DE69232418T2

DE69232418T2 - Technetium - 99M markierte Peptide zur Bildformung

Info

Publication number: DE69232418T2
Application number: DE69232418T
Authority: DE
Inventors: Scott Buttram; T. Dean; William Mcbride
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1991-11-27
Filing date: 1992-11-19
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2012-11-20
Also published as: US5814297A; CA2124458C; US5807537A; AU3415197A; US6017509A; WO1993010747A2; US5866097A; EP0614379A1; DE69232418D1; ES2172513T3; AU3276093A; JPH07506086A; CA2124458A1; WO1993010747A3; AU721198B2; US5443815A; EP0614379B1; ATE213168T1; DK0614379T3; JP3036602B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft radiodiagnostische Reagenzien und Peptide, und Verfahren zur Herstellung von markierten radiodiagnostischen Mitteln. Die Erfindung betrifft insbesondere mit Technetium-99m (Tc-99m) markierte Reagenzien, Verfahren und Kits zur Herstellung dieser Reagenzien, und Verfahren zur Anwendung solcher Reagenzien. Die Erfindung betrifft ganz besonders mit Tc-99m markierte Peptide, die zwischen 4 und 100 Aminosäurereste aufweisen und kovalent mit einer ein Radioisotop komplexierenden Gruppe verbunden sind.

