JP3541385B2

JP3541385B2 - 新規細胞表層タンパク質

Info

Publication number: JP3541385B2
Application number: JP51400194A
Authority: JP
Inventors: 寿川崎; 誠土屋; 清志三輪; 義雄河原
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 2004-07-07
Anticipated expiration: 2019-07-07
Also published as: WO1994015963A1; CN1036850C; CN1101208A; BR9403528A; KR950700329A; EP0644200A4; US5681717A; DE69409895D1; CN1124339C; ES2115208T3; EP0644200B1; DE69409895T2; US5547864A; ATE165606T1; CN1160081A; KR0164235B1; EP0644200A1

Description

技術分野
本発明は、発酵法によるＬ−アミノ酸等の有用物質の製造法に有用な微生物育種と該微生物を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸等の有用物質の製造法に関し、詳しくはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来新規細胞表層タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA断片及びその利用に関するものである。
背景技術
コリネホルム細菌は、Ｌ−グルタミン酸あるいはＬ−リジン等のＬ−アミノ酸を著量に生産する微生物であり、その育種もＬ−アミノ酸の生産性を改善することを目的として行われてきた。遺伝子操作技術を用いたアミノ酸生産菌の育種については従来より多くの研究がなされており、報告例も多数ある（Biotechnology Letters,２（1980）525−530,Appl.Environ,Microbiol.,144（1979）181−190,日本農芸化学会昭和56年度大会講演要旨集（1981）８）。しかし、これらはすべてアミノ酸生合成系の遺伝子を材料とし、それらを増強することによって目的とするアミノ酸の菌体当たりの生産性を高めるものであって、細胞表層構造の機能を解明し生産効率を高めるものではなかった。
ところで、アミノ酸を醗酵法により製造する場合には、生産されたアミノ酸を精製する過程で通常イオン交換クロマトグラフィーが行われているが、醗酵液中に菌体が残存していると醗酵液をイオン交換樹脂カラムに通したときにカラムが目詰まりするので、醗酵液から菌体を除去する工程が必要となっている。この工程は通常遠心分離や濾過等によって行われているが、このような菌体分離操作を省くことあるいは簡略化することができれば、工業的に非常に有用である。
微生物の種類によっては、培養後に菌体が凝集するなどして沈降するものが知られており、このような微生物では培地から菌体を分離することは非常に容易であるが、アミノ酸製造に用いられるコリネホルム細菌でそのような性質を有するものは報告されておらず、菌体に凝集性あるいは沈降性を付与する方法ももちろん知られていない。
尚、国際公開WO93/03158号公報には、本願のＫ−プロテインに類似する新規細胞表層タンパク質が記載されているが、このタンパク質はＫ−プロテインとは明確に区別できるものである。また、同公報には前記細胞表層タンパク質のシグナルペプチドを利用したタンパク質の発現・分泌系が開示されているが、このようなタンパク質がコリネホルム細菌の栄養源の取り込みや菌体の凝集性に関与することは知られていない。
また、コリネホルム細菌は、Ｌ−アミノ酸生産菌として産業上利用されてきたが、最近では同細菌が高分泌性であることが解明されており、バチルス属細菌で既に実用化されている異種タンパク質の生産に利用する試みもある。上記国際公開WO93/03158号公報も、同趣旨の技術を開示している。
本発明が解決しようとする課題は、コリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与する新規細胞表層タンパク質及びその遺伝子を取得することと、該遺伝子がコリネホルム細菌細胞内で増幅されて得られる形質転換体を取得することである。また、該形質転換体の宿主としてＬ−アミノ酸等の有用物質生産能を有するコリネホルム細菌を用い、該宿主細菌を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸等の有用物質の製造法を改良すること、さらにはＬ−アミノ酸の醗酵生産の工程を簡略化するために、上記新規細胞表層タンパク質を欠失し凝集性を有するコリネホルム細菌を取得することを課題とする。
発明の開示
本発明者らは鋭意研究の結果、コリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与する新規細胞表層タンパク質及びその遺伝子を取得することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち本願発明は、分子中に（１）Thr−Leu−Arg−Gln−His−Tyr−Ser−Ser−Leu−Ile−Pro−Asn−Leu−Phe−Ile−Ala−Ala−Val−Gly−Asn−Ile−Asn−Glu−Leu−Asn−Asn−Ala−Asp−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Leu−Phe−Leu−Asp−Trp−Asp−Thr,（２）Asn−Lys−Thr−Asp−Phe−Ala−Glu−Ile−Glu−Leu−Tyr−Asp−Val−Leu−Tyr−Thr−Asp−Ala−Asp−Ile−Ser−Gly−Asp−Ala−Pro−Leu−Leu−Ala−Pro−Ala−Tyr−Lysの２つの配列を有し、分子量が約63,000ダルトンであるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来新規細胞表層タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA断片、該DNA断片がコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターに接続されて得られる組換えDNA、前記DNA断片がコリネホルム細菌細胞内で増幅されることによって得られる形質転換体、及び該形質転換体であってＬ−アミノ酸等の有用物質生産能を有するものを培地中に培養し、該有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より該有用物質を採取することを特徴とする発酵法によるＬ−アミノ酸等の有用物質の製造法である。
さらに本願発明は、前記新規細胞表層タンパク質または該タンパク質と実質的に同一のタンパク質であってコリネホルム細菌の細胞表層に存在するタンパク質を欠失し、菌体凝集性を有することを特徴とするコリネホルム細菌、前記新規細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１部を含むDNA断片と、このDNA断片と同一または相同性を有する染色体上のDNA配列との相同組換えにより、該細胞表層タンパク質遺伝子または該タンパク質と実質的に同一のタンパク質であってコリネホルム細菌の細胞表層に存在するタンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことを特徴とする該細胞表層タンパク質を欠失し菌体凝集性を有することを特徴とするコリネホルム細菌、さらに、Ｌ−アミノ酸等の有用物質生産能を有するコリネホルム細菌を培養し、該有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より該有用物質を採取する有用物質の製造法において、前記コリネホルム細菌は前記新規細胞表層タンパク質を欠失し菌体凝集性を有するコリネホルム細菌であり、培養終了後に培地を静置して該コリネホルム細菌の菌体を沈降させる工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸等の有用物質の製造法を提供する。
尚、本発明にいうコリネホルム細菌とは、後述するように、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義されている好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌である一群の微生物であるが、このようなコリネホルム細菌に属する特定の微生物を、単に「コリネホルム細菌」ということがある。また、本発明の新規細胞表層タンパク質を欠失したコリネホルム細菌及び該タンパク質遺伝子を破壊されたコリネホルム細菌を、併せて「Ｋ−プロテイン欠失菌」ということがある。
＜１＞新規細胞表層タンパク質、その遺伝子、形質転換体及びＬ−アミノ酸の製造法
本発明における新規細胞表層タンパク質の取得は以下のようにして行なう。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、例えば2256株（ATCC 13869）菌体を超音波破砕機（OHTAKE 5202PZT）等により破砕し、これを3,000xg,5分,4℃の条件よりも強い条件、好ましくは12,000xg,1分,4℃の遠心にかけ上清を回収する。さらに、100,000xg,20分,4℃の条件よりも強い条件、好ましくは100,000xg,30分,4℃で遠心を行い、この沈澱を回収し細胞表層画分とする。この画分に存在する分子量63,000付近に大量に存在するタンパク質が本発明である新規細胞表層タンパク質、すなわちＫ−プロテインである。
Ｋ−プロテインの精製は以下のようにして行なう。調製される細胞表層画分には、細胞質膜及び細胞壁の両者が含有される。そこで、細胞質膜を界面活性剤を用いて可溶化することによって両者は分離される。界面活性剤の種類、濃度、可溶化の時間、温度、グリセロール添加量、NaCl添加量等によって可溶化の程度は異なるため、精製の最適条件を見いだすことにより本発明は初めて完成される。この最適条件の決定は本発明によって初めてなされた。すなわち、3.0μｇタンパク質の細胞表層画分を1mlの1.25％（w/v）SDSを含む緩衝液（50mMリン酸カリウムpH8.0,1mMジチオスレイトール）に加え、４−90℃、好ましくは37℃で、30分以上、好ましくは１時間保温した後、145,000xg,20分の条件よりも強い条件、好ましくは145,000xg,30分の遠心を行い、沈澱を回収する方法である。該沈澱の可溶化は、沈澱物に対して0.01〜10μｇタンパク質／μｌ、好ましくは0.2μｇタンパク質／μｌとなるように50mMリン酸カリウムpH8.0,0.1％SDSを加え、懸濁した後、約３分間煮沸し可溶化することによって行われる。
Ｋ−プロテインの分子量はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Gel Electrophoresis of Proteins,IRL Press（1981）B.D.Hammes et.al.）における移動度から推定される。Ｋ−プロテインの分子量は約63,000と推定される。
Ｋ−プロテインのアミノ酸配列の決定は以下のようにして行なわれる。精製されたＫ−プロテインを10μｇタンパク質/ml−2mgタンパク質/ml、好ましくは200μｇタンパク質/mlとなるよう50mM Tris/Cl pH7.3,0.1％SDSに懸濁し、約５分間煮沸することにより可溶化する。放冷後、この溶液に、界面活性剤不溶性画分タンパク質とエンドプロテイナーゼLys−Ｃ（Boehringer Manheim社製）との比が約10:1−200:1、好ましくは50:1（wt/wt）となるようにLys−Ｃを添加し、37℃,30分以上、好ましくは37℃,3時間インキュベートする。
Lys−Ｃを用いて限定分解されたＫ−プロテイン溶液を逆相クロマトグラフィーを用いて分画する。使用するカラムは市販されているものを適宜選択して使用できるが、例えばSenshu Pac VP−318−1251 4.6φx250mmが用いられる。なお、溶出はCH₃CN,0.1％TFA等の勾配溶液を用いて行なわれる。流速は1ml/minで行われる。こうして得られる画分のうち、ペプチド含量の高い画分を用いてアミノ酸配列の決定が行なわれる。決定方法は従来公知の方法（P.Edman,Arch.Biochem,22 475（1949）等）に従うが、例えばApplied Biosystems社の気相シークエンサー470−Ａを用いて供給者の使用説明書に従って行なうことができる。
Ｋ−プロテインは分子中に（１）Thr−Leu−Arg−Gln−His−Tyr−Ser−Ser−Leu−Ile−Pro−Asn−Leu−Phe−Ile−Ala−Ala−Val−Gly−Asn−Ile−Asn−Glu−Leu−Asn−Asn−Ala−Asp−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Leu−Phe−Leu−Asp−Trp−Asp−Thr（配列表配列番号１），（２）Asn−Lys−Thr−Asp−Phe−Ala−Glu−Ile−Glu−Leu−Tyr−Asp−Val−Leu−Tyr−Thr−Asp−Ala−Asp−Ile−Ser−Gly−Asp−Ala−Pro−Leu−Leu−Ala−Pro−Ala−Tyr−Lys（配列表配列番号２）の２つの配列を有する。
Ｋ−プロテイン遺伝子を単離する方法は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）例えば2256株（ATCC 13869）より、まず染色体DNAを抽出し（例えばH.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72,619,（1963）の方法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断する。染色体DNAを切断するために、切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。
ついで、エシェリヒア属細菌細胞内で増殖し得るベクターDNAに接続し、得られた組換えDNAを用いてエシェリヒア属の微生物、例えばJM109株を形質転換せしめ、遺伝子ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーよりのＫ−プロテイン遺伝子の単離は、既知のアミノ酸配列より演繹される塩基配列を有する合成DNAをプローブにしてコロニーハイブリダイゼーション法によりなされる。
