithionit-Ion, Zinn(II)-Ion und Eisen(II)- Ion. Erfindungsgemäße Komplexe werden auch gebildet durch Markieren mittels Ligandenaustausch mit einem zuvor reduzierten Tc-99m Komplex, wie hierin bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch Kits zur Herstellung szintigraphischer Abbildungsmittel bereit, bei denen es sich um eine Zusammensetzung handelt, die ein polysulfatiertes Glykan und Tc-99m markierte erfindungsgemäße Reagenzien umfaßt. Kits zur Herstellung der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel, bei denen die Radiomarkierung Tc-99m ist, bestehen aus einem ersten verschlossenen Gefäß, welches eine vorbestimmte Menge einer unmarkierten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reagenzes und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel, um das Reagenz mit Technetium-99m zu markieren, enthält, und einem zweiten verschlossenen Gefäß, welches eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen polysulfatierten Glykans enthält. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen werden dann hergestellt durch Markieren des Inhalts des ersten Gefäßes mit Technetium- 99m und danach Mischen des Inhalts des ersten Gefäßes mit dem Inhalt des zweiten Gefäßes, wobei die Zusammensetzung bereitgestellt wird. Alternativ können geeignete Mengen des unmarkierten Reagenzes und des polysulfatierten Glykans in einem einzigen Gefäß enthalten sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist das polysulfatierte Glykan Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat oder Derivate davon.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Peptid-Ausführungsformen der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel durch chemische Synthese in vitro bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide durch Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung von Zusammensetzungen, die Tc- 99m markierte szintigraphische Abbildungsmittel umfassen, zur Abbildung von Entzündungs- und Infektionsorten innerhalb eines Säugetierkörpers bereit, indem gamma-szintigraphische Abbildungen in vivo erhalten werden. Diese Verfahren umfassen das Verabreichen einer wirksamen diagnostischen Menge einer Tc-99m markierten Zusammensetzung und das Nachweisen der durch die Tc-99m Markierung, die an dem Entzündungsort innerhalb des Säugetierkörpers lokalisiert ist, emittierten gamma-Strahlung.
Es werden auch Verfahren bereitgestellt zur spezifischen Radiomarkierung von Gesamtblut und zur Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers unter Verwendung von Gemischen, die radioaktiv markiertes Gesamtblut umfassen. Eine solche Ausführungsform umfaßt das Mischen von Gesamtblut mit einer Menge, bevorzugt von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm eines polysulfatierten Glykans, wobei ein Gemisch gebildet wird. Danach wird durch Zugabe einer Menge von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm einer radiomarkierten, bevorzugt Tc-99m markierten Stoffzusammensetzung, bei der es sich um ein Reagenz handelt, das eine kovalent mit einer Radiomarkierungbindenden Komponente verknüpfte mehrbasige Komponente umfaßt, zu dem ersten Gesamtblut-Gemisch, ein radiomarkiertes Gesamtblut-Gemisch gebildet. Dieses radiomarkierte Gesamtblutgemisch wird dann einem Tier wie etwa einem Menschen verabreicht, der einen Entzündungsort in vivo hat oder von dem dies angenommen wird, und das radioaktive Signal wird nachgewiesen, wobei der Entzündungsort wie hierin beschrieben lokalisiert wird. Dieses Verfahren stellt gegenüber im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Markierung von Leukozyten einen Vorteil bereit, da das jetzige Verfahren die Erfordernis einer Isolierung von Leukozyten aus Gesamtblut und der damit verbundenen umfassenden Manipulation von Gesamtblut ex corpora beseitigt.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können auch aus einer mehrwertigen Linkerkomponente bestehen. Erfindungsgemäße mehrwertige Linkerkomponenten bestehen aus mindestens 2 identischen Linker-funktionellen Gruppen, die zu einer kovalenten Bindung an mehrbasige Verbindungen oder Tc-99m bindende Komponenten fähig sind. Bevorzugte Linker-funktionelle Gruppen sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder Thiol-reaktive Gruppen. In bevorzugten Ausführungsformen bestehen die mehrwertigen Linkerkomponenten aus Bis-succinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2- Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB), N-[2-(N',N'-bis(2- succinimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9- diazanonanamid (BAT-BS), Tris(succinimidylethyl)amin (TSEA), Bissuccinimidohexan (BSH), 4-(O-CH&sub2;CO-Gly-Gly-Cys.amid)acetophenon (ETAC), Tris(acetamidoethyl)amin, Bis(acetamidomethyl)amin, Bis(acetamidoethyl)amin, α,&epsi;- Bis(acetyl)lysin, Lysin, 1,8-Bis-acetamido-3,6-dioxaoctan oder einem Derivat davon.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlicheren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich werden.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine in vivo szintigraphische Abbildung eines menschlichen Patienten, der einen Milzbettabszeß hat, in einem Patienten 8 Wochen nach Splenektomie unter Verwendung von erfindungsgemäßem szintigraphischen Abbildungsmittel Tc- 99m/P322H.