2. Stand der Technik

Die Verwendung von Chelatbildnern zum Radiomarkieren von Polypeptiden ist im Stand der Technik bekannt.
Im US-Patent Nr. 4 434 151 beschrieben Byrne et al. bifunktionelle Homocystein-Thiolacton- Chelatbildner, die Radionukleide an Verbindungen mit terminalen Aminogruppen, welche sich in einem abzubildenden Organ bzw. Gewebe anreichern können, kuppeln können.
Im US-Patent Nr. 4 444 690 beschreibt Fritzberg eine Reihe von auf 2,3- Bis(mercaptoacetamido)propanoat basierenden, Technetium-chelatisierenden Mitteln.
Im US-Patent Nr. 4 472 509 lehren Gansow et al. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Metall-Chelat-konjugierten monoklonalen Antikörpern.
In den US-Patenten Nr. 4 571 430 und 4 575 556 beschreiben Byrne et al. neue bifunktionelle Homocystein-Thiolacton-Chelatbildner zum Chelatisieren von Radionukleiden, die Radionukleide an Verbindungen mit terminalen Aminogruppen, die sich in einem abzubildenden Organ bzw. Gewebe anreichern können, kuppeln können.
Im US-Patent Nr. 4 861 869 beschreiben Nicolotti et al. bifunktionelle Kupplungsmittel, die sich zur Bildung von Konjugaten mit biologischen Molekülen wie Antikörpern eignen. In dieser Literaturstelle werden Verbindungen wie S- Benzoylmercaptoacetylglycylglycylglycin beschrieben.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 84109831.2 (EP-A-0 135 160) werden Technetium-chelatisierende Komplexe von Bisamido-bisthio-Liganden und deren Salzen beschrieben, die vorwiegend als Mittel zur Kontrolle der Nierenfunktion verwendet werden.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 86100360.6 (EP-A-0 188 256) werden Dithiol-, Diamino- oder Diamidocarbonsäuren oder Aminkomplexe beschrieben, die sich zur Herstellung von Technetiumreagenzien zur Bilddarstellung eignen.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 88104755.9 (EP-A-0 284 071) werden verschiedene S-geschützte chelatisierende Mercaptoacetylglycylglycingruppen beschrieben, die an große Proteine wie z. B. Antikörper gebunden sind.
In der britischen Patentanmeldung Nr. 8927255.3 (GB-A-2 225 579) offenbaren Albert et al. Radioimaging-Verfahren unter Verwendung von Somatostatinderivaten wie z. B. eines über eine an den Aminoterminus gebundene chelatisierende Gruppe mit ¹¹¹In markiertem Octreotids.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 90306428.5 (EP-A-0 403 243) offenbaren Flanagan et al. die Tc-99m-Markierung von synthetischen Peptidfragmenten mit einer Reihe organischer Chelatmoleküle.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. WO 91/01144 offenbaren Albert et al. Radioimaging- Verfahren unter Verwendung von radioaktiv markierten Peptiden, die mit Wachstumsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Cytokinen verwandt sind und ein spezifisches Erkennungspeptid enthalten, das kovalent an eine radionuklid-chelatisierende Gruppe gebunden ist.
In Inorg. Chem. 20: 1629-1632 (1981) offenbaren Davison et al. Oxotechnetium-Chelatkomplexe.
In J. Nucl. Med. 23: 592-598 (1982) offenbaren Fritzberg et al. ein auf N,N'-Bis(mercaptoacetyl)- 2,3-diaminopropanoat basierendes, technetiumchelatisierendes Mittel.
In J. Nucl, Med. 24: P126 (1983) offenbaren Byrne und Tolman ein bifunktionelles Thiolacton- Chelatisierungsmittel zur Kupplung von Tc-99m an biologische Moleküle.
In Inorg. Chem. 27: 2154-2161 (1988) beschreiben Bryson et al. Thiolatliganden zum Komplexieren mit Technetium.
In Inorg. Chem. 29: 2948-2951 (1990) beschreiben Bryson et al. Thiolatliganden zum Komplexieren mit Technetium.
J. Nucl. Med. 32: 981 (1991), Abstract Nr. 305, von Kwekkeboom et al. betrifft mit ¹¹¹In radioaktiv markierte Somatostatin-Analoga.
In Abstract LM10, 12. American Peptide Symposium: 1991, beschreiben Albert et al. Anwendungen für mit ¹¹¹In markierte, diethylen-triaminopentaessigsäure-derivatisierte Somatostatinanaloga.
In EP 527 056 werden radioaktiv markierte Oligopeptide, die zur in-vivo-Abbildung von Tumoren bestimmt sind und die Aminosäuresequenz Leucin-Asparaginsäure-Valin (LDV) enthalten, offenbart.
In WO 92/18534 wird die radioaktive Markierung von Peptiden, die die Aminosäuresequenz Glutaminsäure- Prolin-Prolin-Threonin (EPPT) enthalten, offenbart.
Von einer Reihe von Radionukliden ist bekannt, daß sie sich für Radioimaging eignen, unter anderem &sup6;&sup7;Ga, 99mTC (TC-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb oder ¹&sup8;&sup6;Re. Die Empfindlichkeit von Methoden zur bildlichen Darstellung unter Verwendung von radioaktiv markierten Peptiden ist wesentlich höher als die anderer vom Stand der Technik bekannten Techniken, da durch die spezifische Bindung des radioaktiven Peptids das radioaktive Signal über den Zellen, die von Interesse sind, beispielsweise Tumorzellen, konzentriert wird.
