DE69409895T2

DE69409895T2 - Zelloberflächenprotein aus brevibakterium lactofermentum

Info

Publication number: DE69409895T2
Application number: DE69409895T
Authority: DE
Inventors: Yoshio C. R. L. Ajinomoto Co. Inc Kawasaki-Shi Kanagawa 210 Kawahara; Hisashi C. R. L. Ajinomoto Co. Inc. Kawasaki-Shi Kanagawa 210 Kawasaki; Kiyoshi C. R. L. Ajinomoto Co. Inc. Kawasaki-Shi Kanagawa 210 Miwa; Makoto C. R. L. Ajinomoto Co. Inc Kawasaki-Shi Kanagawa 210 Tsuchiya
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1998-12-24
Anticipated expiration: 2014-01-14
Also published as: WO1994015963A1; CN1036850C; CN1101208A; BR9403528A; KR950700329A; EP0644200A4; US5681717A; DE69409895D1; JP3541385B2; CN1124339C; ES2115208T3; EP0644200B1; US5547864A; ATE165606T1; CN1160081A; KR0164235B1; EP0644200A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Züchtung von Mikroorganismen, die sich für die Herstellung von nützlichen Substanzen, wie L-Aminosäuren, durch Fermentationsverfahren eignen, und Verfahren zur Herstellung von nützlichen Substanzen, wie L-Aminosäuren, durch Fermentationsverfahren unter Verwendung der vorstehend genannten Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Zelloberflächenschichtprotein, das aus Brevibacterium lactofermentum abgeleitet ist, ein DNA-Segment, das ein Gen, das für das Protein codiert, enthält, und dessen Verwendung.

Hintergrund

Coryneforme Bakterien sind Mikroorganismen, die L-Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure oder L-Lysin, in großen Mengen bilden, und ihre Züchtung wird mit dem Ziel unternommen, die Produktivität für L-Aminosäuren zu verbessern. Es sind bereits verschiedene untersuchungen zur Züchtung von Aminosäuren bildenden Bakterien unter Anwendung der Genmanipulationstechnik durchgeführt und beschrieben worden (Biotechnology Letters, 2 (1980) 525 - 530; Appln. Environ. Microbiol., 144 (1979) 181 - 190; Abstract of Lecture for the Meeting of the Society of Agricultural Chemistry of Japan (1981) 8). Alle diese Untersuchungen waren jedoch auf die Verbesserung der Produktivität für die gewünschte Aminosäure pro Zelle unter Verwendung von Genen in Aminosäure-Biosynthesesystemen als Materialien und ihre Verstärkung gerichtet, und sie waren nicht auf die Verbesserung der Produktivität durch Analyse der Funktion der Zelloberflächenstruktur gerichtet.
Nebenbei bemerkt wird, wenn eine Aminosäure durch ein Fermentationsverfahren hergestellt wird, eine Ionenaustauschchromatographie üblicherweise im Verlauf der Reinigung der gebildeten Aminosäure durchgeführt; wenn jedoch bakterielle Zellen im Fermentationsmedium verbleiben, dann wird die Ionenaustauschharzsäule verstopft, wenn das Fermentationsmedium durch die Säule geleitet wird, und dementsprechend ist eine Stufe zur Entfernung der bakteriellen Zellen aus dem Fermentationsmedium erforderlich. Die Stufe wird üblicherweise durch Zentrifugation, Filtration oder dergleichen durchgeführt, und es wäre in industrieller Hinsicht sehr nützlich, wenn ein derartiger Zellabtrennschritt eingespart oder vereinfacht werden könnte.
Es ist bekannt, daß mikrobielle Zellen in dem Medium, abhängig von der Art der Mikroorganismen, aufgrund von Aggregation oder dergleichen nach dem Kultivieren ausgefällt werden, und eine Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium ist für derartige Mikroorganismen sehr einfach. Bis jetzt ist jedoch über keine coryneformen Baktieren, die bei der Aminosäureherstellung verwendet werden und derartige Eigenschaften aufweisen, berichtet worden, und ein Verfahren zur Bereitstellung von mikrobiellen Zellen mit Aggregations- oder Fällungseigenschaften ist bis jetzt ebenfalls nicht bekannt.
Die veröffentlichte Druckschrift WO 93/03158 offenbart ein neues Zelloberflächenschichtprotein ähnlich dem K-Protein der vorliegenden Erfindung; dieses Protein unterscheidet sich jedoch klar vom K-Protein. Ferner offenbart diese Veröffentlichung ein Proteinexpressions-gekretions-System, bei dem das Signalpeptid des Zelloberflächenschichtproteins genutzt wird; es war bis jetzt jedoch nicht bekannt, daß ein derartiges Protein zur Aufnahme von Nährstoffen von coryneformen Bakterien und zur Aggregation der bakteriellen Zellen beiträgt.
Ferner werden zwar coryneforme Bakterien industriell als L-Aminosäuren bildende Bakterien verwendet; es wurde jedoch kürzlich festgestellt, daß die Bakterien stark sekretorisch sind, und es ist ein Versuch unternommen worden, sie für die Herstellung von verschiedenen Proteinen zu verwenden, für die in der Praxis bereits Bacilli verwendet werden. Die vorstehend genannte internationale Veröffentlichung WO 93/03158 offenbart ebenfalls eine Technologie dieser Art.
Die Aufgabe, die mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden soll, besteht darin, ein neues Zelloberflächenschichtprotein, das zur Aufnahme von Nährstoffen bei coryneformen Bakterien beiträgt, und ein Gen dafür zu erhalten sowie eine Transformante zu erhalten, die durch Amplifikation des Gens in der Zelle eines coryneformen Bakteriums erhalten wird. Die vorliegende Erfindung hat auch zum Gegenstand, coryneforme Bakterien mit einer Aktivität zur Bildung nützlicher Substanzen, wie von L-Aminosäuren, als einen Wirt für die Transformante zu verwenden und das Verfahren zur Herstellung von nützlichen Substanzen, wie L-Aminosäuren, durch Fermentationsverfahren unter Verwendung der vorstehend genannten Wirtsbakterien zu verbessern sowie coryneforme Bakterien mit Aggregationseigenschaften zu erhalten, denen das neue Zelloberflächenschichtprotein fehlt, um das Verfahren der Aminosäureherstellung zu vereinfachen.

Darstellung der Erfindung

Als Ergebnis einer ernsthaften Untersuchung ist es den Erfindern der vorliegenden Anmeldung gelungen, ein neues Zelloberflächenschichtprotein und ein Gen dafür zu erhalten, die zur Aufnahme eines Nährstoffes bei Bakterien beitragen, und sie haben die vorliegende Erfindung gemacht.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein neues Zelloberflächenschichtprotein, das von Brevibacterium lactofermentum abgeleitet ist, das folgende zwei Sequenzen im Molekül aufweist:
(1) Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala- Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe- Leu-Asp-Trp-Asp-Thr; und
(2) Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp- Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys;
und ein Molekulargewicht von etwa 63000 Dalton hat, ein DNA-Fragment, das ein Gen enthält, das für das Protein codiert, eine rekombinante DNA, die durch Ligieren des DNA-Fragments mit einem Vektor, der zur autonomen Replication in einer Zelle von coryneformen Bakterien befähigt ist, erhalten wird, eine Transformante, die durch Einführen des DNA-Fragments in eine Zelle von coryneformen Bakterien und Amplifizieren erhalten wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz, wie einer L-Aminosäure, durch ein Fermentationsverfahren, welches das Kultivieren der Transformante mit einer Aktivität zur Herstellung einer nützlichen Substanz, wie einer L-Aminosäure, in einem Kulturmedium, das Bilden und Anreichern der nützlichen Substanz in dem Kulturmedium und das Gewinnen der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium umfaßt, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt coryneforme Bakterien, die die Eigenschaft der Zellaggregation haben und denen das Zelloberflächenschichtprotein, das vorstehend beschrieben wurde, oder ein mit diesem vorstehend genannten Protein im wesentlichen identisches Protein, das an der Zelloberfläche von coryneformen Bakterien vorhanden ist, fehlt, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch coryneforme Bakterien mit der Eigenschaft der Zellaggregation bereit, denen das Zelloberflächenschichtprotein fehlt, wobei ein Gen, das für das Zelloberflächenschichtprotein codiert, oder ein Gen, das für ein Protein codiert, das mit dem vorstehend genannten Protein im wesentlichen identisch ist und das in der Zelloberfläche von coryneformen Bakterien vorhanden ist, durch homologe Rekombination eines DNA-Fragments, das mindestens einen Abschnitt eines Gens enthält, das für das Zelloberflächenschichtprotein codiert, mit einer DNA-Sequenz auf einem Chromosom, die identisch oder homolog mit dem DNA-Fragment ist, zerstört ist, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz bereit, welches umfaßt:
Kultivieren von coryneformen Bakterien mit einer Aktivität zur Herstellung einer nützlichen Substanz, wie einer L-Aminosäure;
Bilden und Anreichern der nützlichen Substanz in einem Kulturmedium; und
Gewinnen der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium,
wobei den coryneformen Bakterien das vorstehend genannte neue Zelloberflächenschichtprotein fehlt und sie die Eigenschaft der Zellaggregation aufweisen, wobei das Verfahren weiter den Schritt des Stehenlassens des Kulturmediums nach dem Ablauf der Kultivierung, um dabei die Zellen der coryneformen Bakterien zu fällen, umfaßt.
Coryneformen Bakterien, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, sind, wie nachstehend beschrieben wird, eine Gruppe von Mikroorganismen, die bazilliform, aerob, gram-positiv, nicht säurebeständig und asporogen sind (gemäß der Definition in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, S. 599 (1974)). Spezielle Mikroorganismen, die zu diesen coryneformen Bakterien gehören, werden nachstehend einfach als »coryneformen Bakterien« bezeichnet. Ferner werden die coryneformen Bakterien, denen das erfindungsgemäße Zelloberflächenprotein fehlt, und die coryneformen Bakterien, in denen ein Gen, das für das Zelloberflächenschichtprotein codiert, zerstört ist, gelegentlich zusammenfassend als »K-Protein-defizienter Stamm« bezeichnet.

