DE69329382T2

DE69329382T2 - Technetium-99m markierte peptide zur bilderzeugung von thrombus

Info

Publication number: DE69329382T2
Application number: DE69329382T
Authority: DE
Inventors: Richard T. Dean; John Lister-James
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2013-05-22
Also published as: EP0641222B1; WO1993023085A1; JP3380738B2; JPH07508289A; US5925331A; EP1004322A3; CA2136330C; ATE329624T1; DE69334033D1; AU4384593A; CA2136330A1; ATE196094T1; EP1004322B1; EP0641222A1; DE69329382D1; EP1004322A2; DK0641222T3; JP2941057B2; AU677208B2; ES2150945T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft radiodiagnostische Reagenzien und Verfahren zur Herstellung von markierten radiodiagnostischen Mitteln. Insbesondere betrifft die Erfindung Reagenzien, die mit Technetium-99m (Tc-99m) markiert werden können, Verfahren und Kits zur Herstellung und Radiomarkierung von solchen Reagenzien und Verfahren zur Verwendung solcher Reagenzien zur diagnostischen Abbildung von Gefäßverschlußstellen im Körper eines Säugetiers.

2. Stand der Technik

Thrombose und Thromboembolismus, insbesondere tiefe Venenthrombose (TVT) und Lungenembolie (PE), sind häufig vorkommende klinische Leiden, die mit einer beträchtlichen Morbidität und Mortalität verbunden sind. Es wird geschätzt, daß in den Vereinigten Staaten jedes Jahr ca. 5 Millionen Patienten eine oder mehrere TVT-Episoden erleiden und daß über 500.000 PE-Fälle auftreten, die 100.000 Todesfälle zur Folge haben (J. Seabold, Society of Nuclear Medicine Annual Meeting 1990). Weiterhin wird geschätzt, daß mehr als 90% aller Lungenembolien auf TVTs in den unteren Extremitäten zurückzuführen sind. Zum Glück können diese Leiden durch Therapie mit einem Antikoagulationsmittel wirksam behandelt werden, wenn dieses früh genug angewendet wird. Eine solche Behandlung ist jedoch mit Risiken (z. B. internen Blutungen) verbunden, die eine unnötige prophylaktische Anwendung ausschließen. In akuten Fällen können fortgeschrittenere Methoden der thrombolytischen Intervention (wie z. B. die Verabreichung von gentechnisch hergestelltem Gewebsplasminogenaktivator oder Streptokinase) zum Einsatz kommen, jedoch sind diese Verfahren noch risikoreicher. Darüber hinaus ist es für eine effektive klinische Anwendung dieser Verfahren erforderlich, daß der verursachende Thrombus lokalisiert wird, damit die Wirksamkeit der Behandlung kontrolliert werden kann.
Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf, Thrombi in vivo schnell zu lokalisieren, besonders bevorzugt unter Anwendung von nicht-invasiven Methoden. Gegenwärtig werden zur Identifikation von Thrombolysestellen Kontrastvenographie und Ultraschall nach dem Kompressions-B-Mode-Verfahren angewendet; welches Verfahren dabei zum Einsatz kommt, hängt von der erwarteten Lage des Gefäßverschlusses ab. Allerdings ist die erstgenannte Methode invasiv, und beide Verfahren sind für den Patienten unbequem. Darüber hinaus sind diese Methoden in vielen Fällen ungeeignet, oder sie liefern ungenaue Ergebnisse.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin lassen sich gewisse pathologische Zustände lokalisieren, bzw. läßt sich ihr Ausmaß abschätzen, indem man die Verteilung kleiner Mengen von intern verabreichten, radioaktiv markierten Tracern (den Radiotracern bzw. Radiopharmaka) nachweist. Die zum Nachweis dieser Radiopharmaka angewandten Methoden sind allgemein als Abbildungsverfahren bzw. Radio-Imaging bekannt.
Beim Radio-Imaging handelt es sich bei dem radioaktiven Marker um ein Radionuklid, das Gammastrahlung abgibt, und der Radiotracer wird mittels einer Kamera, die auf Gammastrahlung anspricht, lokalisiert (dieses Verfahren wird häufig als Gammaszintigraphie bezeichnet). Die abgebildete Stelle ist detektierbar, da als Radiotracer entweder eine Substanz gewählt wird, die sich an einem Krankheitsherd anreichert (positiver Kontrast) oder, alternativ dazu, eine Substanz gewählt wird, die sich spezifisch nicht an solchen Krankheitsherden anreichert (negativer Kontrast).
Für optimales Radio-Imaging bei Menschen müssen eine Anzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Um die Nachweiseffizienz zu maximieren, werden Radionuklide bevorzugt, die Gammaenergie im Bereich von 100 bis 200 keV abgeben. Um die vom Patienten absorbierte Strahlungsdosis möglichst gering zu halten, sollte die physikalische Halbwertszeit des Radionuklids so kurz sein, wie es das Abbildungsverfahren erlaubt. Damit Untersuchungen an jedem beliebigen Tag und zu jeder beliebigen Tageszeit durchgeführt werden können, ist es vorteilhaft, in der Klinik stets eine Radionuklidquelle zur Verfügung zu haben.
Zum Radio-Imaging eignen sich verschiedene Radionukleide, einschließlich &sup6;&sup7;Ga, 99mTc (Tc-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb oder ¹&sup8;&sup6;Re. Dabei ist Tc-99m ein besonders bevorzugtes Radionukleid, da es Gammastrahlung von 140 keV abgibt, eine physikalische Halbwertszeit von 6 Stunden hat und mit einem Molybdän- 99/Technetium-99m-Generator bequem vor Ort verfügbar ist.
Mit Radio-Imaging, insbesondere Gammaszintigraphie, steht eine nicht-invasive Methode zur Lokalisierung von Gefäßverschlüssen in vivo zur Verfügung. Ein Gamma-emittierender Radiotracer, der sich bei in vivo Verabreichung vorzugsweise spezifisch an eine Thrombuskomponente und nicht an anderes Gewebe bindet, kann ein externes szintigraphisches Bild geben, in dem die Lage des Thrombus-gebundenen Radiotracers und somit des Thrombus definiert ist.
Thromben enthalten mehrere potentielle Targets für Radiotracer. Thromben sind aus Blutzellen, vorwiegend Blutplättchen, aufgebaut, die mit quervernetztem Fibrinprotein verstrickt sind. Venöse Thromben sind reich an Fibrin, während arterielle Thromben reich an Blutplättchen sind. Fibrin und Blutplättchen sind also naheliegende Targets beim Design von Radiopharmaka zur Abbildung von Thromben, wobei es in beiden mehrere mögliche Targetstellen gibt.
Beim Radio-Imaging von Thromben wurden aktivierte Blutplättchen und Fibrin als Targets verwendet, da sich weder das eine noch das andere normalerweise in zirkulierendem Blut findet; zirkulierendes Blut enthält nicht-aktivierte Blutplättchen und Fibrinogen, eine Vorstufe von Fibrin.
Bei der Bildung eines Gefäßverschlusses kommt es zur proteolytischen Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin und der physiologischen Umwandlung von nicht-aktivierten Blutplättchen zu einem aktivierten Stadium. Da im Blutkreislauf nur wenig Fibrin zirkuliert (im Gegensatz zu seiner Fibrinogen-Vorstufe) und da die meisten zirkulierenden Blutplättchen nicht aktiviert sind, stellen Fibrin und aktivierte Blutplättchen überaus geeignete und spezifische Targets zur Abbildung von Thromben dar, da man sie in vivo außer in einem Thrombus nirgends in nennenswerter Weise finden wird.
Die Verwendung von radiomarkiertem Fibrinogen und radiomarkierten Blutplättchen zum Radio-Imaging bringt jedoch eine Anzahl von Nachteilen mit sich. Die Clearance von radiomarkiertem Fibrinogen und radiomarkierten Blutplättchen aus dem Blut und dem Hintergrundgewebe ist langsam, was eine lange Verzögerung zwischen Injektion und Abbildung erforderlich macht. Weiterhin nimmt die Effizienz von radiomarkierten Platelets als Abbildungsmittel mit zunehmendem Alter der Thromben ab, obwohl Fibrin und Blutplättchen, die sich bereits in einem existierenden Thrombus befinden, auch bei älteren Gefäßverschlüssen Targets bleiben.
Versuche, Radiotracer zur Abbildung von Gefäßverschlüssen zur Verfügung zu stellen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Hierunter fallen autologe Blutplättchen, die entweder mit ¹¹¹In oder 99mTc (Tc-99m) markiert wurden, und ¹²³I und ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen (wobei letzteres mit einer Gammaszintillationssonde und nicht mit einer Gammakamera nachgewiesen wurde). Darüber hinaus können auch andere mit einem Thrombus assoziierte Komponenten des Koagulationssystems, wie Enzyme (z. B. Thrombin), Proenzyme und andere Faktoren geeignete mit einem Thrombus assoziierte Targets für Radiotracer sein. Weitere radiomarkierte Verbindungen, die zur Markierung von Gefäßverschlüssen verwendet wurden, schließen Plasmin, Plasminogenaktivatoren, Heparin, Fibronectin, Fibrin-Fragment E&sub1; und monoklonale Anti-Fibrin- und Anti-Blutplättchen-Antikörper ein [für eine Übersicht, siehe Knight, 1990, Sem. Nucl. Med. 20: 52-67].