具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）株の染色体DNAを制限酵素、例えばSau3A Iを、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット/mlで様々な時間（１分〜２時間）作用させて消化し、部分分解して種々の染色体DNA断片混合物を得る。エシェリヒア属細菌細胞内で増殖し得るベクターDNAに、染色体DNAの切断に用いた制限酵素Sau3A Iと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamH Iを、温度30℃以上、酵素濃度１〜100ユニット/mlで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させて完全消化し、切断開裂されたDNAを得る。次いで、上記のようにして得たブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）由来で、Ｋ−プロテイン遺伝子を含有するDNA断片を含む混合物と、開裂切断されたベクターDNAを混合し、これにDNAリガーゼ、このましくはT4 DNAリガーゼを、温度４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させて組換えDNAを得る。
本発明において用いることのできることのできるベクターDNAとしては、プラスミドベクターDNAが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。Ｋ−プロテイン遺伝子の発現を効率的に実施するために、lac、trp、PL等の微生物内で働くプロモーターを用いてもよい。尚、ここでいう組換えDNAには、Ｋ−プロテイン遺伝子をトランスポゾン（Berg,D.E.and Berg,C.M.,Bio/Technol.,１,417（1983））、Muファージ（特開平２−109985号公報）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Habor Lab.（1972））を用いた方法で染色体に組み込んだものも含まれる。
この組換えDNAを用いて、例えば大腸菌Ｋ−12株、好ましくはJM109株等を形質転換して、遺伝子ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作成法についてはMolecular Cloning second edition（Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis et.al.）に詳しい。形質転換はD.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68,326,1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159（1970））により行うことができる。
つづいて、コロニーハイブリダイゼーション法により上記遺伝子ライブラリーよりＫ−プロテイン遺伝子を含有するDNA断片を含む組換えDNAを単離する。コロニーハイブリダイゼション法はMolecular Cloning second edition（Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis et.al.）に記載される方法に従って行なう。
コロニーハイブリダイゼション法で用いるDNAプローブとしては、精製されたＫ−プロテインのアミノ酸配列より演繹される塩基配列を有する合成DNAが用いられる。好ましくは、5'−TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG−3'（配列表配列番号３）の配列を持つ30merのDNAをApplied Biosystems社のDNA合成機を用いて合成したものがあげられる。配列の決定にあっては、１種のアミノ酸残基に対応するコドンが複数存在することが大きな障害である。このため、対応するコドンの少ないアミノ酸領域を選定し、また、ブレビバクテリウム属細菌のコドン使用頻度を参考にして配列を決定する。DNAの合成はApplied Biosystems社製DNA合成機model 380Bを使用し、ホスホアミダイド法を用いて（Tetrahedron Letters,22,1859（1981）参照）常法に従って合成できる。
あるいはＫ−プロテイン遺伝子の取得は、H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72,619（1963）の方法等により取得された染色体DNAよりPCR（polymerase chain reaction;White,T.J.et al;Trends Genet.５,185（1989）参照）によりＫ−プロテイン遺伝子を増幅することによっても行える。増幅に用いるDNAプライマーはＫ−プロテイン遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するDNA二重鎖の両3'末端に相補するものを用いる。Ｋ−プロテイン遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該DNA断片をプローブとして用いて全領域を含むDNA断片を遺伝子ライブラリーよりスクリーニングする必要がある。全領域を増幅した場合には、PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のDNA断片を含む領域（バンド）を切り出すことによってＫ−プロテイン遺伝子を含有するDNA断片を回収できる。
DNAプライマーとしては、精製されたＫ−プロテインのアミノ酸配列より演繹される塩基配列を有する合成DNAが用いられる。配列の決定にあっては、１種のアミノ酸残基に対応するコドンが複数存在することが大きな障害である。このため、対応するコドンの少ないアミノ酸領域を選定し、また、ブレビバクテリウム属細菌のコドン使用頻度を参考にして配列を決定する。DNAの合成はApplied Biosystems社製DNA合成機model 380Bを使用し、ホスホアミダイド法を用いて（Tetrahedron Letters,2 2,1859（1981）参照）常法に従って合成できる。PCR反応は、宝酒造社製DNAサーマルサイクラーPJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
PCR法により増幅されたＫ−プロテイン遺伝子全領域あるいは一部領域を含有するDNA断片は、エシェリヒア属細菌細胞内において増幅し得るベクターDNAに接続され、エシェリヒア属細菌細胞に導入される。用いられるベクターDNAと形質転換法は、上述の方法と同様である。Ｋ−プロテイン遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該DNA断片をプローブとして用いて全領域を含むDNA断片を遺伝子ライブラリーより単離する。単離方法は上述のコロニーハイブリダイゼージョン法を用いる。
単離されたＫ−プロテイン遺伝子を含むDNA断片が本当にＫ−プロテイン遺伝子を含むかどうかの確認は、コロニーハイブリダイゼーション法あるいはPCR法に用いた合成DNAをプライマーにして塩基配列の決定を行い、決定された塩基配列が上述のアミノ酸配列をコードするものであるかどうか確認することによりなされる。塩基配列の決定方法はdideoxy法（Molecular Cloning second edition（Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis et.al.）によって行なう。
Ｋ−プロテインがコリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与する新規細胞表層タンパク質であるかどうかを確認するには、Ｋ−プロテイン欠失菌を作製し、該欠失菌のアンモニウムイオン取り込み能を測定する。そしてその数値がＫ−プロテイン非欠失株のアンモニウムイオン取り込み能に比較して顕著な低下がみられることを確認する。
次にＫ−プロテイン遺伝子を含むDNA断片がコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターに接続されて得られる組換えDNA、前記DNA断片が細胞内で増幅されることによって得られるコリネホルム細菌に属する形質転換体、および該形質転換体であってＬ−アミノ酸生産能を有するものを培地中に培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積せしめ、培地中よりＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法について説明する。
本発明にいうコリネホルム細菌、例えばブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の微生物とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌である。このようなブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の微生物のうち以下に述べるようなブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属のＬ−グルタミン酸生産性細菌が本発明において用いることが出来る。
ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属のグルタミン酸生産性細菌の野生株の例としては次のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 1402
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC 13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムATCC 13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354
本発明にて使用されうるベクターDNAは、ブレビバクテリウム属はコリネバクテリウム属細菌細胞内において増殖し得るものであればどのようなものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげられる。
（１）pAM 330 特開昭58−67699参照
（２）pHM 1519 特開昭58−77895参照
（３）pAJ 655 特開昭58−192900参照
（４）pAJ 611 同上
（５）pAJ 1844 同上
（６）pCG 1 特開昭57−134500参照
（７）pCG 2 特開昭58−35197参照
（８）pCG 4 特開昭57−183799参照
（９）pCG 11 同上
ベクターDNAの開裂は、当該DNAを一箇所で切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的に切断することにより行う。
ベクターDNAは、Ｋ−プロテイン遺伝子をコードするDNA断片を切断した際に用いられた制限酵素により切断され、またはＫ−プロテイン遺伝子をコードするDNA断片及び断片されたベクターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、ついでベクターDNAとＫ−プロテイン遺伝子をコードするDNA断片とのライゲーション反応に付される。
このようにして得られた、ベクターDNAとＫ−プロテイン遺伝子をコードするDNA断片とが連結された組換えDNAをブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属細菌に属する受容菌へ導入するには、エシェリヒア・コリＫ−12について報告されている様は（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,１,153（1977））細胞がDNAを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法により可能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929（1978））、DNA受容菌を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして組換えDNA受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることができるし、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロトプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックF68（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
さらには、前記パルス法（杉本ら，特開平２−207791号公報）によっても、組換えDNAをブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属細菌に属する受容菌へ導入できる。
以上の方法で取得した、Ｋ−プロテイン遺伝子をコードするDNA断片を含有する組換えDNAを保有するＬ−アミノ酸生産能を有する形質転換体を培養し、培養液に目的のＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめ、これを採取する。
使用するＬ−アミノ酸生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で16〜72時間実施するのがよく、培養温度は30℃〜45℃に、培養中pHは５〜７に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
ところで、コリネホルム細菌はＬ−アミノ酸を著量生産する微生物であり、発酵法によりＬ−アミノ酸の製造におおいに利用されてきた。のみならず、最近ではコリネホルム細菌の高分泌姓を利用して物質生産にも利用されている。
Ｋ−プロテインは細胞表層に存在し、栄養源の取り込みに関与するタンパク質と考えられるので、Ｋ−プロテイン遺伝子を含むDNA断片が細胞内で増殖されることによって得られるコリネホルム細菌に属する形質転換体が有用物質生産能を有する場合には、同形質転換体を培地中に培養し、有効物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より有用物質を採取することを特徴とする発酵法による有用物質の製造法も当然改良されると思われる。
