JPH0691829B2

JPH0691829B2 - 発酵法によるｌ―リジンの製造法

Info

Publication number: JPH0691829B2
Application number: JP59169897A
Authority: JP
Inventors: 孝之輔佐野; 宏一伊藤; 清志三輪; 茂中森
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1983-08-24
Filing date: 1984-08-16
Publication date: 1994-11-16
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: JPS6062994A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、発酵法によるＬ−リジンの製造法に関し、
更に詳しくは、組換えプラスミドを有するコリネ型細菌
を用いる発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。

飼料として用いられるＬ−リジンは通常、ブレビバクテ
リウム属またはコリネバクテリエム属に属するＬ−リジ
ン生産変異株を使って発酵法により工業的に生産されて
いる。現在知られている種々のＬ−リジン生産株はブレ
ビバクテリウム属またはコリネバクテリエム属の微生物
の野性株の人工変異により作られている。このような人
工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２−ア
ミノエチル）−システィン（以下、AECと略記する）耐
性変異株、その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸
を必要とする変異株（特公昭48−28078号，特公昭56−6
499号）,AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホ
モセリン,L−プロリン,L−セリン,L−アルギニン,L−ア
ラニン,L−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）,DL−α−アミノ−
ε−カプロラクタム，α−アミノ−ラウリルラクタム，
アスパラギン酸−アナログ，スルファ剤，キノイド,N−
ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異
株，オキザロ酢酸，脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）
または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変
異株（特開昭50−53588号，特開昭50−31093号，特開昭
52−102498号，特開昭53−9394号，特開昭53−86089
号，特開昭55−9783号，特開昭55−9759号，特開昭56−
32995号，特開昭56−39778号，特公昭53−43591号，特
公昭53−1833号），イノシトールまたは酢酸を要求する
Ｌ−リジン生産変異株（特開昭55−9784号，特開昭56−
8692号），フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に
対して感性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55−97
83号，特開昭53−86090号）。その他に米国特許出願第3
33455号明細書にはエチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネ
バクテリエムの変異株が開示されている。更に、先行技
術には組換えプラスミドDNAを用いて形質転換したエシ
ェリヒア・コリ株が開示され、この株はアミノ酸の生産
を増加する（例えば米国特許第4278765号参照）。

一方、ブレビバクテリウム及びコリネバクテリエム属の
細菌については識別可能な表現型マーカーを持つプラス
ミドが存在することは永い間知られていなかったが（ヨ
ーロッパ特許公開第3391号参照）、最近の研究ではスレ
オニンまたはイソロイシンの生成を支配するプラスミド
を有するコリネ型細菌の育成の可能性が開示されている
（米国特許願第376396号，及び第392145号参照）。更
に、米国特許願第386980号にはコリネ型細菌であるグル
タミン酸生産菌中で増殖可能な複合プラスミドが開示さ
れている。

リジン，イソロイシン及びスレオニン生合成経路を下記
に概略的に示す。

上記径路におけるアスパラギン酸セミアルデヒドの連接
個所にはスレオニン及びイソロイシンへの径路の第１の
分岐がある。これら２種のアミノ酸に導く酵素はホモセ
リンデヒドロゲナーゼ（以下、HDaseと略記する）であ
り、リジンに導く酵素はジヒドロジピコリン酸シンセタ
ーゼ（以下、DHDPシンセターゼと略記する）である。

リジン生合成径路のいくつかの遺伝子を含むハイブリッ
ドプラスミドを有するエシェリヒア・コリ株が最近開示
されたことは注目すべきことである。リジンのオーバー
プロデューサー（TOCR21）を形質転換し、別の株でリジ
ンの合成が研究された（例えばLe-Reverend et al,Euro
pean Journal of Applied Microbiology and Biotechno
logy,15:227−231（1982）及びフランス特許公開第2511
032号（出願番号第81/15385号）、1983年２月11日公開
参照）。これらの文献から明らかなように、dapA遺伝子
（DHDPシンセターゼをコードしている）を有するプラス
ミドのみがリジン生産の増加をもたらすのである。この
反応は、リジンオーバープロデューサー（アスパラギン
酸キナーゼ反応を変える変異株を有する）における限ら
れた生合成段階である。著者等はこのような遺伝子増幅
法は代謝物をオーバープロデュースする株の改質に使用
できることを示唆している。しかしながら、これらの文
献には、この作用をコリネ型細菌に拡張することを示唆
する記載は全くない。米国特許出願第504471号にはイソ
ロイシン及びスレオニン生合成径路をコントロールする
遺伝情報を有する組換えプラスミドがコリネ型細菌中に
存在することが開示されている。