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt szintigraphische Abbildungsmittel zur Abbildung von Zielorten innerhalb eines Säugetierkörpers bereit, die sich an Entzündungsorten anreichern, umfassend Zusammensetzungen von Tc-99m markierten Reagenzien und polysulfatierten Glykanen. Die Reagenzien der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen mehrbasige Verbindungen, die kovalent mit einer Radiomarkierung bindenden Komponente verknüpft sind, wobei die Radiomarkierung bindende Komponente ein Radioisotop bindet. Für diese Erfindung soll der Begriff "mehrbasige Verbindung" chemische Verbindungen mit mindestens 5 chemischen Funktionalitäten umfassen, die basisch und bei physiologischem pH- Wert (d. h. etwa pH 7,0 ± 0,5) kationisch sind, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, primäre Amine, wobei die mehrbasigen Verbindungen bei physiologischem pH- Wert polykationisch sind. Erfindungsgemäße polysulfatierte Glykane umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat oder Derivate davon.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen lokalisieren spezifisch an Entzündungsorten. Diese Zusammensetzungen können auch an Leukozyten, bevorzugt Monozyten und Neutrophile, am meisten bevorzugt an Neutrophile, binden. Bei dieser Erfindung soll der Begriff "an Leukozyten binden" die Bedeutung haben, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in der Lage sind, sich an Infektions- oder Entzündungsorten in einem Säugetierkörper ausreichend anzureichern, um einen Nachweis der Anreicherung von radiomarkierten Komplexen, welche aus den hierin offenbarten Zusammensetzungen hergestellt werden, an Infektions- oder Entzündungsorten durch gamma-Szintigraphie zu gestatten.
In Peptid-Ausführungsformen der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel umfassen bevorzugte Peptide Plättchenfaktor 4 und davon abgeleitete Peptide. Bei dieser Erfindung soll der Begriff "davon abgeleitete Peptide" Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die zu der gesamten oder einem Teil der Aminosäuresequenz von Plättchenfaktor 4 homolog ist, umfassen. Durch diesen Begriff sollen auch Peptidfragmente von Plättchenfaktor 4, ob durch proteolytischen Abbau von nativem Plättchenfaktor 4-Protein oder durch chemische Synthese eines Teils der Plättchenfaktor 4-Aminosäuresequenz erzeugt, umschrieben werden. Peptidfragmente, welche in der Praxis dieser Erfindung geeignet sind, umfassen diejenigen Fragmente, welche in der Lage sind, sich an Infektions- und Entzündungsorten in einem Säugetierkörper anzureichern. Beispiele derartiger Peptide werden nachstehend hierin in den Beispielen gezeigt.
In Cp(aa)Cp-enthaltenden szintigraphischen Abbildungsmitteln, worin Cp ein geschütztes Cystein ist, sind die S-Schutzgruppen gleich oder verschieden und können sein, sind aber nicht beschränkt auf
- CH&sub2;-Aryl(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-CH-(Aryl)&sub2;(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-C-(Aryl)&sub3;(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-CH&sub2;-(4-Methoxyphenyl),
-CH-(4-Pyridyl)(phenyl)&sub2;,
-C(CH&sub3;)&sub3;,
-9-Phenylfluorenyl,
-CH&sub2;NHCOR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CH&sub2;-NHCOOR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CONHR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CH&sub2;-S-CH&sub2;-Phenyl.
Radiomarkierung bindende Komponenten, die als "(pgp)S" bezeichnete Cystein- Schwefel-Schutzgruppen, wie etwa die erfindungsgemäßen Bisamino, Bisthiol Komponenten umfassen, werden durch die vorstehende Auflistung von Schutzgruppen ebenfalls beschrieben.
Die bevorzugte Schutzgruppe hat die Formel -CH&sub2;-NHCOR, worin R ein Niederalkyl mit zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder mit Niederalkyl, Hydroxyl, Niederalkoxy, Carboxy oder Niederalkoxycarbonyl substituiertes Phenyl ist.
Eine Markierung mit Tc-99m ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, da die nuklearen und radioaktiven Eigenschaften dieses Isotops es zu einer idealen Komponente eines szintigraphischen Abbildungsmittels machen. Dieses Isotop hat eine Einzelphotonenenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von etwa 6 Stunden, und es ist aus einem &sup9;&sup9;Mo - 99mTc Generator leicht erhältlich. Andere im Stand der Technik bekannte Radionuklide haben beträchtlich längere effektive Halbwertszeiten (beispielsweise ¹¹¹In, das eine Halbwertszeit von 67,4 h hat) oder sind toxisch (beispielsweise ¹²&sup5;I).
Jede erfindungsgemäße Ausführungsform, die ein mehrbasiges Peptid enthält, besteht aus einer Sequenz von Aminosäuren. Der Begriff Aminosäure, wie in dieser Erfindung verwendet, soll alle natürlich vorkommenden und anderen L- und D- Aminosäuren umfassen. Mehrbasige Peptide umfassende Reagenzien, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden (in den nachfolgenden Peptiden sind die Aminosäuren L- Aminosäuren, sofern nicht anders angegeben):
Acetyl-KCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKKCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKKKCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES.
Acetyl-KKKKKCGCGGPLYKKIIKKLLES
Acetyl-KKKKKK.[BAT].GGPLYKKIIKKLLES.