Verfahren zur Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit Tc-99m sind im Stand der Technik offenbart.
Im US-Patent Nr. 4 444 690 beschreibt Fritzberg eine Reihe von auf 2,3- Bis(mercaptoacetamido)propanoat basierenden technetiumchelatisierenden Mitteln.
Im US-Patent Nr. 4 472 509 lehren Gansow et al. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Tc- 99m-chelatkonjugierten monoklonalen Antikörpern.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 87300426.1 (EP-A-0 237 150) offenbaren Reno und Bottino die radioaktive Markierung von Antikörpern mit Tc-99m.
In der EPC-Anmeldung Nr. 87118142.6 (EP-A- 0 271 806) offenbaren Bremer et al. das organspezifische Radioimaging unter Verwendung von mit Tc-99m radioaktiv markierten Proteinen.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. WO 88/07382 offenbaren Pak et al. ein Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit Tc-99m.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/07456 beschreiben Goedemans et al. die radioaktive Markierung von Proteinen unter Verwendung von cyclischen Thiolverbindungen, insbesondere auf 2-Iminothiolan und Derivaten davon.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/09405 offenbaren Schochat et al. die direkte radioaktive Markierung von Proteinen, die wenigstens eine "herunterhängende" Sulfhydrylgruppe enthalten.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/12625 beschreiben Dean et al. bifunktionelle Kupplungsmittel für die Markierung von Proteinen bzw. Peptiden mit Tc-99m.
In der EPC-Anmeldung Nr. 90402206.8 (EP-A-0 412 012) beschreiben Thornback et al. die Herstellung und Verwendung von radioaktiv markierten Proteinen und Peptiden unter Verwendung von thiolhaltigen Verbindungen, insbesondere 2-Iminothiolan.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15818 beschreibt Stuttle die Markierung von RGD enthaltenden Oligopeptiden mit Tc-99m.
In Sem. Nucl. Med. 4: 281-293 (1974) lehrt Rhodes die Markierung von humanem Serumalbumin mit Tc- 99m.
In J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982) offenbaren Khaw et al. Verfahren zur Markierung von biologisch aktiven Makromolekülen mit Tc-99m.
Byrne und Tolman, supra, offenbaren ein bifunktionelles Thiolacton-Chelatisierungsmittel zur Kupplung von Tc-99m an biologische Moleküle.
Knight et al., Abstract Nr. 209, 37. Jahrestagung der Society for Nuclear Medicine (1990), beschreiben die Abbildung von Thromben mit Tc-99m markierten Peptiden.
In WO 90/10463 wird die Markierung des Peptids Formyl-Methionin-Leucin-Phenylalanin mit Technetium-99m durch Zufügung eines Cysteins zum Tripeptid zur Anwendung in der Bilddarstellung vorgeschlagen.
In WO 91/17173 wird die Markierung von Peptiden mit einer Metallothionein-chelatisierenden Sequenz, die mehr als ein Thiol enthält, offenbart.
Cox et al., Abstract, 7tes International Symposium on Radiopharmacology, S. 16, 1991, offenbaren die Verwendung von mit ¹³¹I und ¹¹¹In markierten Somatostatinanaloga zur Radiolokalisierung von endokrinen Tumoren in vivo durch Szintigraphie.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung bereit, bei denen es sich um radioaktiv markierte Peptide handelt. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen zwischen 4 und 100 Aminosäurereste, die kovalent mit einer radioisotopenkomplexierenden Gruppe verbunden sind, wobei die komplexierende Gruppe ein Radioisotop bindet.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Peptide, die kovalent mit radioisotopenkomplexierenden Gruppen verbunden sind, die eine Thioleinheit umfassen, mit der folgenden Struktur:
A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X
wobei A für H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4; steht; B für H, SH oder -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht; X für SH oder -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht; Z für H oder R&sup4; steht; R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges, verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen; n für 0, 1 oder 2 steht; und: 1. wenn B für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht, X für SH und n für 1 oder 2 steht; und 2. wenn X für NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht, B für SH und n für 1 oder 2 steht; und 3. wenn B für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC steht, X für SH und n für 0 oder 1 steht; und 4. wenn A für H oder R&sup4; steht und wenn B für SH steht, X für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht; und wenn X für SH steht, B für -NHR³ oder - N(R³)-(Peptid) steht; und 5. wenn X für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC und B für SH steht; und 6. wenn Z für Methyl steht, X für Methyl, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC, B für SH und n für 0 steht; wobei die Technetium-99m- komplexierende Gruppe ein einzelnes Thiol enthält und wobei sich die Thioleinheit in der reduzierten Form befindet und die komplexierende Gruppe kovalent an das Peptid gebunden werden kann.