Die vielversprechendsten Methoden unter den im Stand der Technik bekannten Methoden zur Radiomarkierung von Gefäßverschlüssen sind radiomarkierte Blutplättchen, radiomarkierte Antikörper und radiomarkiertes Fibrin-Fragment E&sub1;. Die routinemäßige Verwendung all dieser Methoden ist jedoch mit schwerwiegenden Nachteilen verbunden.
Der Einsatz von radiomarkierten autologen Blutplättchen zur Abbildung von Thromben erfordert die Entnahme von autologem Blut und die Abtrennung und Radiomarkierung der Blutplättchen unter sterilen Bedingungen (zusätzlich muß die Radiomarkierung so durchgeführt werden, daß die Blutplättchen nicht aktiviert werden), und die radiomarkierten Blutplättchen müssen dann wieder dem Patienten verabreicht werden. Solche radiomarkierten Blutplättchen haben eine lange Zirkulationszeit, wodurch sich im Frühstadium ein schlechtes Target/Nicht-Target-Verhältnis ergibt, so daß das Radio-Imaging erst nach einer Wartezeit von 24 bis 72 Stunden durchgeführt werden kann. Weiterhin werden ältere Thromben nur schlecht bildlich wiedergegeben, da diese Thromben frische Blutplättchen nicht wirksam aufnehmen.
Auch radiomarkierte monoklonale Antifibrin- und Antiblutplättchen-Antikörper sind im Stand der Technik schon verwendet worden (typischerweise zur bildlichen Darstellung von TVT). Nachteilig bei der Verwendung solcher Reagenzien ist, daß Antikörper (und sogar Antikörperfragmente) eine langsame Clearance im Blut und normalem Gewebe haben, so daß zur optimalen Abbildung eine Wartezeit von wenigstens mehreren Stunden erforderlich ist. Darüber hinaus können immunologische Reagenzien im Patienten eine Immunantwort auslösen. Weiterhin müssen solche Reagenzien aus Säugetierzellinien (Hybridomen) hergestellt werden, wodurch sich das Risiko einer Kontaminierung durch infektiöse Humanviren ergibt.
Verfahren, bei denen radiomarkierte Proteine und proteolytische Fragmente davon zur Abbildung von Gefäßverschlüssen eingesetzt wurden, sind im Stand der Technik beschrieben. So ist beispielsweise Fragment E&sub1; ein proteolytisches Fibrinfragment, welches aus koaguliertem quervernetztem Fibrin abgeleitet ist. Es wurde mit ¹²³I und Tc-99m markiert, wodurch man in Menschen hochqualitative Bilder erhält.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 823017009, 1982, offenbaren Olexa et al. pharmazeutisch verträgliche, radioaktiv markierte proteolytische Fragmente, ausgewählt aus aus quervernetztem Fibrin isoliertem Fragment E&sub1;, aus quervernetztem Fibrin isoliertem Fragment E&sub2; und proteolytischen Fragmenten mit Aminosäuresequenzen, die zwischen den von E&sub1; und E&sub2; liegen. Leider müssen diese Proteinfragmente aufwendig aus menschlichem Fibrinogen hergestellt werden, so daß sie für ein Routineherstellungsverfahren ungeeignet sind.
In PCT/US88/03318, 1988, offenbaren Hadley et al. eine Methode zum Nachweis eines Fibrin/Blutplättchen-Klumpens in vivo, welche die folgenden Schritte umfaßt: (a) Verabreichung eines markierten, abgeschwächten thrombolytischen Proteins, in dem der Marker selektiv an einen Abschnitt des thrombolytischen Proteins gebunden ist, bei dem es sich nicht um die Fibrin-bindende Domäne handelt, an einen Patienten; und (b) Feststellen des Verteilungsmusters des markierten thrombolytischen Proteins im Patienten.
In PCT/US89/02656, 1989, offenbart Sobel ein Verfahren zur Lokalisierung der Position eines oder mehrerer Thromben in einem Tier unter Verwendung von radiomarkiertem, enzymatisch inaktivem Gewebsplasminogenaktivator.
Peptide mit der Fähigkeit, sich an Thromben zu binden, sind vom Stand der Technik her bekannt.
In dem US-Patent Nr. 4,578,079 beschreiben Ruoslahti & Pierschbacher Peptide mit der Sequenz X-Arg-Gly-Asp-R-Y, wobei X und Y entweder für H oder eine Aminosäure stehen und R für Thr oder Cys steht, welche dazu in der Lage sind, sich in vivo an Thromben zu binden.
In US-Patent Nr. 4,792,525 beschreiben Ruoslahti & Pierschbacher Peptide der Sequenz Arg-Gly-Asp-X, wobei X für Ser, Thr oder Cys steht, welche sich in vivo an Thromben binden können.
In US-Patent Nr. 5,086,069, 1992, offenbaren Klein et al. Guaninderivate, die sich an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden, der auf der Zelloberfläche von aktivierten Blutplättchen vorkommt.
In PCT/US88/04403, 1989, offenbaren Pierschbacher et al. konformativ eingeschränkte RGD-enthaltende Peptide zur Inhibierung der Bindung von Zellen an ein Substrat.
PCT/US89/01742, 1989, von Hawiger et al. betrifft Peptide, die Sequenzen für zwei Bindungsstellen eines Proteins enthalten.
In der europäischen Patentanmeldung 90202015.5, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202030.4, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202031.2, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202032.0, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311148.2, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311151.6, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311537.6, 1990, offenbaren Ali et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In PCT/U590/03788, 1991, offenbaren Barker et al. cyclische Peptide zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation.
In PCT/US91/02356, 1991, offenbaren Pierschbacher et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 0478328A1, 1992, offenbaren Egbertson et al. Tyrosinderivate, die sich mit hoher Affinität an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden.
In 204th Meeting, Amer. Chem. Soc. Abs. 44, 1992, offenbaren Ojima et al. synthetische multimere RDGF-Peptide, die zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation geeignet sind.
In J. Med. Chem. 35: 4640-4642, 1992, beschreiben Hartman et al. Tyrosinderivate mit hoher Affinität für den GPIIb/IIIa-Rezeptor.
Radiomarkierte Peptide, die sich zum Radio- Imaging von Gefäßverschlüssen eignen, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
In PCT/US88/02276, 1988, offenbaren Ranby et al. ein Verfahren zum Nachweis von Fibrinablagerungen in Tieren, bei dem eine radiomarkierte Verbindung kovalent an Fibrin gebunden wird.
In PCT/GB90/00933, 1990, offenbart Stuttle radioaktiv markierte Peptide mit 3 bis 10 Aminosäuren, die die Sequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) umfassen und sich in vivo an eine RGD-Bindungsstelle binden können.
In PCT/US91/03116, 1991, offenbaren Rodwell et al. Konjugate von "molekularen Erkennungseinheiten" mit "Effektordomänen".
In PCT/US90/04642, 1991, offenbaren Maraganore et al. einen radiomarkierten Thrombusinhibitor, bestehend aus (a) einer Inhibitor-Struktureinheit, (b) einer Linker-Struktureinheit und (c) einer "anion binding exosite (ABE)" Bindungsstelle-Struktureinheit.
Der Gebrauch von Komplexierungsmitteln beim Radiomarkieren von Polypeptiden und Verfahren zur Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit Tc-99m sind aus dem Stand der Technik bekannt und in den gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldungen mit den laufenden Nummern 07/653,012, 07/807,062, 07/871,282, 07/886,752; 07/893,981, 07/955,466, 08/019,864 und 08/044,825 und den Internationalen PCT-Anmeldungen PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320 offenbart.
