JP2000262288A - コリネ型細菌の温度感受性プラスミド - Google Patents
コリネ型細菌の温度感受性プラスミドInfo
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 既に報告されている温度感受性プラスミドと
相同性を示さない、あるいは不和合性を示さないプラス
ミドより温度感受性プラスミドを取得し、宿主の遺伝的
性質を効率よく短期間で改変できる方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）特定の塩基配列を有する野生型の
複製制御領域部分に変異を有し、培養温度が３１℃より
低温でコリネ型細菌細胞内で自律複製できるが、３１℃
以上の温度では同細胞内で自律複製ができないプラスミ
ドに、コリネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子と相同
な配列を有するＤＮＡ断片を連結して組換えプラスミド
を得、（ｂ）同組換えプラスミドをコリネ型細菌細胞に
導入し、（ｃ）同細菌を３１℃以上の温度で培養し、
（ｄ）同ＤＮＡ断片と、同ＤＮＡ断片と相同な配列を有
するコリネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子との間に
相同組換えを生じせしめ、（ｅ）同ＤＮＡ断片が染色体
上に組み込まれたコリネ型細菌を選択することにより、
ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれたコリネ型細菌を調
製する。
相同性を示さない、あるいは不和合性を示さないプラス
ミドより温度感受性プラスミドを取得し、宿主の遺伝的
性質を効率よく短期間で改変できる方法を提供する。 【解決手段】 （ａ）特定の塩基配列を有する野生型の
複製制御領域部分に変異を有し、培養温度が３１℃より
低温でコリネ型細菌細胞内で自律複製できるが、３１℃
以上の温度では同細胞内で自律複製ができないプラスミ
ドに、コリネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子と相同
な配列を有するＤＮＡ断片を連結して組換えプラスミド
を得、（ｂ）同組換えプラスミドをコリネ型細菌細胞に
導入し、（ｃ）同細菌を３１℃以上の温度で培養し、
（ｄ）同ＤＮＡ断片と、同ＤＮＡ断片と相同な配列を有
するコリネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子との間に
相同組換えを生じせしめ、（ｅ）同ＤＮＡ断片が染色体
上に組み込まれたコリネ型細菌を選択することにより、
ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれたコリネ型細菌を調
製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌の新
規な温度感受性プラスミドに関する。同プラスミドは、
アミノ酸などの有用物質の発酵生産に用いられているコ
リネ型細菌の染色体遺伝子を改変し、その遺伝的形質を
変換する方法に利用することができるものであり、アミ
ノ酸などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用する
ことができる。
規な温度感受性プラスミドに関する。同プラスミドは、
アミノ酸などの有用物質の発酵生産に用いられているコ
リネ型細菌の染色体遺伝子を改変し、その遺伝的形質を
変換する方法に利用することができるものであり、アミ
ノ酸などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用する
ことができる。
【０００２】
【従来の技術】コリネ型細菌の遺伝的形質を染色体上の
特定の遺伝子を計画的に改変し、また、定まったコピー
数の遺伝子を安定に染色体上に固定することにより改変
し、アミノ酸など有用物質の発酵生産に利用しようとい
う試みは既に報告されている（特開平5-7491号）。これ
は、コリネ型細菌中で自律複製可能なプラスミドDNAの
複製制御領域を、培養温度を上昇させることにより複製
不能になる、温度感受性変異型の複製制御領域に改変し
たプラスミドを利用したものである。しかし、この温度
感受性複製制御領域を有するプラスミドは、この複製制
御領域が由来する野生型複製制御領域を有する他のプラ
スミドを保持するコリネ型細菌においては、プラスミド
間での相同組み換えが起こることがあり、形質転換体が
保持するプラスミドが温度感受性の複製制御領域でなく
なる現象が観察されていた。同様に、このプラスミドを
用いてコリネ型細菌の染色体上の遺伝子を改変しようと
する場合、宿主コリネ型細菌が前記プラスミドと同じ由
来の複製制御領域を有するプラスミドを保持している
と、このプラスミドが育種の過程で不和合性により脱落
する現象も観察されていた。
特定の遺伝子を計画的に改変し、また、定まったコピー
数の遺伝子を安定に染色体上に固定することにより改変
し、アミノ酸など有用物質の発酵生産に利用しようとい
う試みは既に報告されている（特開平5-7491号）。これ
は、コリネ型細菌中で自律複製可能なプラスミドDNAの
複製制御領域を、培養温度を上昇させることにより複製
不能になる、温度感受性変異型の複製制御領域に改変し
たプラスミドを利用したものである。しかし、この温度
感受性複製制御領域を有するプラスミドは、この複製制
御領域が由来する野生型複製制御領域を有する他のプラ
スミドを保持するコリネ型細菌においては、プラスミド
間での相同組み換えが起こることがあり、形質転換体が
保持するプラスミドが温度感受性の複製制御領域でなく
なる現象が観察されていた。同様に、このプラスミドを
用いてコリネ型細菌の染色体上の遺伝子を改変しようと
する場合、宿主コリネ型細菌が前記プラスミドと同じ由
来の複製制御領域を有するプラスミドを保持している
と、このプラスミドが育種の過程で不和合性により脱落
する現象も観察されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、既に
報告されている温度感受性プラスミドと相同性を示さな
い、あるいは不和合性を示さないプラスミドより温度感
受性プラスミドを取得し、宿主の遺伝的性質を効率よく
短期間で改変できる方法を提供することである。
報告されている温度感受性プラスミドと相同性を示さな
い、あるいは不和合性を示さないプラスミドより温度感
受性プラスミドを取得し、宿主の遺伝的性質を効率よく
短期間で改変できる方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行った結果、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラ
スミドｐＡＭ３３０(特開昭58-67699号公報、Miwa, K.