Ｋ−プロテイン遺伝子を含むDNA断片が細胞内で増殖されることによって得られるコリネホルム細菌に属する形質転換体であって有用物質生産能を有するものを培地中に培養し、有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より有用物質を採取することを特徴とする発酵法による有用物質の製造法は、上述したＬ−アミノ酸の製造法と主要部において同一である。
ここでいう有用物質とは、調味量原料である核酸の場合がある。核酸を生産するコリネホルム細菌は、特公平57−22558号公報に開示されるコリネバクテリウム・エキイ（Corynebacterium equi）AJ11347株等がある。
あるいは、有用物質とは外来タンパク質である。すなわち、ヒトインターフェロン、ヒトインターロイキンあるいはヒトホルモンなどの生理活性物質、酵素、または抗体などがある。微生物を用いて外来タンパク質を生産する方法は、主としてエシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌で知られているが、コリネホルム細菌でも同様な技術が開発されている。コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターに、コリネホルム細菌細胞内で機能するプロモーターおよび外来タンパク質をコードするDNAを連結して組換えDNAを調製し、同組換えDNAをコリネホルム細菌に導入して、同組換えDNA上の同タンパク質をコードするDNAの発現を通じて同タンパク質の生産を行うことを基本とする。同技術は例えば特開昭62−151184号公報または特開昭62−244382号公報に開示されている。
＜２＞Ｋ−プロテイン欠失菌及びこれを利用したＬ−アミノ酸の製造法
上述したように、本発明により初めて見い出されたＫ−プロテインは、コリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与することが確認されたが、さらにＫ−プロテインは菌体の凝集性にも関与し、Ｋ−プロテインを欠失したコリネホルム細菌が凝集性を示すことが本願発明により明らかとなった。
Ｋ−プロテイン欠失菌は、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のＫ−プロテイン遺伝子にＫ−プロテインを実質的に産生しないような変異を起こさせることによって得られる。また、自然界からＫ−プロテインを実質的に産生しないような変異を有する自然突然変異株を選択してもよい。
さらに、Ｋ−プロテインをコードする遺伝子の少なくとも１部を含むDNA断片の染色体上のＫ−プロテイン遺伝子との相同組換えによってＫ−プロテイン遺伝子を破壊することによってもＫ−プロテイン欠失菌は得られる。
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）以外のコリネホルム細菌であっても、Ｋ−プロテインと同一あるいはＫ−プロテインと実質的に同一のタンパク質（以下、「Ｋ−プロテイン様タンパク質」という）を細胞表層に有していることが予想される。例えば、国際公開WO93/03158号公報には、本願のＫ−プロテインに類似しているが明確に区別され得る新規細胞表層タンパク質が記載されている。
このようなＫ−プロテイン様タンパク質もまた、栄養源の取り込みや菌体の凝集性に関与し、Ｋ−プロテイン様タンパク質を欠失したコリネホルム細菌も凝集性を有することが期待される。
Ｋ−プロテイン様タンパク質欠失菌は、Ｋ−プロテイン欠失菌と同様に、Ｋ−プロテイン様タンパク質遺伝子にＫ−プロテイン様タンパク質を実質的に産生しないような変異を起こさせることによって得られる。また、自然界からＫ−プロテイン様タンパク質を実質的に産生しないような変異を有する自然突然変異株を選択してもよい。さらに、Ｋ−プロテインをコードする遺伝子の少なくとも１部を含むDNA断片と、このDNA断片と相同性を有する染色体上のＫ−プロテイン様遺伝子との相同組換えによって、Ｋ−プロテイン様タンパク遺伝子を破壊することによってもＫ−プロテイン様タンパク欠失菌は得られる。
以下に、Ｋ−プロテイン欠失変異株の取得法を示すが、以下の記載においてＫ−プロテインをＫ−プロテイン様タンパク質に置き換えれば、同様にしてＫ−プロテイン様タンパク質欠失変異株が得られる。
Ｋ−プロテイン遺伝子にＫ−プロテインを実質的に産生しないような変異を起こさせるには、紫外線照射またはＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）等の変異剤による処理など、通常微生物の人為突然変異を起こさせる方法を適用すればよい。
変異処理したコリネホルム細菌からＫ−プロテイン欠失菌を選択する方法としては、抗Ｋ−プロテイン抗体を用いた抗体法、例えばウェスタンブロッティグ法が挙げられる。具体的には、平板培地上においたナイロンメンブレン等の膜上に変異処理したコリネホルム細菌のコロニーを形成させ、膜上に菌体タンパク質を固定する。この際、膜上のコロニーと１対１の対応がつくように別の平板培地上にレプリカを作製しておく。次いでこの膜を抗Ｋ−プロテイン抗体、抗Ｋ−プロテイン抗体調製に用いた免疫動物のイムノグロブリン画分に対する酵素標識した第二抗体、及び標識酵素による酵素反応で発色する色素を各々含む溶液に順次浸漬、インキュベートすると、Ｋ−プロテイン非欠失菌の菌体タンパク質が固定された位置が発色する。したがって、色素の発色が起こらないコロニーを同定し、このコロニーに対応するレプリカ上のコロニーを単離することによって、Ｋ−プロテイン欠失菌を選択することができる。このようにして選択されたＫ−プロテイン欠失菌の細胞表層画分タンパク質のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Ｋ−プロテインが含まれていないことを確認しておくことが好ましい。
抗Ｋ−プロテイン抗体は、前記＜１＞に示したようにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）の細胞表層画分から調製したＫ−プロテインを用い、通常の抗血清の作製法と同様にしてマウス等の動物を免疫し、血液を採取することにより得られる。また、Ｋ−プロテインで免疫した動物の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞等の増殖能を有する培養細胞とを融合してハイブリドーマ細胞を創製し、このハイブリドーマ細胞を培養することにより得られる抗Ｋ−プロテインモノクローナル抗体を用いてもよい。
酵素標識した第二抗体は、抗Ｋ−プロテイン抗体調製に用いた免疫動物のイムノグロブリン画分に対する抗イムノグロブリン抗体にβ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ等の酵素を共有結合することによって得られるが、各種動物のイムノグロブリンに対する酵素標識抗体が市販されているので、それを用いてもよい。
変異処理したコリネホルム細菌からＫ−プロテイン欠失菌を選択する方法のもう一つを開示する。シングル・コロニー・アイソレーションした細胞ごとに＜１＞で記載した方法で細胞表層画分を調製し、同画分を試料としてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験を行う。分子量約63,000付近にＫ−プロテインのバンドが検出されない株がＫ−プロテイン欠失株である。この方法は非常に手間がかかるが、確実にＫ−プロテイン欠失株を選択できるので、２次スクリーニングの段階で採用するのが望ましい。
上記と同様の方法により、Ｋ−プロテインを実質的に産生しないような変異を有する突然変異株を自然界から選択することができる。
次に、遺伝子破壊によるＫ−プロテイン欠失菌又はＫ−プロテイン様タンパク欠失菌の取得法を説明する。コリネホルム細菌細胞にＫ−プロテイン遺伝子の一部を含むDNA断片を含むDNAを導入し、このＫ−プロテイン遺伝子の一部を含むDNA断片と、このDNA断片と同一または相同性を有する染色体上のDNA配列との相同組換えを起こさせることにより染色体DNA上のＫ−プロテイン遺伝子またはＫ−プロテイン様タンパク質遺伝子を分断させ、Ｋ−プロテイン又はＫ−プロテイン様タンパク質を欠失させることができる。この遺伝子の分断機構の概念図を図１に示す。
具体的には、Ｋ−プロテイン遺伝子の一部を含むDNA断片を、ベクタープラスミドDNAに連結し、遺伝子破壊用プラスミドを作製する。この遺伝子破壊用プラスミドを、上記＜１＞と同様にエシェリヒア・コリＫ−12について報告されている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法、バチルス・ズブチリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,１,153（1977））細胞がDNAを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Genet.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929（1978））、DNA受容菌を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストにして組換えDNA受容菌に導入する方法、あるいは電気パルス法（杉本ら，特開平２−207791号公報）によって、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等のコリネホルム細菌に導入して形質転換株を得る。
遺伝子破壊用プラスミドの作製に用いるベクタープラスミドには、温度感受性複製起点を有するベクター、例えばpHSC 4（杉本ら，フランス特許公開1992年2667875号公報）を用い、得られた形質転換株をプラスミド複製非許容温度で培養することが好ましい。そうすることによって、細胞中の染色体外で遺伝子破壊用プラスミドが自律増殖することを防ぎ、染色体DNAに遺伝子破壊用プラスミドが組み込まれた形質転換体を優先的に増殖させることができる。また、形質転換体の選択を容易にするためにベクタープラスミドには薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を保持するものを使用することが好ましい。
遺伝子破壊用プラスミドをコリネホルム細菌に導入し、好ましくはプラスミド複製非許容温度でマーカーに対応した薬剤を含む培地で培養すると、遺伝子破壊用プラスミドが染色体上に組み込まれた形質転換体が得られる。このような形質転換体は、遺伝子破壊用プラスミドに保持されるＫ−プロテイン遺伝子の一部を含むDNA断片と染色体上のＫ−プロテイン遺伝子又はＫ−プロテイン様タンパク質遺伝子との相同組換えにより、染色体上のＫ−プロテイン遺伝子内に遺伝子破壊用プラスミドが組み込まれ、その結果染色体Ｋ−プロテイン遺伝子が分断されている可能性が高い。得られた形質転換体がＫ−プロテインを欠失していることの確認は、形質転換体の細胞表層画分タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより確認することができる。また、菌体の凝集性によっても確認することができる。
Ｋ−プロテイン欠失菌を得るために突然変異を起こさせるコリネホルム細菌あるいはＫ−プロテイン遺伝子を破壊するコリネホルム細菌としては、上記＜１＞で述べたブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の微生物が挙げられる。
次に、Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネホルム細菌を培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積せしめ、培地中よりＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造法において、前記コリネホルム細菌はＫ−プロテイン欠失菌またはＫ−プロテイン様タンパク質欠失菌であり、培養終了後に培地を静置して該コリネホルム細菌の菌体を沈降させる工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法を説明する。
Ｌ−アミノ酸生産能を有するコリネホルム細菌であってＫ−プロテイン又はを欠失している微生物を培養し、培養液に目的のＬ−アミノ酸を生成蓄積せしめる。使用するＬ−アミノ酸生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、ビートモラセス、ケインモラセス、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で16〜72時間実施するのがよく、培養温度は30℃〜45℃に、培養中pHは５〜７に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
これらの培地組成及び培養条件は、菌体の凝集性に影響を与えることがあるので、得られたＫ−プロテイン欠失菌に適した条件を適宜選択すればよい。
次いで、培養終了後に培地を静置し、凝集した菌体を沈降させることにより培養上清と菌体とを分離する。培養上清と菌体との分離は、沈降した菌体が混入しないように培養上清を回収することにより行うことができる。また、通常の遠心分離や濾過による菌体分離操作を行ってもよく、この場合は菌体が凝集するのでこれらの操作が容易になる。
菌体分離後の発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、通常行われているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。Ｌ−リジンのような塩基性アミノ酸は、通常発酵液をpH4程度に調整してから陽イオン交換樹脂法による精製が行われている。本発明のＫ−プロテイン欠失菌はpH4程度において一層凝集性を増すので、菌体を沈降させる工程はpHを調整してから行うと、一層短時間で沈降が終了し、菌体分離が効率よく行える。さらに、菌体を分離した培養上清をそのままイオン交換樹脂筒に通すことができる。
本発明により、Ｋ−プロテインが菌体の凝集性に関与することが示されたが、この概念は、Ｌ−アミノ酸以外の発酵工業におけるダウンストリームでの除菌工程あるいは醗酵工程での菌体再利用型バイオリアクター、さらには活性汚泥菌の沈降性向上等にも応用することができる。
例えば、Ｋ−プロテインまたはＫ−プロテイン様タンパク質を欠失し、菌体凝集性を有するコリネホルム細菌が有用物質生産能を有する場合には、同細胞を培養中に培養し、有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より有用物質を採取することを特徴とする発酵法による有用物質の製造法が改良される。同製造法においても菌体の分離操作が必須であるからである。