Mehrbasige Peptid-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können in vitro chemisch synthetisiert werden. Peptide der vorliegenden Erfindung können im allgemeinen vorteilhaft auf einem Peptid-Synthesizer hergestellt werden. Unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, können erfindungsgemäße Peptide synthetisiert werden, wobei die Radiomarkierungbindende Komponente während einer chemischen Synthese in vitro kovalent mit dem Peptid verknüpft wird. Derartige, während der Synthese kovalent mit der Radiomarkierung bindenden Komponente verknüpfte Peptide sind vorteilhaft, da spezifische Stellen für die kovalente Verknüpfung darin bestimmt werden können.
Erfindungsgemäße Radiomarkierung bindende Komponenten können während der Peptidsynthese in das spezifische mehrbasige Zielpeptid eingeführt werden. Für Ausführungsformen, die Picolinsäure (Pic-) [z. B. Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)-] umfassen, kann die Radiomarkierung bindende Komponente als der letzte (d. h. Amino-terminale) Rest während der Synthese synthetisiert werden. Zusätzlich kann die Picolinsäure-enthaltende Radiomarkierung bindende Komponente kovalent mit der &epsi;-Amingruppe von Lysin verknüpft werden, wobei beispielsweise αN(Fmoc)-Lys- &epsi;N-[Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] erhalten wird, das an beliebiger Stelle in die Peptidkette eingebaut werden kann. Diese Abfolge ist besonders vorteilhaft, da sie eine einfache Art des Einbaus in das Ziel-Bindepeptid liefert.
In ähnlicher Weise kann die Picolylamin (Pica)-enthaltende Radiomarkierungbindende Komponente [-Cys-(Schutzgruppe)-Gly-Pica] während der Peptidsynthese hergestellt werden durch Aufnahme der Sequenz [-Cys-(Schutzgruppe)-Gly-] am Carboxy-Terminus der Peptidkette. Nach der Abspaltung des Peptids vom Harz wird der Carboxy-Terminus des Peptids aktiviert und an Picolylamin gekoppelt. Dieser Syntheseweg erfordert, daß reaktive Funktionalitäten in den Seitenketten maskiert (geschützt) bleiben und während der Konjugation des Picolylamins nicht reagieren.
Diese Erfindung stellt den Einbau dieser Chelatoren in praktisch jedes Plättchenfaktor 4-abgeleitete Peptid bereit, was zu Tc-99m radiomarkierten Peptidkomponenten der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel führt.
Diese Erfindung stellt auch mehrbasige, kleine synthetische Bisamin-Bisthiol (BAT) Chelatoren beinhaltende Verbindungen, die mit Tc-99m markiert werden können, bereit.
Bei der Bildung eines Komplexes aus radioaktivem Technetium-99m mit den erfindungsgemäßen Reagenzien wird der Technetium-Komplex, bevorzugt ein Salz von Tc-99m Pertechnetat, in der Gegenwart eines Reduktionsmittels mit dem Abbildungsmittel umgesetzt, in einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reduktionsmittel Zinn(II)chlorid. Komplexe und Mittel zur Herstellung derartiger Komplexe werden günstig in Form eines Kits bereitgestellt, umfassend ein verschlossenes Gefäß, welches eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen, zu markierenden Reagenzes enthält, und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel, um das Reagenz mit Tc-99m zu markieren. Alternativ kann der Komplex gebildet werden durch Umsetzen eines erfindungsgemäßen Reagenzes mit einem vorgebildeten labilen Komplex aus Technetium und einer anderen, als Transfer-Ligand bezeichneten Verbindung. Dieses Verfahren ist als Ligandenaustausch bekannt und dem Fachmann gut bekannt. Der labile Komplex kann unter Verwendung solcher Transferliganden wie beispielsweise Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol gebildet werden. Zu den bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Tc-99m Pertechnetat-Salzen gehören die Alkalimetallsalze wie etwa das Natriumsalz, oder Ammoniumsalze oder Niederalkylammoniumsalze. Egal, welche Ausführungsform verwendet wird, kann das Gefäß, welches das unmarkierte Reagenz und Reduktionsmittel enthält, vorteilhaft auch die polysulfatierten Glykan- Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten. Die Umsetzung der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel mit Tc-99m Pertechnetat oder einem vorgebildeten labilen Tc-99m Komplex kann bei Raumtemperatur in einem wässrigen Medium durchgeführt werden. Wenn ein anionischer Komplex in einem wässrigen Medium gebildet wird, liegt der radiomarkierte Komplex in Form eines Salzes mit einem geeigneten Kation vor, wie etwa Natriumkation, Ammoniumkation, Mono-, Di- oder Tri-niederalkylaminkation, oder jedem pharmazeutisch akzeptablen Kation.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Herstellung Technetium-99m markierter Peptide bereitgestellt. Die Peptid-Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Reagenzien können unter Verwendung von Verfahren und Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt sind und nachstehend hierin beschrieben werden, chemisch synthetisiert werden. Eine geeignete Menge eines solchen Reagenzes wird in ein Gefäß eingebracht, das ein Reduktionsmittel wie etwa Zinn(II)chlorid oder ein Festphasen-Reduktionsmittel enthält, in einer ausreichenden Menge um das Mittel mit Tc-99m zu markieren. Es kann auch eine geeignete Menge eines Transferliganden wie beschrieben (wie etwa beispielsweise Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol) aufgenommen werden. Technetium-99m markierte Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können durch die Zugabe einer geeigneten Menge von Tc-99m oder Tc-99m Komplex zu den Gefäßen und Umsetzung unter Bedingungen wie in Beispiel 2 hierin nachstehend beschrieben, hergestellt werden. Die Kits umfassen auch ein zweites verschlossens Gefäß, das eine geeignete Menge eines polysulfatierten Glykans enthält. Beispiele wirksamer polysulfatierter Glykane umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat oder Derivate davon. Erfindungsgemäße, Tc-99m markierte szintigraphische Abbildungsmittel können hergestellt werden durch Mischen der Tc-99m markierten mehrbasigen Komponente aus dem ersten Gefäß mit dem polysulfatierten Glykan aus dem zweiten Gefäß.
Durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte radioaktiv markierte szintigraphische Abbildungsmittel werden mit einem geeigneten Radioaktivitätsgehalt bereitgestellt. Bei der Bildung radioaktiver Tc-99m Komplexe ist es im allgemeinen bevorzugt, radioaktive Komplexe in Lösungen zu bilden, die Radioaktivität in Konzentrationen von etwa 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
Zusammensetzungen, die szintigraphische Abbildungsmittel enthalten, welche aus Technetium-99m markierten Reagenzien und polysulfatierten Glykanen bestehen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, können zur Visualisierung von Entzündungsorten, einschließlich Abszessen und Orten einer "verborgenen" Infektion, verwendet werden. Die Tc-99m markierten Zusammensetzungen können auch verwendet werden zur Visualisierung von Entzündungsorten, die durch Gewebeischämie, einschließlich solcher Erkrankungen wie entzündlicher Darmerkrankung und Arthritis hervorgerufen werden. Gemäß dieser Erfindung werden die Technetium-99m markierten Zusammensetzungen, worin die Reagenzien entweder als ein Komplex oder als ein Salz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Gegenion bereitgestellt sind, in einer injizierbaren Einzeldosis verabreicht. Jeder der üblichen, dem Fachmann bekannten Träger, wie etwa sterile Salzlösung oder Plasma, können nach der Radiomarkierung verwendet werden, um die injizierbare Lösung zur diagnostischen Abbildung verschiedener Organe, Tumore und dergleichen gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Im allgemeinen hat die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von etwa 0,01 mCi bis etwa 100 mCi, bevorzugt 1 mCi bis 20 mCi. Die für eine Einzeldosis zu injizierende Zusammensetzung hat ein Volumen von etwa 0,01 ml bis etwa 10 ml. Nach intravenöser Verabreichung kann die Abbildung des Organs oder Tumors in vivo innerhalb weniger Minuten stattfinden. Falls gewünscht kann das Abbilden jedoch nach Stunden oder sogar länger nach der Injektion in Patienten stattfinden. In den meisten Fällen wird sich eine ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb etwa 0,5 Stunden in dem abzubildenden Bereich anreichern, so daß die Aufnahme von Szintigraphien möglich wird. Jedes herkömmliche szintigraphische Abbildeverfahren für diagnostische Zwecke kann mit dieser Erfindung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Technetium-99m markierten Zusammensetzungen können intravenös in jedem herkömmlichen Medium für intravenöse Injektion, wie etwa in wässrigem Salzmedium, oder in Blutplasmamedium, verabreicht werden. Ein solches Medium kann auch herkömmliche pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten, wie etwa beispielsweise pharmazeutisch akzeptable Salze, um den osmotischen Druck einzustellen, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören physiologische Kochsalzlösung und Plasma.
Alternativ stellt die Erfindung Verfahren bereit zur spezifischen Radiomarkierung von Gesamtblut und zur Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers unter Verwendung von derart radiomarkiertem Gesamtblut. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird Gesamtblut mit einer Menge von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm eines polysulfatierten Glykans gemischt, wobei ein Gemisch gebildet wird. Danach wird eine Menge von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm einer radiomarkierten, bevorzugt Tc-99m markierten Stoffzusammensetzung, bei der es sich um ein Reagenz handelt, das eine kovalent mit einer Radiomarkierung-bindenden Komponente verknüpfte mehrbasige Komponente umfaßt, zugegeben, wobei ein radiomarkiertes Gemisch gebildet wird. Dieses radiomarkierte Gesamtblutgemisch wird dann einem Tier wie etwa einem Menschen verabreicht, der einen Entzündungsort in vivo hat oder von dem dies angenommen wird, und das radioaktive Signal wird nachgewiesen, wobei der Entzündungsort wie hierin beschrieben lokalisiert wird. Das Erfordernis einer Verwendung von antigenisch kompatiblem, bevorzugt aber nicht notwendigerweise autologem, heparinisiertem Gesamtblut in dieser Ausführungsform des Experiments wird vom Fachmann verstanden werden.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Zusammensetzungen werden in den nachfolgenden Beispielen ausführlicher erläutert. Diese Beispiele erläutern bestimmte Aspekte des vorstehend beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse. Diese Beispiele werden als Erläuterung und keinesfalls als Einschränkung gezeigt.