et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901 (1984))から、
低温では自律複製できるが、それよりも高い温度では自
律複製できないような変異を有するプラスミドを取得す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意検討を行った結果、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラ
スミドｐＡＭ３３０(特開昭58-67699号公報、Miwa, K.
et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901 (1984))から、
低温では自律複製できるが、それよりも高い温度では自
律複製できないような変異を有するプラスミドを取得す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち本発明は、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムATCC13869が保持するプラスミドp
AM330に由来する複製制御領域であって、コリネ型細菌
中で、同細菌が生育可能な温度範囲において低温では自
律複製でき、高温では自律複製できない温度感受性複製
制御領域と、マーカー遺伝子とを含むプラスミドであ
る。
ラクトファーメンタムATCC13869が保持するプラスミドp
AM330に由来する複製制御領域であって、コリネ型細菌
中で、同細菌が生育可能な温度範囲において低温では自
律複製でき、高温では自律複製できない温度感受性複製
制御領域と、マーカー遺伝子とを含むプラスミドであ
る。
【０００６】前記マーカー遺伝子としては、ストレプト
コッカス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が好まし
く、具体的にはカナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびス
ペクチノマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
コッカス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が好まし
く、具体的にはカナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびス
ペクチノマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【０００７】本発明はまた、前記プラスミドにおいて、
エシェリヒア属細菌中でプラスミドを自律複製可能にす
る複製制御領域をさらに含むプラスミドを提供する。本
発明はさらに、配列表の配列番号１７に示す塩基配列中
に含まれるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869が保持するプラスミドpAM330に由来する複製
制御領域であって、同塩基配列において塩基番号１２５
５のＣがＴに置換される変異、塩基番号１５３４のＣが
Ｔに置換される変異、塩基番号１８６６のＧがＡに置換
される変異、塩基番号２０５８のＧがＡに置換される変
異、塩基番号２１８７のＣがＴに置換される変異、及び
塩基番号３１９３のＧがＡに置換される変異から選ばれ
る変異、又は、前記塩基配列に含まれるコード領域によ
りコードされるアミノ酸配列においてＮ末端から７３番
目のプロリンが他のアミノ酸に置換される変異を有し、
コリネ型細菌が生育可能な温度範囲において低温では自
律複製でき、高温では自律複製できない温度感受性複製
制御領域を提供する。
エシェリヒア属細菌中でプラスミドを自律複製可能にす
る複製制御領域をさらに含むプラスミドを提供する。本
発明はさらに、配列表の配列番号１７に示す塩基配列中
に含まれるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869が保持するプラスミドpAM330に由来する複製
制御領域であって、同塩基配列において塩基番号１２５
５のＣがＴに置換される変異、塩基番号１５３４のＣが
Ｔに置換される変異、塩基番号１８６６のＧがＡに置換
される変異、塩基番号２０５８のＧがＡに置換される変
異、塩基番号２１８７のＣがＴに置換される変異、及び
塩基番号３１９３のＧがＡに置換される変異から選ばれ
る変異、又は、前記塩基配列に含まれるコード領域によ
りコードされるアミノ酸配列においてＮ末端から７３番
目のプロリンが他のアミノ酸に置換される変異を有し、
コリネ型細菌が生育可能な温度範囲において低温では自
律複製でき、高温では自律複製できない温度感受性複製
制御領域を提供する。
【０００８】また本発明は、ＤＮＡ断片が染色体上に組
み込まれたコリネ型細菌の創製方法であって、下記工程
を含む方法を提供する。 （ａ）前記プラスミドに、コリネ型細菌の染色体上に存
在するＤＮＡ配列と相同な配列を有するＤＮＡ断片を連
結して得られる組換えプラスミドを、コリネ型細菌細胞
に導入し、（ｂ）前記細菌を、前記プラスミドが自律複
製できる温度で培養して、前記ＤＮＡ断片と、同ＤＮＡ
断片と相同な配列を有するコリネ型細菌の染色体上に存
在するＤＮＡ配列との間に相同組換えを生じさせ、そし
て（ｃ）前記ＤＮＡ断片が前記プラスミドとともに染色
体上に組み込まれた細菌を選択する。
み込まれたコリネ型細菌の創製方法であって、下記工程
を含む方法を提供する。 （ａ）前記プラスミドに、コリネ型細菌の染色体上に存
在するＤＮＡ配列と相同な配列を有するＤＮＡ断片を連
結して得られる組換えプラスミドを、コリネ型細菌細胞
に導入し、（ｂ）前記細菌を、前記プラスミドが自律複