Es besteht immer noch ein Bedarf an kleinen (zur Verbesserung der Blut- und Hintergrundgewebsclearance), synthetischen (damit eine routinemäßige Herstellung praktikabel wird, und zur Erleichterung der Zulassung), mit Tc-99m radiomarkierten Molekülen zur Abbildung von Thromben in vivo. Dieser Bedarf wird durch kleine synthetische, mit Tc-99m radiomarkierte Peptide, die sich spezifisch an Komponenten des Thrombus binden und die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt werden, gedeckt.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt radioaktiv markierte Reagenzien zur Verfügung, bei denen es sich um Mittel zur diagnostischen, szintigraphischen Abbildung handelt. Insbesondere stellt die Erfindung Reagenzien zur Herstellung von mit Technetium-99m (Tc-99m) radioaktiv markierten Mitteln zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen Reagenzien umfassen jeweils eine spezifisch bindende Verbindung, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Peptide, die sich in vivo spezifisch an einen Thrombus bindet und die kovalent mit einer einen radioaktiven Marker bindenden Struktureinheit verbunden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien zur Verfügung, in denen es sich bei den spezifisch bindenden Verbindungen um cyclische Peptide mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren handelt.
Die Verwendung von kleinen Verbindungen, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, ist mit deutlichen kommerziellen Vorteilen verbunden. Solche kleinen Verbindungen lassen sich leicht herstellen. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, daß sie nicht immunogen sind und schnell aus den Gefäßen entfernt werden, wodurch eine bessere und schnellere Abbildung der Gefäßverschlüsse möglich wird. Im Gegensatz dazu sind größere Moleküle wie Antikörper oder Fragmente davon, oder andere Peptide biologischen Ursprungs, die größer als 10.000 Dalton sind, teuer in der Herstellung, und es ist wahrscheinlich, daß sie immunogen sind und langsamer aus dem Blutkreislauf entfernt werden, was bei der schnellen in vivo Diagnose von Gefäßverschlüssen stört.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses bereitgestellt, umfassend ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und einer Technetium-99m bindenden Struktureinheit, die kovalent mit dem Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus cyclischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa-Rezeptor darstellen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses, umfassend ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und einer Technetium-99m bindenden Struktureinheit, die kovalent mit dem Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus cyclischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa-Rezeptor darstellen, und wobei die Technetium-99 m bindende Struktureinheit die nachfolgende Struktureinheit umfaßt: C(pgp)s-(aa)-C(pgp)s, wobei C(pgp)s ein Cystein mit einer geschützten Thiolgruppe ist und (aa) einer Aminosäure entspricht, bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien zur Verfügung, in denen das Peptid und die Technetium-99m bindende Struktureinheit durch 1 bis 20 Aminosäuren kovalent miteinander verbunden sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses, umfassend ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und einer Technetium-99m bindenden Struktureinheit, die kovalent mit dem Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus cyclischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa-Rezeptor darstellen, und wobei die Technetium-99m bindende Struktureinheit die nachfolgende Struktureinheit umfaßt: A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X, wobei A für H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4; steht; B für H, SH, -NHR³, -NHR³, -N(R³)- (Peptid) oder R&sup4; steht; X für H, SH, -NHR³, -N(R³)- (Peptid) oder R&sup4; steht; Z für H oder R&sup4; steht; R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils unabhängig voneinander für H oder einen kurzkettigen, linearen oder verzweigten oder cyclischen Alkylrest stehen; n für 0, 1 oder 2 steht; und (1) wenn B = -NHR³ oder -N(R³)-Peptid ist, so ist X=SH und n = 1 oder 2; (2) wenn X = -NHR³ oder -N(R)³- (Peptid) ist, so ist B = SH und n = 1 oder 2; (3) wenn B = H oder R&sup4;, so ist A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid) -OOC, X = SH und n = 0 oder 1; (4) wenn A = H oder R&sup4; ist, dann ist X = -NHR³ oder -N(R³)- (Peptid), wenn gleichzeitig B = SH ist, und B = -NHR³ oder -N(R³)- (Peptid), wenn gleichzeitig X = SH ist; (5) wenn X = H oder R&sup4; ist, so ist A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC und B = SH; (6) wenn Z = Methyl ist, so ist X = Methyl, A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC, B = SH und n = 0; und (7) wenn 8 und X gleichzeitig SH sind, ist n nicht 0; und wobei die Thiol-Struktureinheit in ihrer reduzierten Form vorliegt, zur Verfügung gestellt. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien zur Verfügung, in denen das Peptid und die Technetium-99m bindende Struktureinheit kovalent durch 1 bis 20 Aminosäuren miteinander verbunden sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses, umfassend ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und einer Technetium-99m bindenden Struktureinheit, die kovalent mit dem Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus cyclischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa-Rezeptor darstellen, und wobei die Technetium-99m bindende Struktureinheit mit Technetium- 99m einen neutralen Komplex bildet und eine Formel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
[für den Zweck dieser Erfindung werden radioaktive Marker bindende Struktureinheiten mit dieser Struktur als auf Picolinsäure (Pic)-basierende Struktureinheiten bezeichnet] wobei X = H oder eine Schutzgruppe ist, und (Aminosäure) einer beliebigen Aminosäure entspricht; oder
[für den Zweck dieser Erfindung werden radioaktive Marker bindende Struktureinheiten mit dieser Struktur als auf Picolylamin (Pica)-basierende Struktureinheiten bezeichnet] wobei X = H oder eine Schutzgruppe ist, und (Aminosäure) einer beliebigen Aminosäure entspricht; oder
wobei R&sup5; unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, jedes (pgp)s unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist, m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind, A = lineares oder zyklisches kurzkettiges Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, deren Kombinationen oder substituierte Derivate, und X das Peptid ist, oder
wobei R&sup5; unabhängig voneinander H, ein kurzkettiges Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder ein mit kurzkettigem Alkyl oder kurzkettigem Alkoxy substituiertes Phenyl ist, m, n und p unabhängig voneinander 1 oder 2 sind, A = lineares oder zyklisches kurzkettiges Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, deren Kombinationen oder substituierte Derivate ist, V = H oder -CO-Peptid ist, R&sup6; = H oder ein Peptid ist; und wobei R&sup6; ein Peptid sein muß, wenn V 8 ist, und V = -CO-Peptid sein muß, wenn R&sup6; = H, zur Verfügung gestellt. [Für den Zweck dieser Erfindung werden radioaktive Marker bindende Struktureinheiten mit dieser Struktur als "BAT"-Struktureinheiten bezeichnet]. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien zur Verfügung, in denen das Peptid und die Technetium-99m bindende Struktureinheit durch 1 bis 20 Aminosäuren kovalent miteinander verbunden sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die spezifisch bindende Verbindung des Reagenzes durch eine Aminosäure, ganz besonders bevorzugt Glycin, kovalent mit der den radioaktiven Marker bindenden Struktureinheit verbunden.
In bevorzugten Ausführungsformen der obenerwähnten Aspekte der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der spezifisch bindenden Verbindung um ein Peptid aus 4 bis 100 Aminosäuren. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform des radioaktiven Markers ist Technetium-99m.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien lassen sich darstellen, indem man die spezifisch bindenden Verbindungen oder die den radioaktiven Marker bindenden Struktureinheiten kovalent mit einer mehrwertigen verbindenden Struktureinheit verbindet. Erfindungsgemäße mehrwertige Verbindungseinheiten umfassen wenigstens zwei identische Gruppen mit Linkerfunktionalität, die dazu in der Lage sind, kovalent an spezifisch bindende Verbindungen oder radioaktive Marker bindende Struktureinheiten zu binden. Bevorzugte Gruppen mit Linkerfunktionalität sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder Thiol-reaktive Gruppen. Bei bevorzugten Ausführungsformen besteht die mehrwertige Verbindungseinheit aus einer der nachfolgend aufgezählten Verbindungen: bis-Succinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB), tris- (Succinimidylethyl)amin (TSEA), N-[2-(N',N'-bis-(2- Succinimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis-(2-methyl-2- mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid (BAT-BS), 4-(O-CH&sub2;CO- Gly-Gly-Cys-Amid)-acetophenon (ETAC) und bis- Succinimidohexan (BSH).