1. Das neue Zelloberflächenschichtprotein, sein Gen, Transformanten und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Das erfindungsgemäße neue Zelloberflächenschichtprotein wird erhalten, wie es nachstehend beschrieben ist. Zellen von Brevibacterium lactofermentum, zum Beispiel Stamm 2256 (ATCC 13869) werden aufgebrochen, zum Beispiel mit einer Beschallungsvorrichtung (»Supersonicator« OHTAKE 5202PZT). Anschließend wird das Zelllysat unter stärkeren Bedingungen als 3000 x g für 5 min bei 4ºC, vorzugsweise 12000 x g für 1 min bei 4ºC, zentrifugiert, um einen Überstand zu gewinnen. Anschließend wird der Überstand unter stärkeren Bedingungen als 100000 x g für 20 min bei 4ºC, vorzugsweise 100000 x g für 30 min bei 4ºC, zentrifugiert, und das ausgefällte Material wird als Zelloberflächenschichtfraktion gewonnen. Das Protein, das in großer Menge bei einem Molekulargewicht von etwa 63000 in dieser Fraktion vorliegt, ist das erfindungsgemäße neue Zelloberflächenschichtprotein, d.h. das K-Protein.
Das K-Protein wird gereinigt, wie es nachstehend beschrieben wird. Die hergestellte Zelloberflächenschichtfraktion enthält sowohl cytoplasmatische Membran als auch Zellwand. Diese werden anschließend getrennt, indem die cytoplasmatische Membran unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels solubilisiert wird. Da das Ausmaß der Solubilisierung abhängig zum Beispiel von der Art und Konzentration des oberflächenaktiven Mittels, der Zeit und der Temperatur des Solubilisierungsverfahrens sowie der Konzentration an zusätzlichem Glycerin und/oder NaCl variiert, kann die vorliegende Erfindung nur abgeschlossen werden, wenn die optimalen Bedingungen für die Reinigung gefunden werden. Die Festlegung der optimalen Bedingungen ist zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung erfolgt. Es werden also 3,0 ug einer Zelloberflächenschichtfraktion zu 1 ml einer Pufferlösung (50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert: 8,0, 0,1 mM Dithiothreit) mit einem Gehalt an 1,25% (Gew./Vol.) SDS gegeben, bei 4ºC bis 90ºC und vorzugsweise bei 37ºC für mehr als 30 Minuten und vorzugsweise für 1 Stunde gehalten, anschließend einer Zentrifugation unter Bedingungen, die stärker sind als 145000 x g für 20 min und vorzugsweise 145000 x g für 30 min, unterzogen, und ausgefälltes Material wird gewonnen. Das ausgefällte Material wird in 50 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 8,0 mit einem Gehalt an 0,1% SDS suspendiert, so daß die Suspension 0,01 - 10 ug Protein/ul und vorzugsweise 0,2 ug Protein/ul enthält, und anschließend durch Kochen für etwa 3 min solubilisiert.
Das Molekulargewicht des K-Proteins wird aus der Beweglichkeit bei der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Gel Electrophoresis of Proteins, IRL Press (1981), B.D. Hammes et al.) bestimmt. Das Molekulargewicht des K-Proteins wird zu etwa 63000 bestimmt.
Die Aminosäuresequenz des K-Proteins wird bestimmt, wie es nachstehend beschrieben wird. Das gereinigte K-Protein wird in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,3 mit einem Gehalt an 0,1% SDS, so daß die Suspension 10 ug Protein/ml bis 2 mg Protein/ml und vorzugsweise 200 ug Protein/ml enthält, suspendiert, und die Suspension wird für etwa 5 min gekocht, um das K-Protein zu solubilisieren. Nachdem man die Lösung sich hat abkühlen lassen, wird zu der Lösung Endoprotease Lys-C (hergestellt von Beehringer Mannheim Co.) gegeben, so daß das Verhältnis von Proteinfraktion, die in einem oberflächenaktiven Mittel unlöslich ist, und Lys-C etwa 10:1 bis 200:1 und vorzugsweise 50:1 (Gew./Gew.) beträgt, und es wird bei 37ºC für mehr als 30 min und vorzugsweise bei 37ºC für 3 Stunden inkubiert.
Das mit Lys-C partiell verdaute K-Protein wird durch Umkehrphasenchromatographie fraktioniert. Kommerziell erhältliche Säulen können in geeigneter Weise für die Chromatographie gewählt werden; zum Beispiel kann Senshu Pac VP-318-1251 4,6 ∅ X 250 mm verwendet werden. Die Elution erfolgt unter Verwendung einer Gradientenlösung, wie CH&sub3;CN-0,1% TFA. Die Durchflußgeschwindigkeit kann 1 ml/min betragen. Von den auf diese Weise erhaltenen Fraktionen wird eine Fraktion mit einem höherem Peptidgehalt verwendet, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Das Bestimmungsverfahren entspricht einem bekannten Verfahren (P. Edman, Arch. Biochem. 22 (1949) 475), zum Beispiel unter Verwendung einer Gasphasen-Sequenziervorrichtung 470-A, die von Applied Biosystems Co. hergestellt wird, gemäß der Anleitung des Herstellers.
Das K-Protein weist die beiden folgenden Sequenzen im Molekül auf:
(1) Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala- Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe- Leu-Asp-Trp-Asp-Thr (Sequenzprotokoll, SEQ ID NO: 1) und
(2) Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp- Ala-ASP-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys (Sequenzprotokoll, SEQ ID NO: 2).
Das K-Proteingen wird wie folgt isoliert. Chromosomale DNA wird zunächst aus Brevibacterium lactofermentum, zum Beispiel Stamm 2256 (ATCC 13869), extrahiert (es kann zum Beispiel ein Verfahren angewandt werden, das von H. Saito und K. Miura in Biochem. Biophys. Acta 72 (1963) 610 beschrieben wird) und mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Es kann eine Vielzahl von Restriktionsenzymen verwendet werden, wobei das Ausmaß des Verdaus der chromosomalen DNA durch Einstellung der Reaktionsbedingungen, zum Beispiel der Reaktionszeit, gesteuert wird.
Ein DNA-Fragment und eine Vektor-DNA, die zur Replikation in der Zelle eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, befähigt ist, werden unter Bildung einer rekombinanten DNA ligiert, und anschließend werden Escherichia-Bakterien, zum Beispiel Escherichia coli Stamm JM109, mit der rekombinanten DNA transformiert, um eine genomische DNA- Bibliothek herzustellen. Das K-Proteingen kann aus der Bibliothek durch Koloniehybridisierung unter Verwendung einer synthetischen DNA mit einer Nucleotidsequenz, die aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet ist, als Sonde isoliert werden.
Genauer gesagt wird chromosomale DNA aus Brevibacterium lactofermentum Stamm 2256 (ATCC 13869) partiell mit einem Restriktionsenzym, zum Beispiel Sau3AI, bei einer Temperatur von mehr als 30ºC und vorzugsweise 37ºC bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10 Einheiten/ml für verschiedene Zeiten (1 min bis 2 Stunden) verdaut, wobei man Gemische von chromosomalen DNA-Fragmenten verschiedener Größe erhält. Die Vektor-DNA, die zur Replikation in den Zellen der Escherichia-Bakterien befähigt ist, wird vollständig mit einem Restriktionsenzym, das zu einer identischen endständigen Basensequenz mit der des für den Verdau der chromosomalen DNA verwendeten Restriktionsenzyms Sau3AI führt, zum Beispiel BamHI, geschnitten, und zwar bei einer Temperatur von mehr als 30ºC und einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml für mehr als 1 Stunde und vorzugsweise für 1 bis 3 Stunden, um geschnittene und linearisierte DNA zu erhalten. Anschließend werden das Gemisch, das das DNA-Fragment unter Einschluß des K-Proteingens, das aus Brevibacterium lactofermentum Stamm 2256 (ATCC 13869) abgeleitet ist, enthält, und das erhalten wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, und die linearisierte Vektor-DNA gemischt und unter Verwendung von DNA-Ligase, vorzugsweise von T4-DNA-Ligase, bei einer Temperatur von 4 bis 16ºC, einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten für mehr als 1 Stunde und vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden ligiert, um rekombinante DNA zu erhalten.
Als die Vektor-DNA, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird eine Plasmidvektor-DNA bevorzugt, und es können zum Beispiel pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399 und RSF1010 genannt werden. Außerdem kann auch ein Phagen-DNA-Vektor verwendet werden. Zur effektiven Expression des K-Proteingens kann auch ein Promoter, der in Mikroorganismen funktioniert, wie lac, trp oder PL, verwendet werden. Die rekombinante DNA, auf die hier Bezug genommen wird, kann eine rekombinante DNA umfassen, die durch Integration des K-Proteingens in das Chromosom nach einem Verfahren unter Verwendung eines Transposons (D.E. Berg und C.M. Berg, Bio/Technol., 1 (1983) 417), unter Verwendung eines Mu-Phagen (japanische Offenlegungsschrift 90-109985) oder durch homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972) erhalten wird.
Eine Genbibliothek wird durch Transformation, zum Beispiel von Escherichia coli K-12 und vorzugsweise JM109, mit der vorstehend genannten rekombinanten DNA hergestellt. Ein Verfahren zur Herstellung der Genbibliothek wird ausführlich in Molecular Cloning, zweite Auflage (Cold Spring Harbor Press, 1989, Maniatis et al.) beschrieben. Die Transformation kann nach dem Verfahren von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68 (1979) 326) oder einem Verfahren der Verstärkung der DNA-Durchlässigkeit durch Behandlung von Empfängerzellen mit Calciumchlorid (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53 (1970) 159) durchgeführt werden.
Anschließend wird eine rekombinante DNA, die ein DNA-Fragment enthält, das das K-Proteingen umfaßt, aus der Genbibliothek nach einem Koloniehybridisierungsverfahren isoliert. Die Koloniehybridisierung kann gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das in Molecular Cloning, zweite Auflage (Cold Spring Harbor Press, 1989, Maniatis et al.) beschrieben wird.
Als eine DNA-Sonde, die bei der Koloniehybridisierung verwendet wird, wird eine synthetische DNA mit einer Basensequenz, die aus der Aminosäuresequenz des gereinigten K-Proteins abgeleitet ist, verwendet. Zum Beispiel kann als bevorzugt ein 30-meres Oligonucleotid mit der Sequenz 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3' (SEQ ID NO: 3), das unter Verwendung eines von Applied Biosystems Co. hergestellten DNA-Syntheseautomaten hergestellt wird, genannt werden. Bei der Bestimmung der Sequenz führt das Vorhandensein mehrerer Codons, die einer Art von Aminosäurerest entsprechen, zu erheblichen Problemen. Im Hinblick darauf wird die Sequenz durch Auswahl einer Region, in der der Grad der Degeneriertheit der Codons, die den einzelnen Aminosäuren entsprechen, klein ist, oder durch Bezugnahme auf die Codonnutzung der Gattung Brevibacterium, bestimmt. Oligonucleotide können nach üblichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten Modell 380B, hergestellt von Applied Biosystems Co., unter Anwendung des Phosphoramidit-Verfahrens (vergleiche Tetrahedron Letters, 22 (1981) 1859) hergestellt werden.
Alternativ dazu kann das K-Proteingen auch durch Amplifizieren der K-Proteingene aus der chromosomalen DNA, die zum Beispiel nach dem Verfahren von H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta., 72 (1963) 619 erhalten wurde, durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion: T.J. White et al., Trends Genet., 5 (1989) 185) erhalten werden. Für die PCR verwendete DNA- Primer sind komplementär zu Sequenzen beider 3'-Enden der doppelsträngigen DNA unter Einschluß des gesamten oder einer Teilregion des K-Proteingens. Für den Fall, daß nur eine Teilregion des K-Proteingens amplifiziert wird, ist es erforderlich, das DNA-Fragment unter Einschluß des gesamten K-Proteingens aus der Genbibliothek unter Verwendung des vorstehend genannten DNA-Fragments als Sonde abzusuchen. Für den Fall der Amplifikation des gesamten Gens können DNA-Fragmente unter Einschluß des K-Proteingens durch Trennung des PCR-Reaktiongemisches durch Agarosegel- Elektrophorese und Ausschneiden der Bande, die das gewünschte DNA-Fragment enthält, aus dem Agarosegel gewonnen werden.
Als DNA-Primer wird eine synthetische DNA mit einer Basensequenz, die von der Aminosäuresequenz des gereinigten K-Proteins abgeleitet ist, verwendet. Bei der Bestimmung der Sequenz führt das Vorhandensein einer Mehrzahl von Codons, die einer Art von Aminosäurerest entsprechen, zu erheblichen Problemen. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache wird die Sequenz durch Auswahl einer Region, in der der Grad der Degeneriertheit der Codons, die den einzelnen Aminosäuren entsprechen, klein ist, oder durch Berücksichtigung der Codonnutzung der Gattung Brevibacterium bestimmt. Die DNA kann entsprechend einem üblichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten Modell 380B, der von Applied Biosystems Co. hergestellt wird, und unter Anwendung des Phosphoramidit-Verfahrens synthetisiert werden. Die PCR-Reaktion kann unter Verwendung der Vorrichtung DNA Thermal Cycler Modell PJ2000, hergestellt von Takara Shuzo Co., unter Verwendung einer Taq-DNA-Polymerase entsprechend dem vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt werden.