Die Erfindung umfaßt Peptide zur Markierung mit Tc-99m und zur Abbildung von Targetstellen im Körper eines Säugetieres, die zwischen 4 und 100 Aminosäurereste umfassen, welche kovalent mit einer radioisotopenkomplexierenden Gruppe verbunden sind, wobei die komplexierende Gruppe ein Radioisotop bindet. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung solcher kovalent an eine radioisotopenkomplexierende Gruppe gebundene Peptide. Die Erfindung schließt weiterhin Tc-99m- Komplexe, Verfahren zur Herstellung solcher Tc-99m-Komplexe und Verfahren zur Verwendung der Tc-99m-Komplexe zur Abbildung von Targetstellen im Körper von Säugetieren ein.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt mit Tc-99m markierte Peptide zur Abbildung von Targetstellen im Körper eines Säugetiers bereit, die zwischen 4 und 100 Aminosäurereste umfassen, welche kovalent mit einer radioisotopenkomplexierenden Gruppe verbunden sind, wobei die komplexierende Gruppe ein Radioisotop bindet.
Bei der Markierung mit Tc-99m handelt es sich um einen Vorteil der vorliegenden Erfindung, da dieses Isotop dank seiner nuklearen und radioaktiven Eigenschaften ein ideales Mittel der szintigraphischen Bilddarstellung ist. Das Isotop weist eine Einzelphotonenenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf und ist leicht über einen &sup9;&sup9;Mo-99mTc- Generator verfügbar. Andere im Stand der Technik bekannte Radionukleide haben wesentlich längere effektive Halbwertszeiten (beispielsweise ¹¹¹In mit einer Halbwertszeit von 67,4 Stunden) oder sind toxisch (beispielsweise ¹²&sup5;I).
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in vitro chemisch synthetisiert werden. Im allgemeinen lassen sich die Peptide der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in einem Aminosäuresynthesizer darstellen. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich darstellen, indem man bei der chemischen in-vitro-Synthese unter Anwendung von dem Fachmann gut bekannten Vorschriften die komplexierende Gruppe kovalent mit dem Peptid verbindet. Solche bei der Synthese kovalent mit der komplexierenden Gruppe verbundenen Peptide sind vorteilhaft, da sich in ihnen spezifische Stellen für eine kovalente Anbindung festlegen lassen.
Bei der Bildung eines Komplexes von radioaktivem Technetium mit den erfindungsgemäßen Peptiden setzt man den Technetiumkomplex, vorzugsweise ein Tc-99m-Pertechnetatsalz, mit den erfindungsgemäßen Peptiden in Gegenwart eines Reduktionsmittels um; bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Reduktionsmittel aus der aus einem Dithionition, einem Festphasenreduktionsmittel und einem Zinn(II)-Ion, insbesondere Zinn(II)-chlorid, bestehenden Gruppe ausgewählt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform setzt man den Technetiumkomplex mit einem Peptid der Formel HS- CH&sub2;-CO-GGGRALVDTLKFVTQAEGAK.Amid um. Komplexe und Mittel zur Herstellung solcher Komplexe werden bequem in Form eines Kits bereitgestellt, welches ein versiegeltes Vial mit einer vorbestimmten Menge der zu markierenden erfindungsgemäßen Peptide und eine zur Markierung des Peptids mit Tc-99m ausreichende Menge an Reduktionsmittel enthält. Alternativ dazu kann man den Komplex durch Umsetzung des erfindungsgemäßen Peptids mit einem vorgefertigten labilen Technetium-Komplex und einer weiteren, als Transferliganden bezeichneten Verbindung bilden. Dieses Verfahren, mit dem der Fachmann gut vertraut ist, ist als "Ligandenaustausch" bekannt. Der labile Komplex kann unter Einsatz von Transferliganden wie beispielsweise Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit gebildet werden. Zu den für die vorliegende Erfindung geeigneten Tc-99m-Pertechnetatsalzen gehören Alkalisalze wie das Natriumsalz, und Ammoniumsalze und niedere Alkylammoniumsalze. Die Umsetzung der erfindungsgemäßen Peptide mit Tc- Pertechnetat oder dem vorgefertigten labilen Tc- 99m-Komplex kann man bei Raumtemperatur in einem wäßrigen Medium durchführen. Im wäßrigen Medium wird der anionische Komplex, der eine Ladung von [-1] aufweist, in Form eines Salzes mit einem geeigneten Kation wie dem Natriumkation, dem Ammoniumkation, dem Mono-, Di- oder Tri-Niederes- Alkyl-Aminkation, usw., gebildet. Gemäß der Erfindung läßt sich jedes herkömmliche Salz des anionischen Komplexes mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Kation verwenden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die zu markierenden erfindungsgemäßen Peptide vor dem Markieren durch Inkubieren mit einem Reduktionsmittel reduziert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Reduktionsmittel aus der aus einem Dithionition, einem Festphasenreduktionsmittel und einem Zinn(II)-Ion, insbesondere Zinn(II)-chlorid, bestehenden Gruppe ausgewählt. Das vorreduzierte Peptid wird dann durch Umsetzen mit einem Tc-99m unter reduzierenden Bedingungen oder mit vorreduziertem Tc-99m bzw. einem Tc99m-Komplex markiert
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Darstellung von mit Technetium markierten Peptiden bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Peptide können chemisch unter Anwendung von Methoden und Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt und unten beschrieben sind, synthetisiert werden. So dargestellte Peptide umfassen zwischen 4 und 100 Aminosäurereste und sind kovalent mit einer radioisotopenkomplexierenden Gruppe verbunden, wobei die komplexierende Gruppe ein Radioisotop bindet. In ein Vial, das eine für eine Markierung des Peptids mit Tc-99m ausreichende Menge an Reduktionsmittel wie beispielsweise Zinn(II)- chlorid oder ein Festphasenreduktionsmittel enthält, wird eine entsprechende Menge des Peptids gegeben. Dabei kann man auch eine entsprechende Menge eines der oben beschriebenen Transferliganden (wie z. B. Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit) zufügen. Mit Technetium markierte Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung lassen sich darstellen, indem man den Vials eine entsprechende Menge von Tc-99m oder Tc-99m-Komplex zusetzt und unter den unten in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen umsetzt.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten radioaktiv markierten Peptide werden mit einer geeigneten Menge an Radioaktivität bereitgestellt. Bei der Darstellung von radioaktiven anionischen Tc-99m-Komplexen ist es im allgemeinen bevorzugt, die radioaktiven Komplexe in Lösungen anzufertigen, deren Radioaktivität bei Konzentrationen von etwa 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml liegt.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten technetiummarkierten Peptide lassen sich zur Abbildung von Organen wie z. B. der Niere zur Diagnose von Erkrankungen dieser Organe verwenden, und es ist weiterhin möglich, Tumore, insbesondere gastrointestinale Tumore, Myelome, kleinzellige Lungenkarzinome und andere APUDome, endokrine Tumore wie medulläre Thyroidkarzinome und Hypophysentumore, Hirntumore wie z. B. Meningiome und Astrocytome und Prostata-, Brust-, Dickdarm- und Eierstocktumore abzubilden. Gemäß dieser Erfindung werden die technetiummarkierten Peptide bzw. anionischen Komplexe entweder als Komplex oder als Salz mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Kation als injizierbare Einzeldosis verabreicht. Nach der Radiomarkierung kann man einen beliebigen der dem Fachmann bekannten gewöhnlichen Trägerstoffe wie z. B. wäßrige Kochsalzlösung oder Blutplasma zur Herstellung der injizierbaren Lösung zur erfindungsgemäßen diagnostischen Abbildung von verschiedenen Organen, Tumoren und dergleichen verwenden. Im allgemeinen weist die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von etwa 0,01 mCi bis etwa 100 mCi, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi, auf. Die bei einer Einzeldosierung zu injizierende Lösung hat ein Volumen von etwa 0,01 ml bis etwa 10 ml. Nach der intravenösen Verabreichung kann die in vivo-Bilddarstellung des Organs oder Tumors innerhalb weniger Minuten erfolgen. Die Bilddarstellung kann jedoch gewünschtenfalls auch Stunden oder sogar noch später nach Verabreichung der Injektion an einen Patienten erfolgen. In den meisten Fällen wird sich innerhalb von etwa 0,1 Stunden eine für eine Aufnahme von Szintiphotos ausreichende Menge der verabreichten Dosis in der abzubildenden Gegend angereichert haben. Dabei kann erfindungsgemäß eine beliebige herkömmliche Methode der szintigraphischen Bilderzeugung für diagnostische Zwecke angewandt werden.
Die durch die Erfindung bereitgestellten technetiummarkierten Peptide und Komplexe können intravenös in einem beliebigen herkömmlichen Medium für die intravenöse Injektion wie z. B. einem wäßrigen Kochsalzmedium oder in Blutplasmamedium verabreicht werden. Solche Medien können weiterhin herkömmliche pharmazeutische Zusatzstoffe wie beispielsweise pharmazeutisch unbedenkliche Salze zum Einstellen des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen, enthalten. Zu den bevorzugten Medien gehören normale Kochsalzlösung und Plasma.
Die Methoden zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen werden ausführlicher in den folgenden Beispielen dargestellt. Diese Beispiele erläutern gewisse Aspekte der oben beschriebenen Methode und vorteilhafte Ergebnisse; sie dienen zur Erläuterung und stellen keine Einschränkung dar.