Die Erfindung stellt darüber hinaus Mittel zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses zur Abbildung eines Gefäßverschlusses im Körper eines Säugetieres zur Verfügung, umfassend ein spezifisch bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und eine Technetium-99m bindende Struktureinheit, die kovalent mit dem spezifisch bindenden Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus zyklischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa- Rezeptor darstellen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin Mittel zur szintigraphischen Bilderzeugung, bei denen es sich um Komplexe der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m handelt, und Methoden zur radioaktiven Markierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m. Die von der Erfindung zur Verfügung gestellten radioaktiv markierten Komplexe werden gebildet, wenn erfindungsgemäße Reagenzien in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit Tc-99m reagiert werden. Bevorzugte Reduktionsmittel sind das Dithionition, das Zinn(II)-Ion und das Eisen(II)-Ion, wobei diese Aufzählung keine Einschränkung darstellen soll. Erfindungsgemäße Komplexe werden weiterhin gebildet, wenn man die erfindungsgemäßen Reagenzien durch Ligandenaustausch mit einem vorher reduzierten Tc-99m- Komplex, wie hier zur Verfügung gestellt, mit Tc-99m markiert.
Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Herstellung von Mitteln zur szintigraphischen Bilderzeugung bereit, bei denen es sich um mit Tc-99m radioaktiv markierte erfindungsgemäße Reagenzien handelt. Kits zur Markierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99m umfassen ein verschlossenes Gefäß, das eine vorher festgelegte Menge eines erfindungsgemäßen Reagenzes oder einer Mischung davon und eine ausreichende Menge eines Reduktionsmittels enthält, um das Reagenz mit Tc-99m zu markieren.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Darstellung von erfindungsgemäßen Reagenzien durch in vitro durchgeführte, chemische Synthese bereit. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Peptide durch Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung von Mitteln zu szintigraphischen Bilderzeugung, bei denen es sich um mit Tc-99m markierte Reagenzien handelt, zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses im Körper eines Säugetieres durch Erzeugen von gammaszintigraphischen in vivo-Abbildungen bereit. Bei diesen Verfahren werden diagnostisch wirksame Mengen von erfindungsgemäßen, mit Tc-99m markierten Reagenzien verabreicht und die von dem Tc-99m-Marker, der an der Stelle des Gefäßverschlusses im Körper des Säugetieres lokalisiert ist, abgegebene Gammastrahlung nachgewiesen.
Spezielle bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden ausführlicheren Beschreibung von bestimmten bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien, einschließlich Peptidreagenzien, zur Herstellung von radioaktiv markierten Mitteln zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses zur Abbildung eines Gefäßverschlusses in dem Körper eines Säugetieres bereit. Die durch die Erfindung bereitgestellten Reagenzien umfassen eine einen radioaktiven Marker bindende Struktureinheit, die kovalent mit einer spezifisch bindenden Verbindung verbunden ist, welche dazu in der Lage ist, sich an wenigstens eine Komponente eines Thrombus zu binden. Für den Zweck der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Mittel zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses" auf die Ausführungsformen der Erfindung, die eine spezifisch bindende Verbindung enthalten, die kovalent mit einer einen radioaktiven Marker bindenden Struktureinheit verbunden ist und vorzugsweise mit Tc-99m, ¹¹¹In oder &sup6;&sup8;Ga, ganz besonders bevorzugt mit Tc- 99m, radioaktiv markiert ist.
Bei der Markierung mit Tc-99m handelt es sich um einen Vorteil der vorliegenden Erfindung, da dieses Isotop dank seiner nuklearen und radioaktiven Eigenschaften ein ideales Mittel zur szintigraphischen Bilderzeugung ist. Das Isotop weist eine Einzelphotonenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf und ist leicht über einen &sup9;&sup9;Mo-99mTc-Generator verfügbar. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß keiner der bevorzugten Radionukleide toxisch ist, im Gegensatz zu anderen aus dem Stand der Technik bekannten Radionukleiden (zum Beispiel ¹²&sup5;I).
In den Tc-99m bindenden Struktureinheiten und den Verbindungen, die kovalent mit solchen Struktureinheiten verbunden sind, die einen Thiol enthalten, der kovalent mit einer erfindungsgemäßen Thiol-Schutzgruppe [(pgp)s] verbunden ist, können die Thiol-Schutzgruppen gleich oder verschieden sein und zum Beispiel aus der folgenden Gruppe stammen, wobei dies nicht als Einschränkung gemeint ist:
-CH&sub2;-Aryl (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxy-substituiertes Phenyl);
-CH-(Aryl)&sub2;, (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxy-substituiertes Phenyl);
C-(Aryl)&sub3;, (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxy-substituiertes Phenyl);
-CH&sub2;-(4-Methoxyphenyl);
-CH-(4-Pyridyl)(phenyl)&sub2;;
-C(CH&sub3;)&sub3;;
-9-Phenylfluorenyl;
-CH&sub2;NHCOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;-NHCOOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CONHR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;-S-CH&sub2;-Phenyl
Bevorzugte Schutzgruppen sind die der Formel -CH&sub2;-NHCOR, wobei R für einen kurzkettigen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einen Phenylrest oder einen Phenylrest, der mit einem kurzkettigen Alkylrest, einer Hydroxylgruppe, einer kurzkettigen Alkoxygruppe, einer Carboxylgruppe oder einer kurzkettigen Alkoxycarbonylgruppe substituiert ist, steht. Die am meisten bevorzugte Schutzgruppe ist die Acetamidomethylgruppe.
Jede spezifisch bindende Ausführungsform der Erfindung, die Peptide enthält, umfaßt eine Aminosäuresequenz. Mit dem Ausdruck "Aminosäure", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind alle natürlich vorkommenden und andere L- und D-Aminosäuren gemeint. Reagenzien, die spezifisch bindende erfindungsgemäße Peptide enthalten, schließen die folgenden ein, wobei die Aufzählung nicht als Einschränkung gedacht ist (bei den Aminosäuren in den unten aufgeführten Peptiden handelt es sich um L-Aminosäuren, wenn nicht anders angegeben): Liganden für den GPIIb/IIIa-Rezeptor
(Einbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren finden sich in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York), S. 33; die anderen Abkürzungen sind in der Legende zur Tabelle I erläutert). Die Aufzählung der durch die Erfindung bereitgestellten Reagenzien dient nur zur Erläuterung und stellt keine Einschränkung bzw. Ausgrenzung dar, und es wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein, daß Reagenzien, die Kombinationen der hier offenbarten Peptide oder ihrer Äquivalente umfassen, kovalent mit irgendeiner der erfindungsgemäßen komplexierenden Struktureinheiten verbunden werden können und in den Schutzbereich der Erfindung fallen, einschließlich Kombinationen dieser Peptide und komplexierenden Struktureinheiten, die die hier offenbarten Verbindungseinheiten umfassen.
Bei den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die Peptide mit einer für einen Liganden des Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptors kodierenden Aminosäuresequenz aufweisen, ist jedes der Reagenzien dazu in der Lage, die Aggregation von humanen Blutplättchen in thrombozytenreichem Plasma um 50% zu inhibieren, wenn es in einer Konzentration von höchstens 0,3 uM vorliegt.