BEISPIEL 1

Festphasen-Peptidsynthese

Festphasen-Peptidsynthese (SPPS, solid phase peptide synthesis) wurde durchgeführt im 0,25 Millimol (mMol) Maßstab unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 431A Peptid-Synthesizers und unter Verwendung von 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als Amino-terminale Schutzgruppe, Kupplung mit Dicyclohexylcarbodümid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1 H-benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphatlHydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT), und unter Verwendung von p-Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrol (HMP) Harz für Carboxy-terminale Säuren oder Rink-Amidharz für Carboxy-terminale Amide.
Wenn N-α-Acetylgruppen eingeführt wurden, erfolgte dies durch Behandlung des harzgebundenen Peptids mit Essigsäureanhydrid in N-Methylpyrrolidinon (NMP).
Harzgebundene Produkte wurden routinemäßig abgespalten unter Verwendung einer Lösung, bestehend aus Trifluoressigsäure, Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan, hergestellt in Verhältnissen von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2, während 1,5 bis 3 h bei Raumtemperatur. Rohe Peptide wurden gereinigt mittels präparativer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta Pak C18 Säule und einem Elutionsgradienten unter Verwendung von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit Acetonitril. Acetonitril wurde aus den eluierten Fraktionen abgedampft, die dann lyophylisiert wurden. Die Identität jedes Produkts wurde bestätigt durch Massenspektroskopie unter Beschuß mit energiereichen Atomen (FABMS, fast atom bombardment mass spectroscopy) oder durch Elektrospray-Massenspektroskopie (ESMS).

BEISPIEL 2

Herstellung von szintigraphischen Abbildungsmitteln

Peptid (1,0), hergestellt wie in Beispiel 1, wurde in 1,0 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung, 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) oder Wasser aufgelöst. Tc-99m Gluceptat wurde hergestellt durch Rekonstitution eines Glucoscan-Gefässes (E. I Du Pont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m Natriumpertechnetat, das bis zu 200 mCi enthielt, und Stehen Lassen bei Raumtemperatur während 15 Minuten. 250 ul Tc- 99m Gluceptat wurden dann zu dem Peptidreagenz zugegeben und die Reaktion wurde 30 min bei 100ºC oder Raumtemperatur laufen gelassen, und danach wurde durch ein 0,2 um Filter filtriert.
Die Reinheit des Tc-99m markierten Peptidreagenzes wurde durch HPLC unter Verwendung der Bedingungen, die in den Fußnoten der nachfolgenden Tabelle beschrieben sind, bestimmt. Radioaktive Komponenten wurden nachgewiesen mittels eines zwischengeschalteten radiometrischen Detektors, der mit einer Integrations-Aufzeichnungsvorrichtung verbunden war. Tc-99m Gluceptat und Tc- 99m Natriumpertechnetat eluieren unter diesen Bedingungen in zwischen 1 und 4 Minuten, während das Tc-99m markierte Peptid nach einem erheblich längeren Zeitraum eluierte.
Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht die erfolgreiche Tc-99m Markierung von gemäß Beispiel 1 hergestellten Peptiden unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens. TABELLE I
Ac = Acetyl, Acm = Acetamidomethyl; Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren können gefunden werden in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York), Seite 33.
allgemeines HPLC-Verfahren: Lösungsmittel A = 0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub9;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Lösungsmittel-Fließrate = 1,2 ml/min
Waters-Säule = Waters Delta-Pak C 18 5u · 39 · 150 mm Säule
Methode: Gradientenelution 100%·A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Erfindungsgemäße szintigraphische Abbildungsmittel werden durch die Zugabe eines polysulfatierten Glykans aus derartigen Tc-99m markierten Peptiden hergestellt. Beispielsweise werden besondere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel hergestellt durch die Zugabe von Heparin zu Tc-99m markierten Peptiden, hergestellt wie oben beschrieben, in einer Konzentration von 0,1-10 mg Peptid I 1-200 mCi Tc-99m in einem Volumen von 0,1-10 ml, auf eine Endkonzentration von etwa 10-100 USP Einheiten Heparin/ml.