BEISPIEL 1

Festphasenpeptidsynthese

Die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) wurde im 0,25 Millimol(mmol)-Maßstab auf einem Applied Biosystems Model 431A Peptidsynthesizer durchgeführt, wobei der Aminoterminus mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc) geschützt, die Kupplung mit 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) durchgeführt und für carboxylterminale Säuren ein p-Hydroxymethylphenoxymethyl-polystyrol-(HMP-)Harz oder für carboxylterminale Amide ein Rink-Amidharz eingesetzt wurde. Harzgebundene Produkte wurden routinemäßig durch 1,5-3stündige Behandlung mit einer Lösung von Trifluoressigsäure, Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan, im Verhältnis von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2 bei Raumtemperatur abgespalten. Die rohen Peptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta Pak C18-Säule und Gradientenelution mit 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, gereinigt. Das Acetonitril aus den eluierten Fraktionen wurde abgedampft, und die Fraktionen wurden dann lyophilisiert. Die Identität jedes Produktes wurde durch Fast-Atom- Bombardment-Massenspektrometrie (FABMS) bestätigt.

BEISPIEL 2

Allgemeine Vorschrift zur radioaktiven Markierung mit Tc-99m

0,1 mg eines nach Beispiel 1 dargestellten Peptids wurde in 0,1 ml 0,05M Kaliumphosphatpuffer (pH- Wert 7,4) gelöst. Tc-99m-Gluceptat wurde durch Rekonstitution eines Glucoscan-Vials (E. I. DuPont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m- Natriumpertechnetat, das bis zu 200 mCi enthielt, dargestellt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 25 ul des Tc-99m- Gluceptats zum Peptid gegeben und der Ansatz wurde 30 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen und dann durch einen 0,2-um-Filter filtriert.
Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde durch HPLC unter Anwendung einer analytischen Vydak 218TP54-Säule (RP-18, 5 Mikron, 220 · 4,6 mm) und Elution mit dem folgenden Gradienten: 100% A (0,1% TFA in H&sub2;O) bis 100% B (CH&sub3;CN : H&sub2;O : TFA, 70 : 30 : 0,1) über 10 Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 1,2 ml/min. dann 5 Minuten lang 100% Lösung B, bestimmt. Radioaktive Komponenten wurden durch eine mit einem integrierten Schreiber verbundenen radiometrischen In-Line-Detektor nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen eluierten Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m- Natriumpertechnetat zwischen 1 und 4 Minuten, während die Tc-99m-markierten Peptide erst nach einer wesentlich längeren Zeit eluierten.
In der folgenden Tabelle wird die erfolgreiche Tc- 99m-Markierung von gemäß Beispiel 1 dargestellten Peptiden unter Anwendung der hier beschriebenen Methoden erläutert.
Es versteht sich, daß in der obigen Offenbarung gewisse spezifische Ausführungsformen der Erfindung betont werden und daß Gedanke und Schutzbereich der Erfindung alle äquivalenten Alternativen bzw. Modifikationen umfassen, wie in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt. TABELLE 1
a ma = Mercaptoessigsäure
b Pen = L-Penicillamin
c mmp = 2-Mercapto-2-methylpropionsäure

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Target-Stellen im Körper eines Säugetieres, welches den Schritt der Umsetzung von Technetium-99m und eines Reduktionsmittels mit einem Peptid umfaßt, wobei das Peptid zwischen 4 und 100 Aminosäuren aufweist und kovalent mit einer Technetium-99m-komplexierenden Gruppe verbunden ist, die eine Thioleinheit in reduzierter Form enthält und die folgende Struktur aufweist:

A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X

wobei A für H, HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC, (Peptid)-OOC oder R&sup4; steht;