Ｌ−リジンの、より優れたかつ能率的な発酵生産方法に
対する要求が依然として存在する。

ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（DAP Dase）をコードする遺伝情報がコリネ型細菌中に
増殖可能な特定のビークルに接続し、その結果その遺伝
情報を保持するハイブリッドビークルが特定のコリネ型
細菌のホストまたは受容株内で増殖すると、形質転換さ
れたコリネ型微生物はＬ−リジンの優れた生産菌である
ことを本発明者等は見出した。本発明はＬ−リジンを大
量に生産するコリネ型細菌タイプのうちブレビバクテリ
ウム属及びコリネバクテリウム属の多くの菌がホストと
して利用できるので、特に興味深い。

このように本発明は、Ｌ−リジンの発酵生産方法及びそ
の方法に含まれる種々の遺伝的、微生物学要素に関する
ものである。本発明は、例えばジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼの遺伝子の分離方法，該遺伝子を含有
し、コリネ型細菌中に複製可能な種々のビークル，この
ようなビークルを含有するコリネ型細菌タイプの種々の
微生物及びＬ−リジン生産のための発酵法に関するもの
である。

詳しくは、本発明はコリネ型・グルタミン酸生産菌に属
するDNA供与菌より得られるジアミノピメリン酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子をコードするDNA断片が、コリネ型
・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタ
ープラスミドに接続されて、コリネ型・グルタミン酸生
産菌に属し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイ
ン耐性、α−クロロカプロラクタム耐性、アラニン要求
性であるDNA受容菌に導入されて得られるＬ−リジン生
産能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ
−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造
法に関するものである。

リジン，スレオニン及びイソロイシン生産の生合成経路
は前記した通りである。概略図はＬ−リジンへの径路の
最終段階としてDAP Daseが出現することを示している。
DAP Daseをコードするのに充分な遺伝情報を含むDNAは
特定のDNA供与株から得られる。該供与株は望ましくは
コリネ型細菌であり、最も望ましくはブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム（Brevebacterium lactoferm
entum）である。DAP Daseをコードする遺伝情報は、供
与株からのDNAを部分的に切断し、特定のプラスミドに
遺伝配列を導入し、複数の組換えDNAの混合物を用いてD
AP Daseを欠失したコリネ型細菌を形質転換し、次いで
ジアミノピメリン酸（dap）に生育可能な形質転換株を
分離することにより得られる。

特に、遺伝配列を含むDAP Dase遺伝情報はブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869（野性型）か
ら得ることができる。DAP Dase遺伝子から成る遺伝情報
は分子量約2.9±0.1メガダルトンであり、２個のPst
I,2個のSac I,2個のHindIII,1個のCla Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼサイトを持ち、２個のPst Ｉサイトによ
りフランクされているDNA断片に見出される。

この形質転換に有用な受容株または供与株は所謂コリネ
型細菌である。これらの細菌は好気性，グラム陽性桿
菌，非抗酸性であり、Bergey's Manual of Deternative
Bacteriology,第８版,599頁（1974年）に記載されてい
る。本発明において供与株として有用なコリネ型細菌の
野性株の具体例は下記の通りである。

ブレビバクテリウム・ジバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラッセコーラ ATCC 17965 他望ましい結果は、コリネ型細菌をホストとして利用する
に先立って該細菌を公知の方法で低制限酵素活性に変異
したときに得られる。