Die erfindungsgemäßen spezifisch bindenden Peptide können chemisch in vitro synthetisiert werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich im allgemeinen vorteilhaft mit einem Aminosäure- Synthesizer darstellen. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich so darstellen, daß die den radioaktiven Marker bindende Struktureinheit kovalent während der chemischen Synthese in vitro mit dem Peptid verbunden wird, und zwar unter Einsatz von Methoden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Solche während der Synthese kovalent mit der den radioaktiven Marker bindenden Struktureinheit verbundenen Peptide sind vorteilhaft, da sich die spezifischen Stellen der kovalenten Verbindung bestimmen lassen.
Die erfindungsgemäßen, den radioaktiven Marker bindenden Struktureinheiten lassen sich während der Peptidsynthese in das target-spezifische Peptid einführen. Im Fall von Ausführungsformen, die Picolinsäure [(Pic-); z. B. Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)-] enthalten, kann die den radioaktiven Marker bindende Struktureinheit in der Synthese als letzter Rest (d. h. am Amino-Ende) synthetisiert werden. Darüber hinaus kann die Picolinsäure enthaltende, den radioaktiven Marker bindende Struktureinheit kovalent mit der &epsi;-Aminogruppe von Lysin verbunden sein, wodurch man zum Beispiel αN(Fmoc)-Lys-&epsi;N[Pic-Gly-Cys (Schutzgruppe)] erhalten wird, welches in einer beliebigen Position in die Peptidkette eingebaut werden kann. Die Sequenz ist besonders vorteilhaft, da sie auf einfache Weise den Einbau in das targetbindende Peptid ermöglicht.
Analog ist es möglich, die Picolylamin(Pica) enthaltende, einen radioaktiven Marker bindende Struktureinheit [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-Pica] während der Peptidsynthese herzustellen, indern man die [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-]-Sequenz am Carboxyl-Ende der Peptidkette einfügt. Nach Abspaltung des Peptids vom Harz wird der Carboxyl-Terminus des Peptids aktiviert und mit Picolylamin gekoppelt. Bei diesem Syntheseweg ist es erforderlich, daß reaktive Seitenkettenfunktionalitäten maskiert (geschützt) bleiben und während der Verbindung mit dem Picolylamin nicht reagieren.
Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau der Pic-Gly-Cys- und -Cys-Gly-Pica-Chelatoren in praktisch jedes beliebige, in vivo zur spezifischen Bindung an einen Thrombus fähige Peptid bereit, wodurch man ein radioaktiv markiertes Peptid erhält, in welchem Tc-99m als neutraler Komplex gehalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin spezifisch bindende, kleine synthetische Peptide zur Verfügung, die Bisamin-Bisthiol-(BAT)-Chelatoren umfassen, die mit Tc-99m markiert sein können. Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau dieser Chelatoren in praktisch jedes beliebige, in vivo zur spezifischen Bindung an einen Thrombus fähige Peptid bereit, wodurch man ein radioaktiv markiertes Peptid erhält, in welchem Tc-99m als neutraler Komplex gehalten wird. Beispiele für kleine synthetische Peptidreagenzien, die BAT-Chelatoren als radioaktive Marker bindende Struktureinheiten enthalten, sind unten in den Beispielen angegeben.
Bei der Bindung eines Komplexes von radioaktiven Technetium-99m mit den Reagenzien der vorliegenden Erfindung wird der Technetiumkomplex, vorzugsweise ein Salz von Tc-99m-Pertechnetat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit dem Reagenz umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)-Ionen; das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)- Chlorid. Die zur Herstellung solcher Komplexe erforderlichen Mittel werden zweckmäßigerweise in einem Kit zur Verfügung gestellt, wobei das Kit ein verschlossenes Gefäß umfaßt, das eine vorher festgelegte Menge eines zu markierenden, erfindungsgemäßen Reagenzes und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel enthält, um das Reagenz mit Tc-99m zu markieren. Alternativ dazu kann man den Komplex auch durch Umsetzung eines erfindungsgemäßen Reagenzes mit einem zuvor gebildeten, labilen Komplex von Technetium und einer anderen, als Transferligand bezeichneten Verbindung bilden. Dieses Verfahren wird als Ligandenaustausch bezeichnet und ist dem Fachmann wohlbekannt. Der labile Komplex kann zum Beispiel unter Verwendung von Transferliganden wie Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit gebildet werden. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung brauchbaren Tc-99m-Pertechnetatsalze schließen die Alkalisalze wie z. B. das Natriumsalz, und die Ammoniumsalze und kurzkettigen Alkylammoniumsalze ein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Darstellung von mit Technetium markierten Reagenzien zur Verfügung gestellt. Eine geeignete Menge des Reagenzes wird in ein Vial gegeben, das ein Reduktionsmittel, wie z. B. Zinn(II)-Chlorid, in einer Menge enthält, die zur Markierung des Reagenzes mit Tc-99m ausreichend ist. Dabei kann auch eine geeignete Menge eines der beschriebenen Transferliganden (wie z. B. Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit) vorliegen. Das Kit kann weiterhin übliche pharmazeutische Adjuvanzien enthalten, wie z. B. pharmazeutisch verträgliche Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Die Komponenten des Kits können in flüssiger, gefrorener oder trockener Form vorliegen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Komponenten des Kits in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt.
Erfindungsgemäße, mit einem radioaktiven Marker versehene Mittel zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses lassen sich darstellen, indem man eine geeignete Menge von Tc-99m oder eines Tc-99m-Komplexes in die Vials gibt und unter den unten in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen umsetzt.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten radioaktiv markierten Mittel zur szintigraphischen Abbildung weisen eine geeignete Menge Radioaktivität auf. Bei der Darstellung von radioaktiven Tc-99m-Komplexen werden im allgemeinen bevorzugt radioaktive Komplexe in Lösungen gebildet, die Radioaktivität in Konzentrationen von ungefähr 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Mittel zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses können zur Abbildung von Thromben in Körpern von Säugetieren verwendet werden, wenn sie mit Tc-99m markiert sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit Tc-99m markierten Reagenzien als eine injizierbare Einzeldosis verabreicht. Die von der Erfindung bereitgestellten, mit Tc-99m markierten Reagenzien können intravenös in einem beliebigen herkömmlichen Medium zur intravenösen Injektion, wie z. B. einem wäßrigen Kochsalzmedium, oder im Blutplasmamedium, verabreicht werden. Im allgemeinen weist die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von ungefähr 0,01 mCi bis ungefähr 100 mCi, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi, auf. Die als Einzeldosis zu injizierende Lösung hat ein Volumen von ungefähr 0,01 ml bis ungefähr 10 ml. Nach der intravenösen Verabreichung kann die diagnostische Abbildung des Gefäßverschlusses in vivo innerhalb von wenigen Minuten durchgeführt werden. Falls gewünscht, kann die Abbildung jedoch auch erst nach einigen Stunden oder noch länger nach Injektion des radioaktiv markierten Reagenzes in den Patienten durchgeführt werden. In den meisten Fällen wird sich eine zur Aufnahme von Szintiphotos ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb von ungefähr 0,1 Stunden in der abzubildenden Gegend angereichert haben. Erfindungsgemäß kann man jede herkömmliche Methode zur szintigraphischen Abbildung für diagnostische Zwecke einsetzen.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen sind ausführlicher in den folgenden Beispielen dargestellt. In diesen Beispielen werden gewisse Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse erläutert. Diese Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.