B für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

X für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

Z für H oder R&sup4; steht;

R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges, verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen;

n für 0, 1 oder 2 steht;

und, wenn B für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht, X für SH und n für 1 oder 2 steht;

wenn X für NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht, B für SH und n für 1 oder 2 steht;

wenn B für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid) -NHOC oder (Peptid) -OOC steht, X für SH und n für 0 oder 1 steht;

wenn A für H oder R&sup4; steht und wenn B für SH steht, X für -NHR³ oder -N(R³)- (Peptid) steht;

und, wenn X für SH steht, B für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht;

wenn X für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC und B für SH steht;

wenn Z für Methyl steht, X für Methyl, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC, B für SH und n für 0 steht;

wobei die Technetium-99m-komplexierende Gruppe ein einzelnes Thiol enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel aus der aus einem Dithionition, einem Zinn(II)-Ion und einem Festphasenreduktionsmittel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung, welches den Schritt der Umsetzung eines vorgefertigten labilen Technetium-99m-Komplexes und eines Transferliganden mit dem in Anspruch 1 definierten Peptid umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Peptid die folgende Formel aufweist:

HS-CH&sub2;-CO-GGGRALVDTLKFVTQAEGAK.Amid

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Peptid durch eine chemische Festphasensynthese in vitro synthetisiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man das Peptid und die Technetium-99m-komplexierende Einheit des Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung während der chemischen Festphasensynthese in vitro kovalent verbindet.

7. Stoffzusammensetzung, enthaltend Zinn(II)-Ione und ein Peptid zur Abbildung von Target-Stellen im Körper eines Säugetieres, wobei das Peptid zwischen 4 und 100 Aminosäuren aufweist und kovalent mit einer Technetium-99m-komplexierenden Gruppe verbunden ist, die eine Thioleinheit in reduzierter Form enthält und die folgende Struktur aufweist:

A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X

B für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

X für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

Z für H oder R&sup4; steht;

n für 0, 1 oder 2 steht;

wenn X für NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht,

B für SH und n für 1 oder 2 steht;

wenn B für H oder R&sup4; steht, A für HOOC, H&sub2;NOC, (Peptid)-NHOC oder (Peptid)-OOC steht, X für SH und n für 0 oder 1 steht;

und, wenn für SH steht, B für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht;

wobei die Technetium-99m-komplexierende Gruppe ein einzelnes Thiol enthält.

8. Kit zur Herstellung eines Radiopharmazeutikums, welches ein versiegeltes Vial mit einer vorbestimmten Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 7 enthält.

9. Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung, enthaltend ein Peptid zur Abbildung von Target- Stellen im Körper eines Säugetieres, wobei das Peptid zwischen 4 und 100 Aminosäuren aufweist und kovalent mit einer Technetium-99m- komplexierenden Gruppe verbunden ist, die eine Thioleinheit der folgenden Struktur enthält:

A-CZ(B)-[C(R¹R²)]n-X

B für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

X für H, SH, -NHR³, -N(R³)-(Peptid) oder R&sup4; steht;

Z für H oder R&sup4; steht;

n für 0, 1 oder 2 steht;

und, wenn für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht, X für SH und n für 1 oder 2 steht;

und, wenn X für SH steht, B für -NHR³ oder -N(R³)-(Peptid) steht;

wobei die Technetium-99m-komplexierende Gruppe ein einzelnes Thiol enthält und mit Technetium- 99m markiert ist;

mit der Maßgabe, daß, wenn es sich bei der Technetium-99m-komplexierenden Gruppe um Cystein oder ein an ein Peptid gebundenes Cystein handelt,

a) das Peptid, wenn es zwischen 4 und 50 Aminosäuren aufweist, nicht die Aminosäuresequenz LDV enthält, bzw.

b) das Peptid, wenn es zwischen 4 und 100 Aminosäuren aufweist, nicht die Aminosäuresequenz EPPT enthält.

10. Stoffzusammensetzung, welche das Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung nach Anspruch 9 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält, zur Verwendung bei der Abbildung einer Target- Stelle im Körper eines Säugetieres.