すなわち、有用物質生産能を有するコリネリホルム細菌を培養し、有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より有用物質を採取することを特徴とする発酵法による有用物質の製造法において、上記コリネホルム細菌がＫ−プロテインまたはＫ−プロテイン様タンパク質を欠失し、菌体凝集性を有するコリネホルム細菌であり、培養終了後に培地を静置して該コリネホルム細菌の菌体を沈降させる工程を含むことを特徴とする有用物質の製造法も、上述のＬ−アミノ酸の製造法の場合と同様に菌体分離操作が容易になる。
ここでいう有用物質とは、調味量原料である核酸の場合がある。核酸を生産するコリネホルム細菌は、特公平57−22558号公報に開示されるコリネバクテリウム・エキイ（Corynebacterium equi）AJ11347株等がある。
あるいは、有用物質とは外来タンパク質である。すなわち、ヒトインターフェロン、ヒトインターロイキンあるいはヒトホルモンなどの生理活性物質、酵素、または抗体などがある。微生物を用いて外来タンパク質を生産する方法は、主としてエシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌で知られているが、コリネホルム細菌でも同様な技術が開発されている。コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターに、コリネホルム細菌細胞内で機能するプロモーターおよび外来タンパク質をコードするDNAを連結して組換えDNAを調製し、同組換えDNAをコリネホルム細菌に導入して、同組換えDNA上の同タンパク質をコードするDNAの発現を通じて同タンパク質の生産を行うことを基本とする。同技術は例えば特開昭62−151184号公報に開示されている。
【図面の簡単な説明】
図１相同組換えによる遺伝子分断の概念図
図２Ｋ−プロテインのアンモニウムイオン取り込みへの関与を示す。
○・・・Ｋ−プロテイン非欠失株（AEC^r2256株）
●・・・Ｋ−プロテイン非欠失株（AEC^r2256株）、CCCP添加
□・・・Ｋ−プロテイン欠失株（AJ12760株）
■・・・Ｋ−プロテイン欠失株（AJ12760株）、CCCP添加
図３Ｋ−プロテイン欠失株及びＫ−プロテイン非欠失株の沈降度を示す図（炭素源：グルコース、培養終了後の培地のpH:4.0に調整）
×・・・2256株（ATCC13869）
＋・・・YSR株
◇・・・AEC^r2256株
△・・・AJ 12760
▲・・・AJ 12956
上記記号は図４〜６においても同様である。
図４Ｋ−プロテイン欠失株及びＫ−プロテイン非欠失株の沈降度を示す図（炭素源：スクロース、培養終了後の培地のpH:4.0に調整）
図５Ｋ−プロテイン欠失株及びＫ−プロテイン非欠失株の沈降度を示す図（炭素源：グルコース、培養終了後の培地のpH:無調整）
図６Ｋ−プロテイン欠失株及びＫ−プロテイン非欠失株の沈降度を示す図（炭素源：スクロース、培養終了後の培地のpH:無調整）
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１新規細胞表層タンパク質Ｋ−プロテイン
（１）新規細胞表層タンパク質の発見
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869をCM2G（yeast extract 10g,bacto tryptone 10g,glucose 5g,NaCl 5g,水で11にする）培地で一晩、30℃にて振とう培養した培養液1mlより集菌した。緩衝液Ａ（50mMリン酸カリウム,pH8.0,10mM硫酸マグネシウム）で洗浄した後、1mlの緩衝液Ａに懸濁し凍結融解を行い、０℃に保ちながら超音波破砕機（OHTAKE 5202PZT）により菌体を破砕した。これを12,000xg,1分,4℃の遠心にかけ上清を回収した。さらに、100,000xg,30分,4℃で遠心を行い、この沈澱を回収し細胞表層画分とした。この画分のうち5x10⁹細胞相当分を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、分子量63,000付近に大量に存在するタンパク質のバンドを見いだし、該タンパク質をＫ−プロテインと命名した。
本願発明者は、この細胞表層タンパク質が外部からの栄養源の取り込みに関する機能を有することを期待し、実験を進めた。
（２）Ｋ−プロテインの精製
まず、（１）で述べた方法で、細胞表層画分を調製した。この細胞表層画分は細胞質膜及び、細胞壁の両者を含有する。そこで、細胞質膜を界面活性剤を用いて可溶化することによって、両者を分離することを試みた。界面活性剤の種類、濃度、可溶化の時間、温度、グリセロール添加効果、NaCl添加効果について詳細に検討を重ねた結果、以下に述べる方法でＫ−プロテインの精製を行うことが可能となった。それは、3.0μｇタンパク質（Bio Rad社製BCプロテインアッセイキットを用いて定量した）の細胞表層画分を1mlの1.25％（w/v）SDSを含む緩衝液（50mMリン酸カリウムpH8.0,1mMジチオスレイトール）に加え、37℃で１時間保温した後、145,000xg,30分の遠心を行い、沈澱を回収する方法である。回収は、沈澱物に対して0.2μｇタンパク質／μｌとなるように50mMリン酸カリウムpH8.0,0.1％SDSを加え、懸濁した後、３分間煮沸し可溶化することによって行った。この界面活性剤不溶性画分15μｇタンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたところ、分子量63,000の単一タンパク質であることが確認された。
（３）Ｋ−プロテインの性質
（３−１）分子量
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における移動度から、Ｋ−プロテインの分子量は約63,000と推定された。
（３−２）部分アミノ酸配列の決定
（２）の方法で述べた方法によって精製したＫ−プロテインを200μｇタンパク質/mlとなるよう50mM Tris/Cl pH7.3,0.1/SDSに懸濁し、５分間煮沸することにより可溶化した。放冷後、この溶液に、界面活性剤不溶性画分タンパク質とエンドプロテイナーゼLys−Ｃとの比が50:1（wt/wt）となるようにLys−Ｃを添加して37℃,3時間インキュベートした。
Lys−Ｃを用いて限定分解したＫ−プロテイン溶液のうち500pmoleタンパク質相当を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。使用したカラムはSenshu Pac VP−318−1251 4.6φx250mmである。なお、溶出は24％CH₃CN,0.1％TFAで開始し、66％CH₃CN,0.1％TFAまでのグラジエントをかけ、流速は1ml/minで行った。ここで得られた画分のうち、ペプチド含量の高い２つの画分（55.7−57.0％CH₃CN溶出画分及び、59.3−60.5％CH₃CN溶出画分）についてApplied Biosystems社の気相シークエンサー470−Ａを用いてアミノ酸配列の決定を行った。アミノ酸配列の決定方法はApplied Biosystems社の取扱い説明書に従い行った。その結果、Ｋ−プロテインは分子中に（１）Thr−Leu−Arg−Gln−His−Tyr−Ser−Ser−Leu−Ile−Pro−Asn−Leu−Phe−Ile−Ala−Ala−Val−Gly−Asn−Ile−Asn−Glu−Leu−Asn−Asn−Ala−Asp−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Leu−Phe−Leu−Asp−Trp−Asp−Thr（配列番号１），（２）Asn−Lys−Thr−Asp−Phe−Ala−Glu−Ile−Glu−Leu−Tyr−Asp−Val−Leu−Tyr−Thr−Asp−Ala−Asp−Ile−Ser−Gly−Asp−Ala−Pro−Leu−Leu−Ala−Pro−Ala−Tyr−Lys（配列番号２）の２つの配列を有することが判明した。
実施例２Ｋ−プロテイン遺伝子の取得
（１）遺伝子ライブラリーの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）より、Saito−Miuraの方法（Biochem.Biophys.Acta.,8278（1963）619−629）によって染色体DNAを調製した。このDNA約50μｇに２ユニットのSau3A Iを添加し、37℃で40分間保温することによって部分分解を行った。これを10％から40％のショ糖密度勾配遠心（120,000xg,26時間）にかけることによって分画した。
約1,500から6,000bpの画分を回収し（容量1.5ml）、これをTEバッファー（10mM Tris/HCl,1mM EDTA,pH8.0）に対して、４℃にて透析を行った。透析チューブは三光純薬社製Seamless Cellulose Tubing Size 8/32を用いた。透析は、21のバッファーに対して４時間行った後に、バッファー交換を行い、さらに２時間行った。
透析後の1,500−6,000bpの染色体DNA画分を、Maniatisらの方法（Molecular Cloning second edition,Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis et.al.）に従い、２−butanolで抽出した後、予めBamH Iで切断したベクターpSTV28（宝酒造社製）とT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を用い連結した。この溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）の形質転換を宝酒造社の説明書に従って行い、約5,000クローンをもつ遺伝子ライブラリーを作製した。尚、Ｋ−プロテイン遺伝子断片がクローン化されたベクターを保持する宿主は、Ｋ−プロテイン遺伝子が高率で発現すると致死的になると考えられるので、低コピーベクターであるpSTV28を使用した。
（２）Ｋ−プロテイン遺伝子のクローニング
実施例１（３−２）のアミノ酸配列をもとに、5'−TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG−3'（配列番号３）の配列を持つ30merのDNAをApplied Biosystems社のDNA合成機を用いて合成し、コロニーハイブリダイゼーションに用いるプローブとした。配列の決定にあっては、１種のアミノ酸残基に対応するコドンが複数存在することが大きな障害であり、いかなる方法でこれに対処するかに成否がかかっている。本発明に於いては以下に述べる２点を考慮することによって、優れたプローブを作製することが可能となり、これが成功の大きな要因となった。その２点は、（１）比較的長い領域のアミノ酸配列を決定することができたため、対応するコドンの少ないアミノ酸領域を選定することが可能であったこと、（２）ブレビバクテリウム属細菌のコドン使用頻度に関して確固たる知見はないので、土屋らがリパーゼをクローニングした際の知見（特開平４−271780号公報）を参考にしたことである。
作製した遺伝子ライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによって上記プローブとハイブリダイズするコロニーを取得する。コロニーのレプリカには、Hybond−Ｎ（Amersham社製）メンブランを用い、ハイブリダイゼーションは50℃で、40時間行い、洗浄は40℃,1時間の条件で４回行った。得られたコロニーを用いて、再度、コロニーハイブリダイゼーションにより、２次スクリーニングを行った。プローブには上記DNAを、メンブランにはHybond−Ｎ（Amersham社製）を用い、ハイブリダイゼーションを50℃で、24時間行い、洗浄を40℃,1時間を３回、50℃,1時間を２回行った。この２次スクリーニングでクローンを12個に絞った。この２次スクリーニングでポジティブであった12個のコロニーより、アルカリ−SDS法を用いてプラスミドDNAを回収し、Eco R I,Hin d III（共に、宝酒造社製）による切断パターンを調べたところ、12個すべてのクローンにおいてDNA断片がpSTV28のBamH I部位に挿入されていた。
こうして得られたDNA断片をVacuGene（Pharmacia LKB Biotechnology社製）を用い、その説明書に従って、Hybond−Ｎメンブランにブロッティングし、上記DNAをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。なお、ハイブリダイゼーションは50℃,26時間、洗浄は、40℃,1時間を１回、50℃,1時間を１回の各条件で行った。その結果、２次スクリーニングでポジティブであった12クローンのうち６クローンがハイブリダイズすること、その６クローンは制限酵素切断パターンから、３種類に分類できることが判明した。
こうして得られた３種類の挿入DNA断片の塩基配列を、上記プローブをプライマーとして、ダイデオキシ法によって決定したところ、１種類の挿入DNA断片が5'−AACAATGCAGATCAGGCTGCACGTGAGCTCTTCCTCGATTGGGACACC−3'の配列（配列番号４）を含有していた。これは、先に決定したアミノ酸配列のうち、プローブとして用いた部分よりカルボキシ末端側のアミノ酸配列、すなわちAsn−Asn−Ala−Asp−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Leu−Phe−Leu−Asp−Trp−Asp−Thr（配列番号１アミノ酸番号25〜40に相当）をコードする塩基配列であり、このことから、このDNA断片が目的の遺伝子の少なくとも一部を含むことが確認された。
そこで、この挿入DNA断片の全長についてダイデオキシ法によって塩基配列を決定した。決定された塩基配列は配列表配列番号５に示す。該断片はＫ−プロテインをコードしていることが判明した。配列表配列番号５には、推定されるＫ−プロテインのアミノ酸配列も併記してある。
実施例３Ｋ−プロテイン欠失菌の作製
（１）Ｋ−プロテイン欠失変異株の作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）を親株として、以下に示すようにして、菌体ごとＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）による変異処理を行った。2256株を、２×TY培地（1.6％ Bacto trypton,1％ Yeast extract,0.5％ NaCl）で培養し、660nmでの吸光度が約0.3になったところで集菌した。菌体を表１に示した組成のTM緩衝液で洗浄した後、NTG液（NTGを0.2mg/mLとなるようにTM緩衝液に溶解したもの）に懸濁し、37℃で０〜90分処理した。こうしてNTG処理した菌体を、TM緩衝液及び２×TY培地で洗浄後、２×TY培地で一夜培養して変異を固定した。