コリネ型細菌をDAP Daseインサートを有するビークルで
形質転換すると、該細菌は異種遺伝子から得た遺伝情報
を発現する。

ホモセリンデヒドロジナーゼの欠損株（オキソトロフ）
であるかまたはＳ−（２−アミノエチル）−システィン
（AEC）に耐性を有するホストは特に興味深いものであ
る。DAP Daseにおける非欠損株（プロトトロフ）である
ホストも望ましいものである。DAP Daseをコードする遺
伝子を特にマルチコピープラスミドに挿入すると、この
酵素に対する遺伝子コピーの数が著しく増加し、かつ最
終Ｌ−リジンの生産を非常に増加する。事実、DAP Dase
非欠損（DAP Dase⁺）ホスト中にDAP Dase遺伝子を有す
るマルチコピープラスミドを使用することにより最高濃
度のＬ−リジンが得られる。DAP Daseの欠損株はDAP Da
se遺伝子を有するビークルを選択し、分離するためのホ
ストとして通常用いられる。したがって、このようにし
て分離したビークルをDAP Daseの非欠損株の形質転換に
用いることは有利である。

また、アスパートキナーゼ野性ホストまたはアスパート
キナーゼ反応を変えることにより変異したホストを用い
ることは興味深いものである。アスパラギン酸キナーゼ
反応を変えることにより変異してホストがリジンを過剰
生産するようにしたホストにおいては、そのパラギン酸
キナーゼ反応はもはや速度が制限されない。したがっ
て、このような変異ホストを利用することにより最大の
効果が得られる。

コリネ型細菌中で増殖可能であるいかなる増殖性のビー
クルもDAP Dase遺伝子を運び込むために利用可能であ
り、またホストの形質転換のために用いることができ
る。プラスミド，ファージまたは他のベクター等のビー
クルを利用することができる。米国特許出願第386980号
に開示されている複合プラスミドは特に重要である。こ
れらのプラスミドはコリネ型グルタミン酸生産細菌中で
増殖可能なプラスミド（ａ）に由来するドライブユニッ
ト部位（Ａ）及びエシェリヒア・コリまたはバチルス・
ズブチリス中で増殖可能で、かつ少なくとも薬物耐性を
示す部位を持つプラスミド（ｂ）に由来する１個または
数個の遺伝子断片（Ｂ）から成る。遺伝子断片が更にプ
ラスミド（ｂ）のドライブユニット部位を有するとき、
この複合プラスミドはエシェリヒア・コリまたはバチル
ス・ズブチリス中で増殖可能になり、かくして複合プラ
スミドはエシェリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリ
ス中でスクリーニングされ、あるいは増幅される。

所謂「薬物耐性」とはホストの細胞の成長を阻止する抗
生物質のような薬剤に対する耐性を包含するものであ
る。このような抗生物質の例にはペニシリン，カナマイ
シン，クロラムフェニコール，エリスロマイシン，アク
チノマイシン等がある。

コリネ型細菌に増殖可能なマルチコピープラスミド
（ａ）の具体例は前述の出願に示されており、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869から分離
され、分子量3.0メガダルトン（第１図の制限地図）のp
AM330,コリネバクテリウム・グルタミクムFERM Ｐ−54
85から分離され、分子量3.0メガダルトン（第２図の制
限地図）のpAM286,コリネバクテリウム・グルタミクムA
TCC13058から分離され、分子量1.8メガダルトン（第３
図の制限地図）のpHM1519等がある。

エシェリヒア・コリに増殖可能なプラスミド（ｂ）はマ
ルチコピープラスミドで、薬物耐性という遺伝情報を有
しており、例えばpAC105,pBR322,pBR324,pBR325等があ
る。バチルス・ズブチスリに増殖可能で、かつ薬物耐性
という遺伝情報を有するプラスミド（ｂ）は、望ましく
はマルチコピーであり、pT127,pC194,pC221,pC223,pUB1
10等が含まれる。

プラスミド（ａ）及び（ｂ）から複合プラスミドを調製
するには、制限酵素による切断，リガーゼによる連結等
の常法を採用することができる。

連結反応後、コリネ型細菌中に増殖可能で、かつ該コリ
ネ型細菌を薬物耐性に形質転換可能なプラスミドを分離
して望ましい複合プラスミドを選別する。

プラスミド（ａ）に由来するドライブユニット部位，プ
ラスミド（ｂ）に由来する別のドライブユニット部位及
びプラスミド（ｂ）の薬物耐性遺伝子を有する複合プラ
スミドはコリネ型細菌及びエシェリヒア・コリまたはバ
チルス・ズブチリス中に増殖可能で、(1)コリネ型細菌
または(2)エシェリヒア・コリ（この場合はエシェリヒ
ア・コリ中に増殖可能なプラスミドを用いた）またはバ
チルス・ズブチリス（この場合はバチルス・ズブチリス
中に増殖可能なプラスミドを用いた）を形質転換可能
で、かつ薬物耐性を有するプラスミド中に見出すことが
できる。