BEISPIEL 1

Festphasen-Peptidsynthese

Die Festphasen-Peptidsynthese (FPPS) wurde im 0,25-Millimol(mNol)-Maßstab mit einem Applied Biosystems Model 431A-Peptidsynthesizer durchgeführt, wobei das Amino-Ende mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt wurde, die Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) durchgeführt wurde und ein p-Hydroxymethylphenoxy-methylpolystyrol- (HMP)-Harz für Säuren am Carboxylende bzw. ein Rink- Amidharz für Amide am Carboxyl-Ende eingesetzt wurde. Die harzgebundenen Produkte wurden routinemäßig unter Verwendung einer aus Trifluoressigsäure, Wasser, Thioanisol (wenn das Peptid einen Arginin-Rest enthält), Ethandithiol und Triethylsilan im Verhältnis von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 bestehenden Lösung 0,5-3 h lang bei Raumtemperatur abgespalten.
Gegebenenfalls wurden N-terminale Acetylgruppen durch 30minütige Behandlung des harzgebundenen Peptids mit freier N-terminaler Aminogruppe mit 20% v/v Essigsäureanhydrid in NMP(N-Methylpyrrolidinon) eingeführt. Gegebenenfalls wurden 2-Chloracetyl- und 2-Bromacetylgruppen eingeführt, entweder indem man während der FPPS als letzten anzukuppelnden Rest die entsprechende 2-Halogenessigsäure verwendete oder indem man das harzgebundene Peptid mit N-terminaler freier Aminosäure entweder mit 2-Halogenessigsäure/Diisoproplycarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP oder mit dem 2-Halogenessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP behandelt. Gegebenenfalls wurden die 2-halogenacetylierten Peptide durch 4- bis 48stündiges Rühren einer 0,1-1,0 mg/ml Lösung in Phosphat- oder Bicarbonatpuffer (pH 8) enthaltend 0,5-1,0 mM EDTA, gefolgt von Ansäuerung mit Essigsäure, Lyophilisierung und Aufreinigung durch HPLC, zyklisiert. Gegebenenfalls wurden Cys-Cys-Disulfid-Bindungen zyklisiert, indem man die cystein-freien Thiolpeptidvorstufen, 0,1 mg/ml, in Puffer mit einem pH-Wert von 7 mit Aliquots von 0,006 M K&sub3;Fe(CN)&sub6; behandelte, bis eine stabile gelbe Färbung erhalten blieb. Der Überschuß an Oxidationsmittel wurde mit überschüssigem Cystein reduziert, und die Mischung wurde dann lyophilisiert und durch HPLC aufgereinigt.
Gegebenenfalls wurde die "Pic"-Gruppe eingeführt, indem man als letzten Rest in der Peptidsynthese Picolinsäure verwendete. Gegebenenfalls wurde die "Pica"-Gruppe eingeführt, indem man unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid Picolylamin mit einer Peptidvorstufe konjugierte. Gegebenenfalls wurden BAT-Liganden eingeführt, entweder durch Verwendung der entsprechenden BAT-Säure als letzten während der FPPS anzukoppelnden Rest, oder durch Behandeln des harzgebundenen Peptids mit N-terminaler freier Aminogruppe mit BAT-Säure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP. Gegebenenfalls wurde [BAM] mit dem Peptid konjugiert, indem zunächst das Peptid-Carboxylat mit einer Mischung von Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid oder HBTU/HOBT in DMF, NMP oder CH&sub2;Cl&sub2; aktiviert wurde und die Kupplung dann in Gegenwart von Diisopropylethylamin durchgeführt wurde; nach der Kupplung wurde das Konjugat wie oben beschrieben entschützt.
Gegebenenfalls wurden BSME-Addukte durch Umsetzung von Peptiden mit nur einer Thiolgruppe (5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8) mit 0,5 Moläquivalenten BMME (bis-Maleinimidomethylether), vorgelöst in Acetonitril, bei Raumtemperatur für ungefähr 1-18 Stunden, dargestellt. Die Lösung wurde konzentriert und das Produkt durch HPLC gereinigt.
Gegebenenfalls wurden BSH-Addukte durch Verwendung von bis-Maleinimidohexan an Stelle von BMME dargestellt.
Gegebenenfalls wurden TSEA-Addukte dargestellt, indem man Peptide mit einer einzelnen Thiolgruppe (bei Konzentrationen von 10 bis 100 mg/ml Peptid in DMF, oder 5 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH 8)/Acetonitril oder THF) bei Raumtemperatur ungefähr 1-18 h mit 0,33 Moläquivalenten TMEA (tris-(2-Maleinimidoethyl)amin; siehe ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung 07/955,466 auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird), vorgelöst in Acetonitril oder DMF, gegebenenfalls mit Zugabe von einem Moläquivalent Triethanolamin, umsetzte. Solche Addukte enthaltende Reaktionsmischungen wurden konzentriert, und die Addukte wurden dann durch HPLC gereinigt.
Gegebenenfalls wurden BAT-BS-Addukte dargestellt, indem man Peptide mit einer einzelnen Thiolgruppe (bei Konzentrationen von 2 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH 8)/Acetonitril oder THF) bei Raumtemperatur ungefähr 1-18 h mit 0,5 Moläquivalenten BAT-BM(N-[2-(N',N'-bis(2-Maleinimidoethyl) aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2- methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazononanamid; siehe ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung 08/044,825 auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird), vorgelöst in Acetonitril oder THF, umsetzte. Die Lösung wurde anschließend eingedampft, und die [BAT-BS]- Peptidkonjugate wurden durch einstündige Behandlung mit 10 ml TFA und 0,2 ml Triethylsilan entschützt. Die Lösung wurde konzentriert und die Produktaddukte mit Ether gefällt und dann durch HPLC gereinigt.
Die rohen Peptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta Park C18-Säule und Gradientenelution mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, gereinigt. Von den eluierten Fraktionen wurde das Acetonitril abgedampft, und die Fraktionen wurden dann lyophilisiert. Die Identität des jeweiligen Produktes wurde durch Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie (FABMS) bestätigt.

BEISPIEL 2

Allgemeines Verfahren zur radioaktiven Markierung mit Tc-99m

0,1 mg eines wie in Beispiel 1 hergestellten Peptidreagenzes wurden in 0,1 ml Wasser oder Ethanol : Wasser 50 : 50 oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder 50 mN Kaliumphosphatpuffer (pH = 5,6 oder 7,4) gelöst. Tc-99m-Gluceptat wurde durch Rekonstitution eines Glucoscan-Vials (E. L. DuPont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat, enthaltend bis zu 200 mCi, und anschließendem Stehenlassen bei Raumtemperatur für 15 Minuten, dargestellt. 25 ul Tc-99m-Gluceptat wurden dann zum Peptid gegeben, und nach 15- bis 30-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur oder 100ºC wurde die Mischung durch einen 0,2-um-Filter filtriert.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde unter Anwendung der in den Fußnoten in Tabelle I beschriebenen Bedingungen durch HPLC bestimmt. Radioaktive Komponenten wurden durch einen in-line radiometrischen Detektor, der mit einem integrierenden Rekorder verbunden war, nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen eluieren Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m- Natriumpertechnetat zwischen 1 und 4 Minuten, während das mit Tc-99m markierte Peptid erst sehr viel später eluiert.
Die folgende Tabelle veranschaulicht gelungene Tc-99m-Markierungen von nach Beispiel 1 dargestellten Peptiden unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens. TABELLE I TABELLE I (Forts.)
* Die hochgestellten Zahlen beziehen sich auf die folgenden Markierungsbedingungen:
2. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst und bei 100ºC markiert.
3. Das Peptid wird in Wasser gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
4. Das Peptid wird in Wasser gelöst und bei 100ºC markiert.
5. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) gelöst und bei 100ºC markiert.
** HPLC-Methoden (angegeben durch die hochgestellte Zahl nach RT):
allgemein: Lösungsmittel A = 0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub7;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/70% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub9;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Durchflußgeschwindigkeit des Lösungsmittels = 1 ml/min
Vydak-Säule = Vydak218TP54-RP-18, 5u · 220 mm · 4,6 mm, analytische Säule mit Schutzsäule
Brownlee-Säule = Brownlee Spheri-5 RP-18, 5u · 220 mm · 4,6 mm Säule
Waters-Säule = Waters Delta-Pak C18, 5u · 150 mm · 3,9 mm Säule
Methode 1: Brownlee-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 2: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Methode 3: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 4: Waters-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 20 min
Methode 5: Waters-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
*** Bestätigt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese
**** Bestätigt durch Bindung des Peptids an einer Affinitätssäule
Die Einzelbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren finden sich zum Beispiel in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York) S. 33; Unterstreichungen deuten die Bildung einer Thiolbindung zwischen den verbundenen Aminosäuren der Derivatgruppen an; die Peptide sind jeweils über die freie Thiol- Struktureinheit des ungeschützten Cysteinrestes (C) im betreffenden Peptid mit BSH-, ETAC-, BSME-, TSEA- oder [BAT-BS]-Linkern verbunden; Acm=Acetamidomethyl; Mob=4-Methoxybenzyl; Apc=L-[S-(3-Aminopropyl)cystein]; FD=D-Phenylalanin; YD=D-Tyrosin; BAT=N&sup6;,N&sup9;-bis- (2-Mercapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonansäure; BAT-BS=N-[2-N',N'-bis-(2-Succinimidoethyl)aminoethyl]- N&sup6;,N&sup9;-bis-(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9- diazanonanamid; BSME=bis-Succinimidomethylether; TSEA=tris-(2-Succinimidoethyl)amin; NES=N-Ethylsuccinimid; BSH=1,6-bis-Succinimidohexan
a= bestätigt durch Elektrospray-Massenspektrometrie [ESMS]