Das DNA-Fragment, das das gesamte K-Proteingen oder eine Teilregion des K-Proteingens enthält und durch die PCR-Reaktion amplifiziert worden ist, wird an eine Vektor-DNA ligiert, die zur Replikation in Zellen von Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, befähigt ist, um eine rekombinante DNA zu bilden. Anschließend wird die rekombinante DNA in die Zellen von Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, eingeführt. Die Vektor-DNA und das Transformationsverfahren, die hier verwendet werden, sind identisch zu denen, die vorstehend beschrieben wurden. Im Fall der Amplifikation nur einer Teilregion des K-Proteingens kann ein DNA- Fragment, das das gesamte K-Proteingen enthält, aus der Genbibliothek unter Verwendung des vorstehend erwähnten DNA-Fragments als Sonde isoliert werden. Als Verfahren zur Isolierung kann das vorstehend beschriebene Koloniehybridisierungsverfahren angewandt werden.
Ob das isolierte DNA-Fragment, das das K-Proteingen enthält, tatsächlich das K-Proteingen enthält oder nicht, wird durch Nucleotidsequenzierung des DNA-Fragments unter Verwendung der synthetischen DNA, die für die Koloniehybridisierung oder die PCR als Primer verwendet wurde, und Untersuchung, ob die bestimmte Nucleotidsequenz für die vorstehend erwähnte Aminosäuresequenz codiert, festgestellt. Die Nucleotidsequenz kann nach dem Didesoxyverfahren bestimmt werden (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, 1989, Maniatis et al.).
Ob das K-Protein das neue Zelloberflächenschichtprotein, das zur Aufnahme von Nährstoffen bei coryneformen Bakterien beiträgt, ist oder nicht, kann durch Herstellung eines K-Protein-defizienten Stamms und Messung der Aktivität des K-Protein-defizienten Stamms hinsichtlich der Aufnahme von Ammoniumionen untersucht werden. Es wird dann festgestellt, daß der numerische Wert eine bemerkenswerte Verringerung im Vergleich mit der Ammoniumionenaufnahmeaktivität eines K-Protein aufweisenden Stamms zeigt.
Es werden nachstehend eine rekombinante DNA, die durch Ligation des DNA-Fragments, das das K-Proteingen enthält, mit einem Vektor, der zur autonomen Replikation in Zellen von coryneformen Bakterien befähigt ist, erhalten wird, eine Transformante von coryneformen Bakterien, die durch Einführung und Amplifikation des DNA-Fragments in die Zellen erhalten wird, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch ein Fermentationsverfahren, das das Kultivieren der vorstehend genannten Transformante mit einer Produktivität für L-Aminosäuren, die Bildung und Anreicherung der L-Aminosäuren in dem Kulturmedium und die Gewinnung der L- Aminosäuren aus dem Kulturmedium umfaßt, erläutert.
Die coryneformen Bakterien, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, zum Beispiel Mikroorganismen, die zu Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (8. Auflage, Seite 599 (1974)) definiert sind und die bacilliform, aerob, gram-positiv, nicht säurebeständig und asporogen sind. Von den Mikroorganismen Brevibacterium oder Corynebacterium können die L-Glutaminsäure bildenden Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium oder zur Gattung Corynebacterium gehören und die nachstehend beschrieben werden, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Als Beispiele für Wildtyp-Stämme von Glutaminsäure bildenden Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium oder zur Gattung Corynebacterium gehören, können folgende Stämme genannt werden:
Brevibacterium dibaricatum ATCC 14020
Brevibacterium saccharoriticum ATCC 14066
Brevibacterium immariofilm ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium flabum ATCC 13826
Brevibacterium thiogenetallis ATCC 19240
Brevibacterium acetoacidfilum ATCC 13870
Brevibacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Brevibacterium calnae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 13060
Corynebacterium lilyum ATCC 15990
Corynebacterium meracecola ATCC 17965
Microbacterium ammoniafilum ATCC 15354
Beliebige Vektor-DNA, die in den bakteriellen Zellen von Brevibacterium oder Corynebacterium repliziert werden kann, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Spezielle Beispiele sind nachstehend an gegeben.
(1) pAM 330 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 83-67699
(2) pHM 1519 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 83-77895
(3) pAJ 655 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 83-192900
(4) pAJ 611 dito
(5) pAJ 1844 dito
(6) pCG 1 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 82-134500
(7) pCG 2 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 83-35197
(8) pCG 4 vergleiche japanische Offenlegungsschrift 82-183799
(9) pCG 11 dito
Die Vektor-DNA wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das die Vektor-DNA an einer einzigen Stelle schneidet, oder sie wird partiell mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das die DNA an mehreren Erkennungsstellen schneidet.
Die Vektor-DNA wird mit dem Restriktionsenzym geschnitten, das zum Schneiden des DNA-Fragments, das für das K-Proteingen codiert, verwendet wurde, und mit dem DNA-Fragment ligiert. Wenn die Vektor-DNA mit einem Restriktionsenzym geschnitten wird, das anderen Enden als die des DNA- Fragments, das für das K-Protein codiert, bildet, dann werden Oligonucleotidlinker mit Basensequenzen, die komplementär zu den Enden des linearisierten Vektors sind, mit beiden Enden des DNA-Fragments ligiert, und anschließend wird das mit den Linkern versehene DNA-Fragment mit der Vektor-DNA ligiert.
Die erhaltene rekombinante DNA, in die die Vektor-DNA und das DNA- Fragment, das für das K-Proteingen codiert, ligiert sind, können in Empfänger, die zur Gattung Brevibacterium oder zur Gattung Corynebacterium gehören, nach einem Verfahren der Verstärkung der DNA-Durchlässigkeit durch Behandlung der Empfängerzellen mit Calciumchlorid, wie es für Escherichia coli K-12 angegeben wurde (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53 (1970) 159), oder einem Verfahren der Einführung von DNA in ein exponentielles Stadium der Zellen, so daß die Zellen die DNA aufnehmen können (sogenannte kompetente Zellen), wie es für Bacillus subtilis angegeben wurde (C.H. Duncan, G.A. Wilson und F.E. Young, Gene 1 (1977) 153), eingeführt werden. Alternativ dazu kann die rekombinante DNA in bakterielle Zellen eingeführt werden, indem die Zellen in Protoplasten oder Sphäroplasten, die imstande sind, die rekombinante DNA ohne weiteres aufzunehmen, umgewandelt werden, wie es für Bacillus subtilis, Actinomyceten und Hefen bekannt ist (S. Chang und S.N. Choen, Molec. Gen. Genet., 168 (1979) 111); M.J. Bibb, J.M. Ward und O.A. Hopwood, Nature, 274 (1978) 398; A. Hinnen, J.B. Hicks und G.R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978) 1929).
Bei dem Protoplastenverfahren kann eine ausreichend hohe Transformationshäufigkeit auch nach einem Verfahren erzielt werden, das für Bacillus subtilis angewandt wird, wie es vorstehend beschrieben wurde, und ein Verfahren der Einführung der DNA in die Protoplasten von Corynebacterium oder Brevibacterium in Gegenwart von Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol und zweiwertigen Metallionen, wie es in der japanischen Offenlegungsschrift 82-183799 offenbart wird, kann selbstverständlich angewandt werden. Eine ähnliche Wirkung kann auch nach einem Verfahren der Förderung der Aufnahme der DNA erzielt werden, zum Beispiel durch Zugabe von Carboxymethylcellulose, Dextran, Ficoll oder Bulronic F68 (hergestellt von Selba Co.) anstelle von Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol.
Ferner kann die rekombinante DNA in die Empfängerbakterien, die zur Gattung Brevibacterium oder zur Gattung Corynebacterium gehören, auch nach einem elektrischen Pulsverfahren (sogenannte Elektroporation) eingeführt werden (Sugimoto et al., japanische Offenlegungsschrift 90-207791).
Eine L-Aminosäuren bildende Transformante, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde und die rekombinante DNA, die das DNA-Fragment enthält, das für das K-Protein codiert, umfaßt, wird kultiviert, und die gewünschte L-Aminosäure wird gebildet und im Kulturmedium angereichert, das dann gewonnen wird.
Das Kulturmedium für die L-Aminosäureherstellung, das hier verwendet wird, ist ein übliches Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls weitere organische Bestandteile enthält.
Als die Kohlenstoffquelle können Saccharide, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose oder Stärkehydrolysate, Alkohole, wie Glycerin oder Sorbit, und organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, verwendet werden.
Als die Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organische Stickstoffverbindungen, wie Sojabohnenhydrolysate, gasförmiges Ammoniak und Ammoniumhydroxid verwendet werden.
Als organische Mikronährstoffe werden dem Kulturmedium vorzugsweise erforderliche Substanzen, wie Vitamin B1 oder Hefeextrakt, in geeigneten Mengen zugesetzt. Außerdem werden gegebenenfalls kleine Mengen an Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugesetzt.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen für 16 bis 72 Stunden durchgeführt, während die Kultivierungstemperatur auf 30ºC bis 45ºC und der pH-Wert während der Kultivierung auf 5 bis 7 eingestellt werden. Anorganische oder organische saure oder alkalische Substanzen, zum Beispiel gasförmiges Ammoniak und dergleichen, können zur pH-Einstellung verwendet werden. Die L-Aminosäure kann aus der Fermentationsflüssigkeit durch eine Kombination eines üblichen Ionenaustauschharzverfahrens, eines Fällungsverfahrens und anderer bekannter Verfahren gewonnen werden.
Nebenbei bemerkt sind coryneforme Bakterien Mikroorganismen, die L- Aminosäuren in großen Mengen bilden, und sie werden allgemein für die Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentationsverfahren eingesetzt. Außerdem wird auch die große Sekretionsfähigkeit der coryneformen Bakterien für die Herstellung verschiedener Materialien genutzt.
Da angenommen wird, daß das K-Protein in der Zelloberflächenschicht vorhanden ist und zur Aufnahme von Nährstoffen ins Cytoplasma beiträgt, wird angenommen, daß, wenn eine Transformante von coryneformen Bakterien, die durch Einführung und Replikation von DNA-Fragmenten, die das K-Proteingen enthalten, in die Zelle erhalten wird, eine Produktivität für eine nützliche Substanz aufweist, ein Verfahren zur Herstellung der nützlichen Substanz durch ein Fermentationsverfahren, das das Kultivieren der Transformante in einem Kulturmedium, die Bildung und Anreicherung der nützlichen Substanz in dem Kulturmedium und die Gewinnung der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium umfaßt, ebenfalls verbessert werden kann.
Das vorstehend genannte Verfahren zur Herstellung der nützlichen Substanz ist identisch mit dem Aminosäure-Herstellungsverfahren, das vorstehend im Hinblick auf einen Hauptteil beschrieben wurde.
Die nützliche Substanz, auf die hier Bezug genommen wird, umfaßt Nucleinsäuren als Rohmaterialien für Gewürze. Die coryneformen Bakterien, die Nucleinsäuren bilden, umfassen zum Beispiel Corynebacterium equi AJ 11347, wie es in dem japanischen Patent 82-22558 offenbart ist.
Andererseits bedeutet die nützliche Substanz Fremdproteine. Es können physiologisch aktive Substanzen, wie Humaninterferon, Humaninterleukin oder humane Hormone, Enzyme oder Antikörper, genannt werden. Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen unter Verwendung von Mikroorganismen sind hauptsächlich für die Bakterien Escherichia oder Bacillus bekannt, und ähnliche Techniken sind auch für coryneforme Bakterien entwikkelt worden. Die Technik umfaßt im wesentlichen die Herstellung einer rekombinanten DNA durch Ligation eines Vektors, der zur autonomen Replikation in den Zellen der coryneformen Bakterien befähigt ist, mit einem Promotor, der in den Zellen von coryneformen Bakterien wirken kann, und einem DNA-Fragment, das für das Fremdprotein codiert, die Einführung der rekombinanten DNA in die coryneformen Bakterien und die Herstellung des Proteins durch Expression der DNA, die für das Protein auf der rekombinanten DNA codiert. Die Technologie wird zum Beispiel in den japanischen Offenlegungsschriften 87-151184 und 87-244382 offenbart.