上記のようにしてNTGを用いて変異処理した菌体からシングル・コロニー・アイソレーションを行い、約1000個のコロニーを単離し、各々のコロニーを形成するクローンについてＫ−プロテインが欠失しているかどうかを調べる。各クローンごとに実施例１（１）で記載した方法で細胞表層画分を調製し、同画分を試料としてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験を行った。こうして分子量63,000付近にＫ−プロテインのバンドが検出されない株、すなわちＫ−プロテイン欠失株が取得できた。本株をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）YSR株と命名した。
上記のようにして得られたYSR株の染色体DNAを調べ、同株がＫ−プロテインを欠失している原因が遺伝子にあるのかどうか調べた。すなわち、実施例１と同様にして、YSR株よりＫ−プロテイン遺伝子をクローニングし、構造を解析した。
YSR株からSaito−Miuraの方法（Biochem.Biophys.Acta.,8278（1963）619−629）によって染色体DNAを調製した。このDNA約50μｇに２ユニットのSau3A Iを添加し、37℃で40分間保温することによって部分分解を行った。これを10％から40％のショ糖密度勾配遠心（120,000xg,26時間）にかけることによって分画した。
約1,500から6,000bpの画分を回収し（容量1.5ml）、これをTEバッファー（10mM Tris/HCl,1mM EDTA,pH8.0）に対して、４℃にて透析を行った。透析チューブは三光純薬社製Seamless Cellulose Tubing Size 8/32を用いた。透析は、21のバッファーに対して４時間行った後に、バッファー交換を行い、さらに２時間行った。
透析後の1,500−6,000bpの染色体DNA画分を、Maniatisらの方法（Molecular Cloning second edition,Cold Spring Harbor Press（1989）Maniatis et.al.）に従い、２−butanolで抽出した後、予めBamH Iで切断したベクターpUC18（宝酒造社製）とT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を用い連結した。この溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109（宝酒造社製）の形質転換を宝酒造社の説明書に従って行い、遺伝子ライブラリーを作製した。
こうして得られた遺伝子ライブラリーから、実施例２（２）で得られた5'−TTCATCGCTGCTGTCGGCAACATCAACGAG−3'の配列を持つ合成DNAをプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーションによりＫ−プロテイン遺伝子を保持するクローンのスクリーニングを行った。コロニーのレプリカには、Hybond−Ｎ（Amersham社製）メンブランを用い、ハイブリダイゼーションは50℃で40時間行い、洗浄は40℃,1時間の条件で４回行った。得られたコロニーを用いて、再度、コロニーハイブリダイゼーションにより、２次スクリーニングを行った。プローブには上記DNAを、メンブランにはHybond−Ｎ（Amersham社製）を用い、ハイブリダイゼーションを50℃で、24時間行い、洗浄を40℃,1時間を３回、50℃,1時間を２回行った。
２次スクリーニングで得られた陽性コロニーより、アルカリ−SDS法を用いてプラスミドDNAを回収し、制限酵素切断パターンを調べ、Ｋ−プロテイン遺伝子全領域を含んでいると予想されるクローンについて、挿入フラグメントの塩基配列をダイデオキシ法によって決定した。その結果、YSR株より単離されたＫ−プロテイン遺伝子は、配列表配列番号６に示す配列を有することが明らかとなった。この配列と配列表配列番号５の配列を比較したところ、YSRのＫ−プロテイン遺伝子は次に示す変異を有することがわかった。尚、表２中の塩基番号は、配列番号６における塩基番号である。