BEISPIEL 3

Thrombocytenaggregationsinhibierungsassays

Die Untersuchungen zur Thrombocytenaggregation wurden im wesentlichen wie von Zucker beschrieben (1989, Methods in Enzymol. 169: 117-133) durchgeführt. Kurz zusammengefaßt wurde die Thrombocytenaggregation gegebenenfalls mit putativen thrombocytenaggregationsinhibierenden Verbindungen unter Verwendung von frischem menschlichem Plasma, das reich an Blutplättchen war und 300.000 Plättchen pro Mikroliter enthielt, untersucht. Die Thrombocytenaggregation wurde durch Zugabe einer Lösung von Adenosin-Diphosphat (Endkonzentration 10 bis 10 Mikromolar) induziert, und das Ausmaß der Thrombocytenaggregation wurde mit Hilfe eines Bio/Data-Aggregometers (Bio/Data Corp., Horsham, PA) verfolgt. Die Konzentrationen der verwendeten, die Thrombocytenaggregation hemmenden Verbindungen variierte von 0,1 bis 500 ug/ml. Die Inhibitorkonzentration, bei der die Plättchenaggregation um 50% reduziert war (definiert als IC&sub5;&sub0;) wurde aus Auftragung der Inhibitorkonzentration gegen das Ausmaß der Thrombocytenaggregation bestimmt. Als positive Kontrolle wurde eine Inhibierungskurve für das Peptid RGDS bei jeder untersuchten Blutplättchencharge bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle II gezeigt. In Tabelle II wurden die folgenden Verbindungen untersucht:
P97 = GRGDVRGDFKCAcmGCAcmAmid
P32 = CAcmGCAcmRRRRRRRRRGDV
P134 = CH&sub2;CO-YDRGDCGGCAcmGCAcmAmid
P245 = CH&sub2;CO-YD · Apc · GDCGGCAcmGCAcmGGFDPRPGAmid
P98 = GRGDVRGDFCAcmGCAcmAmid
P81 = CH&sub2;CO-YDRGDCCAcmGCAcmAmid
P154 = CH&sub2;CO-YDApcGDCGGGCAcmGCAcmAmid
P381 = (CH&sub2;CO-YDApcGDCKGCAcmGCAcmGGC-Amid)&sub2;-BSME
P317 = (CH&sub2;CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-Amid)&sub2;-TSEA
P280 = (CH&sub2;CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-Amid)&sub2;-BSME
P357 = (CH&sub2;CO-YDApcGDCGGCAcmGCAcmGGC-Amid)&sub2;-[BAT-BS]
(Die Abkürzungen sind wie in der Legende zu Tabelle I definiert).
Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die Peptidreagenzien der vorliegenden Erfindung mit hoher Affinität an aktivierte Blutplättchen binden, wobei die Affinität in vielen Fällen höher ist als die der natürlich vorkommenden Sequenz RGDS.

TABELLE II

Peptide IC&sub5;&sub0;(uM)*

P317 0,036
P381 0,035
P357 0,081
P280 0,090
P154 0,3
P245 0,5
P143 1,3
P97 8
P98 15
P81 25
P32 26
RGDS 150-250
* Reagenzkonzentration, bei der die durch Zugabe von Adenosin-Diphosphat (ADP) induzierte Aggregation von menschlichen Blutplättchen in thrombocytenreichem Plasma zu 50% inhibiert wird.

BEISPIEL 4

Diagnostische in vivo Abbildung einer tiefen Venenthrombose unter Verwendung eines mit Tc-99m markierten Peptids in Hunden

Mischlingshunde (Gewicht 11-16 kg, über Nacht nüchtern gehalten) wurden mit einer Kombination von Ketamin und Aceprozamin i. m. ruhiggestellt und dann mit Natrium-Pentabarbital i. v. narkotisiert. Jedem Tier wurde ein 18er Angiographiekatheter in die distale Hälfte der rechten V. femoralis und eine 8 mm Embolisationsspule aus Edelstahl, umwickelt mit Dacron® (Cook Co., Bloomington IN), ungefähr in der Mitte des Oberschenkels in die V. femoralis eingepflanzt. Der Katheter wurde wieder entfernt, die Wunde zugenäht und die Plazierung der Spule durch eine Röntgenaufnahme dokumentiert. Die Tiere durften sich dann über Nacht wieder erholen.
Ein Tag nach der Plazierung der Spule wurden die Tiere jeweils wieder narkotisiert, in jeden Vorderlauf wurde ein intravenöser Dauertropf mit physiologischer Kochsalzlösung gelegt, und zur Entnahme von Urin wurde ein Harnblasenkatheter eingeführt. Das Tier wurde auf dem Rücken unter eine Gammakamera gelegt, die mit einem Niedrigenergie-Allzweckkollimator versehen und auf den Photopeak von Tc-99m eingestellt wurde.
Das mit Tc-99m markierte Peptid [185-370 mBq (5-10 mCi) Tc-99m] wurde sequenziell am Einstichpunkt einer der intravenösen Leitungen in den Vorderläufen injiziert. Die zweite Leitung diente zur Blutentnahme.
Die Aufnahme von Bildern mit der Gammakamera wurde gleichzeitig mit der Injektion begonnen. Während der ersten 10 min wurden als dynamische Studie (Bildaquisition über 10 sec) Vorderaufnahmen des Herzens aufgenommen, gefolgt von statischen Bildern jeweils 1, 2, 3 und 4 h nach der Injektion. Vorderaufnahmen der Läufe wurden über 500.000 Counts bzw. 20 min (je nachdem, was kürzer war) aufgenommen, jeweils bei ungefähr 10-20 min. und ungefähr 1, 2, 3 und 4 h nach der Injektion. Bei der Aufnahme der Bilder der Läufe wurde die Blase mit einem Schild aus Blei geschützt.
Nach der Aufnahme der letzten Abbildung wurden die Tiere jeweils tief mit Pentobarbital narkotisiert. Zwei Blutproben wurden mittels einer Herzpunktur unter Verwendung einer heparinisierten Spritze entnommen, gefolgt von einer tödlichen Dosis einer gesättigten Kaliumchloridlösung, die über intrakardiale Injektion oder eine intravenöse Bolusinjektion verabreicht wurde. Die den Gefäßverschluß enthaltende V. femoralis, ein ähnlicher Abschnitt der Vene des gegenüberliegenden (Kontroll-)Laufes, Gefäßabschnitte proximal zum Thrombus und Proben des Oberschenkelmuskels wurden dann vorsichtig herauspräpariert. Der Thrombus, die Spule und die Dacron-Fasern der Spule wurden dann aus dem Gefäß herauspräpariert. Thrombus, die mit Kochsalzlösung gewaschenen Gewebeproben, Spule und die Dacron-Fasern der Spule wurden getrennt, und jede der Proben wurde in ein vorher ausgewogenes Reagenzglas gelegt. Die Proben wurden gewogen und in einem Gammazähler zusammen mit bekannten Fraktionen der injizierten Dosen im Tc-99m-Kanal ausgezählt.
Das Gewicht des frischen Thrombus, die injizierte Dosis in Prozent (%ID)/g im Thrombus und im unmittelbar vor der Tötung der Tiere erhaltenen Blut sowie das Thrombus/Blut- und Thrombus/Muskel-Verhältnis wurden bestimmt. Aus den im Computer gespeicherten Abbildungen wurde das Thrombus/Hintergrund-Verhältnis durch Analyse der in den Regions-of-interest (ROI) über Thrombus und angrenzendem Muskel gemessenen Counts/Pixel bestimmt. Die aus diesen Experimenten erhaltenen Gewebedaten sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Die szintigraphischen Abbildungen, die die Lage der mit Hilfe des mit TC-99m markierten Peptids in vivo nachgewiesenen venösen Thromben zeigen, sind in Abb. 1 wiedergegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, daß mittels der Tc-99m-markierten erfindungsgemäßen Reagenzien tiefe Venenthrombi schnell und effizient in vivo lokalisiert werden können. 1 h nach der Injektion und, mit zunehmendem Kontrast und besserer fokaler Definition, für fast 4 h nach der Injektion anhaltend, war eine klare Lokalisierung möglich.
Es versteht sich, daß in der vorhergehenden Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung hervorgehoben werden, und daß alle entsprechenden Modifikationen bzw. Alternativen in den Schutzbereich der Erfindung, so wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, fallen. TABELLE III
Bei den gezeigten Werten handelt es sich um Durchschnittswerte ± Standardabweichung vom Mittelwert; [an = Anzahl der mit diesem Peptid durchgeführten Experimente]