(2) K-Protein-defizienter Stamm und Verfahren zur Herstellung von L- Aminosäuren unter Verwendung des Stamms

Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde festgestellt, daß das K-Protein, das zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung aufgefunden wurde, zur Aufnahme von Nährstoffen von coryneformen Bakterien beiträgt, und es wird ferner durch die vorliegende Erfindung offenbart, daß das K-Protein auch zur Aggregation von bakteriellen Zellen beiträgt und daß coryneforme Bakterien, denen das K-Protein fehlt, Aggregationseigenschaften zeigen.
Ein K-Protein-defizienter Stamm wird erhalten, indem eine solche Mutation, daß im wesentlichen kein K-Protein gebildet wird, an dem K-Proteingen, zum Beispiel von Brevibacterium lactofermentum, bewirkt wird. Alternativ dazu kann ein spontan mutierter Stamm mit einer solchen Mutation, daß im wesentlichen kein K-Protein gebildet wird, aus der Natur selektiert werden.
Ferner kann ein K-Protein-defizienter Stamm auch durch Zerstörung des K-Proteingens durch homologe Rekombination zwischen einem DNA-Fragment, das mindestens einen Abschnitt eines Gens enthält, das für das K- Protein codiert, und dem K-Proteingen auf dem Chromosom erhalten werden.
Ferner wird angenommen, daß auch coryneforme Bakterien, die von Brevibacterium lactofermentum verschieden sind, ein Protein, das identisch mit oder im wesentlichen identisch mit dem K-Protein ist (nachstehend als »K-Protein-ähnliches Protein« bezeichnet) in der Zelloberflächenschicht aufweisen. Zum Beispiel beschreibt die Druckschrift WO 93/03158 ein neues Zelloberflächenschichtprotein, das dem K-Protein der vorliegenden Erfindung ähnlich ist, davon jedoch klar unterschieden werden kann.
Es ist zu erwarten, daß ein derartiges K-Protein-ähnliches Protein ebenfalls zur Aufnahme von Nährstoffen oder zu den Aggregationseigenschaften von bakteriellen Zellen beiträgt und daß coryneforme Bakterien, denen das K-Protein-ähnliche Protein fehlt, ebenfalls Aggregationseigenschaften aufweisen.
Coryneforme Bakterien, denen das K-Protein-ähnliche Protein fehlt, können in der gleichen Weise wie der K-Protein-defiziente Stamm erhalten werden, indem eine solche Mutation, daß im wesentlichen kein K-Proteinähnliches Protein gebildet wird, an dem K-Protein-ähnlichen Proteingen vorgenommen wird. Ferner kann ein spontan mutierter Stamm mit einer solchen Mutation, daß im wesentlichen kein K-Protein-ähnliches Protein gebildet wird, aus der Natur selektiert werden. Ferner können coryneforme Bakterien, denen das K-Protein-ähnliche Protein fehlt, auch erhalten werden, indem das Gen, das für das K-Protein-ähnliche Protein codiert, durch homologe Rekombination zwischen einem DNA-Fragment, das mindestens einen Abschnitt eines K-Protein-Gens enhält, und einem Gen, das für das K-Protein-ähnliche Protein auf dem Chromosom codiert und das homolog zu dem DNA-Fragment ist, zerstört wird.
Es wird nun ein Verfahren beschrieben, um einen K-Protein-defizienten Stamm zu erhalten. In der folgenden Beschreibung kann, wenn das K- Protein durch das K-Protein-ähnliche Protein ersetzt wird, ein Stamm, dem das K-Protein-ähnliche Protein fehlt, in der gleichen Weise erhalten werden.
Eine Mutation, so daß im wesentlichen kein K-Protein gebildet wird, kann an dem K-Proteingen durch Anwendung eines üblichen Verfahrens bewirkt werden, bei dem eine künstliche Mutation bei Mikroorganismen bewirkt wird, wie UV-Bestrahlung oder Behandlung mit einem mutagenen Mittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG).
Als ein Verfahren zur Selektion eines K-Protein-defizienten Stamms aus coryneformen Bakterien, die der Mutagenese unterzogen wurden, kann zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung eines anti-K-Protein-Antikörpers, zum Beispiel ein Western-Blot-Verfahren, genannt werden. Genauer gesagt werden Kolonien von mutierten coryneformen Bakterien auf einer Membran, wie einer Nylonmembran, die auf einer Agarmediumplatte angeordnet ist, um das zelluläre Protein auf der Membran zu fixieren, gebildet. In diesem Fall wird eine replizierte Platte auf einer getrennten Agarmediumplatte hergestellt, so daß eine 1:1-Übereinstimmung mit den Kolonien auf der Membran erzielt wird. Wenn dann die Membran nacheinander in Lösungen, die einen anti-K-Protein-Antikörper, einen Enzym-markierten zweiten Antikörper gegen eine Immunglobulinfraktion des immunisierten Tiers, das für die Herstellung des anti-K-Protein-Antikörpers verwendet wurde, bzw. Farbstoffe, die eine Farbe durch eine enzymatische Reaktion, die durch das markierende Enzym hervorgerufen wird, enthalten, getaucht und anschließend inkubiert wird, dann entwickelt sich eine Farbe an einer Position, an der das Zellprotein der K-Protein enthaltenden Bakterien fixiert ist. Dementsprechend können K-Protein-defiziente Bakterien selektiert werden, indem die Kolonie identifiziert wird, die keine Farbentwicklung des Farbstoffs herruft, und indem die Kolonie von der replizierten Platte, die dieser Kolonie entspricht, isoliert wird. Es ist bevorzugt, wenn eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese für die Proteine der Zelloberflächenschichtfraktion des auf diese Weise selektierten K-Protein-defizienten Stamms durchgeführt wird, um zu bestätigen, daß im wesentlichen kein K-Protein exprimiert wird.
Der anti-K-Protein-Antikörper wird durch Immunisierung eines Tiers, wie einer Maus, unter Verwendung des K-Proteins, das aus der Zelloberflächenschichtfraktion von Brevibacterium lactofermentum hergestellt wurde, wie es vorstehend unter (1) angegeben wurde, in der gleichen Weise wie bei einem üblichen Präperationsverfahren für Immunisierung und Blutgewinnung erhalten. Es ist auch möglich, einen monoclonalen anti-K-Protein-Antikörper, der durch Fusion von Milzzellen eines Tiers, das mit dem K-Protein immunisiert wurde, und von Kulturzellen mit einer kontinuierlichen Wachstumsaktivität, wie Mausmyelomzellen, zur Herstellung von Hybridomzellen und Kultivieren der resultierenden Hybridomzellen erhalten wird, zu verwenden.
Der Enzym-markierte zweite Antikörper wird durch Bildung einer kovalenten Bindung zwischen einem Enzym, wie β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, und einem anti-Immunglobulin-Antikörper gegen eine Immunglobulinfraktion des immunisierten Tiers, das zur Herstellung des anti-K-Protein-Antikörpers herangezogen wurde, erhalten. Enzym-markierte Antikörper gegen Immunglobuline verschiedener Arten von Tieren sind kommerziell erhältlich und können verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren zur Selektion von K-Protein-defizienten Stämmen aus mutierten coryneformen Bakterien wird erläutert. Eine Zelloberflächenschichtfraktion wird nach dem vorstehend unter (1) beschriebenen Verfahren für jede Zelle, die einer Einzelkolonie-Isolierung unterzogen wurde, hergestellt, und die erhaltene Zelloberflächenschichtfraktion wird einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Ein Stamm, für den keine K-Proteinbande nahe dem Molekulargewicht von etwa 63000 nachgewiesen wird, ist der K-Protein-defiziente Stamm. Das Verfahren ist zwar überaus zeitaufwendig, es ist jedoch günstig, es für die zweite Screening-Stufe anzuwenden, da damit zuverlässig ein K-Protein-defizienter Stamm selektiert werden kann.
Nach dem gleichen Verfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, kann ein mutierter Stamm mit einer Mutation, so daß im wesentlichen kein K-Protein gebildet wird, aus der Natur selektiert werden.
Es wird nun ein Verfahren erklärt, um einen K-Protein-defizienten Stamm oder einen K-Protein-ähnliches Protein-defizienten Stamm durch Genunterbrechung zu erhalten. Eine DNA, die ein DNA-Fragment enthält, das einen Abschnitt des K-Proteingens enthält, wird in eine Zelle von coryneformen Bakterien eingeführt, und eine homologe Rekombination wird zwischen dem DNA-Fragment, das einen Abschnitt des K-Proteingens enthält, und einer DNA-Sequenz auf dem Chromosom, die identisch oder homolog zu dem DNA-Fragment ist, bewirkt, womit es ermöglicht wird, das K-Proteingen oder das K-Protein-ähnliche Proteingen auf der chromosomalen DNA zu unterbrechen, so daß die Bildung des K-Proteins oder des K-Protein-ähnlichen Proteins verhindert wird. Eine schematische Darstellung des Mechanismus der Genunterbrechung ist in Fig. 1 gezeigt.
Genauer gesagt wird ein DNA-Fragment, das einen Abschnitt des K-Proteingens enthält, mit einer Vektorplasmid-DNA ligiert, um ein Plasmid für die Genunterbrechung herzustellen. Das Plasmid für die Genunterbrechung wird in coryneforme Bakterien, wie Brevibacterium lactofermentum, eingeführt, wobei man eine Transformante erhält, und zwar nach einem Verfahren der Verstärkung der DNA-Durchlässigkeit durch Behandlung der Empfängerzellen mit Calciumchlorid, wie es für Escherichia K-12 beschrieben wurde (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53 (1970) 159), einem Verfahren der Einführung von DNA in Zellen im Wachstumsstadium, so daß die Zellen die DNA einbauen können, wie es für Bacillus subtilis angegeben wurde (sogenannte kompetente Zellen) (C.H. Duncan, G.A. Wilson und F.E. Young, Gene, 1 (1977) 153), einem Verfahren der Umwandlung des DNA-Empfängers in einen Protoplasten oder Sphäroplasten, der zur einfachen Aufnahme von DNA und zur Einführung des rekombinanten Plasmids in die DNA des Empfängers imstande ist, wie es für Bacillus subtilis, Actinomyceten und Hefen bekannt ist (S. Chang uns S.N. Choen, Molec. Gen. Genet., 168 (1979) 111; M.J. Bibb, J.M. Ward und O.A. Hopwood, Nature, 274 (1978) 398; A. Hinnen, J.B. Hicks und G.R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978) 1929) oder einem elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., japanische Offenlegungsschrift 90-207791) in der gleichen Weise, wie es vorstehend unter (1) beschrieben wurde.
Es ist bevorzugt, als ein Vektorplasmid, das für die Herstellung des Plasmids für die Genunterbrechung verwendet wird, einen Vektor mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung, zum Beispiel pHSC4 (Sugimoto et al., französische Offenlegungsschrift 2667875/1992) zu verwenden und die resultierende Transformante bei einer die Replikation hemmenden Temperatur zu kultivieren. Dies kann eine autonome Replikation des Plasmids außerhalb des Chromosoms in der Zelle verhindern und bewirken, daß die Transformante, bei der das Plasmid in die chromosomale DNA eingebaut ist, bevorzugt wächst. Ferner ist es, um die Selektion der Transformante zu erleichtern, günstig, ein solches Vektorplasmid zu verwenden, das ein Markergen enthält, zum Beispiel ein Arzneimittelresistenzgen.
Wenn das coryneforme Bakterium, in das das Plasmid für die Genunterbrechung eingeführt worden ist, in einem Kulturmedium, das ein Arzneimittel, das dem Markergen entspricht, enthält, kultiviert wird, und zwar vorzugsweise bei einer die Replikation hemmenden Temperatur, dann kann nur eine Transformante, bei der das Plasmid in das Chromosom integriert ist, wachsen. Bei einer derartigen transformierten Zelle ist das Plasmid für die Genzerstörung in das K-Proteingen auf dem Chromosom durch homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment, das einen Abschnitt des K- Proteingens enthält und das in dem Plasmid für die Genzerstörung enthalten ist, und dem K-Proteingen oder dem K-Protein-ähnlichen Proteingen auf dem Chromosom integriert, und demzufolge ist das chromosomale K-Proteingen wahrscheinlich unterbrochen. Ob einer auf diese Weise erhaltenen Transformante das K-Protein fehlt oder nicht, kann untersucht werden, indem die Zelloberflächenschichtfraktion der Transformanten einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen wird. Es kann ferner auch durch die erforderlichen Aggregationseigenschaften der transformierten Zellen untersucht werden.
Als coryneforme Bakterien, die mutiert werden sollen, um den K-Protein-defizienten Stamm zu erhalten, oder bei denen das K-Proteingen unterbrochen werden soll, können Mikroorganismen von Brevibacterium oder Corynebacterium genannt werden, wie sie vorstehend unter (1) angegeben wurden.
Es wird nun ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren beschrieben, das folgendes umfaßt: Kultivieren von coryneformen Bakterien mit einer Aktivität zur Bildung einer L-Aminosäure, Bildung und Anreicherung der L-Aminosäure in dem Kulturmedium und Gewinnung der L-Aminosäure aus dem Kulturmedium, wobei den coryneformen Bakterien das K-Protein oder K-Protein-ähnliche Protein fehlt, wobei das Verfahren ferner die Stufe des Stehenlassens des Kulturmediums nach Abschluß der Kultivierung und der dabei erfolgenden Ausfällung der Zellen der coryneformen Bakterien umfaßt.
Coryneforme Bakterien mit einer Aktivität zur Bildung der L-Aminosäure, denen das K-Protein oder K-Protein-ähnliche Protein fehlt, werden kultiviert, und die gewünschte L-Aminosäure wird gebildet und im Kulturmedium angereichert. Das Kulturmedium, das für die Herstellung der L-Aminosäure verwendet wird, ist ein übliches Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls weitere organische Bestandteile enthält.
Als die Kohlenstoffquelle können zum Beispiel Saccharide, wie Rübenmelasse, Zuckerrohrmelasse, Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysate, Alkohole, wie Glycerin und Sorbit, sowie organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, verwendet werden.
Als die Stickstoffquelle können zum Beispiel anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organische Stickstoffverbindungen, wie Sojabohnenhydrolysate, gasförmiges Ammoniak und Ammoniumhydroxid verwendet werden.
Als organische Mikronährstoffquelle werden dem Kulturmedium zweckmäßigerweise geeignete Mengen an erforderlichen Substanzen, wie Vitamin B1 oder Hefeextrakt, zugesetzt. Außerdem werden bei Bedarf kleine Mengen an Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen und Manganionen dem Kulturmedium zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen für 16 bis 72 Stunden, während die Kultivierungstemperatur auf 30ºC bis 45ºC und der pH-Wert bei der Kultivierung auf 5 bis 7 eingestellt werden. Zur Einstellung des pH-Werts können organische oder anorganische saure oder alkalische Substanzen und ferner gasförmiges Ammoniak verwendet werden.
Da die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Kultivierungsbedingungen einen Einfluß auf die Aggregationseigenschaften der bakteriellen Zellen haben können, werden Bedingungen, die für den K-Protein-defizienten Stamm geeignet sind, in zweckmäßiger Weise gewählt.
Nach Ablauf der Kultivierung läßt man dann das Kulturmedium stehen, und aggregierte bakterielle Zellen werden gefällt, so daß sie von dem Kulturüberstand getrennt werden. Der Kulturüberstand und die bakteriellen Zellen können getrennt werden, indem der Überstand so gewonnen wird, daß die gefällten bakteriellen Zellen nicht hinein geraten. Ferner kann ein Zellabtrennverfahren durch eine übliche Zentrifugaltrennung oder Filtration durchgeführt werden, und das Abtrennverfahren wird erleichtert, da die bakteriellen Zellen aggregiert sind.
Nach der Abtrennung der bakteriellen Zellen kann die L-Aminosäure aus dem Fermentationsmedium durch eine Kombination von üblicher Ionenaustauschchromatographie, einem Fällungsverfahren und anderen bekannten Verfahren gewonnen werden. Eine basische Aminosäure, wie L-Lysin, wird üblicherweise durch Kationenaustauschchromatographie nach Einstellung des pH- Werts der Fermentationslösung auf etwa 4 gereinigt. Da bei dem erfindungsgemäßen K-Protein-defizienten Stamm ferner die Aggregationseigenschaften bei einem pH-Wert von etwa 4 verstärkt sind, kann, wenn die Zellfällungsstufe nach der pH-Werteinstellung durchgeführt wird, die Fällung in einer kürzeren Zeitspanne abgeschlossen werden, was eine wirksamere Abtrennung der bakteriellen Zellen ermöglicht. Ferner können die Kulturüberstände, die von den bakteriellen Zellen abgetrennt sind, direkt durch die Ionenaustauschharzsäule geleitet werden.
Die vorliegende Erfindung zeigt, daß das K-Protein zu den Aggregationseigenschaften der Zellen beiträgt, und dieses Konzept ist auch auf eine Zellentfernungsstufe bei der Weiterverarbeitung in der Fermentationsindustrie, die sich nicht auf die Herstellung von L-Aminosäuren bezieht, auf einen Bioreaktor mit Zellrückführung und ferner auf die Verbesserung der Fällung von aktiven Schlammbakterien selbst in der Fermentationsindustrie, die sich nicht auf L-Aminosäuren bezieht, anwendbar.
Wenn zum Beispiel den coryneformen Bakterien, die eine Aktivität zur Bildung einer nützlichen Substanz haben, das K-Protein oder das K-Protein-ähnliche Protein fehlt und sie Zellaggregationseigenschaften aufweisen, dann ermöglicht dies die Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung der nützlichen Substanz durch ein Fermentationsverfahren, das das Kultivieren der Bakterien in einem Kulturmedium, die Bildung und Anreicherung der nützlichen Substanz in dem Kulturmedium und die Gewinnung der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium umfaßt. Dies hat seinen Grund darin, daß der Zellabtrennschritt auch bei diesen Herstellungsverfahren wesentlich ist.
Der Zellabtrennschritt wird also in der gleichen Weise wie bei dem Aminosäureherstellungsverfahren, das vorstehend beschrieben wurde, bei einem Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz durch ein Fermentationsverfahren, das das Kultivieren von coryneformen Bakterien mit einer Aktivität zur Bildung der nützlichen Substanz, die Bildung und Anreicherung der nützlichen Substanz in einem Kulturmedium und die Gewinnung der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium umfaßt, wobei den coryneformen Bakterien das K-Protein oder K-Protein-ähnliche Protein fehlt und sie Zellaggregationseigenschaften aufweisen, und das ferner eine Stufe des Stehenlassens des Kulturmediums nach dem Ablauf der Kultivierung, wobei die Zellen der coryneformen Bakterien gefällt werden, umfaßt, erleichtert.
Die nützliche Substanz, auf die hier Bezug genommen wird, umfaßt eine Nucleinsäure als ein Ausgangsmaterial für Gewürze. Die coryneformen Bakterien, die Nucleinsäuren bilden, umfassen zum Beispiel Corynebactenum equi AJ 11347, wie es im japanischen Patent 82-22558 offenbart ist.
Ferner umfaßt die nützliche Substanz auch Fremdproteine. Es können also physiologisch aktive Substanzen, wie Humaninterferon oder Humaninterleukin, Enzyme oder Antikörper genannt werden. Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen unter Verwendung von Mikroorganismen sind hauptsächlich für Bakterien, die zur Gattung Escherichia oder zur Gattung Bacillus gehören, bekannt, und eine ähnliche Technologie ist auch für coryneforme Bakterien entwickelt worden. Diese Technik umfaßt im wesentlichen die Ligation eines Vektors, der zur autonomen Replikation in den Zellen der coryneformen Bakterien imstande ist, mit einem Promoter, der in der Zelle der coryneformen Bakterien wirken kann, und einer DNA, die für das Fremdprotein codiert, so daß eine rekombinante DNA gebildet wird, die Einführung der rekombinanten DNA in die coryneformen Bakterien und die Herstellung des Proteins durch die Expression der DNA, die für das Protein auf der rekombinanten DNA codiert. Diese Technik ist zum Beispiel in der japanischen Offenlegungsschrift 87-151184 offenbart.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Schematische Darstellung der Genunterbrechung durch homologe Rekombination.
Fig. 2: Beitrag des K-Proteins zur Aufnahme von Ammoniumionen.
O K-Protein-suffizienter Stamm (AECr2256)
K-Protein-suffizienter Stamm (AECr 22556), CCCP (Carbonylcyanid-m- chlorphenylhydrazin) zugegeben
K-Protein-defizienter Stamm (AJ 12760)
K-Protein-defizienter Stamm (AJ 12760), CCCP zugegeben
Fig. 3: Diagramm, daß den Fällungsgrad des K-Protein-defizienten Stamms und des Stamms mit K-Protein zeigt (Kohlenstoffquelle: Glucose; Kulturmedium nach Abschluß der Kultivierung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt).
X Stamm 2256 (ATCC 13869)
+ Stamm YSR
Stamm AECr 2256
Δ AJ 12760
AJ 12956
Die vorstehend gezeigten Symbole werden auch für die Figuren 4 bis 6 verwendet.
Fig. 4: Diagramm, das den Fällungsgrad des K-Protein-defizienten Stamms und des Stamms mit K-Protein zeigt (Kohlenstoffquelle Saccharose; Kulturmedium nach Abschluß der Kultivierung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt).
Fig. 5: Diagramm, das den Fällungsgrad des K-Protein-defizienten Stamms und des Stamms mit K-Protein zeigt (Kohlenstoffquelle: Glucose; keine Einstellung des pH-Wertes des Kulturmediums nach Abschluß der Kultivierung).
Fig. 6: Diagramm, das den Fällungsgrad des K-Protein-defizienten Stamms und des Stamms mit K-Protein zeigt (Kohlenstoffquelle: Saccharose; keine Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums nach Abschluß der Kultivierung).

Beste Art der Ausführung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nun konkreter durch Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Neues Zelloberflächenschichtprotein (K-Protein)

(1) Auffinden eines neuen Zelloberflächenschichtproteins

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde einer Schüttelkultur über Nacht bei 30ºC in einem CM2G-Kulturmedium (Hefeextrakt: 10 g; Bactotrypton: 10 g; Glucose: 5 g; NaCl: 5 g; mit Wasser auf 1 l aufgefüllt) unterzogen, und Zellen wurden aus 1 ml Kulturbrühe gewonnen. Nach Waschen mit einer Pufferlösung A (50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert: 8,0, 10 mM Magnesiumsulfat) wurden die Zellen in 1 ml Pufferlösung A suspendiert, eingefroren und aufgetaut, und die Zellen wurden mit einer Vorrichtung Supersonicator (OHTAKE 5202PZT) aufgebrochen, während sie bei 0ºC gehalten wurden. Anschließend wurde das Zell-Lysat bei 12000xg für 1 min bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen. Der erhaltene Überstand wurde erneut bei 10000xg für 30 min bei 4ºC zentrifugiert, und die ausgefällten Materialien wurden als Zelloberflächenschichtfraktionen gewonnen. Von diesen Fraktionen wurde ein Anteil, der 5 x 10&sup9; Zellen entsprach, einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Als Ergebnis wurde eine Proteinbande, die in einer großen Menge vorhanden war, nahe dem Molekulargewicht von etwa 63000 gefunden, und dieses Protein wurde als K-Protein bezeichnet.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erwartet, daß das Zelloberflächenschichtprotein eine Funktion aufweist, die zur Aufnahme von Nährstoffen von der Außenseite der bakteriellen Zelle beiträgt, und die folgenden Experimente durchgeführt.

(2) Reinigung des K-Proteins

Zunächst wurde eine Zelloberflächenschichtfraktion nach dem Verfahren hergestellt, wie es vorstehend unter (1) beschrieben wurde. Die Zelloberflächenschichtfraktion enthielt sowohl cytoplasmatische Membranen als auch Zellwände. Anschließend wurde versucht, sie durch Solubilisierung der cytoplasmatischen Membranen unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels aufzutrennen. Als Ergebnis einer ausführlichen Untersuchung hinsichtlich der Art und Konzentration des oberflächenaktiven Mittels, der Zeit und der Temperatur für die Solubilisierung, des Einflusses der Zugabe von Glycerin und des Einflusses der Zugabe von NaCl konnte das K- Protein nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren gereinigt werden. 3 ug einer Zelloberflächenschichtfraktion des Proteins (die quantitative Bestimmung erfolgte mit Hilfe des BC-Protein-Assay-Reagenzsatzes, der von BioRad Co. Hergestellt wird) wurden in 1 ml einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 1,25% (Gew./Vol.) SDS (50 mM Kaliumphosphat, pH-Wert: 8, 0,1 mM Dithiothreit) suspendiert, und die Suspension wurde für 1 Stunde bei 37ºC gehalten. Anschließend wurde die Suspension bei 145000xg für 30 min zentrifugiert, und das ausgefällte Material wurde gewonnen. Das ausgefällte Material wurde gewonnen, indem es in 50 mM Kaliumphosphat bei einem pH Wert von 8,0 mit einem Gehalt an 0,1% SDS suspendiert wurde, so daß 0,2 ug Protein/ul enthalten waren. Anschließend wurde für 3 min gekocht. 15 ug Protein als im oberflächenaktiven Mittel unlösliche Fraktion wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, und es wurde bestätigt, daß es sich um ein homogenes Protein mit einem Molekulargewicht von 63000 handelt.

(3) Eigenschaften des K-Proteins

(3 - 1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des K-Proteins wurde auf der Basis der Beweglichkeit bei der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese zu etwa 63000 bestimmt.

(3-2) Bestimmung von partiellen Aminosäuresequenzen

Das nach dem vorstehend unter (2) beschriebenen Verfahren gereinigte K-Protein wurde in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,3, 0,1% SDS suspendiert, so daß eine Konzentration von 200 ug Protein/ml erzielt wurde, und durch Kochen für 5 min solubilisiert. Nach Abkühlen wurde Endoprotease Lys-C zu der Lösung gegeben, so daß das Verhältnis von Protein als die im oberflächenaktiven Mittel unlösliche Fraktion und von Lys-C 50:1 (Gew./Gew.) betrug, und es wurde bei 37ºC für 3 Stunden inkubiert.
Für die K-Protein-Lösung, die einem begrenzten Verdau unter Verwendung von Lys-C unterzogen wurde, wurde ein Anteil, der 500 pMol K-Protein entsprach, durch Umkehrphasenchromatographie fraktioniert. Die verwendete Säule war Senshu Pac VP-318-1251 4,6 ∅ x 250 mm. Die Elution wurde mit einem CH&sub3;CN-Gradienten (24% Ch&sub3;CN, 0,1% TFA - 66% CH&sub3;CN, 0,1% TFA) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Von den Fraktionen des Eluenten wurde die Aminosäuresequenz für 2 Fraktionen mit hohem Peptidgehalt (Fraktionen, die bei 55,7 - 57,0% CH&sub3;CN und 59,3 - 60,5% CH&sub3;CN eluiert wurden) unter Verwendung der Vorrichtung Gas Phase Sequencer 470-A, hergestellt von Applied Biosystems Co., bestimmt. Die Aminosäuresequenz wurde nach dem Verfahren entsprechend der Anleitung des Herstellers Applied Biosystems Co. bestimmt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, daß das K-Protein die beiden folgenden Sequenzen im Molekül aufweist, d.h.
(1) Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala- Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu- Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr (SEQ ID NO: 1) und
(2) Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr- Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys (SEQ ID NO: 2).

Beispiel 2: Isolierung des K-Proteingens

(1) Herstellung einer Genbibliothek

Chromosomale DNA wurde aus Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869) nach dem Verfahren von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., 8278 (1963) 619-629) hergestellt. 2 Einheiten Sau3AI wurden zu etwa 50 ug der chromosomalen DNA gegeben, und es erfolgte ein partieller Verdau, indem die Temperatur bei 37ºC für 40 min gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Saccharosegradienten (10%-40%) bei 120000xg für 26 Stunden zentrifugiert, um die DNA-Fragmente zu fraktionieren.
Fraktionen von etwa 1500 bis 6000 bp wurden gewonnen (Volumen: 1,5 ml) und bei 4ºC gegen TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert: 8,0) dialysiert. Der »Seamless Cellulose Tubing Size 8/32«, hergestellt von Sanko Junyaku Co., wurde als Dialyseschlauch verwendet. Die Dialyse wurde für 4 Stunden gegen 2 l Puffer und für weitere 2 Stunden nach Austausch des Puffers durchgeführt.
Nach der Dialyse wurde die chromosomale DNA-Fraktion von 1500 bis 6000 bp mit 2-Butanol gemäß einem Verfahren von Maniatis et al. (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, 1989, Maniatis et al.) extrahiert, und anschließend wurden die DNA-Fragmente an den Vektor pSTV28, der zuvor mit BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co.) geschnitten worden war, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligiert. Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co.) wurde mit dem erhaltenen Ligationsgemisch entsprechend der Anleitung des Herstellers Takara Shuzo Co. transformiert, wobei man eine Genbibliothek erhielt, die aus etwa 5000 Clonen bestand. Es wurde berücksichtigt, daß ein Wirt, der einen Vektor enthält, in dem das K-Proteingenfragment doniert ist, abstirbt, wenn das K-Proteingen in einem hohen Grad exprimiert wird; daher wurde der Vektor pSTV28 mit kleiner Kopienzahl verwendet.

(2) Clonierung des K-Proteingens

Auf der Basis der Aminosäuresequenz in Beispiel 1 (3-2) wurde das 30-mere Oligonucleotid mit der Sequenz 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG- 3' (SEQ ID NO:3) unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten, der von Applied Biosystems Co. gefertigt wurde, als eine Sonde für die Koloniehybridisierung hergestellt. Bei der Bestimmung der Sequenz führt das Vorhandensein einer Mehrzahl von Codons, die einer Art von Aminosäurerest entsprechen, zu erheblichen Problemen, und es ist wichtig, damit fertig zu werden. In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine hervorragende Sonde herzustellen, indem zwei Gesichtspunkte, die nachstehend beschrieben werden, berücksichtigt werden, und dies ist ein wesentlicher Faktor für den Erfolg. Die beiden Gesichtspunkte sind: (1) es war möglich, eine Aminosäureregion zu wählen, in der der Grad der Degeneriertheit der Codons, die den einzelnen Aminosäuren entsprechen, klein ist, da die Aminosäuresequenz einer relativ langen Region bestimmt werden kann; und (2) es gibt zwar keine definitiven Erkenntnisse im Hinblick auf die Häufigkeit der Codonnutzung in Brevibacterium; es wurde jedoch auf die Kenntnisse von Tsuchiya et al. bei der Clonierung von Lipase (japanische Offenlegungsschrift 92-271780) zurückgegriffen.
Eine Koloniehybridisierung mit der Sonde wurde aus der auf diese Weise hergestellten Genbibliothek durch Koloniehybridisierung erzielt. Eine Hybond-N-Membran (hergestellt von Amersham Co.) wurde zur Herstellung einer Replik der Kolonie verwendet. Die Hybridisierung wurde bei 50ºC für 40 Stunden durchgeführt, und anschließend wurde der Filter viermal unter der Bedingung von 40ºC für 1 Stunde gewaschen. Ein sekundäres Screening wurde für die auf diese Weise erhaltenen Hybridisierungs-positiven Kolonien durch Koloniehybridisierung durchgeführt. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Oligonucleotids als Sonde und der Hybond-N- Membran (hergestellt von Amersham Co.) als Membran zur Herstellung einer Replik wurde die Hybridisierung bei 50ºC für 24 Stunden durchgeführt, und es wurde dreimal bei 40ºC für 1 Stunde und zweimal bei 50ºC für 1 Stunde gewaschen. 12 Clone wurden bei dem sekundären Screening selektiert. Plasmid-DNA wurde nach dem Alkali-SDS-Verfahren aus diesen 12 Kolonien, die bei dem sekundären Screening positiv waren, gewonnen. Aus dem Ergebnis der Untersuchung von Schnittmustern dieser Plasmide bei Verdau mit EcoRI und HindIII (beide hergestellt von Takara Shuzo Co.) wurde bestätigt, daß jedes der Plasmide ein inseriertes DNA-Fragment an der BAMHI-Stelle von pSTV28 aufwies.
Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wurde auf die Hybond-N- Membran unter Verwendung von Vacugene (hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology Co.) entsprechend der Anweisung des Herstellers übertragen, und eine Southern-Hybridisierung wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotidsonde durchgeführt. Die Hybridisierung wurde unter der Bedingung 50ºC für 26 Stunden durchgeführt, und es wurde einmal bei 40ºC für 1 Stunde und einmal bei 50ºC für 1 Stunde gewaschen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß 6 der 12 Clone, die beim sekundären Screening positiv waren, mit der Sonde hybridisierten, und die 6 done konnten auf der Basis des Restriktionsenym-Schnittmusters in drei Typen klassifiziert werden.
Die Nucleotidsequenzen für die auf diese Weise erhaltenen drei Typen von inserierten DNA-Fragmenten wurden nach dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des vorstehend beschriebenen oligonucleotids als Primer bestimmt, und es wurde festgestellt, daß ein Typ des inserierten DNA-Fragments folgende Sequenz enthielt:
5'-AACAATGCAGATCAGGCTGCACGTGAGCTCTTCCTCGATTGGGACACC-3' (SEQ ID NO: 4).
Diese Sequenz codiert für die Aminosäuresequenz, die sich an der carboxyterminalen Seite eines Abschnitts befindet, der für die Bestimmung der Sequenz der Sonde in der zuvor bestimmten Aminosäuresequenz verwendet wurde, d.h. Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp- Thr (entsprechend den Aminosäuren Nr. 25 - 40 in SEQ ID NO:1), und daraus wurde bestätigt, daß das DNA-Fragment mindestens einen Abschnitt des gewünschten Gens enthielt.
Anschließend wurde die Nucleotidsequenz für die gesamte Länge des inserierten DNA-Fragments nach dem Didesoxy-Verfahren bestimmt. Die bestimmte Basensequenz ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 angegeben. Es wurde festgestellt, daß das Fragment für das K-Protein codiert. Die Aminosäuresequenz des K-Proteins, die aus der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, ist ebenfalls im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 5 angegeben.

Beispiel 3: Herstellung eines K-Protein-defizienten Stamms

(1) Herstellung von K-Protein-defizienten Stämmen

Unter Verwendung von Brevibacterium lactofermentum Stamm 2256 (ATCC 13869) als Ausgangsstamm wurde eine Mutationsbehandlung mit N-Methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) für die gesamten Zellen angewandt. Zellen des Stamms 2256 wurden in 2 x TY-Medium (1,6% Bactotrypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) kultiviert, und die Zellen wurden gewonnen, wenn die optische Absorption des Mediums bei 660 nm etwa 0,3 erreichte. Nach Waschen der Zellen mit einer TM-Pufferlösung der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung wurden sie in einer NTG-Lösung (NTG, gelöst in TM-Pufferlösung mit 0,2 mg/ml) suspendiert und bei 37ºC für 0 - 90 min inkubiert. Die NTG-behandelten Zellen wurden mit TM-Pufferlösung und 2 x TY-Medium gewaschen und anschließend in 2 x TY-Medium über Nacht kultiviert, um Mutationen zu fixieren. Tabelle 1
Eingestellt auf einen pH-Wert von 6,0 mit NaOH
Die Isolierung einzelner Kolonien wurde für Zellen, die mit NTG mutiert worden waren, durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde, und etwa 1000 Kolonien wurden isoliert. Jeder der Clone, die diese Kolonien bildeten, wurde darauf untersucht, ob K-Protein vorhanden war oder nicht. Die Zelloberflächenschichtfraktion wurde für jeden der Clone nach dem in Beispiel 1 (1) beschriebenen Verfahren hergestellt, und ein SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese-Experiment wurde unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen Fraktion als Probe durchgeführt. Auf diese Weise konnte ein Stamm, bei dem die Fraktion keine Bande des K-Proteins bei einem Molekulargewicht von etwa 63000 aufwies, d.h. ein K-Protein-defizienter Stamm, erhalten werden. Dieser Stamm wurde als Brevibacterium lactofermentum YSR bezeichnet.
Die chromosomale DNA des auf diese Weise erhaltenen Stamms YSR wurde darauf untersucht, ob die Ursache dafür, daß dem Stamm das K-Protein fehlte, auf das Gen zurückzuführen war oder nicht. Es wurde also das K- Proteingen aus dem Stamm YSR doniert, um dessen Struktur in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 zu analysieren.
Chromosomale DNA wurde aus dem Stamm YSR nach dem Verfahren von Saito-Miura (Biochem. Biophys. Acta, 8278 (1963) 619 - 629) hergestellt. Etwa 50 ug DNA wurden mit 2 Einheiten Sau3AI versetzt und partiell durch Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC für 40 min verdaut. Anschließend wurde die verdaute DNA durch Zentrifugation (120000xg, 26 Stunden) in einem Saccharosedichtegradienten (10% - 40%) fraktioniert.
Fraktionen, die etwa 1500 - 6000 bp entsprachen, wurden gewonnen (Volumen: 1,5 ml) und gegen TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH- Wert: 8,0) bei 4ºC dialysiert. Ein »Seamless Cellulose Tubing Size 8/32«, hergestellt von Sanko Junyaku Co., wurde als Dialyseschlauch verwendet. Die Dialyse wurde gegen 2 l Puffer für 4 Stunden und dann für weitere 2 Stunden nach Austausch des Puffers durchgeführt.
Die auf diese Weise erhaltene Fraktion von chromosomaler DNA von 1500 - 6000 bp wurde mit 2-Butanol nach dem Verfahren von Maniatis et al. (Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press (1989), Maniatis et al.) extrahiert und mit dem Vektor pUC18, der zuvor mit BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co.) geschnitten worden war, ligiert, und zwar unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co.). Anschließend wurde Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co.) mit dem Ligationsgemisch entsprechend der Anleitung des Herstellers Takara Shuzo Co. transformiert, wobei man eine Genbibliothek erhielt.
Die resultierende Genbibliothek wurde auf Clone, die das K-Proteingen enthielten, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung einer synthetischen DNA mit der Sequenz 5'-TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG-3', die in Beispiel 2 (2) erhalten wurde, als Sonde abgesucht. Eine Hybond-N-Membran (hergestellt von Amersham Co.) wurde für eine Replik der Kolonie verwendet. Die Hybridisierung wurde bei 50ºC für 40 Stunden durchgeführt, und es wurde viermal unter der Bedingung 4º0C für 1 Stunde gewaschen. Ein sekundäres Screening wurde auf Hybridisierungs-positive Kolonien durch Koloniehybridisierung durchgeführt. Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA als Sonde und einer Hybond-N-Membran (hergestellt von Amersham Co.) als Membran zur Herstellung einer Replik wurde die Hybridisierung bei 5000 für 24 Stunden durchgeführt, und es wurde dreimal bei 4000 für 1 Stunde und zweimal bei 5000 für 1 Stunde gewaschen.
Plasmid-DNAs wurden nach dem Alkali-SDS-Verfahren aus diesen Kolonien, die bei dem sekundären Screening positiv waren, gewonnen. Das inserierte DNA-Fragment des Olons, von dem nach Restriktionsenzym-Spaltungsmustern erwartet wurde, daß er die gesamte Region des K-Proteingens enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung nach dem Didesoxyverfahren bestimmt. Das Ergebnis zeigte, daß das K-Proteingen, das aus dem Stamm YSR isoliert wurde, eine Sequenz aufwies, wie sie im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 6 angegeben ist. Bei Vergleich der Sequenz mit SEQ ID NO: 5 aus dem sequenzprotokoll wurde festgestellt, daß das K-Proteingen von YSR die nachstehend angegebene Mutation aufweist. Die Nucleotidzahlen in Tabelle 2 entsprechen den Basenzahlen in SEQ ID NO: 6. Tabelle 2
Es wurde festgestellt, daß bei dem K-Proteingen auf dem Chromosom des Stamms YSR eine Rahmenverschiebung durch Deletion und Insertionen von Nucleotiden, wie sie vorstehend beschrieben wurden, hervorgerufen wurde und daß als Ergebnis der Stamm YSR kein K-Protein mehr exprimierte. Das Plasmid, das das mutierte K-Proteingenfragment enthält, wurde als pMAK701 bezeichnet. Escherichia coli-Bakterien AJ12759, die das Plasmid pMAK701 enthalten, wurden beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan; Postleitzahl 305) am 11. Januar 1993 unter der Zugangsnummer FERM P-13364 hinterlegt, von der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag am 11. Januar 1994 umgewandelt und unter der Zugangsnummer FERM BP- 4533 hinterlegt.
Nebenbei bemerkt wurde das Plasmid aus Beispiel 2, das das DNA-Fragment mit der Basensequenz, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 5 angegeben ist, nicht hinterlegt. Für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, eine gerichtete Mutagenese mit dem Gen nach einem Verfahren, zum Beispiel einem PCR-Verfahren oder einem Verfahren unter Verwendung einer U enthaltenden einzeisträngigen DNA, durchzuführen. Dementsprechend kann ein Plasmid, das ein DNA-Fragment mit der im Sequenzprotoll unter SEQ ID NO: 5 angegebenen Basensequenz enthält, leicht unter Verwendung von pMAK701 als Ausgangsmaterial hergestellt werden.

(2) Herstellung eines Stamms mit unterbrochenem K-Proteingen

Aus dem DNA-Fragment, das das in Beispiel 3 (1) erhaltene mutierte K-Proteingen enthielt, wurde ein BamHI-SalI-Fragment mit einer Länge von etwa 650 Basenpaaren ausgeschnitten und mit der BamHI-SalI-Stelle des Vektors pHSC4 mit einem temperaturabhängigen Replikationsinitiationspunkt (Sugimoto et al., französische Offenlegungsschrift 2667875/1992) ligiert, wobei ein Plasmid für die Genunterbrechung pMAK705 hergestellt wurde. pMAK705 wurde in Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869), versehen mit AEC (S-(2-aminoethyl)-L-cystein)-Resistenz (nachstehend als Stamm AECr 2256 bezeichnet), mittels eines elektischen Pulsverfahrens (Sugimoto et al., japanische Offenlegungsschrift 90-207791) eingeführt. Die erhaltenen Transformanten wurden bei einer die Plasmidreplikation hemmenden Temperatur kultiviert, so daß das chromosomale K-Proteingen durch homologe Rekombination an der BamHI-SalI-Region des K-Proteingens unterbrochen wurde. Eine Darstellung des Mechanismus der Genunterbrechung ist in Fig. 1 gezeigt. Das BamHI-SalI-Fragment des mutierten K-Proteingens entspricht der Region von der BamHI-Stelle (Nucleotidnummern 1156 - 1161 in SEQ ID NO: 6) bis zur SalI-Stelle (1704 - 1709) der unter SEQ ID NO: 6 gezeigten Sequenz, das in dem in SEQ ID NO: 5 gezeigten ORF (offenen Leserahmen) vorhanden ist. Dementsprechend zerstört eine der beiden Kopien der unterbrochenen K-Proteingene, die sich aus der homologen Rekombination ergeben, den größten Teil der 3'-Seite des ORF, während die andere den größten Teil der 5'-Seite des ORF zerstört. Einzelheiten des Experiments werden beschrieben.
Der Stamm AECr 2256, der pMAK705 aufwies, wurde in einem CM2G-Medium mit einem Gehalt an 5 ug/ml Chloramphenicol über Nacht kultiviert. Die Kulturbrühe wurde mit CM2G-Medium auf 10 verdünnt, und 100 ul wurden auf eine CM2G-Platte mit einem Gehalt an 5 ug/ml Chloramphenicol ausgestrichen. Die Kultivierung wurde bei 34ºC (eine die Replikation hemmende Temperatur) über Nacht durchgeführt, um Chloramphenicol-resistente Bakterien zu selektieren. Zelloberflächenschichtfraktionen für 2 Chloramphenicol-resistente Stämme, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Das Fehlen des K-Proteins wurde bestätigt. Die beiden auf diese Weise hergestellten K-Protein-defizienten Stämme wurden als AJ 12760 und AJ 12956 bezeichnet. Die Wachstumsgeschwindigkeiten von AJ 12760 und AJ 12956 waren gleich der des Stamms AECr 2256.
Der K-Protein-defiziente Stamm AJ 12760 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan; Postleitzahl 305) am 11. Januar 1993 unter FERM P-13365 hinterlegt und am 11. Januar 1994 von der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung auf der Basis des Budapester Vertrags umgewandelt und unter der Zugangsnummer FERM P-4534 hinterlegt. Ferner wurde der K-Protein-defiziente Stamm AJ 12956 international auf der Basis des Budapester Vertrags am 11. Januar 1994 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan; Postleitzahl 305) unter der Zugangsnummer FERM BP-4532 hinterlegt.

(3) Ammoniumaufnahmeaktivität des K-Protein-defizienten Stamms

Bei Messung der Ammoniumaufnahmeaktivität des vorstehend unter (1) hergestellten K-Protein-defizienten Stamms AJ 12760 wurde eine merkliche Verringerung im Vergleich mit dem Stamm AECr 2256 beobachtet, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Die Messung der Ammoniumaufnahme wurde unter Verwendung von ¹&sup4;C-markiertem Methylammonium, einem Analogon für Ammoniumionen, als Substrat gemäß dem raschen Filtrationsverfahren (A. Jayakumar et al., Analytical Biochemistry, 135 (1983) 475 - 478) durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, daß das K-Protein ein neues Zelloberflächenschichtprotein ist, das zur Aufnahme von Nährstoffen in coryneforme Bakterien beiträgt.
Einzelheiten des Experiments zur Messung der Ammoniumaufnahmeaktivität des K-Protein-defizienten Stamms AJ 12760 sind nachstehend angegeben. Bakterielle Zellen, für die die Aufnahmeaktivität gemessen wurde, wurden von einer CM2G-Agarplatte in ein flüssiges CM2G-Medium überimpft und bei 30ºC über Nacht kultiviert. Nach Abkühlen der Kulturbrühe in Eiswasser wurden Zellen gesammelt und zweimal mit zuvor eisgekühltem Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 6,8, 100 mM NaCl) gewaschen und in Puffer B suspendiert, wobei eine Dichte von 2,0 x 10 Zellen/ml erhalten wurde. 100 ul Zellsuspension wurden in die Vertiefung von Multi-Screen HA, hergestellt von Milipore Co., gegeben. Glucose wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM als Energiequelle zugegeben, und die Temperatur wurde bei 30ºC für 5 min gehalten. Dabei war CCCP (Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (hergestellt von Sigma Co.)) gleichzeitig als Entkopplungsmittel vorhanden, wenn dies erforderlich war (Endkonzentration: 20 uM).
Die Ammoniumaufnahmereaktion wurde durch Zugabe von ¹&sup4;C-markiertem Methylammonium in die einzelnen Vertiefungen bis zu einer Endkonzentration von 20 uM eingeleitet. Nachdem die Temperatur bei 25ºC für eine festgelegte Zeitspanne gehalten worden war, wurde die Reaktionslösung rasch aus den einzelnen Vertiefungen durch Absaugen entfernt, um die Reaktion zu beenden. Nach Absaugen der Reaktionslösung wurden die Zellen, die auf der Multi-Screen HA-Membran gehalten wurden, mit Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH-Wert: 6,8, 1 M NaCl) gewaschen, und nach Trocknen der Membran wurde die in die Zellen aufgenommene ¹&sup4;C-Radioaktivität unter Verwendung eines Bio-imaging Analyzer (BAS-2000, hergestellt von Fuji Photographic Film Inc.) gemessen.