YSR株の染色体上のＫ−プロテイン遺伝子は、上記のような塩基の欠失及び挿入により、フレームシフトを生じてしまっており、その結果YSR株はＫ−プロテインを発現しなくなったことがわかった。この変異Ｋ−プロテイン遺伝子断片を含むプラスミドはpMAK701と命名された。プラスミドpMAK701を保持するエシェリヒア・コリ細菌AJ 12759は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号郵便番号305）に、平成５年１月11日に微工研菌寄第Ｐ−13364号の受託番号で寄託されており、平成６年１月11日にこの原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号FERM BP−4533として寄託されている。
ところで、実施例２において、配列表配列番号５に記載される塩基配列を有するDNA断片を含むプラスミドの寄託はされていない。しかし、PCR法、あるいはＵ含有一本鎖DNAを利用する方法等によって遺伝子に部位特異的変異導入を行うことは、当業者であれば容易になしうるところである。したがって、pMAK701を出発物質にして、配列表配列番号５に記載される塩基配列を有するDNA断片を含むプラスミドも容易に調製できる。
（２）Ｋ−プロテイン遺伝子破壊株の作製
実施例３（１）で取得したＫ−プロテイン変異型遺伝子を含むDNA断片のうち約650塩基対の長さのBam H I−Sal I断片を温度感受性複製起点を有するベクターpHSC 4（杉本ら，フランス特許公開1992年2667875号公報）のBam H I−Sal Iサイトに連結し、遺伝子破壊用プラスミドpMAK705を作製した。pMAK705を、電気パルス法（杉本ら，特開平２−207791号公報）によって、AEC（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）耐性を付与したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）（以下、AEC^r2256株と称す）に導入し、得られた形質転換株をプラスミド複製非許容温度で培養し、Ｋ−プロテイン遺伝子のBam H I−Sal I領域での相同組換えによる染色体Ｋ−プロテイン遺伝子の分断を行った。分断機構の概念図を図１に示す。変異型Ｋ−プロテイン遺伝子のBam H I−Sal I断片は、配列表配列番号６の1156−1161番目のBam H I部位から1704−1709番目のSal I部位までのDNA断片であり、配列表配列番号５に示されるORF（オープンリーディングフレーム）の内部に存在する。したがって、相同組換えの結果生じる２コピーの分断されたＫ−プロテイン遺伝子のうち、一方がORFの3'側の大部分を欠いており、他方がORFの5'側の大部分を欠いている。実験の詳細を以下に述べる。
pMAK705を保持するAEC^r2256株を５μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM2G培地で１晩培養した。この培養液をCM2G培地で10^-3希釈し、うち100μｌを５μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM2Gプレートに塗布した。34℃（複製非許容温度）にて１晩培養を行い、クロラムフェニコール耐性菌を選択した。こうして得られた耐性菌２株の細胞表層画分を実施例１で述べた方法により調製し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、Ｋ−プロテインの欠失が確認された。このようにして作製した２株のＫ−プロテイン欠失菌を各々AJ 12760及びAJ 12956と命名した。これらAJ 12760及びAJ 12956の生育速度はAEC^r2256株と同等であった。
Ｋ−プロテイン欠失菌AJ 12760は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号郵便番号305）に、平成５年１月11日に微工研菌寄第Ｐ−13365号の受託番号で寄託されており、平成６年１月11日にこの原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号FERM BP−4534として寄託されている。また、Ｋ−プロテイン欠失菌AJ 12956は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号郵便番号305）に、平成６年１月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託がなされており、その受託番号はFERM BP−4532である。
（３）Ｋ−プロテイン欠失菌のアンモニウムイオン取り込み能
（１）で作製したＫ−プロテイン欠失菌AJ 12760のアンモニウムイオン取り込み能を測定したところ、図２に示すようにAEC^r2256株に比較して顕著な低下がみられた。測定はアンモニウムイオンのアナログである¹⁴Cでラベルしたメチルアンモニウムを基質として用い、迅速ろ過法（A.Jayakumar et.al.,Analytical Bioch−emistry,135（1983）475−478）によって行った。この結果よりＫ−プロテインはコリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与する新規細胞表層タンパク質であることが判明した。
Ｋ−プロテイン欠失菌AJ 12760のアンモニウムイオン取り込み能の測定実験の詳細を以下に示す。取り込み能を測定しようとする菌をCM2G寒天プレートよりCM2G液体培地に植え、30℃で１晩培養した。この培養液を氷水中にて冷却した後、集菌した。菌体を予め氷冷しておいたバッファーＢ（50mM Tris/HCl pH6.8,100mM NaCl）で２度洗浄し、2.0x10⁸cells/mlとなるようにバッファーＢに懸濁した。この菌体懸濁液100μｌをミリポア社製マルチスクリーン−HAのウェルに入れ、エネルギー源として終濃度10mMとなるようグルコースを添加し、30℃で５分間保温した。この間、必要に応じて、脱共役剤としてCCCP（carbonylcyanide m−chloropheny lhydrazone（Sigma社製））を共存させた（終濃度20μＭ）。
アンモニア取り込み反応の開始は、¹⁴Cでラベルしたメチルアンモニウムを終濃度20μＭとなるように各ウェルに添加することで行った。25℃にて所定時間保温した後、吸引によって反応液を各ウェルから迅速に除去し反応を停止した。吸引後マルチスクリーン−HAのメンブラン上に保持された菌体をバッファーＣ（50mM Tris/HCl pH6.8,1M NaCl）で洗浄し、メンブランを乾燥させた後、菌体に取り込まれた¹⁴Cの放射活性をバイオ・イメージングアナライザー（富士写真フィルム社BAS−2000）を用いて定量した。
実施例４Ｋ−プロテイン欠失菌の沈降性
Ｋ−プロテイン欠失菌の培地中での沈降性を評価した。Ｋ−プロテイン欠失菌としては、Ｋ−プロテイン遺伝子破壊株であるAJ 12760及びAJ 12956、さらにＫ−プロテイン欠失変異株であるYSR株を用いた。また、Ｋ−プロテイン非欠失株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256株（ATCC 13869）及びAEC^r2256株をコントロールとして使用した。
AJ 12760、AJ 12956、YSR、2256、AEC^r2256の各株を、各々20μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM2G平板培地で一晩培養し、各菌体一白金耳（平板面積の1/40に相当する量）を、主培養用液体培地に植菌して31.5℃で24時間培養した。主培養用液体培地は、下記組成の液体培地を500ml容の坂口フラスコに20ml入れ、KOHを用いてpH8.0に調整した後、115℃で10分間加熱滅菌した後、200℃で３時間乾熱殺菌したCaCO₃を別添した。