BEISPIEL 3

Abbildung und Bioverteilung unter Verwendung von Tc-99m markierten szintigraphischen Abbildungsmitteln
Die Wirksamkeit einer szintigraphischen Abbildung von Entzündungsorten in vivo unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wurde wie folgt gezeigt. New Zealand White Kaninchen wurden in der linken Wade intramuskulär mit einem stark wirkenden Escherichia Coll-Stamm angeimpft. Nach 24 h wurden die Tiere durch intramuskuläre Injektion mit Ketamine und Xylazine sediert. Den Tieren wurde danach Tc-99m markiertes Peptid (150 ug Peptid I 2-10 mCi Tc-99m) alleine oder in einer Lösung, die 30 U. S. P. Einheiten/ml Heparin enthielt, intravenös injiziert. Die Tiere wurden in Rückenlage im Blickfeld einer gamma-Kamera (LEAP Kollimator, auf Tc-99m eingestellt) plaziert und über die erste Stunde nach der Injektion, und danach in Intervallen von annähernd einer Stunde über die folgenden 3 h oder 13 h abgebildet. Zwischen den Zeiträumen zur Datensammlung für die Abbildung wurden die Tiere erholen gelassen, und nach Bedarf reanästhesiert.
Nach Vollendung der letzten Abbildung wurde jedes Tier durch eine Überdosis Phenobarbital, induziert durch i.v. Injektion, geopfert, und seziert um Proben von Blut und infiziertem Muskel und Kontrollmuskel zu erhalten. Diese Gewebsproben wurden gewogen und unter Verwendung eines gamma-Zählrohrs ausgezählt. Eine Standardmenge der injizierten Dosis wurde ebenfalls in dieser Weise gezählt. Der im Gewebe verbliebene Prozentsatz der injizierten Dosis (pro Gramm Gewebe) wurde aus den Ergebnissen der gamma-Zählung berechnet. Prozentverhältnisse der injizierten Dosis pro Gramm infiziertes zu nicht infiziertes Muskelgewebe und Prozentverhältnisse der injizierten Dosis pro Gramm infiziertes Gewebe zu Blut wurden berechnet; die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Kaninchen wurden erfindungsgemäße Tc-99m markierte Abbildungsmittel injiziert, mit den Formeln:
Acetyl KKKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES (P322),
Acefyl-KKKKKCGCGGPLYKKIIKKLLES (P483), und
Acetyl-KKKKKK.[BAT].GGPLYKKIIKKLLES (P514).
Die Kombination von Tc-99m markiertem Peptid und Heparin führte zu einem höheren Prozentsatz der injizierten Dosis, die in dem infizierten Muskel nachgewiesen wurde, und zu höheren Verhältnissen von infiziertem Muskel/Blut und infiziertem Muskel zu normalem Muskel, als bei Verwendung des markierten Peptids alleine erhalten wurden (siehe Tabelle II). TABELLE II

BEISPIEL 4

In vivo Abbildung in Menschen unter Verwendung von Tc-99m markierten szintigraphischen Abbildungsmitteln
Die Wirksamkeit einer szintigraphischen Abbildung von Entzündungsorten in vivo in Menschen unter Verwendung von P322H wurde bestimmt. P322H ist ein szintigraphisches Abbildungsmittel, welches hergestellt wird durch Zugabe von Heparin auf eine Endkonzentration von 30 U/ml zu 10-20 mCi Tc-99m markiertem P322 Peptid (umfassend etwa 1 mg Peptid) mit der Formel:
Acetyl KKKKKCACrnGCACmGGPLYKKIIKKLLES.
Das szintigraphische Abbildungsmittel wurde bei 4 menschlichen Patienten getestet, von denen jeder Infektionsorte hatte, die unter Verwendung herkömmlicher Diagnosetechniken (einschließlich Computergestützte Tomographie, Chirurgie und/oder klinische Krankenvorstellung) bestätigt worden waren.
Jedem Patienten wurden 10-20 mCi Tc-99m/P322H durch intravenöse Injektion verabreicht. Gamma-Szintigraphie wurde gleichzeitig mit der Injektion begonnen, und danach wurden über annähernd zwei Stunden nach der Injektion anteriore und posteriore szintigraphische Abbildungen aufgenommen, unter Verwendung einer gamma-Kamera mit großem Blickfeld, die mit einem hochauflösenden Kollimator ausgestattet war (eingestellt auf 140 keV, mit einem Meßfenster von ±20%).
Anfangs wurde ein hoher Grad an Abbildungsaktivität in der Lunge beobachtet; diese Aktivität nahm über den Verlauf der Studie erheblich ab. Eine Aufnahme in Milz, Leber und Knochenmark wurde ebenfalls beobachtet. Aus den Tc-99m/P322H Abbildeabtastungen wurden Diagnosen von Tiefenschenkelabszeß, Blinddarmentzündung, Bauchfellentzündung und Milzbettabszeß aufgestellt; diese Diagnosen waren mit bestätigenden, auf anderer Basis aufgestellten Diagnosen konsistent. Ein Beispiel einer solchen Abbildeabtastung ist in Fig. 1 gezeigt, worin der Milzbettabszeß eines Patienten erfolgreich abgebildet wurde. Der Pfeil zeigt auf die Abbildung eines Milzbettabszesses in einem Patienten, 8 Wochen nach chirurgischer Entfernung der Milz des Patienten.
Diese Studien veranschaulichen die Brauchbarkeit der erfindungsgemäßen szintigraphischen Abbildungsmittel zum szintigraphischen Abbilden in vivo in Menschen.

Claims

1. Zusammensetzung, bei der es sich um ein szintigraphisches Abbildungsmittel für die Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers handelt, wobei die Zusammensetzung ein Reagenz umfaßt, welches eine mehrbasige Verbindung mit einem Molekulargewicht von 500 Dalton bis 15.000 Dalton und mindestens 5 chemische Funktionalitäten, die bei physiologischem pH basisch sind, umfaßt, die kovalent mit einer Technetium-99m bindenden Komponente verknüpft ist, wobei die Zusammensetzung ferner ein polysulfatiertes Glykan mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 1.000 Dalton umfaßt, wobei das Reagenz mit Technetium-99m radioaktiv markiert ist, und wobei die Zusammensetzung in der Lage ist, sich an Entzündungsorten in vivo anzureichern.