Beispiel 4: Fällungseigenschaften des K-Protein-defizienten Stamms

Die Fällungseigenschaften des K-Protein-defizienten Stamms im Kulturmedium wurden ausgewertet. AJ 12760 und AJ 12956 als Stämme mit unterbrochenem K-Proteingen und der Stamm YSR als K-Protein-defizienter mutierter Stamm wurden als K-Protein-defiziente Stämme verwendet. Außerdem wurden Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC 13869) und AECr 2256 als K-Protein-suffiziente Stämme als Kontrollen verwendet. Die einzelnen Stämme AJ 12760, AJ 12956, YSR, 2256 und ACEr 2256 wurden über Nacht- auf einer CM2G-Platte mit einem Gehalt an 20 ug/ml Chloramphenicol kultiviert, und eine Platinschleife der Zellen (eine Menge entsprechend 1/40 einer Platte) wurde in ein flüssiges Hauptkulturmedium überimpft und bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert. Als flüssiges Hauptkulturmedium wurden 20 ml eines flüssigen Kulturmediums mit der nachstehenden Zusammensetzung in einen Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 500 ml gegeben, unter Verwendung von KOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, bei 115ºC für 10 min hitzesterilisiert, und anschließend außerdem mit CaCO&sub3;, das durch trockenes Erhitzen auf 200ºC für 3 Stunden sterilisiert wurde, versetzt. Tabelle 3: Zusammensetzung des Kulturmediums
*: Das Produkt "mame no" enthält 3,49 g Stickstoff/100 ml
Die Kultivierung des Stamms mit unterbrochenem K-Proteingen, der K- Protein-defizienten Mutante und des K-Protein-suffizienten Stamms wurde jeweils doppelt unter Verwendung eines Mediums, dem Glucose zugesetzt worden war, und eines Mediums, dem Saccharose zugesetzt worden war, durchgeführt. Tabelle 4 gibt die Kohlenstoffquelle und den pH-Wert, der nach der Kultivierung gemessen wurde, für die einzelnen Kultivierungsansätze (Probennummern) an. Tabelle 4
Bei den Ansätzen aus der doppelten Kultivierung, die in der mit Glucose versetzten Kultur und der mit Saccharose versetzten Kultur kultiviert worden waren, wurde ein Fällungstest für ein System (Proben Nr. 1 - 10) angewandt, während das Kulturmedium nach der Kultivierung so belassen wurde, wie es war, während für das andere System (Proben Nr. 11 - 20) der pH-Wert des Kulturmediums nach der Kultivierung auf 4,0 eingestellt wurde. Ein pH-Wert von 4,0 entspricht der üblichen Bedingung der Reinigung von L-Lysin-HCl durch Ionenaustauschchromatographie.
Ein Fällungstest wurde durchgeführt, wie er nachstehend beschrieben ist. Jeweils 15 ml Kulturmedium nach der Kultivierung wurden in ein Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von 15 mm übertragen und für eine spontane Fällung der Zellen stehengelassen. Nach Ablauf einer festgelegten Zeitspanne wurde die Position der Grenze zwischen dem Überstand, der sich bei der Fällung der Zellen ergab, und dem ausgefällten Anteil, in dem die Zellen suspendiert waren, gemessen, um den relativen Fällungsgrad nach der nachstehend angegebenen Formel zu berechnen, wobei das Verhältnis (%) des Abstands b von der Oberfläche des Mediums bis zur Grenze zur Höhe a der Oberfläche des Mediums als »Überstandsverhältnis« herangezogen wurde. Die Zellkonzentration wurde auf der Basis der optischen Absorption bei 562 nm (OD&sub5;&sub6;&sub2;) gemessen, wobei das Kulturmedium 26fach verdünnt wurde. Ferner betrug die Höhe a der Oberfläche des Mediums, wenn 15 ml des Mediums in ein Teströhrchen übertragen wurden, 9 cm. Das Trockenzellgewicht wurde durch Umrechnung von OD&sub5;&sub6;&sub2; entsprechend einer zuvor aufgestellten Umrechnungsgleichung berechnet.
(Relativer Fällungsgrad) = (Zelldichte im Fällungsanteil)/(Gesamtzellkonzentration) x 100
(Zelldichte im Fällungsanteil) = (Trockenzellgewicht im homogenen Zustand) x 100 - (Trochenzellgewicht im Überstand) x (Überstandsverhältnis)/100 - (Überstandsverhältnis)
(Überstandsverhältnis) = (b/a) x 100
a: Höhe der Oberfläche des Mediums (d.h. Gesamthöhe des Überstandsanteils und des Fällungsanteils)
b: Abstand von der Oberfläche des Mediums zur Grenze (d.h. ein numerischer Wert, der durch Abziehen der Höhe der Grenze von der Höhe a erhalten wird)
(Trockenzellgewicht) = 1,586(OD&sub5;&sub6;&sub2;)³-1,446(OD&sub5;&sub6;&sub2;)²-1,396(OD&sub5;&sub6;&sub2;)-0,013
Die Gesamtzelldichte (Gesamtzell-OD), der Abstand von der Oberfläche des Mediums zur Grenze (b), die Höhe der Oberfläche des Mediums (a) und die Zelldichte im Überstand (Überstands-OD) in den einzelnen Kultivierungsansätzen wurden sofort, 10 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 180 Minuten und 23 Stunden nach der Übertragung des Kulturmediums in das Teströhrchen gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Tabelle 6 angegeben. Der Wert des relativen Fällungsgrads wird jeweils berechnet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 und Tabelle 8 angegeben. Ferner wird die Änderung des relativen Fällungsgrads im Verlauf der Zeit für die Proben 1, 3, 5, 7 und 9 in Fig. 3, für die Proben 2, 4, 6, 8 und 10 in Fig. 4, für die Proben 11, 13, 15, 17 und 19 in Fig. 5 und für die Proben 12, 14, 16, 18 und 20 in Fig. 6 gezeigt. Tabelle 5 Tabelle 6 Tabelle 7 Tabelle 8
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß Zellen in einer kurzen Zeitspanne (10 - 30 Minuten) unabhängig von der Art der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium und der Einstellung oder Nichteinstellung des pH-Werts des Kulturmediums nach Ablauf der Kultivierung für die Stämme AJ 12760 und AJ 12956 mit unterbrochenem K-Proteingen ausgefällt wurden. Ferner wurde festgestellt, daß Zellen der K-Protein-defizienten Mutante YSR in einer kurzen Zeitspanne in der gleichen Weise wie bei den Stämmen mit unterbrochenem K-Proteingen ausgefällt wurden, wenn sie unter Verwendung von Saccharose als Kohlenstoffquelle kultiviert wurden und nach Abschluß der Kultivierung ohne Einstellung des pH-Werts stehengelassen wurden. Andererseits wurden Zellen von AECr 2256 und 2256 als K-Protein-suffiziente Stämme im wesentlichen nicht ausgefällt, selbst wenn das Kulturmedium 30 Minuten nach Abschluß der Kultivierung stehengelassen wurde. Insbesondere wurde eine Ausfällung der Zellen selbst nach 23 Stunden nicht festgestellt, wenn sie ohne Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums stehengelassen wurden.
Für den Fällungsgrad der Zellen ergab die Messung der Fällungskonstante der Zellaggregationsprodukte das gleiche Ergebnis wie der relative Fällungsgrad, der gemessen wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Zelloberflächenschichtprotein, das zur Aufnahme von Nährstoffen in coryneforme Bakterien beiträgt, und ein Gen dafür bereit, und sie stellt auch eine Transformante, die durch Einführung und Amplifikation des Gens in Zellen von coryneformen Bakterien erhalten wurde, bereit. Ferner ermöglicht sie auch die Verbesserung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Aminosäuren nach einem Fermentationsverfahren unter Verwendung von coryneformen Bakterien mit einer Aktivität zur Bildung von L-Aminosäuren als einen Wirt für die Transformante und die Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung der L- Aminosäure durch das Fermentationsverfahren unter Verwendung der Wirtsbakterien.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung neue coryneforme Bakterien bereit, denen das Zelloberflächenschichtprotein fehlt und die Aggregationseigenschaften aufweisen, wobei eine Energieeinsparung bei der Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung der Bakterien ermöglicht wird.

Claims

1. Zelloberflächenschichtprotein, das von Brevibacterium lactofermentum abgeleitet ist, das folgende zwei Sequenzen im Molekül aufweist:

(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe- Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln- Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr und

(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu- Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro- Ala-Tyr-Lys

und ein Molekulargewicht Von etwa 63 000 Dalton hat.

2. DNA-Fragment, das ein für das Zelloberflächenschichtprotein gemäß Anspruch 1 kodierendes Gen enthält.

3. Rekombinante DNA, die durch Ligieren des DNA-Fragments gemäß Anspruch 2 mit einem Vektor erhalten wird, der zur autonomen Replikation in einer Zelle von coryneformen Bakterien befähigt ist.

4. Transformante, die durch Amplifizieren des DNA- Fragments gemäß Anspruch 2 in einer Zelle von coryneformen Bakterien erhalten wird.

5. Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz durch ein Fermentationsverfahren, welches das Kultivieren einer Transformante gemäß Anspruch 4 mit einer Aktivität zur Herstellung einer nützlichen Substanz in einem Kulturmedium, das Bilden und Anreichern der nützlichen Substanz in dem Kulturmedium und das Gewinnen der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die nützliche Substanz eine L-Aminosäure ist.

7. Coryneforme Bakterien, die die Eigenschaft der Zellaggregation haben und denen das Zelloberflächenschichtprotein gemäß Anspruch 1 oder ein mit diesem Zelloberflächenschichtprotein im wesentlichen identisches Protein fehlt.

8. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 7, in denen ein Gen, das für das Zelloberflächenschichtprotein gemäß Anspruch 1 kodiert, oder ein Gen, das für ein Protein, welches im wesentlichen mit diesem Zelloberflächenschichtprotein identisch ist und in der Zelloberflächenschicht der coryneformen Bakterien vorhanden ist, kodiert, durch homologe Rekombination zwischen einem DNA-Fragment, welches mindestens einen für das Zelloberflächenschichtprotein kodierenden Bereich des Gens enthält, und einer DNA-Sequenz auf einem Chromosom, die mit dem DNA-Fragment identisch oder homolog ist, zerstört ist.

9. Coryneforme Bakterien gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei das cornyeforme Bakterium Brevibacterium lactofermentum ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz, welches umfaßt:

Kultivieren von coryneformen Bakterien mit einer Aktivität zur Herstellung einer nützlichen Substanz,

Bilden und Anreichern der nützlichen Substanz in einem Kulturmedium und

Gewinnen der nützlichen Substanz aus dem Kulturmedium, wobei das coryneforme Bakterium ein coryneformes Bakterium gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 ist,

und das weiter die Schritte des Stehenlassens des Kulturmediums nach dem Ablauf der Kultivierung und des Ausfällens der Zellen des cornyeformen Bakteriums umfaßt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die nützliche Substanz eine L-Aminosäure ist.