本発明に有用な複合プラスミドは特定の国際寄託機関に
寄託されているホストに存在するものであり、下記の通
りである。

pAJ655 ：エシェリヒア・コリAJ 11882,FERM−BP136（FERM−P6517），コリネバクテリウ
ム・グルタミクムSR8201,ATCC39135（第４図制限地図） pAJ611 ：エシェリヒア・コリAJ11883,FERM−BP138（F
ERM−P6519），コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
39136（第６図制限地図） pAJ440 ：バチルス・スブチリスAJ11901,FERM−BP140
（第７図制限地図） pAJ3148:コリネバクテリウム・グルタミクムSR8203,ATC
C39137（第８図制限地図）複合プラスミドは寄託微生物の細胞から次のようにして
得られる。対数増殖期後期に集められた細胞をリゾチー
ムおよびSDSを用いて溶菌し、30000×ｇで遠心分離して
溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加
し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密
度勾配遠心分離を用いて沈殿したDNAを分別精製する。
複合プラスミドは寄託微生物から自然喪失またはキュア
リング（Bacteriological Reviews,36:361−405（197
2））により損傷せずにホストを得て分離することもで
きる。

DAP Dase遺伝子を適当な複製ビークルに挿入するには、
公知の方法により、適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて複製ビークルを切断し、特定の遺伝子配列を連絡す
ることにより可能である。

DAP Dase遺伝子を有するビークルをコリネ型細菌のホス
ト中に取込むには、DNA受容株の細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの浸透性を増加する方法（Mandell,Met a
lによるエシェリヒア・コリＫ−12に関する報告Journal
of Molecular Biology,53:159（1970）または細胞がDN
Aを取込み可能な特定の成長時期に取込む方法（Duncan,
C.H.et alによるバチルス・ズブチリスに関する報告）
がある。プラスミドはまた、プラスミドDNAを容易に取
込むDNA受容体のプロトプラストまたはスフェロプラス
トを形成することによって受容体に取込むことが可能で
ある。これはバチルス・ズブチリス，アクチノマイセス
及び酵母について知られており、Chang,S.et alによる
報告、Molec.Gen.Genet,168:111（1979）,Bibb et alに
よる報告、Nature,274:398（1978）,Hinnen,A.et alに
よる報告、PNAS USA,75:1929（1978）がある。

複合プラスミドはコリネ型細菌を薬物耐性細菌に形質転
換するので、DAP Dase遺伝子を挿入されたプラスミドを
含む形質転換株はその薬物に対する耐性を試験すること
により容易に固定することができる。遺伝マーカーを持
たないビークルを組換えDNAの調製に用いる場合は、DAP
Daseを挿入したビークルを有する形質転換株は成長の
ためのdap要求性を試験することによってホストの細胞
と容易に区別できるので、DAP Daseの欠損株がホストと
して望ましい。

複合プラスミドに挿入したDAP Dase遺伝子は、必要に応
じ常法により容易に他のビークルに転移することができ
る。

かくして得られたＬ−リジン生産菌培養方法は常法であ
り、公知のリジン生産微生物の培養方法に類似してい
る。用いる培地は炭素源，窒素源，無機酸イオン、さら
に必要に応じビタミン及びアミノ酸等の微量有機栄養素
を含む通常の培地である。適当な炭素源としてはグルコ
ース，シュークロース，ラクトース，澱粉加水分解物及
び糖蜜等がある。気体アンモニア，液体アンモニア，ア
ンモニウム塩及び他の窒素含有物質が窒素源として使用
できる。

DAP Dase遺伝子を有するビークルを含有する形質転換さ
れた微生物の培養は、培地のpH及び温度を至適水準に調
整した好気的条件下で行われ、Ｌ−リジンの生成が完了
するまで続けられる。培地に蓄積するこのアミノ酸は常
套手段により回収することができる。

本発明方法によれば、ブレビバクテリウム及びコリネバ
クテリウムの人工変異株を使用する従来知られている方
法より高い収率でＬ−リジンを生産することができる。

以上本発明を詳述したが、以下の実施例により本発明を
さらに詳しく説明する。但し、実施例は単に例示にすぎ
ず、本発明はこれに限定されるものでないことは勿論で
ある。