2. Zusammensetzung, bei der es sich um ein szintigraphisches Abbildungsmittel für die Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers handelt, wobei die Zusammensetzung ein Reagenz umfaßt, welches eine mehrbasige Verbindung mit einem Molekulargewicht von 500 Dalton bis 15.000 Dalton und mindestens 5 chemische Funktionalitäten, die bei physiologischem pH basisch sind, umfaßt, und wobei die mehrbasige Verbindung ein Peptid aus 5 bis 100 20 Aminosäuren ist, das den Plättchenfaktor 4 oder ein Fragment davon umfaßt, und kovalent mit einer Technetium-99m bindenden Komponente verknüpft ist, wobei die Zusammensetzung ferner ein polysulfatiertes Glykan mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 1.000 Dalton umfaßt, wobei das Reagenz mit Technetium-99m radioaktiv markiert ist, und wobei die Zusammensetzung in der Lage ist, sich an Entzündungsorten in vivo anzureichern.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, bei der das polysulfatierte Glykan Heparin, Heparansulfat, Dextransulfat, Chondroitinsulfat oder Dermatansulfat ist, oder Derivate davon.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 oder 3, bei der die Technetium-99m bindende Komponente ausgewählt ist aus: I.

Cp(aa)Cp

wobei Cp ein geschütztes oder ungeschütztes Cystein und (aa) eine Aminosäure ist;

II.

A-CZ(B)-(C(R¹R²)n-X

wobei A H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4; ist;

B H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; ist;

X H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; ist;

Z H oder R&sup4; ist;

R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander H oder einen niederen, unverzweigten oder verzweigten oder zyklischen Alkylrest bedeuten;

n 0, 1 oder 2 ist; und

wenn B gleich -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, X gleich SH und n gleich 1 oder 2 ist;

wenn X gleich -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, B gleich SH und n gleich 1 oder 2 ist;

wenn B gleich H oder R&sup4; ist, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)- OOC, X gleich SH und n gleich 0 oder 1 ist;

wenn A gleich H oder R&sup4; ist, dann wenn B gleich SH ist, X gleich NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, und wenn X gleich SH ist, B gleich -NHR³ oder -N(R³)- (Peptid) ist;

wenn X gleich H oder R&sup4; ist, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)- OOC und B gleich SH ist;

wenn Z gleich Methyl ist, X gleich Methyl, A gleich HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)- NHOC, (Peptid)-OOC, B gleich SH und n gleich 0 ist;

und wobei der Thiolrest in der reduzierten Form vorliegt; und

III.

IV.

wobei X = H oder eine Schutzgruppe;

(Aminosäure) = jede beliebige Aminosäure;

wobei jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist;

jedes (pgp)s unabhängig voneinander eine Thiolschutzgruppe oder H ist;

m, n oder p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind;

A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterozyklyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon; und

wobei jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder mit niederem Alkyl oder niederem Alkoxy substituiertes Phenol ist;

m, n und p unabhängig voneinander 1 oder 2 sind;

A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterozyklyl, Kombinationen oder substituierte Derivate hiervon;

V = H oder -CO-Peptid;

R&sup6; = H oder Peptid; und

wobei wenn V = H, R&sup6; = Peptid, und wenn R&sup6; = H, V = -CO-Peptid;

wobei die die Radiomarkierung bindende Komponente einen Komplex mit einem Radioisotop bildet und der Komplex elektrisch neutral ist.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei entweder:

a) das geschützte Cystein der die Radiomarkierung bindenden Komponente der Formel I eine Schutzgruppe der Formel

- CH&sub2;-NH-CO-R

aufweist, wobei R ein niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, Phenyl oder mit niederem Alkyl, Hydroxy, niederem Alkoxy, Carboxy oder niederem Alkoxycarbonyl substituiertes Phenyl ist; oder

b) die die Radiomarkierung bindende Komponente der Formel Cp(aa)Cp die Formel

aufweist.

6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die mehrbasige Verbindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die die Sequenz PLYKKIIKKLLES oder KKIIKKLLES umfaßt.

7. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei entweder:

a) die mehrbasige Verbindung und die die Radiomarkierung bindende Komponente durch etwa eine bis etwa zwanzig Aminosäuren kovalent verknüpft sind; oder

b) die Zusammensetzung ferner eine polyvalente Verknüpfungskomponente umfaßt, die mit einer Vielzahl der mehrbasigen Verbindungen und auch mit einer Vielzahl der Technetium-99m bindenden Komponenten kovalent verknüpft ist, um ein multimeres, polyvalentes szintigraphisches Abbildungsmittel zu umfassen, wobei das Molekulargewicht des multimeren, polyvalenten szintigraphischen Abbildungsmittels geringer als etwa 20.000 Dalton ist; und wobei die polyvalente Verknüpfungskomponente gegebenenfalls Bis-Succinimidylmethylether, 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure, N [2-(N; N'-Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl)]-N6,N9-bis(2-methyl- 2-mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid, Tris(succinimidylethyl)amin, Bis- (succinimidohexan), 4-(O-CH&sub2;CO-Gly-Gly-Cys.amid)acetophenon, Tris(acetamidoethyl)amin, Bis(acetamidomethyl)amin, Bis(acetamidoethyl)amin, α,&epsi;- Bis(acetyl)lysin, Lysin, 1,8-Bis-acetamido-3,6-dioxaoktan oder ein Derivat davon ist.

8. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die die Radiomarkierung bindende Komponente während der chemischen Synthese in vitro kovalent mit dem Peptid verknüpft ist, gegebenenfalls während der Festphasenpeptidsynthese.

9. Kit für die Herstellung eines radiopharmazeutischen Erzeugnisses, wobei dieser Kit ein erstes versiegeltes Gefäß umfaßt, das eine vorbestimmte Menge einer unmarkierten Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 und eine ausreichende Menge eines reduzierenden Agens zur Markierung des Reagenzes mit Technetium-99m enthält, wobei das reduzierende Agens gegebenenfalls ausgewählt ist aus Dithionit-Ionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)-Ionen.

10. Kit gemäß Anspruch 9, welcher ferner ein zweites versiegeltes Gefäß umfaßt, welches eine vorbestimmte Menge des polysulfatierten Glykans enthält, wobei die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 dadurch hergestellt wird, daß die Stoffmenge im ersten Gefäß mit Technetium-99m markiert wird, und daß dann der Inhalt des ersten Gefäßes mit dem Inhalt des zweiten Gefäßes gemischt wird, wobei die unmarkierte Zusammensetzung und das polysulfatierte Glykan gegebenenfalls in einem einzigen Gefäß enthalten sein können.

11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung wie in Anspruch 2 definiert, bei dem die mehrbasige Verbindung in vitro chemisch synthetisiert wird, wobei die mehrbasige Verbindung gegebenenfalls ein Peptid ist und das Peptid mittels Festphasenpeptidsynthese synthetisiert wird.

12. Stoffzusammensetzung mit der Formel

Acetyl-KCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKCAcmGCAcmQAPLYKKJJKKLLES

Acetyl-KKKCACmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKKKCAcmGCAcmQAPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKKKKCAcmGCAcmQAPLYKIIKKLLES

Acetyl-KCACmGCACmGGPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES

Acetyl-hKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKKKKCAcmGCAcmGGPLYKKIIKKLLES

Acetyl-KKKKKCGCGGPLYKKIIKKLLES

oder

Acetyl-KKKKKK.[BAT].GGPLYKKIIKKLLES.

13. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 12, die mit Technetium-99m markiert ist.

14. Stoffzusammensetzung, die ein mit Technetium-99m markiertes Reagenz gemäß Anspruch 13 und ein polysulfatiertes Glykan, gegebenenfalls Heparin, umfaßt.

15. Reagenz zur Herstellung eines szintigraphischen Abbildungsmittels für die Abbildung von Zielentzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers mit der Formel

Acetyl-KKKKKCGCGGPLYKKIIKKLLES

16. Reagenz gemäß Anspruch 15, das mit Technetium-99m markiert ist.

17. Szintigraphisches Abbildungsmittel für die Abbildung von Entzündungsorten innerhalb eines Säugetierkörpers, das ein mit Technetium-99m markiertes Peptid mit der Formel Acetyl-KKKKKCGCGGPLYKKIIKKLLES und Heparin umfaßt.

18. Kit zur Herstellung eines radiopharmazeutischen Erzeugnisses, das ein erstes versiegeltes Gefäß umfaßt, das eine vorbestimmte Menge des Reagenzes gemäß Anspruch 15 und eine ausreichende Menge an reduzierendem Agens für die Markierung des Reagenzes mit Technetium-99m enthält, und das gegebenenfalls ferner ein zweites versiegeltes Gefäß umfaßt, das eine vorbestimmte Menge an Heparin enthält.

19. Kit zur Herstellung eines radiopharmazeutischen Erzeugnisses, das ein erstes versiegeltes Gefäß umfaßt, das eine vorbestimmte Menge des Reagenzes gemäß Anspruch 15 und eine ausreichende Menge an reduzierendem Agens für die Markierung des Reagenzes mit Technetium-99m enthält, und das gegebenenfalls ferner ein zweites versiegeltes Gefäß umfaßt, das eine vorbestimmte Menge an Dermatansulfat enthält.

20. Verwendung eines szintigraphischen Abbildungsmittels wie in Anspruch 2 oder Anspruch 17 definiert zur Herstellung eines Medikaments zur Abbildung eines Entzündungsortes innerhalb eines Säugetierkörpers.

21. Verwendung eines mit Technetium-99m radiomarkierten Reagenzes gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Abbildung eines Entzündungsortes innerhalb eines Säugetierkörpers, wobei das Medikament Vollblut und ein polysulfatiertes Glykan in einer Menge von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm im Gemisch enthält, wobei das Gemisch ferner eine Menge von etwa 1 Mikrogramm bis 100 Milligramm einer Stoffzusammensetzung umfaßt, die ein mit Technetium-99m markiertes Reagenz gemäß Anspruch 2 umfaßt.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein szintigraphisches Abbildungsmittel wie in einem der Ansprüche 2, 14 oder 17 definiert und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfaßt.