DE69431052T2

DE69431052T2 - Radiomarkierte verbindungen zur thrombus-bilderzeugung

Info

Publication number: DE69431052T2
Application number: DE69431052T
Authority: DE
Inventors: Edward R. Civitello; Richard T. Dean; John Lister-James; William Mcbride
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2014-04-09
Also published as: DK0693941T3; ATE220926T1; ES2179076T3; DE69431052D1; EP0693941B1; AU687080B2; CA2160120A1; SG49788A1; ZA942439B; BR1100946A; JPH08508999A; CA2363780C; WO1994023758A1; AU7241394A; EP0693941A1; JP2954355B2; US6056940A; CA2363780A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung und Reagentien, und Verfahren zur Herstellung solcher Mittel und Reagentien. Die Erfindung betrifft insbesondere Reagentien, die mit Technetium-99m (Tc-99m) radioaktiv markiert werden können, Verfahren und Kits zur Herstellung und radioaktiven Markierung solcher Reagentien, und Methoden zur Verwendung solcher radioaktiv markierten Reagentien zur Abbildung von Stellen, an denen sich Thromben bilden, im Körper eines Säugetieres.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Thrombose und Thromboembolie, insbesondere tiefe Venenthrombose (TVT) und Lungenembolie (pulmonary embolism, PE) sind häufig vorkommende klinische Leiden, die mit einer beträchtlichen Morbidität und Mortalität verbunden sind. Es wird geschätzt, daß in den Vereinigten Staaten jedes Jahr ca. 5 Millionen Patienten eine oder mehrere TVT-Episoden erleiden und daß über 500 000 PE-Fälle auftreten, was 100 000 Todesfälle zur Folge hat (J. Seabold, Society of Nuclear Medicine Annual Meeting 1990). Weiterhin wird geschätzt, daß mehr als 90% aller Lungenembolien auf TVTs in den unteren Extremitäten zurückzuführen sind. Diese Leiden können durch Therapie mit einem Antikoagulationsmittel wirksam behandelt werden, wenn dieses früh genug angewendet wird. Eine solche Behandlung ist jedoch mit Risiken (z. B. inneren Blutungen) verbunden, die eine unnötige prophylaktische Anwendung ausschließen. In akuten Fällen können fortgeschrittenere Methoden der thrombolytischen Intervention (wie z. B. die Verabreichung von gentechnisch hergestelltem Gewebsplasminogenaktivator oder Streptokinase) zum Einsatz kommen, jedoch sind diese Verfahren noch risikoreicher. Darüber hinaus ist es für eine effektive klinische Anwendung dieser Verfahren erforderlich, daß der störende Thrombus lokalisiert wird, damit die Wirksamkeit der Behandlung kontrolliert werden kann.
Aus diesen Gründen ist ein schnelles Mittel zum Lokalisieren von Thromben in vivo, ganz besonders bevorzugt unter Anwendung von nicht-invasiven Methoden, überaus wünschenswert. Gegenwärtig werden für die Identifizierung von TVT-Stellen Kontrastvenographie und Ultraschall nach dem Kompressions-B-Mode-Verfahren angewendet; welches Verfahren dabei zum Einsatz kommt, hängt von der erwarteten Lage des Gefäßverschlusses ab. Die erstgenannte Methode ist jedoch invasiv, und beide Verfahren bereiten dem Patienten Beschwerden. Darüber hinaus sind diese Methoden in vielen Fällen entweder ungeeignet, oder sie liefern ungenaue Ergebnisse.
Zur Diagnose von Lungenembolien wendet man gegenwärtig beispielsweise Röntgenaufnahmen des Brustkorbs, Elektrokardiogramme (EKG), eine Messung der arteriellen Sauerstoffspannung, Perfusions- und Ventilationslungenscans und pulmonale Angiographie an. Mit Ausnahme des letztgenannten (invasiven) Verfahrens kann jedoch keine dieser Methoden eine unzweideutige Diagnose liefern.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin werden bestimmte pathologische Zustände lokalisiert bzw. ihre Ausbreitung abgeschätzt, indem man die spezifische Verteilung kleiner Mengen von intern verabreichten, radioaktiv markierten Tracer-Verbindungen (die als Radiotracer oder Radiopharmaka bezeichnet werden) nachweist. Die zum Nachweis dieser Radiopharmaka angewandten Methoden sind allgemein als Methoden zur Bilderzeugung bzw. Radioimaging bekannt.
Zum Radioimaging eignen sich bekannterweise eine Vielzahl von Radionukliden, einschließlich &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, 99mTC (TC-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb und ¹&sup8;&sup6;Re. Von diesen Radionukliden sind Tc-99m und ¹¹¹In die bevorzugten Einzelphotonen emittierenden Radionuklide, und &sup6;&sup8;Ga ist ein bevorzugtes Positronen emittierendes Radionuklid. Tc-99m ist ein bevorzugtes Radionuklid, da es Gammastrahlung von 140 keV abgibt, eine physikalische Halbwertszeit von 6 Stunden hat und mit einem Molybdän-99/Technetium-99m-Generator bequem vor Ort verfügbar ist.
Ein Gamma-emittierender Radiotracer, der sich bei in- vivo-Verabreichung vorzugsweise spezifisch an eine Thrombuskomponente und nicht an anderes Gewebe bindet, kann ein externes szintigraphisches Bild geben, in dem die Lage des Thrombus-gebundenen Radiotracers und somit des Thrombus definiert ist. Thromben bestehen aus Blutzellen, vorwiegend aktivierten Blutplättchen, die in quervernetztem Fibrin eingebunden sind. Aktivierte Blutplättchen sind besonders gute Ziele für das Radioimaging von Thromben, da man sie normalerweise nicht in zirkulierendem Blut (das nicht aktivierte Blutplättchen enthält) findet.
Aktivierte Blutplättchen exprimieren auf ihrer Zelloberfläche den GPIIb/IIIa-Rezeptor. Der normale Ligand für diesen Rezeptor ist Fibrinogen (Plow et al., 1987, Perspectives in Inflammation, Neoplasia and Vascular Cell Biology, S. 267-275). Es wurden jedoch kleine synthetische Analoga (bei denen es sich um Peptide handeln kann, jedoch nicht muß) entwickelt, die sich an diesen Rezeptor binden (beispielsweise Klein et al., 1992, US-Patent Nr. 5,086,069, und Egbertson et al., 1992, europäische Patentanmeldung EP 0 478 328 A1). Wenngleich eine Vielzahl dieser synthetischen Moleküle sich nur mit niedriger Affinität binden, wurden andere synthetisiert, die eine sehr hohe Affinität haben (siehe Egbertson et al., ibid.). Die vorliegende Erfindung stellt kleine, synthetische, radioaktiv (vorzugsweise mit Tc-99m, ¹¹¹In oder &sup6;&sup8;Ga) markierte Verbindungen bereit, die sich mit hoher Affinität an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden, als szintigraphische Mittel zur nicht-invasiven in-vivo- Bilddarstellung von Thromben bereit.
Versuche, Radiotracer zur Abbildung von Gefäßverschlüssen zur Verfügung zu stellen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Hierunter fallen autologe Blutplättchen, die entweder mit ¹¹¹In oder 99mTc (TC-99m) markiert wurden, und ¹²³I- und ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen (wobei letzteres mit einer Gammaszintillationssonde und nicht mit einer Gammakamera nachgewiesen wurde). Weitere radioaktiv markierte Verbindungen, die zur Markierung von Gefäßverschlüssen verwendet wurden, schließen Plasmin, Plasminogenaktivatoren, Heparin, Fibronectin, Fibrin-Fragment E&sub1; und monoklonale Anti-Fibrin- und Anti-Blutplättchen- Antikörper ein (für eine Übersicht siehe Knight, 1990, Sem. Nucl. Med. 20: 52-67)
Verbindungen mit der Fähigkeit, sich an den GPIIb/IIIa- Rezeptor von Blutplättchen zu binden, sind vom Stand der Technik her bekannt.
In dem US-Patent Nr. 4,578,079 beschreiben Ruoslahti & Pierschbacher Peptide mit der Sequenz X-Arg-Gly-Asp-R- Y, in der X und Y entweder für H oder eine Aminosäure stehen und R für Thr oder Cys steht, welche dazu in der Lage sind, sich an Blutplättchen zu binden.
In US-Patent Nr. 4,792,525 beschreiben Ruoslahti & Pierschbacher Peptide mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-X, in der X für Ser, Thr oder Cys steht, welche sich an Blutplättchen binden können.
In US-Patent Nr. 5,086,069, 1992, offenbaren Klein et al. Guaninderivate, die sich an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden.
In PCT/U588/04403, 1989, offenbaren Pierschbacher et al. konformativ eingeschränkte RGD-enthaltende Peptide zur Inhibierung der Bindung von Zellen an ein Substrat.
In der europäischen Patentanmeldung 90202015.5, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202030.4, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202031.2, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90202032.0, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische RGD-enthaltende Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311148.2, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311151.6, 1990, offenbaren Nutt et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 90311537.6, 1990, offenbaren Ali et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der internationalen Patentanmeldung mit der laufenden Nummer PCT/U590/03788, 1991, offenbaren Barker et al. cyclische Peptide zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation.
In der internationalen Patentanmeldung mit der laufenden Nummer PCT/US91/02356, 1991, offenbaren Pierschbacher et al. cyclische Peptide, bei denen es sich um Fibrinogenrezeptorantagonisten handelt.
In der europäischen Patentanmeldung 92304111.5, 1992, offenbaren Duggan et al. Fibrinogenrezeptorantagonisten.
In den europäischen Patentanmeldungen 92103861.8 und 92108214.5, 1992, offenbaren Garland et al. Phenylamidderivate zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation.
In der internationalen Patentanmeldung PCT/US92/05463, 1993, offenbaren Bondinell et. al., bicyclische Fibrinogenantagonisten.
In der internationalen Patentanmeldung PCT/US92/08788, offenbaren Blackburn et al. nichtpeptidische Integrininhibitoren mit Spezifität für den GPIIb/IIIa- Rezeptor.
In der europäischen Patentanmeldung 0478328A1, 1992, offenbaren Egbertson et al. Tyrosinderivate, die sich mit hoher Affinität an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden.
In 204th Meeting, Amer. Chem. Soc. Abst. 44, 1992, offenbaren Ojima et al. synthetische multimere RDGF- Peptide, die zur Inhibierung der Blutplättchenaggregation geeignet sind.
In J. Med. Chem. 35: 4640-4642, 1992, beschreiben Hartman et al. Tyrosinderivate mit hoher Affinität für den GPIIb/IIIa-Rezeptor.
Radiomarkierte Peptide, die sich zum Radioimaging von Gefäßverschlüssen eignen, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
In PCT/GB90/00933, 1990, offenbart Stuttle radioaktiv markierte Peptide mit 3 bis 10 Aminosäuren, die die Sequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) umfassen und sich in vivo an eine RGD-Bindungsstelle binden können.
In PCT/US91/03116, 1991, offenbaren Rodwell et al. Konjugate von "molekularen Erkennungseinheiten" mit "Effektordomänen".
Die Verwendung von Chelatoren zur radioaktiven Markierung von Peptiden und Verfahren zur Markierung von Peptiden mit Tc-99m sind aus dem Stand der Technik bekannt und in WO92/13572, WO93/10747, WO93/21962, WO93/23085, WO93/25244, WO94/07918, WO94/19024 und WO94/28942 offenbart, und radioaktiv markierte Peptide zur Verwendung als Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Thromben sind im Stand der Technik bekannt und in WO93/23085 und WO93/25244 offenbart.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an kleinen (zur Verbesserung der Blut- und Hintergrundsgewebsclearance), synthetischen (damit eine routinemäßige Herstellung praktikabel wird, und zur Erleichterung der Zulassung), spezifisch bindenden Molekülen mit hoher Affinität, die mit einem praktischen radioaktiven Marker, vorzugsweise Tc-99m, radioaktiv markiert sind, zur Abbildung von Thromben in vivo. Dieser Bedarf wird durch kleine synthetische Verbindungen, die sich spezifisch an den auf der Zelloberfläche von aktivierten Blutplättchen exprimierten GPIIb/IIIa- Rezeptor binden und die mit einem praktischen Radioisotop, vorzugsweise Tc-99m, ¹³¹In oder &sup6;&sup8;Ga, radioaktiv markiert sind, gedeckt und durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt szintigraphische Mittel zur Abbildung von Thromben bereit, bei denen es sich um radioaktiv markierte Reagentien handelt. Die Erfindung stellt insbesondere Reagentien zur Herstellung von Mitteln zur Abbildung von Thromben bereit, die mit Technetium-99m (Tc-99m), ¹¹¹In oder &sup6;&sup8;Ga, vorzugsweise mit Tc-99m, radioaktiv markiert sind. Die erfindungsgemäßen Reagentien umfassen jeweils eine spezifisch bindende Verbindung (einschließlich von Peptiden, jedoch nicht darauf beschränkt), die sich spezifisch und mit hoher Affinität an den Glykoprotein- IIb/IIIa- (GPIIb/IIIa-) Rezeptor von Blutplättchen bindet und kovalent mit einer einen radioaktiven Marker komplexierenden Einheit verbunden ist.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Reagens zur Darstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben, welches eine einen radioaktiven Marker komplexierende Einheit enthält, die kovalent an eine Verbindung gebunden ist, die sich an den Glykoprotein- IIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten bindet und ein Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton aufweist, wobei das Reagens dazu in der Lage ist, die Aggregation von humanen Thrombozyten in einem thrombozytenreichen Plasma um 50% (IC&sub5;&sub0;) zu hemmen, wenn es in einer Konzentration von nicht mehr als 0,3 uM vorliegt, bereit; mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Reagens nicht um
CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGGCAcmGCAcm.Amid oder
(CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC.Amid)&sub2;-BSME
handelt.
Für eine optimale Bilderzeugung muß das Reagens dazu in der Lage sein, sich mit ausreichender Affinität an den GPIIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten zu binden, so daß es bei einem Standardassay zur Blutplättchenaggregation (siehe Beispiel 3, unten) bei einer Reagenskonzentration von nicht mehr als 0,3 uM die durch Adenosindiphosphat (ADP) induzierte Aggregation von menschlichen Blutplättchen inhibiert. Die Verwendung von kleinen Verbindungen, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton, ist darüber hinaus mit deutlichen kommerziellen Vorteilen verbunden. Solche kleinen Verbindungen lassen sich leicht herstellen. Zusätzlich ist es, in vorteilhafter Weise, wahrscheinlicher, daß solche Verbindungen nicht immunogen sind und schnell aus dem Gefäßsystem eliminiert werden, was eine bessere und schnellere Abbildung von Thromben erlaubt. Im Gegensatz dazu sind größere Moleküle wie z. B. Antikörper von Fragmenten davon, oder andere Peptide biologischen Ursprungs mit einer Größe von mehr als 10 000 Dalton in der Herstellung teurer und mit größerer Wahrscheinlichkeit immunogen, und sie werden langsamer aus dem Blutstrom entfernt, was bei schnellen in-vivo-Diagnosen von Thromben stört.
Die Erfindung stellt weiterhin Reagentien bereit, bei denen es sich bei den spezifisch bindenden Verbindungen um geradkettige oder cyclische Peptide mit einer Aminosäuresequenz von 4 bis 100 Aminosäuren handelt.
Die Erfindung stellt weiterhin Reagentien der oben erwähnten Art bereit, bei denen die Verbindung aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
a) einem Peptid umfassend 4 bis 100 Aminosäuren;
b) einem Peptid mit der Formel:
wobei A für eine lipophile D-α-Aminosäure oder eine N-Alkyl-L-α-Aminosäure oder L-Prolin steht;
X für eine L-α-Aminosäure steht, die eine Seitenkette aufweist, die eine positive Ladung annehmen kann; und
R jeweils unabhängig voneinander für H, niederes Alkyl oder niederes Alkoxyalkyl steht;
c) einem Peptid mit der Formel:
wobei A für D-Tyrosin oder D-Phenylalanin steht und X für L-[S-(3-Aminopropyl)cystein oder L-4-Amidinophenylalanin steht;
d) einem Peptid mit der Formel:
(CH&sub2;COYD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGCAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GC- Amid;
e) einem Peptid mit der Formel:
(CH&sub2;COYD.Amp.GDCGGCAcmGCAcmGGCAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GC- Amid;
und
f) einem Peptid mit der Formel:
(CH&sub2;COYD.Amp.GDCKGCGAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GCAmid.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Reagens zur Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben bereitgestellt, das zur Abbildung von Thromben im Körper eines Säugetieres radioaktiv markiert werden kann, welches eine spezifisch bindende Verbindung enthält, die sich spezifisch an den GPIIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten bindet und kovalent mit einer Tc-99m- komplexierenden Einheit der folgenden Formel verbunden ist:
I.
C(pgp)s-(aa)-C(pgp)s
wobei C(pgp)s für ein geschütztes Cystein und (aa) für eine beliebige primäre a- oder β-Aminosäure steht, die keine Thiolgruppe enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Reagens zur Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben bereit, das zur Abbildung von Thromben im Körper eines Säugetieres radioaktiv markiert werden kann, welches eine spezifisch bindende Verbindung enthält, die sich spezifisch an cen GPIIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten bindet und kovalent mit einer Tc-99m- komplexierenden Einheit verbunden ist, die eine einzelne thiolhaltige Einheit der folgenden Formel umfaßt:
IIa. -(Aminosäure)¹-(Aminosäure)²-{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X,
IIb. -{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X}-(Aminosäure)¹-(Aminosäure)²,
IIc. -(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)- (Aminosäure)¹-{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X}, und
IId. -{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X}-(Aminosäure)¹-(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)
wobei (Aminosäure)¹ und (Aminosäure)² jeweils unabhängig voneinander für eine beliebige natürliche, modifizierte, substituierte oder veränderte α- oder β- Aminosäure stehen, die keine Thiolgruppe enthält, und A für H, HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC oder R&sup4; steht; B für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) oder R&sup4; steht; X für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) oder R&sup4; steht; Z für H oder R&sup4; steht; R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges, verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen; n für 0, 1 oder 2 steht; und wobei, (1) wenn B für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht, X für SH und n für 1 oder 2 steht; (2) wenn X für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht, B für SH und n für 1 oder 2 steht; (3) wenn B für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, X für SH und n für 0 oder 1 steht; (4) wenn A für H oder R&sup4; steht, im Fall von B = SH, X für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht und, im Fall von X = SH, B für -NHR³ oder -N(R³)- (Aminosäure oder Peptid) steht; (5) wenn X für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC und B für SH steht; (6) wenn Z für Methyl steht, X für Methyl, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, B für SH und n für 0 steht.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Reagens zur Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben bereit, das zur Abbildung von Thromben im Körper eines Säugetieres radioaktiv markiert werden kann, welches eine spezifisch bindende Verbindung enthält, die sich spezifisch an den GPIIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten bindet und kovalent mit einer einen radioaktiven Marker komplexierenden Einheit der folgenden Formel verbunden ist:
[für die Zwecke dieser Erfindung werden die einen radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als auf Picolinsäure (PIC) basierende Einheiten bezeichnet];
oder
[für die Zwecke dieser Erfindung werden die einen radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als auf Picolylamin (Pica) basierende Einheiten bezeichnet]; wobei X für H oder eine Schutzgruppe steht; (Aminosäure) für eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure steht, die keine Thiolgruppe enthält, die den radioaktiven Marker komplexierende Einheit kovalent an das Peptid gebunden ist und der Komplex von der den radioaktiven Marker komplexierenden Einheit mit dem radioaktiven Marker elektrisch neutral ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Aminosäure um Glycin und X steht für eine Acetamidomethyl- Schutzgruppe. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid kovalent über eine Aminosäure, ganz besonders bevorzugt Glycin, mit der den radioaktiven Marker komplexierenden Einheit verbunden.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Reagens zur Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben bereitgestellt, das zur Abbildung von Thromben im Körper eines Säugetieres radioaktiv markiert werden kann, welches eine spezifisch bindende Verbindung enthält, die sich spezifisch an den GPIIb/IIIa-Rezeptor von Thrombozyten bindet und kovalent mit einer einen radioaktiven Marker komplexierenden Einheit verbunden ist, bei der es sich um eine einen radioaktiven Marker komplexierende Bisaminobisthiol-Einheit handelt. Die Bisaminobisthiol- Einheit in dieser Ausführungsform der Erfindung weist eine Formel ausgewählt aus der folgenden Gruppe auf:
wobei R&sup5; jeweils unabhängig für H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; stehen kann; (pgp)s jeweils unabhängig für eine Thiol- Schutzgruppe oder H stehen kann; m, n und p unabhängig voneinander für 2 oder 3 stehen; A für geradkettiges oder cyclisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon steht und X ein Peptid ist; und
wobei R&sup5; jeweils unabhängig für H, niederes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder durch niederes Alkyl oder niederes Alkoxy substituiertes Phenyl steht; m, n und p jeweils unabhängig voneinander für 1 oder 2 stehen; A für geradkettiges oder cyclisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon steht; V für H oder CO- (Aminosäure oder Peptid) steht; R&sup6; für H, (Aminosäure) oder Peptid steht; mit der Maßgabe, daß, wenn V für H steht, R&sup6; für Aminosäure oder Peptid steht und daß, wenn R&sup6; für H steht, V für Aminosäure oder Peptid steht, wobei (Aminosäure) eine beliebige primäre α- oder β- Aminosäure ist, die keine Thiolgruppe enthält. [Für die Zwecke dieser Erfindung werden die einen radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als "BAT"-Einheiten bezeichnet]. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid kovalent über eine Aminosäure, ganz besonders bevorzugt Glycin, mit der den radioaktiven Marker komplexierenden Einheit verbunden.
In bevorzugten Ausführungsformen der oben erwähnten Aspekte dieser Erfindung handelt es sich bei der spezifisch bindenden Verbindung um ein Peptide, das zwischen 4 und 100 Aminosäuren umfaßt. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform des radioaktiven Markers ist Technetium-99m.
Die erfindungsgemäßen Reagentien lassen sich darstellen, indem man die spezifisch bindenden Verbindungen bzw. die einen radioaktiven Marker komplexierenden Einheiten kovalent an eine polyvalente verbrückende Einheit bindet. Erfindungsgemäße polyvalente verbrückende Einheiten umfassen wenigstens 2 identische Gruppen mit Linker-Funktion, die spezifisch bindende Verbindungen bzw. radioaktive Marker komplexierende Einheiten kovalent binden können. Bevorzugte Gruppen mit Linker-Funktion sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder thiolreaktive Gruppen. In bevorzugten Ausführungsformen bestehen die polyvalenten verbrückenden Einheiten aus Bissuccinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB), Tris(succinimidylethyl)amin (TSEA), Tris(2- chloracetamidoethyl)amin, 1,2-Bis-[2-(chloracetamido)- ethoxy]ethan und N-[2-(N',N'-Bis(2-succinimidoethyl)- aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9- diazanonanamid (BAT-BS).
Die Erfindung umfaßt weiterhin Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung, bei denen es sich um Komplexe der erfindungsgemäßen Reagentien mit Tc-99m, ¹¹¹In oder &sup6;&sup8;Ga, ganz besonders bevorzugt mit Tc-99m, handelt, und Methoden zur radioaktiven Markierung der Reagentien. Mit Tc-99m radioaktiv markierte, erfindungsgemäße Komplexe werden gebildet, indem man die erfindungsgemäßen Reagentien in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit Tc-99m umsetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind beispielsweise das Dithionition, das Zinn(II)-Ion oder das Eisen(II)-Ion. Erfindungsgemäße Komplexe werden weiterhin gebildet, wenn man die erfindungsgemäßen Reagentien durch Ligandenaustausch mit einem vorher reduzierten mit Tc- 99m-Komplex, wie hier zur Verfügung gestellt, mit Tc- 99m markiert.
Die Erfindung stellt auch Kits zur Herstellung von Mitteln zur szintigraphischen Bilddarstellung bereit, bei denen es sich um die mit Tc-99m radioaktiv markierten erfindungsgemäßen Reagentien handelt. Die Kits zur Markierung der durch die Erfindung bereitgestellten Reagentien mit Tc-99m enthalten ein verschlossenes Vial, das eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen Reagens und ein Reduktionsmittel in einer Menge enthält, die ausreicht, um das Reagens mit Tc-99m zu markieren.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen PeptidReagentien durch chemische Synthese in vitro bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide durch Festphasensynthese synthetisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung von Mitteln zur szintigraphischen Bilderzeugung, bei denen es sich um mit Tc-99m markierte Reagentien handelt, zur Abbildung von Gefäßverschlüssen im Körper eines Säugetieres durch Erzeugen von gammaszintigraphischen in-vivo-Abbildungen bereit. Bei diesen Verfahren wird eine diagnostisch wirksame Menge von erfindungsgemäßen, mit Tc-99m- markierten Reagentien verabreicht, und die vom Tc-99m- Marker, der an der Stelle des Gefäßverschlusses im Körper des Säugetieres lokalisiert ist, abgegebene Gammastrahlung nachgewiesen.
Spezielle bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden ausführlicheren Beschreibung von bestimmten bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Reagentien einschließlich PeptidReagentien zur Herstellung von radioaktiv markierten Mitteln zur Abbildung eines Gefäßverschlusses im Körper eines Säugetieres bereit.
Die durch die Erfindung bereitgestellten Reagentien umfassen eine einen radioaktiven Marker bindende Struktureinheit, die kovalent mit einer spezifisch bindenden Verbindung verbunden ist, welche sich an einen Blutplättchenrezeptor bindet, bei dem es sich um den GPIIb/IIIa-Rezeptor von Blutplättchen handelt, und welche dazu in der Lage ist, in thrombozytenreichem Plasma die Aggregation von menschlichen Blutplättchen um 50% zu hemmen, wenn sie in einer Konzentration von nicht mehr als 0,3 uM vorliegt. Für den Zweck der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Mittel zur Abbildung eines Gefäßverschlusses" auf Ausführungsformen der Erfindung, die eine spezifisch bindende Verbindung umfassen, die kovalent mit einer einen radioaktiven Marker komplexierenden Einheit verbunden ist und die vorzugsweise mit Tc-99m, ¹¹¹In oder &sup6;&sup8;Ga, ganz besonders bevorzugt mit Tc-99m, radioaktiv markiert ist.
Bei der Markierung mit Tc-99m handelt es sich um einen Vorteil der vorliegenden Erfindung, da dieses Isotop dank seiner nuklearen und radioaktiven Eigenschaften ein ideales Mittel zur szintigraphischen Bilderzeugung ist. Das Isotop weist eine Einzelphotonenenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf und ist leicht über einen &sup9;&sup9;Mo-99mTc- Generator verfügbar. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß keines der bevorzugten Radionukleide toxisch ist, im Gegensatz zu anderen aus dem Stand der Technik bekannten Radionukleiden (beispielsweise ¹²&sup5;I).
In den Tc-99mkomplexierenden Einheiten und den kovalent mit diesen Einheiten verbundenen Einheiten, die einen Thiol kovalent mit einer erfindungsgemäßen Thiol-Schutzgruppe [(pgp)s] enthalten, können die Thiol- Schutzgruppen gleich oder verschieden sein und beispielsweise die folgenden Gruppen sein (wobei die Auswahl jedoch nicht auf diese beschränkt ist):
-CH&sub2;-Aryl (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxysubstituiertes Phenyl);
-CH-(Aryl)&sub2;, (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxysubstituiertes Phenyl);
-C-(Aryl)&sub3;, (Aryl steht für Phenyl oder alkyl- oder alkyloxysubstituiertes Phenyl);
-CH&sub2;-(4-Methoxyphenyl);
-CH-(4-Pyridyl)(phenyl)&sub2;;
-C(CH&sub3;)&sub3;;
-9-Phenylfluorenyl;
-CH&sub2;NHCOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;-NHCOOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CONHR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
-CH&sub2;-S-CH&sub2;-Phenyl.
Bevorzugte Schutzgruppen weisen die Formel -CH&sub2;-NHCOR auf, wobei R für niederes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder durch niederes Alkyl, Hydroxyl, niederes Alkoxy, Carboxyl oder niederes Alkoxycarbonyl substituiertes Phenyl steht. Die am meisten bevorzugte Schutzgruppe ist eine Acetamidomethylgruppe.
Die einzelnen spezifisch bindenden, peptidhaltigen Ausführungsformen der Erfindung umfassen jeweils eine Aminosäuresequenz. Der Ausdruck "Aminosäure" soll, so wie er hier in der Erfindung verwendet wird, alle natürlich vorkommenden oder synthetischen L- und D-, primären α- oder β-Aminosäuren umfassen. Die durch die Erfindung bereitgestellten spezifisch bindenden Peptide schließen Peptide der folgenden Sequenzen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt (die Aminosäuren in den folgenden Peptiden sind, wenn nicht anders angegeben, L-Aminosäuren):
und O-(4-Piperidinyl)butyl-tyrosin.
Die spezifisch bindenden Peptide der vorliegenden Erfindung können chemisch in vitro synthetisiert werden. Peptide der vorliegenden Erfindung lassen sich im allgemeinen vorteilhaft in einem Peptid-Synthesizer darstellen. Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide kann so erfolgen, daß die den radioaktiven Marker bindende Einheit während der chemischen Synthese in vitro kovalent mit dem Peptid verbunden wird, wobei dem Fachmann gut bekannte Vorschriften angewendet werden. Solche während der Synthese kovalent an die den radioaktiven Marker bindende Einheit gebundenen Peptide sind vorteilhaft, da es so möglich ist, die Stellen für eine kovalente Bindung spezifisch zu bestimmen.
Die den radioaktiven Marker bindenden erfindungsgemäßen Einheiten können während der Peptidsynthese in das targetspezifische Peptid eingeführt werden. Bei Ausführungsformen mit Picolinsäure [(Pic-); z. B. Pic- Gly-Cys(Schutzgruppe)-], kann die den radioaktiven Marker bindende Einheit als letzter (d. h. aminoterminaler) Rest in der Synthese synthetisiert werden. Weiterhin kann man die picolinsäurehaltige, den radioaktiven Marker bindende Einheit kovalent an die &epsi;- Aminogruppe von Lysin binden, was beispielsweise αN(Fmoc)-Lys-&epsi;N[Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] ergibt, die in einer beliebigen Position in die Peptidkette eingebaut werden kann. Diese Sequenz ist besonders vorteilhaft, da hiermit eine einfache Möglichkeit zur Einführung in das an das Target bindende Peptid bereitgestellt wird.
In ähnlicher Weise kann man die Picolylamin (Pica) enthaltende, den radioaktiven Marker bindende Einheit [-Cys(Schutzgruppe)-Gly-Pica] während der Peptidsynthese darstellen, indem man die Sequenz [- Cys(Schutzgruppe)-Gly-] am Carboxylterminus der Peptidkette einfügt. Nach Abspalten des Peptids vom Harz wird der Carboxylterminus des Peptids aktiviert und an Picolylamin gekoppelt. Bei diesem Syntheseweg ist es erforderlich, daß reaktive Seitenkettenfunktionalitäten maskiert (geschützt) bleiben und während der Konjugation des Picolylamins nicht reagieren.
Beispiele für die kleinen synthetischen Peptide, die die Pic-Gly-Cys- und -Cys-Gly-Pica Komplexbildner enthalten, sind in den Beispielen unten angeführt. Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau dieser Komplexbildner in praktisch jedes beliebige Peptid bereit, daß dazu fähig ist, sich in vivo spezifisch an einen Thrombus zu binden, wodurch man ein radioaktiv markiertes Peptid erhält, in dem Tc-99m als neutraler Komplex vorliegt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin spezifisch bindende kleine synthetische Peptide bereit, in die Bisaminbisthiol- (BAT-) Komplexbildner eingebaut sind, die mit Tc-99m markiert sein können. Die vorliegende Erfindung stellt den Einbau dieser Komplexbildner in praktisch jedes beliebige Peptid bereit, daß dazu fähig ist, sich in vivo spezifisch an einen Thrombus zu binden, wodurch man ein radioaktiv markiertes Peptid erhält, in dem Tc-99m als neutraler Komplex vorliegt. Ein Beispiel eines kleinen synthetischen Peptids, das einen BAT-Komplexbildner als einen radioaktiven Marker bindende Einheit enthält, ist unten in den Beispielen angeführt.
Bei der Herstellung eines Komplexes von radioaktivem Technetium mit den erfindungsgemäßen Reagentien wird der Technetiumkomplex, vorzugsweise ein Salz von Tc- 99m-Pertechnetat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit dem Reagens umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)- Ionen; das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)-chlorid. Die zur Herstellung solcher Komplexe erforderlichen Mittel werden zweckmäßigerweise in einem Kit zur Verfügung gestellt, das ein verschlossenes Vial mit einer vorbestimmten Menge eines zu markierenden erfindungsgemäßen Reagens und ein Reduktionsmittel in einer Menge, die zur Markierung des Reagens mit Tc-99m ausreicht, enthält. Alternativ dazu kann man den Komplex auch durch Umsetzung Eines erfindungsgemäßen Reagens mit einem zuvor gebildeten labilen Komplex von Technetium und einer anderen, als Transferligand bezeichneten Verbindung bilden. Dieses Verfahren wird als Ligandenaustausch bezeichnet und ist dem Fachmann wohlbekannt. Der labile Komplex kann beispielsweise unter Verwendung von Transferliganden wie Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit gebildet werden. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung brauchbaren Tc-99m-Pertechnetatsalze schließen beispielsweise Alkalisalze wie z. B. das Natriumsalz und Ammoniumsalze und kurzkettige Alkylammoniumsalze ein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Darstellung von mit Technetium markierten Peptiden zur Verfügung gestellt. Eine geeignete Menge eines Reagens wird in ein Vial gegeben, das auch ein Reduktionsmittel wie z. B. Zinn(II)-chlorid in einer Menge enthält, die zur Markierung des Reagens mit Tc- 99m ausreichend ist. Dabei kann auch eine geeignete Menge eines der beschriebenen Transferliganden (wie z. B. Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit) vorliegen. Das Kit kann weiterhin übliche pharmazeutische Adjuvantien enthalten, wie z. B. pharmazeutisch unbedenkliche Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Die Komponenten des Kits können in flüssiger, gefrorener oder trockener Form vorliegen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Komponenten des Kits in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt.
Erfindungsgemäße, mit einem radioaktiven Marker versehene Reagentien zur Abbildung von Gefäßverschlüssen lassen sich darstellen, indem man eine geeignete Menge an Tc-99m oder eines Tc-99m- Komplexes in die Vials gibt und unter den unten in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen umsetzt.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten radioaktiv markierten Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung weisen eine geeignete Menge Radioaktivität auf. Bei der Darstellung von radioaktiven Tc-99m-Komplexen werden im allgemeinen bevorzugt radioaktive Komplexe in Lösungen gebildet, die Radioaktivität in Konzentrationen von ungefähr 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Reagentien zur Abbildung von Gefäßverschlüssen können, wenn sie radioaktiv, vorzugsweise mit Tc-99m, markiert sind, zur Abbildung von Thromben im Körper eines Säugetieres verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit Tc-99m markierten Reagentien als eine injizierbare Einzeldosis verabreicht. Die von der Erfindung bereitgestellten, mit Tc-99m markierten Reagentien können intravenös in einem beliebigen herkömmlichen Medium zur intravenösen Injektion, wie z. B. einem wäßrigen Kochsalzmedium, oder im Blutplasmamedium, verabreicht werden. Im allgemeinen weist die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von ungefähr 0,01 mCi bis ungefähr 100 mCi, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi, auf. Die als Einzeldosis zu injizierende Lösung hat ein Volumen von ungefähr 0,01 ml bis 10 ml. Nach der intravenösen Verabreichung kann die Abbildung des Gefäßverschlusses in vivo innerhalb von wenigen Minuten durchgeführt werden. Falls gewünscht, kann die Abbildung jedoch auch erst nach einigen Stunden oder noch länger nach der Injektion des radioaktiv markierten Peptids in den Patienten durchgeführt werden. In den meisten Fällen wird sich eine zur Aufnahme von Szintiphotos ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb von ungefähr 0,1 Stunden in der abzubildenden Gegend angereichert haben. Erfindungsgemäß kann man jede herkömmliche Methode zur szintigraphischen Abbildung für diagnostische Zwecke einsetzen.
Es wird dem Fachmann auf dem entsprechenden Gebiet weiterhin bewußt sein, daß man Thromben gewöhnlich dort findet, wo artherosklerotische Plaques vorhanden sind; daß Integrinrezeptoren, die sich an die erfindungsgemäßen Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung binden, sich in gewissen Tumoren finden und daß solche Integrinrezeptoren an Zelladhäsionsprozessen beteiligt sind, die die Lokalisierung von Leukozyten an den Infektionsstellen begleiten bzw. initiieren. Es leuchtet daher ein, daß sich die erfindungsgemäßen Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung weiterhin als Mittel zur Bilddarstellung für die Abbildung von Stellen eignen, an denen der GPIIb/IIIa-Rezeptor exprimiert wird, einschließlich atherosklerotischer Plaques, Tumoren und Infektionsstellen.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen sind ausführlicher in den folgenden Beispielen dargestellt. In diesen Beispielen werden gewisse Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse erläutert. Diese Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.

BEISPIEL 1

Synthese von BAT-BM (N-[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl)- aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid)

BAT-BM wurde wie folgt dargestellt. BAT-Säure (N&sup9;-(t- Butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonansäure) (10,03 g, 10,89 mmol) und 75 ml wasserfreies Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) wurden in einen 250-ml-Rundkolben mit Magnetrührer und Argonballon gegeben. Diese Lösung wurde mit Diisopropylcarbodiimid (3,40 ml, 21,7 mmol, 199 Mol-%), und dann mit N-Hydroxysuccinimid (3,12 g, 27,1 mmol, 249 Mol-%) versetzt. Innerhalb von einer Stunde ließ sich eine Eintrübung der Lösung beobachten, und es wurde weiter insgesamt 4 h lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Eine Lösung von Tris(2-aminoethyl)- amin (30 ml, 200 mmol, 1840 Mol-%) in 30 ml Methylenchlorid wurde dann zugegeben, und es wurde weiter über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen Essigsäureethylester (150 ml) und 0,5 M Kaliumcarbonatlösung (K&sub2;CO&sub3;; 150 ml) verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Kochsalzlösung gewaschen und eingeengt, wodurch man das Rohprodukt N- [2-(N',N'-Bis(2-aminoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid als Schaum/Öl erhielt.
Dieses Rohprodukt wurde in einen 300 ml THF enthaltenden 1000-ml-Rundkolben mit magnetischem Rührstab gegeben, gefolgt von 30 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (NaHCO&sub3;), 100 ml Wasser und N-Methoxycarbonylmaleimid (6,13 g, 39,5 mmol, 363 Mol-%). Diese heterogene Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das THF wurde mit einem Rotationsverdampfer aus der Mischung entfernt, und der wäßrige Rückstand wurde zweimal mit Essigsäureethylester ausgeschüttelt (2 · 75 ml). Die vereinigten organischen Phasen dieser Extraktionen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, durch eine mittlere Fritte filtriert und zu etwa 12 g Rohprodukt eingeengt. Reinigung durch Flüssigchromatographie (250 g Siliziumdioxid/Elution mit einem Gradienten von Chloroform → 2% Methanol in Chloroform) lieferte 5,3 g des reinen Produkts (N-[2- (N',N'-Bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t- butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid) (entspricht einer Ausbeute von 40%), zusammen mit ungefähr 5 g Rohprodukt, das sich zum Reinprodukt aufreinigen läßt. Die chemische Analyse des gereinigten Produkts bestätigte dessen Identität als BAT-BM wie folgt:
¹H-NMR (200 mHz, CDCl&sub3;): δ 0,91 (12H, s), 1,38 (9H, s), 1,2-1,6 (4H, m), 2,06 (2H, s), 2,18 (2H, t, J = 7), 2,31 (4H, m), 2,55 (2H, t, J = 5), 2,61 (4H, t, J = 6), 2,99 (2H, s), 3,0-3,3 (4H, m), 3,46 (4H, t, J = 6), 6,49 (-NH, t, J = 4), 6,64 (4H, s), 7,1-7,3 (18H, m), 7,6 (12H, t, J = 17).

BEISPIEL 2

Synthese von TMEA [Tris(2-maleimidoethyl)amin]

Tris(2-aminoethyl)amin (1,49 ml, 10 mmol), gelöst in 50 ml gesättigter, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und auf einem Eisbad gekühlt, wurde mit N- Carbomethoxymaleimid (4,808 g, 31 mmol) behandelt. Die Mischung wurde 30 min lang auf Eis und dann weitere 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wodurch man 3,442 g Produkt erhielt. Umkehrphasen- Dünnschichtchromatographie (RP-DC) ergab im wesentlichen einen Fleck (Rf = 0,63 in Acetonitril : 0,5 M Kochsalzlösung 1 : 1). 3,94 mmol (1,817 g) dieses Produkts wurden in 20 ml Tetrahydrofuran und 20 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst und 2 h lang gemischt. Die Reaktionsmischung wurde dann zwischen Essigsäureethylester und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Die Essigsäureethylesterlösung wurde mit Hexan verdünnt und gekühlt. Festes TMEA wurde abfiltriert und getrocknet, was eine Ausbeute von 832 mg ergab. Eine chemische Analyse des Produkts bestätigte dessen Identität als TMEA wie folgt:
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,65 (tr, 2H), 3,45 (tr, 2H), 6,64 (s, 2H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): 35,5, 51,5, 133,9, 170,4.

BEISPIEL 3

Synthese von Tris[2-(2-chloracetamido)ethyl]amin

Tris[2-(2-chloracetamido)ethyl]amin wurde wie folgt dargestellt: eine Lösung von Tris(2-aminoethyl)amin (1,49 ml, 10 mmol) in Dichlormethane (50 ml) wurde mit gepulvertem K&sub2;CO&sub3; (6,9 g, 50 mmol) und dann tropfenweise mit Chloracetylchlorid (2,6 ml, 33 mmol) versetzt. Dies führte zu kräftigem Aufkochen. Die Mischung wurde gekühlt und mit 50 ml Wasser versetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft, wodurch man die Titelverbindung als kristallinen Feststoff (2,5 g, 6,6 mmol, entspricht einer Ausbeute von 66%) erhielt. Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von C18- Platten für die Umkehrphasenchromatographie und einer 50 : 50 Mischung von Acetonitril und 0,5 M Lösung von NaCl in Wasser zeigte einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,62. Der Schmelzpunkt der Kristalle der so dargestellten Titelverbindung wurde als zwischen 116 und 119ºC liegend bestimmt.

BEISPIEL 4

Synthese von 1,2-Bis[2-(2-chloracetamido)ethoxy]ethan

1,2-Bis[2-(2-chloracetamido)ethoxy]ethan wurde wie folgt dargestellt: eine in einem Eisbad gekühlte Mischung von 1,2-Bis(2-aminoethoxy)ethan (1,5 g, 10 mmol) in Dichlormethan (100 ml) und 1 M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung (50 ml) wurde tropfenweise mit Chloracetylchlorid (2,6 ml, 33 mmol) versetzt. Nach 10 Minuten Rühren wurde die organische Phase abgetrennt und eingedampft, wodurch man die Titelverbindung erhielt (2,6 g, entspricht einer Ausbeute von 92%). Die HPLC-Analyse mit Ultraviolett-Absorptionsspektrometrie (220 nm) zeigte einen einzigen Peak.

BEISPIEL 5

Synthese von N&epsi;-(Nα,N&epsi;-Bis-chloracetyllysyl)lysylglycyl-(S-trityl)cysteinamid

N&epsi;-(Nα,N&epsi;-Bis-chloracetyllysyl)lysyl-glycyl-(S-trityl)- cysteinamid wurde wie folgt dargestellt: das geschützte Peptid wurde unter Anwendung der in Beispiel 7 beschriebenen FPPS-Methode mit einem Rink-Amidharz, (Fmoc)Cys(Trt), (Fmoc)Gly, (Boc)Lys(Fmoc), (Fmoc)Lys(Fmoc) und Chloressigsäure dargestellt. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten, entschützt und wieder S-trityliert, wodurch man die Titelverbindung erhielt, die dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde. Die Synthese wurde mit FABMS bestätigt; für ein Peptid mit einem theoretischen Molekulargewicht von 829 (Durchschnitt) wurden MH&spplus; von 828 und 830 gefundenen.

BEISPIEL 6

Synthese von Nα-(Fmoc)-4(N-Pentamethylchromansulfonyl)- amidinophenylalanin [Fmoc-hmp(Pmc)]

Die Titelverbindung Fmoc-Amp(Pmc) wurde wie folgt dargestellt: D,L-Acetyl-4-cyanophenylalanin wurde aus α-Bromtoluonitril und Acetamidomalonsäurediethylester unter Anwendung herkömmlicher Verfahren dargestellt (siehe Marvel, 1955, Org. Syn. Cell. 3: 705-708) und durch selektive Hydrolyse des L-Epimers mit Acylase aus Schweinenieren aufgelöst (siehe Greenstein et al., 1961, in Chemistry of the Amino Acids, Hrsg. Kreiger & Malabar, Seiten 2172-2174).
L-4-Cyanophenylalanin wurde unter Anwendung herkömmlicher Verfahren in den N-α-Boc-t-Butylester umgewandelt. Der N-α-Boc-4-Cyanophenylalanin-tbutylester wurde nach der Methode von Voigt et al. (1988, Pharmazie 43: 412-414) in das 4-Amidinoderivat umgewandelt. Der so erhaltene N-α-Boc-4-amidinophenylalanin-t-butylester wurde im wesentlichen wie für Arginin beschrieben (siehe Ramage et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28: 2287-2290) in das N- Amidinopentamethylchromansulfonyl- (Pmc-) Derivat umgewandelt. Die Boc- und t-Butylgruppen wurden dann unter Anwendung von BF&sub3;.OEt/Essigsäure abgespalten. Das so erhaltene 4-Pentamethylchromasulfonylamidinophenylalanin wurde unter Verwendung von N- (Fluorenylmethoxycarboxy)succinimid (FmocOSu) in die Titelverbindung umgewandelt.
Die Titelverbindung wurde einer HPLC-Analyse unterzogen, wobei bei Verwendung einer Waters Nova-Pak C18-Umkehrphasensäule mit radialer Kompression und Elution mit 3 ml/min eines Gradienten von 100% (0,1% TFA/Wasser) bis 100% (0,1% TFA/10% Wasser/Acetonitril) über 10 Minuten eine Retentionszeit von 10,4 Minuten gefunden wurde. Die Titelverbindung wurde durch ¹H-NMR-Spektrometrie analysiert, wobei das folgende ¹H-NMR-Spektrum gefunden wurde (Probe gelöst in CDCl&sub3;): δ 1,25 (s, 6H), 1,72 (t, 2H), 2,1 (s, 3H), 2,55 (m, 8H), 3,1 (m, 2H), 4,05-4,7 (m, 4H), 5,5 (d, 1H) und 7,0-8,0 (m, 15H).

BEISPIEL 7

Festphasenpeptidsynthese

Die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) wurde in einem Maßstab von 0,25 Millimol (mmol) in einem Applied Biosystems Modell 431A Peptidsynthesizer durchgeführt, wobei die Aminotermini mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt, die Kupplungen mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) vorgenommen und für carboxyterminale Säuren und carboxyterminale Amide p- Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrol (HMP) bzw. Rink- Amidharz verwendet wurden. Harzgebundene Produkte wurden routinemäßig mit einer Lösung von Trifluoressigsäure oder Trifluoressigsäure/Dichlormethan 50/50, die gegebenenfalls Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan enthielt, zubereitet in einem Verhältnis von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2, bei Raumtemperatur über 1,5 bis 3 h abgespalten.
N-terminale Acetylgruppen wurden gegebenenfalls durch 30minütiges Behandeln des harzgebundenen Peptids mit freier N-terminaler Aminogruppe mit 20% Essigsäureanhydrid (v/v) in NMP (N-Methylpyrrolidinon) eingeführt. Zur Herstellung von verzweigtkettigen PeptidReagentien, bei denen Peptidketten sowohl an α- als auch &epsi;-Aminen des Lysins synthetisiert wurden, wurde Nα(Fmoc)N&epsi;(Fmoc)-Lysin für die FPPS eingesetzt. 2-Chloracetyl- und 2-Bromacetylgruppen wurden gegebenfalls eingeführt, indem man entweder die entsprechende 2-Halogenessigsäure als letzten während der FPPS anzukuppelnden Rest verwendete oder das harzgebundene, am N-Terminus freie Aminopeptid entweder mit der 2-Halogenessigsäure/Diisopropylcarbodiimid/N- Hydroxysuccinimid in NMP oder mit dem 2- Halogenessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP behandelte. HPLC-gereinigte 2-halogenacetylierte Peptide wurden gegebenenfalls durch 0,5- bis 48stündiges Rühren in einer 0,1-1,0 mg/ml Lösung mit einem pH-Wert von 8, die gegebenenfalls Phosphat, Bicarbonat oder 0,5-1,0 mM EDTA enthielt und anschließender Ansäuerung mit Essigsäure, Lyophilisieren und Reinigung durch HPLC cyclisiert. Cys-Cys-Disulfidbrücken-Cyclisierungen wurden gegebenenfalls durchgeführt, indem man 0,1 mg/ml der cysteinfreien Thiolpeptid-Vorstufen in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 mit 0,006-M-Aliquots von K&sub3;Fe(CN)&sub6; behandelte, bis eine stabile Gelbfärbung erhalten wurde. Überschüssiges Oxidationsmittel wurde mit einem Überschuß an Cystein reduziert und die Mischung wurde lyophilisiert und dann mittels HPLC gereinigt.
Peptidthiol-chloracetyl-abgeleitete Sulfide wurden gegebenenfalls durch 0,5- bis 24stündige Umsetzung von Peptiden, die einen einzelnen Thiol enthielten, mit einer Konzentration von 2 bis 50 mg/ml in Wasser und Acetonitril oder THF oder DMF bei einem pH-Wert von 10 mit der entsprechenden Anzahl (z. B. 0,5 Moläquivalenten für die Darstellung von Dimeren und 0,33 Moläquivalenten für die Darstellung von Trimeren) der mehrwertigen Chloracetyl-Linkereinheit dargestellt. Die Lösung wurde dann mit Essigsäure neutralisiert, zur Trockne eingedampft und, falls erforderlich, mit 10 ml TFA und Fängern wie 0,2 ml Triethylsilan innerhalb von 30 bis 90 Minuten entschützt. Die Lösung wurde eingeengt und das Produkt wurde mit Ether ausgefällt. Die Produkte wurden durch präparative HPLC gereinigt.
BSME-Addukte wurden gegebenenfalls dargestellt, indem man Peptide mit einem einzelnen Thiol (5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 bis 8) bei Raumtemperatur 1-18 Stunden lang mit 0,5 Moläquivalenten BMME (Bis-maleimidomethylether), vorgelöst in Acetonitril, umsetzte. Die Lösung wurde eingeengt und das Produkt durch HPLC gereinigt.
TSEA-Addukte wurden gegebenenfalls durch eine ungefähr 1-18stündige Umsetzung von Peptid mit einem einzelnen Thiol (in Konzentrationen von 10 bis 100 mg/ml Peptid in DMF oder 5 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphatlösung (pH-Wert 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,33 Moläquivalenten TMEA (Tris(2- maleimidoethyl)amin; Beispiel 2), vorgelöst in Acetonitril oder DMF, mit oder ohne 1 Moläquivalent Triethanolamin, bei Raumtemperatur dargestellt. Diese addukthaltigen Reaktionsmischungen wurden eingeengt, und die Addukte wurden dann mittels HPLC gereinigt.
BAT-BS-Addukte wurden gegebenenfalls durch eine ungefähr 1-18stündige Umsetzung von Peptid mit einem einzelnen Thiol (in Konzentrationen von 2 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphatlösung (pH-Wert 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,5 Moläquivalenten BAT-BM (N-[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t- butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid; Beispiel 1), vorgelöst in Acetonitril oder THF, bei Raumtemperatur dargestellt. Die Lösung wurde dann zur Trockne eingeengt und die [BAT-BS]-Peptid-Konjugate wurden durch 1stündige Behandlung mit 10 ml TFA und 0,2 ml Triethylsilan entschützt. Die Lösung wurde eingeengt und die Produkt-Addukte wurden mit Ether ausgefällt und dann mittels HPLC gereinigt.
Die rohen Peptide wurden durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta Pak C18-Säule und Gradientenelution mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser modifiziert mit Acetonitril gereinigt. Das Acetonitril aus den eluierten Fraktionen wurde abgedampft, und die Fraktionen wurden dann lyophilisiert. Die Identität der einzelnen Produkte wurde durch Fast-Atom-Bombardment- Massenspektrometrie (FABMS) oder Elektrospray- Massenspektrometrie (ESMS) bestätigt.

BEISPIEL 8

Allgemeines Verfahren zur radioaktiven Markierung mit Tc-99m

0,1 mg eines wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten Peptids wurden in 0,1 ml Wasser oder 50 mM Kaliumphosphatpuffer, 0,1 M Hydrogencarbonatpuffer oder 10% Hydroxypropylcyclodextrin (HPCD), jeweils mit einem pH-Wert von 5-10, gelöst. Tc-99m-Gluceptat wurde durch Rekonstitution eines Glucoscan-Vials (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat, enthaltend bis zu 200 mCi, und anschließendes Stehenlassen bei Raumtemperatur für 15 Minuten, dargestellt. 25 ul Tc-99m-Gluceptat wurde dann zum Peptid gegeben, und nach 15-30minütiger Reaktion bei Raumtemperatur oder bei 100ºC wurde die Mischung durch ein 0,2-um-Filter filtriert.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde mittels HPLC unter Anwendung der folgenden Bedingungen bestimmt: eine analytische Waters DeltaPure RP-18- Säule, 5 u, 150 mm · 3,9 mm, wurde mit dem betreffenden radioaktiv markierten Peptid beladen, und die Peptide wurden bei einer Lösungsmittelfließgeschwindigkeit gleich 1 ml/min eluiert. Die Gradientenelution wurde mit 10% Lösungsmittel A (0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O) begonnen und über 20 min auf 40% Lösungsmittel B&sub9;&sub0; (0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O) gesteigert.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde durch HPLC unter den in den Fußnoten der Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen bestimmt. Radioaktive Komponenten wurden durch einen in-line-radiometrischen Detektor, der mit einem integrierenden Recorder verbunden war, nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen eluieren Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m- Natriumpertechnetat zwischen 1 und 4 Minuten, während das mit Tc-99m markierte Peptid erst sehr viel später eluiert.
Die folgende Tabelle zeigt die erfolgreiche Tc-99m- Markierung von nach Beispiel 1 dargestellten Peptiden unter Anwendung der hier beschriebenen Methode. TABELLE I TABELLE I (Fortsetzung)
* Die hochgestellten Ziffern beziehen sich auf die folgenden Markierungsbedingungen:
1. Das Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
2. Das Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) gelöst und bei 100ºC markiert.
3. Das Peptid wurde in Wasser gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
4. Das Peptid wurde in Wasser gelöst und bei 100ºC markiert.
5. Das Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) gelöst und bei 100ºC markiert.
6. Das Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 5,0) gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
7. Das Peptid wurde in einer Mischung aus Ethanol und Wasser (50 : 50) gelöst und bei 100ºC markiert.
8. Das Peptid wurde in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
** HPLC-Methoden (angegeben durch die hochgestellten Ziffern nach Rt):
allgemein: Lösungsmittel A = 0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub7;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/70% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub9;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Fließgeschwindigkeit des Lösungsmittels = 1 ml/min
Vydak-Säule = Vydak 218TP54 RP-18, 5 um, 220 mm · 4,6 mm, analytische Säule mit Vorsäule
Brownlee-Säule = Brownlee Spheri-5 RP-18-Säule, 5 um, 220 mm · 4,6 mm
Waters-Säule = Waters Delta-Pak C18-Säule, 5 um, 150 mm · 3,9 mm
Waters-Säule 2 = Waters Nova-Pak C18-Säule mit radialer Kompression, 5 um, 100 mm · 8 mm
Methode 1: Brownlee-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 2: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Methode 3: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 4: Waters-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 20 min
Methode 5: Waters-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Methode 6: Waters-Säule 2 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
*** Bestätigt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese
Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren finden sich in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York) Seite 33; eine Unterstreichung bedeutet die Bildung einer Thiolbindung zwischen den verbundenen Aminosäuren von Derivatgruppen; die Peptide sind über die freie Thiolgruppe des ungeschützten Cysteinrests (C) im jeweiligen Peptid mit BSH, ETAC, BSME, TSEA, [BAT-BS] oder (CH&sub2;CO) enthaltenden Linke m verbunden; Ac = Acetyl; Bz = Benzoyl; Pic = Picolinoyl (Pyridin-2-carbonyl); Acm = Acetamidomethyl; Mob = 4- Methoxybenzyl; Apc = L-[S-(3-Aminopropyl)cystein; Hly = Homolysin; FD = D-Phenylalanin; YD = D-Tyrosin; ma = 2- Mercaptoessigsäure; mmp - 2-Mercapto-2- methylpropionsäure; BAT = N&sup6;,N&sup9;-Bis(2-mercapto-2- methylpropyl)-6,9-diazanonansäure; ETAC = 4-(O-CH&sub2;CO- Gly-Gly-Cys.Amid)acetophenon; BAT-BS = N-[2-N',N'- Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-mercapto- 2-methylpropyl)-6,9-diazanonanamid; BSME = Bissuccinimidomethylether; TSEA = Tris-(2- succinimidoethyl)amin; NES = N-Ethylsuccinimid; BSH = 1,6-Bis-succinimidohexan; Amp = 4-Amidinophenylalanin.
a = bestätigt durch Elektrospray-Massenspektrometrie [ESMS]

BEISPIEL 9

Thrombozytenaggregationsinhibierungsassays

Die Untersuchungen zur Thrombozytenaggregation werden im wesentlichen wie von Zucker beschrieben (1989, Methods in Enzymol. 169: 117-133) durchgeführt. Kurz zusammengefaßt wird die Thrombozytenaggregation gegebenenfalls mit putativen thrombozytenaggregationsinhibierenden Verbindungen unter Verwendung von frischem menschlichem Plasma, das reich an Blutplättchen ist und 300.000 Plättchen pro Mikroliter enthält, untersucht. Die Thrombozytenaggregation wird durch Zugabe einer Lösung von Adenosin-Diphosphat (Endkonzentration 10 bis 15 Mikromolar) induziert, und das Ausmaß der Thrombozytenaggregation wird mit Hilfe eines Bio/Data-Aggregometers (Bio/Data Corp., Horsham, PA) verfolgt. Die Konzentrationen der verwendeten, die Thrombozytenaggregation hemmenden Verbindungen werden von 0,1 bis 500 ug/ml variiert. Die Inhibitorkonzentration, bei der die Thrombozytenaggregation um 50% reduziert ist (definiert als IC&sub5;&sub0;), wird aus Auftragung der Inhibitorkonzentration gegen das Ausmaß der Thrombozytenaggregation bestimmt. Als positive Kontrolle wird eine Inhibierungskurve für das Peptid RCDS bei jeder untersuchten Blutplättchencharge bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle II gezeigt. In Tabelle II wurden die folgenden Verbindungen getestet (RGDS wird als positive Kontrolle angegeben):
P47 = AcSYGRGDVRGDFKCAcmGCAcm
P97 = GRGDVRGDFKCAcmGCAcmAmid
P32 = CAcmGCAcmRRRRRRRRRGDV
P143 = CH&sub2;CO-YDRGDCGGCAcmGCAcmAmid
P245 = CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGFDPRPAmid
P63 = AcSYGRGDVRGDFKCTCCA
P98 = GRDGVRGDFCAcmGCAcmAmid
P81 = CH&sub2;CO-YDRGDCCAcmGCAcmAmid
(Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren finden sich in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York) Seite 33; Ac = Acetyl; Acm = Acetamidomethyl; Apc = L-[S-(3-Aminopropyl)cystein; YD = D-Tyrosin; BSME = Bissuccinimidylmethylether; TSEA = Tris(succinimidylethyl)amin; [BAT-BS] = N-[2-(N',N'- Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;,-bis(2-methyl- 2-mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid; die Peptide sind über die freie Thiolgruppe des ungeschützten Cysteinrests (C) im jeweiligen Peptid mit BSME, TSEA, [BAT-BS] oder (CH&sub2;CO) enthaltenden Linkem verbunden).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die IC&sub5;&sub0;-Werte bei cyclischen Peptiden im Vergleich zu linearen Peptiden abnehmen und bei mehrwertigen Peptidreagentien noch geringer sind als bei einwertigen Peptidreagentien. Diese Resultate belegen die Wirksamkeit der multimeren mehrwertigen Antithrombosemittel der Erfindung bei der Verminderung der Blutplättchenaggregation. TABELLE II
¹n = 1; ²n = 2; ²n = 3; &sup4;n = 4; &sup5;n = 6; &sup6;n = 9
* Verhältnis von (% der injizierten Dosis/g in einem Thrombus in der V. femoralis)/(% der injizierten Dosis/g Blut) ungefähr 4 h nach der Injektion der einzelnen mit Tc-99m markierten Reagentien in einem TVT-Modell in Hunden
** Reagenskonzentration, bei der 50% der durch Zugabe von Adenosindiphosphat (ADP) induzierten Aggregation von humanen Thrombozyten in thombozytenreichem Plasma inhibiert ist.
Es versteht sich, daß in der obigen Offenbarung bestimmte spezielle Ausführungsformen der Erfindung betont werden und daß alle diesen Ausführungsformen entsprechenden Modifikationen oder Alternativen unter die Wesensart und den Umfang der Erfindung fallen, wie in den angefügten Ansprüchen ausgeführt.

Claims

1. Reagens zur Darstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben, welches eine einen radioaktiven Marker komplexierende Einheit enthält, die kovalent an eine Verbindung gebunden ist, die sich an den Glykoprotein-IIb/IIIa- Rezeptor von Thrombozyten bindet und ein Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton aufweist, wobei das Reagens dazu in der Lage ist, die Aggregation von humanen Thrombozyten in einem thrombozytenreichen Plasma um 50% (IC&sub5;&sub0;) zu hemmen, wenn es in einer Konzentration von nicht mehr als 0,3 uM vorliegt; mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Reagens nicht um

CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGGCAcmGCAcm.Amid oder

(CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC.Amid)&sub2;-BSME

handelt.

2. Reagens nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

a) einem Peptid umfassend 4 bis 100 Aminosäuren;

b) einem Peptid mit der Formel:

wobei A für eine lipophile D-α-Aminosäure oder eine N-Alkyl-L-α-Aminosäure oder L-Prolin steht;

X für eine L-α-Aminosäure steht, die eine Seitenkette aufweist, die eine positive Ladung annehmen kann; und

R jeweils unabhängig voneinander für H, niederes Alkyl oder niederes Alkoxyalkyl steht;

c) einem Peptid mit der Formel:

wobei A für D-Tyrosin oder D-Phenylalanin steht und X für L-[S-(3-Aminopropyl)cystein] oder L-4-Amidinophenylalanin steht;

d) einem Peptid mit der Formel:

(CH&sub2;COYD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGCAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GC- Amid;

e) einem Peptid mit der Formel:

(CH&sub2;COYD.Amp.GDCGGCAcmGCAcmGGCAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GC- Amid;

und

f) einem Peptid mit der Formel:

(CH&sub2;COYD.Amp.GDCKGCGAmid)&sub2;(CH&sub2;CO)&sub2;K(N&epsi;-K)GCAmid.

3. Das Reagens nach Anspruch 1, wobei die den radioaktiven Marker komplexierende Einheit eine ein einzelnes Thiol enthaltende Einheit umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

IIa. -(Aminosäure)¹-(Aminosäure)²-{A-CZ(B)- [C(R¹R²)]n-X},

IIb. -{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X}-(Aminosäure)¹- (Aminosäure)²,

IIc. -(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)-(Aminosäure)¹-{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n- X},

und

IId. -{A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X}-(Aminosäure)¹- (eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)

wobei (Aminosäure)¹ und (Aminosäure)² jeweils unabhängig voneinander für eine beliebige natürliche, modifizierte, substituierte oder veränderte α- oder β- Aminosäure stehen, die keine Thiolgruppe enthält,

und

A für H, HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)- OOC oder R&sup4; steht;

B für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) oder R&sup4; steht;

X für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) oder R&sup4; steht;

Z für H oder R&sup4; steht;

R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges, verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen;

n für 0, 1 oder 2 steht;

und wobei, wenn B für -NHR³ oder -N(R³)- (Aminosäure oder Peptid) steht, X für SH und n für 1 oder 2 steht;

wenn X für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht, B für SH und n für 1 oder 2 steht;

wenn B für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, X für SH und n für 0 oder 1 steht;

wenn A für H oder R&sup4; steht, im Fall von B = SH, X für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht und, im Fall von X = SH, B für -NHR³ oder -N(R³)-(Aminosäure oder Peptid) steht;

wenn X für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC und B für SH steht;

wenn Z für Methyl steht, X für Methyl, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, B für SH und n für 0 steht.

4. Mittel zur szintigraphischen Bilderzeugung, enthaltend das Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen radioaktiven Marker, vorzugsweise Technetium-99m, Indium-111 oder Gallium-68.

5. Komplex, gebildet durch Umsetzung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Technetium-99m in Gegenwart eines Reduktionsmittels, vorzugsweise Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)- Ionen.

6. Komplex, gebildet durch Markieren des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Technetium-99m durch Ligandenaustausch eines vorreduzierten Technetium-99m-Komplexes.

7. Kit zur Herstellung einer radiopharmazeutischen Zubereitung, wobei das Kit ein verschlossenes Vial enthält, das eine vorbestimmte Menge eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein Reduktionsmittel in einer Menge enthält, die ausreicht, um das Reagens mit Technetium-99m zu markieren.

8. Verwendung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Thromben.

9. Verfahren zur Herstellung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch chemische in-vitro- Synthese, vorzugsweise Festphasen-Peptidsynthese.

10. Verfahren zur Markierung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem man das Peptid in Gegenwart eines Reduktionsmittels, vorzugsweise von Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)- Ionen mit Technetium-99m umsetzt.