実施例１（１）供与菌からの染色体DNAの調製ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
（野性型）を酵母エキス１％，ペプトン１％，グルコー
ス0.5％,NaCl0.5％を含み、pH7.2のCM−2G培地１中で
30℃で培養した。指数増殖期に集めた細胞から常法のフ
ェノール法により染色体DNA3.5mgを抽出し、ジアミノピ
リメン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含有するドナーDN
Aとして使用した。

（２）ベクタープラスミドDNAの調製コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13058の隠性の
プラスミド、pHM1519（第３図参照）とエシェリヒア・
コリＫ−12の人工ベクタープラスミドpBR325とを組合せ
ることにより、ベクターとしてハイブリッドプラスミド
pAJ1844（第６図参照）を作成した。この新しいハイブ
リッドプラスミドpAJ1844はエシェリヒア・コリＫ−12,
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC39134
及びコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032中で
増殖し、クロラムフェニコール耐性マーカーを示すシャ
トルベクターである。

酵母エキス１％，ペプトン１％,NaCl0.5％及びグルコー
ス0.5％からなりpH7.0のCM−2G100ml中に生育したブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC39134/pAJ1
844細胞からpAJ1844DNA80μｇを抽出し、ベクターDNAと
して使用した。リゾチーム処理,SDS処理，アガロースゲ
ル電気泳動法及びゲル抽出によりプラスミドDNAの抽出
を行なった。

コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13058及びエシ
ェリヒア・コリＣ−600は共にpAJ1844を担持しており、
これらはATCC39136及びFERM−BP137として寄託されてい
る。

（３）ベクターDNAへの染色体DNA断片の挿入染色体DNA10μｇをエンドヌクレアーゼPstI５μｍを用
いて37℃,5〜60分で部分的に切断した。ベクターDNA10
μｇはPstIにより完全に切断された。加熱してPstIを不
活化した後、両DNAを混合してT₄リガーゼを用いて10℃,
24時間で連結した。

（４）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（DAP Da
se）遺伝子のクローンニング DAPデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニングのための
受容菌株としてブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC39134（1ys^-，thr^-，met^-）を用いた。オキサ
ノグラフ法により欠失段階の一つはリジン生合成におけ
るDAPデカルボキシラーゼであると決定された。その理
由は、この変異株はＬ−リジンに生育するが、DAPでは
生育しないからである。

プロトプラスト形質転換法により上記のキメリックDNA
を受容細胞ATCC39134中へ導入した。CM−2G5mlの初期指
数増殖期においてペニシリンG0.6単位/mlを用いて細胞
を1.5時間処理し、集め、シュークロス500mM,マレイン
酸塩20mM,MgCl₂20mM,Difco Penassayブロス3.5％,pH6.5
のSMMP培地で洗浄した。これらの細胞をSMMP培地中にて
リゾチーム10mg/mlで30℃,20時間処理することによりプ
ロトプラストを調製した。この細胞を遠心分離により集
め、SMMP培地で洗い、SMMP培地0.5ml中に再懸濁した。
このプロトプラスト懸濁液にキメリックDNAを混合し、E
DTA5mM,カルボキシメチルセルロース２％の存在下に２
分間インキュベートし、SMMPで洗い、SMMP中で30℃,2時
間培養してクロラムフェニコール耐性を充分発現させ、
最後にトリス緩衝液1.2％,KCl0.05％，グルコース１
％，MgCl₂・６H₂00.81％，CaCl₂・２H₂O0.22％，ペプト
ン0.4％，酵母エキス0.4％，カザミノ酸0.1％，K₂HPO
₄0.02％，こはく酸ナトリウム13.5％，寒天0.8％及びク
ロラムフェニコール３μg/ml,pH7.0の再生培地に接種し
た。

30℃で２週間培養後、平板上に表われたクロラムフェニ
コール耐性コロニーをグルコース0.5％，(NH₄)₂SO₄0.15
％，尿素0.15％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄・7H₂O0.01％，Ca
Cl₂・2H₂O0.0001％,d−ビオチン30μg/l,サイアミン塩
酸塩100μg/l,L−スレオニン500μg/l,L−メチオニン50
0μg/l及び寒天1.5％,pH7.0の最小培地に複製した。