Claims

1. Ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur diagnostischen Abbildung eines Gefäßverschlusses, umfassend ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren und einer Technetium-99m bindenden Struktureinheit, die kovalent mit dem Peptid verbunden ist, wobei das Peptid aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus zyklischen Peptiden besteht, welche Liganden für einen GPIIb/IIIa-Rezeptor darstellen.

2. Ein Reagenz gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid und die Technetium-99m bindende Struktureinheit durch 1 bis 20 Aminosäuren kovalent miteinander verbunden sind.

3. Ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, weiterhin umfassend eine mehrwertige Verbindungseinheit, die sowohl mit einer Vielzahl von Peptiden kovalent verbunden ist, als auch mit einer Vielzahl von einen radioaktiven Marker bindenden Struktureinheiten kovalent verbunden ist, somit umfassend ein Reagenz zur Herstellung eines multimeren mehrwertigen Mittels zur szintigraphischen Bilderzeugung, wobei das Molekulargewicht des besagten Mittels zur Bilderzeugung weniger als etwa 20'000 Dalton beträgt.

4. Ein Reagenz gemäß Anspruch 3, wobei die mehrwertige Verbindungseinheit aus einer der nachfolgend aufgezählten Verbindungen besteht: bis-Succinimidylmethylether, 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure, N[2-(N',N'-bis-(2-Succinirüdoethyl)aminoethyl)]- N&sup6;,N&sup9;-bis-(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid, tris-(Succinimidylethyl)- amin, bis-Succinimidohexan, 4-(O-CH&sub2;CO-Gly-Gly-Cys.amid)-acetophenon oder ein Derivat der genannten Verbindungen.

5. Ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Technetium-99m bindende Struktureinheit die nachfolgende Struktureinheit umfaßt:

C(pgp)s-(aa)-C(pgp)s

wobei C(pgp)s ein Cystein mit einer geschützten Thiolgruppe ist und (aa) einer Aminosäure entspricht.

6. Ein Reagenz gemäß Anspruch 5, wobei das geschützte Cystein eine Schutzgruppe mit der nachstehend wiedergegebenen Formel aufweist:

-CH&sub2;-NH-CO-R,

wobei R einem kurzkettigen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem 2- oder 3- oder 4-Pyridylrest, einem Phenylrest oder einem Phenylrest, der mit einem kurzkettigen Alkylrest, einer Hydroxylgruppe, einer kurzkettigen Alkoxygruppe, einer Carboxylgruppe oder einer kurzkettigen Alkoxycarbonylgruppe substituiert ist, entspricht.

7. Ein Reagenz gemäß Anspruch 5, wobei C(pgp)s-(aa)-C(pgp)s die nachfolgende Formel aufweist:

8. Ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Technetium-99m bindende Struktureinheit die nachfolgende Struktureinheit umfaßt:

A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X,

wobei A = H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4;;

B = H, SH, -NHR³-Gruppe, N(R³)-(Peptid) oder R&sup4;;

X = H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4;;

Z = H oder R&sup4;;

R¹, R², R³ und R&sup4; sind jeweils unabhängig voneinander H oder ein kurzkettiger, linearer oder verzweigter oder zyklischer Alkylrest;

n = 0,1 oder 2;

und

wenn B = -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, so ist X = SH und n = 1 oder 2;

wenn X = -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) ist, so ist B = SH und n = 1 oder 2;

wenn B = H oder R&sup4;, so ist A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC, X = SH und n = 0 oder 1;

wenn A = H oder R&sup4; ist, dann ist

X = -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid), wenn gleichzeitig B = SH ist, und

B = -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid), wenn gleichzeitig X = SH ist;

wenn X = H oder R&sup4; ist, so ist A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC und B = SH;

wenn Z = Methyl ist, so ist X = Methyl, A = HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC, B = SH und n = 0;

wenn B und X gleichzeitig SH sind, ist n nicht 0;

und wobei die Thiol-Stniktureinheit in ihrer reduzierten Form vorliegt.

9. Ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Technetium bindende Struktureinheit mit Technetium-99m einen neutralen Komplex bildet und eine Formel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

wobei X = H oder eine Schutzgruppe ist, und "(Aminosäure)" einer beliebigen Aminosäure entspricht;

wobei jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, jedes (pgp)s unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

A = lineares oder zyklisches kurzkettiges Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, deren Kombinationen oder substituierte Derivate ist, und

X das Peptid ist;

wobei jedes R&sup5; unabhängig voneinander H, ein kurzkettiges Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder ein mit kurzkettigem Alkyl oder kurzkettigem Alkoxy substituiertes Phenyl ist,

m, n und p unabhängig voneinander 1 oder 2 sind,

A = lineares oder zyklisches kurzkettiges Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, deren Kombinationen oder substituierte Derivate ist,

V = H oder -CO-Peptid ist,

R&sup6; = H oder ein Peptid ist;

und wobei R&sup6; ein Peptid sein muß, wenn V = H ist, und

V = -CO-Peptid sein muß, wenn R&sup6; = H ist.

10. Ein Reagenz gemäß Anspruch 1, welches eine Formel aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

11. Ein Reagenz gemäß Anspruch 1 mit der Formel:

12. Ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, welches mit Technetium-99m radioaktiv markiert ist.

13. Ein Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 mit Technetium-99m durch Ligandenaustauschreaktion eines vorher reduzierten Technetium-99m-Komplexes.

14. Ein Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend die Umsetzung des Reagenzes mit Technetium-99m in Anwesenheit eines Reduktionsmittels.

15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Dithionition, einem Zinn(II)-Ion und einem Eisen(II)-Ion.

16. Ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 mit Hilfe einer in vitro durchgeführten, chemischen Synthese, wobei das Peptid durch eine Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert wird.

17. Ein Kit zur Herstellung eines radiopharmazeutischen Präparats, wobei das besagte Kit ein verschlossenes Gefäß umfaßt, das eine vorher festgelegte Menge eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und eine ausreichende Menge eines Reduktionsmittels enthält, um das Reagenz mit Technetium-99m radioaktiv zu markieren.

18. Ein Reagenz gemäß Anspruch 12 zur Verwendung im Rahmen eines Verfahrens zur Abbildung eines Gefäßverschlusses im Körper eines Säugetieres, umfassend die Verabreichung einer diagnostisch wirksamen Menge des Reagenzes gemäß Anspruch 12, und der Nachweis des an der Stelle eines Gefäßverschlusses befindlichen Technetium-99m.

19. Eine Materialzusammensetzung, die ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 umfaßt.