上記の各Ｋ−プロテイン遺伝子破壊株、Ｋ−プロテイン欠失変異株及びＫ−プロテイン非欠失株の培養は、グルコース添加培地及びスクロース添加培地を用いて各々２連で行った。各培養区（試料No）について炭素源及び培養後に測定したpHを表４に示す。

グルコース添加培地及びスクロース添加培地で培養した２連の培養区のうち、１連（試料No1〜10）については培養後の培地をそのまま、他の１連（試料No11〜20）については培養後の培地のpHを4.0に調整してから沈降テストを行った。尚、pH4.0は、通常Ｌ−リジン−HClをイオン交換クロマトグラフィーにより精製する場合の条件である。
沈降テストは次のようにして行った。培養後の各培地15mLを内径15mmの試験管に移し、静置して菌体を自然に沈澱させた。一定時間経過後に、菌体が沈澱することにより生じる上清部と菌体が懸濁している沈澱部との界面の位置を測定し、培地表面の高さａ（すなわち上清部及び沈澱部を合わせた高さ）に対する培地表面から界面までの距離ｂ（ａから界面の高さを減じた数値）の比（％）を「上清比」とし、下記式により相対沈降度を算出した。尚、菌濃度は培地を26倍希釈したときの562nmでの吸光度（OD₅₆₂）により測定した。また、培地15mLを試験管に移したときの培地表面の高さａは9cmであった。尚、乾燥菌体重量は、あらかじめ作成した換算式によりOD₅₆₂から換算した。

各培養区における総菌濃度（総菌OD）、培地表面から界面までの距離（ｂ）、培地表面の高さ（ａ）、上清の菌濃度（上清OD）を、培地を試験管に移した直後、10分後、30分後、60分後、180分後、及び23時間後に測定した結果を表５及び表６に示す。また、それぞれの時間における相対沈降度を算出した結果を表７、表８に示す。さらに、試料１、３、５、７及び９については図３に、試料２、４、６、８及び10については図４に、試料11、13、15、17及び19については図５に、試料12、14、16、18及び20については図６に相対沈降度の経時変化を図示した。

以上の結果から、Ｋ−プロテイン遺伝子を破壊されたAJ 12760株及びAJ 12956株は、培地の炭素源の種類及び培養終了後の培地のpHの調整、無調整に拘わらず、短時間（10〜30分）で菌体が沈降することがわかった。また、Ｋ−プロテイン欠失変異株YSR株は、スクロースを炭素源として培養し、培養終了後にpHを調整せずに静置すると、Ｋ−プロテイン遺伝子破壊株と同様に菌体が短時間で沈降することがわかった。これに対して、Ｋ−プロテイン非欠失株であるAEC^r2256株及び2256株は、培養終了後に培地を30分静置してもほとんど菌体は沈降せず、特に培地のpHを調整せずに静置した場合には23時間後にも菌体の沈降が認められなかった。
尚、菌体の沈降度は、菌体凝集物の沈降定数を測定しても、上記のようにして測定した相対沈降度と同様の結果が得られる。
産業上の利用可能性
本発明は、コリネホルム細菌の栄養源の取り込みに関与する新規細胞表層タンパク質及びその遺伝子を提供し、該遺伝子がコリネホルム細菌細胞内で増幅されて得られる形質転換体を提供する。また、該形質転換体の宿主としてＬ−アミノ酸生産能を有するコリネホルム細菌を用い、該宿主細菌を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を改良することを可能とする。
さらに本発明は、上記新規細胞表層タンパク質を欠失した凝集性を有するコリネホルム細菌を提供し、これを利用することによりＬ−アミノ酸と製造を省力化することを可能とする。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:40
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム Brevibacterium lactofermentum 2256株（ATCC 13869）
配列

配列番号:2
配列の長さ:32
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム Brevibacterium lactofermentum 2256株（ATCC 13869）
配列

配列番号:3
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列

配列番号:4
配列の長さ:48
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic DNA
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム Brevibacterium lactofermentum 2256株（ATCC 13869）
配列

配列番号:5
配列の長さ:2653
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic DNA
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム Brevibacterium lactofermentum 2256株（ATCC 13869）
配列

配列番号:6
配列の長さ:2693
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:genomic DNA
起源
生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム Brevibacterium lactofermentum YSR株
配列

Claims

分子中に（１）Thr−Leu−Arg−Gln−His−Tyr−Ser−Ser−Leu−Ile−Pro−Asn−Leu−Phe−Ile−Ala−Ala−Val−Gly−Asn−Ile−Asn−Glu−Leu−Asn−Asn−Ala−Asp−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Leu−Phe−Leu−Asp−Trp−Asp−Thr,（２）Asn−Lys−Thr−Asp−Phe−Ala−Glu−Ile−Glu−Leu−Tyr−Asp−Val−Leu−Tyr−Thr−Asp−Ala−Asp−Ile−Ser−Gly−Asp−Ala−Pro−Leu−Leu−Ala−Pro−Ala−Tyr−Lysの２つの配列を有し、分子量が約63,000ダルトンであるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来の細胞表層タンパク質。
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
第３項記載のDNA断片がコリネホルム細菌細胞内で自律複製可能なベクターに接続されて得られる組換えDNA。
コリネホルム細菌に属し、第３項記載のDNA断片が細胞内で増幅されることによって得られる形質転換体。
第５項記載の形質転換体であって有用物質生産能を有するものを培地中に培養し、該有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より該有用物質を採取することを特徴とする発酵法による有用物質の製造法。
前記有用物質がＬ−アミノ酸である第６項記載の方法。
第１項記載の細胞表層タンパク質であってコリネホルム細菌の細胞表層に存在するタンパク質を欠失し、菌体凝集性を有することを特徴とするコリネホルム細菌。
第１項又は第２項に記載の細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１部を含むDNA断片と、このDNA断片と同一または相同性を有する染色体上のDNA配列との相同組換えにより、該細胞表層タンパク質遺伝子または該タンパク質と実質的に同一のタンパク質であってコリネホルム細菌の細胞表層に存在するタンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことを特徴とする第７項記載のコリネホルム細菌。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである第８項または第９項記載のコリネホルム細菌。
有用物質生産能を有するコリネホルム細菌を培養し、該有用物質を培地中に生成蓄積せしめ、培地中より該有用物質を採取する有用物質の製造法において、
前記コリネホルム細菌は第８項〜第10項のいずれか一項に記載のコリネホルム細菌であり、培養終了後に培地を静置して該コリネホルム細菌の菌体を沈降させる工程を含むことを特徴とする有用物質の製造法。
前記有用物質がＬ−アミノ酸である第11項記載の方法。