表われたコロニーを純化し、クロラムフェニコール耐
性，リジン原栄養性を確認し、この形質転換株をAJ1203
1と命名し、微工研にFERMBP−277として寄託した。

（５）キメリックプラスミドの分析２項に記載した手段と同じ手段でAJ12031からプラスミ
ドDNAを抽出した。このDNA1μｇをPstIで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動法で分析した。pAJ101と命名された
キメリックプラスミドは5.4メガダルトンのpAJ1844及び
DAPデカルボキシラーゼ遺伝子を有する2.9メガダルトン
の異種プラスミドから構成されていた。2.9メガダルト
ンのDNAをPstI,SalI及びHindIIIを用いて完全に切断し
て1.9メガダルトン,0.7メガダルトン及び0.3メガダルト
ンの３つの部分に切断した。ClaIもまたこの染色体DNA
を切断した（第９図）。

（６）形質転換株のDAPジカルボキシラーゼ活性形質転換株としてブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムAJ12031（FERM BP−277）、受容株としてATCC391
34株、供与株としてATCC13869株をCM−2G培地中で一夜
培養して集め、洗浄し、100mMK−フォスフェート（リン
酸カリウム）バッファー（pH7.5）を用いて再懸濁し、
音波処理し、遠心分離した。上澄液を粗酵素溶液として
使用した。DAPデカルボキシラーゼ反応混合物は粗酵素
液10％，酵素基質としてのdap1gm/ml及びリン酸カリウ
ムバッファー（pH7.5）よりなる。37℃で３時間培養
後、反応混合物を液クロマトグラフィーにかけ、反応基
質としてのdap及び生産物としてのリジンの量を概算し
た。第１表に示す如く、形質転換株のDAPデカルボキシ
ラーゼはDNA供与株のそれの約２倍であった。

（７）DAP−デカルボキシラーゼ遺伝子クローンpAJ101
によるリジン生産菌の形質転換リジン生産変異株、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムAJ3789（FERM P−2647），リジン−アナログ,S
−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性，α−ク
ロロカプロラクタム耐性，アラニン要求性変異株をpAJ1
01DNAにより形質転換した。クロラムフェニコール耐性
及びアガロースーゲルDNA分析により形質転換株を確認
した後、AJ12033（pAJ101により形質転換されたAJ378
9）を代表的な形質転換株として選んだ。

（８）形質転換株によるリジン生産形質転換株及びその他の株をグルコース10％，(NH₄)₂SO
₄４％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄・7H₂O0.04％，FeSO₄・7H₂O
0.001％，MnCl₂・4H₂O0.0007％,d−ビオチン300μg/l,
サイアミン塩酸塩200μg/l,大豆蛋白加水分解物0.2％,L
−スレオニン0.06％,L−メチオニン0.02％及びCaCO₃５
％,pH7.5の合成培地に30℃で72時間培養し、そのリジン
生産能を試験した。リジンはHLPCより概算した。その結
果を第２表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpAM330の制限地図を示す。第２図はプラスミドpAM286の制限地図を示す。第３図はプラスミドpHM11519の制限地図を示す。第４図は複合プラスミドpAJ655の制限地図を示す。第５図は複合プラスミドpAJ611の制限地図を示す。第６図は複合プラスミドpAJ1844の制限地図を示す。第７図は複合プラスミドpAJ440の制限地図を示す。第８図は複合プラスミドpAJ3148の制限地図を示す。第９図はプラスミドpAJ101の制限地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:15）微生物の受託番号ＦＥＲＭＰ−２６４７審判番号平5−6345 (56)参考文献特開昭58−67699（ＪＰ，Ａ) 特公昭48−28078（ＪＰ，Ｂ１)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型・グルタミン酸生産菌に属するDN
A供与菌より得られるジアミノピメリン酸デカルボキシ
ラーゼ遺伝子をコードするDNA断片が、コリネ型・グル
タミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラ
スミドに接続されて、コリネ型・グルタミン酸生産菌に
属し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐
性、α−クロロカプロラクタム耐性、アラニン要求性で
あるDNA受容菌に導入されて得られるＬ−リジン生産能
を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−リ
ジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。