製できる温度で培養して、前記ＤＮＡ断片と、同ＤＮＡ
断片と相同な配列を有するコリネ型細菌の染色体上に存
在するＤＮＡ配列との間に相同組換えを生じさせ、そし
て（ｃ）前記ＤＮＡ断片が前記プラスミドとともに染色
体上に組み込まれた細菌を選択する。
【０００９】上記方法の好ましい態様は、さらに下記工
程を含む。 （ｄ）前記細菌を培養して、前記染色体に組み込まれた
ＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片と相同な配列を有するコ
リネ型細菌の染色体上に元来存在するＤＮＡ配列との間
に相同組換えを生じさせ、（ｅ）前記細菌を高温で培養
して、染色体上に元来存在するＤＮＡ配列と前記プラス
ミドを染色体から脱落させ、そして（ｆ）染色体上のＤ
ＮＡ配列が前記ＤＮＡ断片に置換された細菌を選択す
る。
程を含む。 （ｄ）前記細菌を培養して、前記染色体に組み込まれた
ＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片と相同な配列を有するコ
リネ型細菌の染色体上に元来存在するＤＮＡ配列との間
に相同組換えを生じさせ、（ｅ）前記細菌を高温で培養
して、染色体上に元来存在するＤＮＡ配列と前記プラス
ミドを染色体から脱落させ、そして（ｆ）染色体上のＤ
ＮＡ配列が前記ＤＮＡ断片に置換された細菌を選択す
る。
【００１０】本発明において、「温度感受性複製制御領
域」とは、プラスミドを自律複製可能にする複製制御領
域であって、コリネ型細菌中でこれを有するプラスミド
がある温度では自律複製できるが、それよりも高い温度
では自律複製できないような変異を有するものをいう。
また、温度感受性複製制御領域を有するプラスミドを温
度感受性プラスミドという。
域」とは、プラスミドを自律複製可能にする複製制御領
域であって、コリネ型細菌中でこれを有するプラスミド
がある温度では自律複製できるが、それよりも高い温度
では自律複製できないような変異を有するものをいう。
また、温度感受性複製制御領域を有するプラスミドを温
度感受性プラスミドという。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプラスミドは、pAM330に由来する、温度感受性
を示す複製制御領域を有する。pAM330は、野生型コリネ
型細菌であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムATCC13869が保持するプラスミドであり、同株から通
常のプラスミドの分離法にしたがって分離することがで
きる。ATCC13869株は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)、住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland
20852, United States of America）から何人も入手す
ることができる。
本発明のプラスミドは、pAM330に由来する、温度感受性
を示す複製制御領域を有する。pAM330は、野生型コリネ
型細菌であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムATCC13869が保持するプラスミドであり、同株から通
常のプラスミドの分離法にしたがって分離することがで
きる。ATCC13869株は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)、住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland
20852, United States of America）から何人も入手す
ることができる。
【００１２】pAM330は、従来知られているコリネ型細菌
由来のプラスミド、例えばpHM1519（K. Miwa et al., A
gric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)、特開昭58-1
92900号公報）とは異なる複製制御領域を有しているた
め、これらのプラスミドは不和合性を示さず、コリネ型
細菌中で共存させることができる。
由来のプラスミド、例えばpHM1519（K. Miwa et al., A
gric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)、特開昭58-1
92900号公報）とは異なる複製制御領域を有しているた
め、これらのプラスミドは不和合性を示さず、コリネ型
細菌中で共存させることができる。
【００１３】pAM330由来の温度感受性複製制御領域は、
pAM330又はpAM330から誘導されるプラスミドを変異処理
し、コリネ型細菌が生育可能な温度範囲において、低温
では自律複製でき、高温では自律複製できない変異型プ
ラスミドを選択することによって、取得することができ
る。
pAM330又はpAM330から誘導されるプラスミドを変異処理
し、コリネ型細菌が生育可能な温度範囲において、低温
では自律複製でき、高温では自律複製できない変異型プ
ラスミドを選択することによって、取得することができ
る。
【００１４】変異処理の方法としては、ヒドロキシルア
ミン等でインビトロ処理する方法（G. O. Humpherys et
al., Molec. gen. Genet., 145, 101-108 (1976)等参
照）、及びプラスミドを保持する微生物を紫外線照射ま
たはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて
いる変異剤によって処理する方法が挙げられるが、イン
ビトロ処理する方法が好ましい。
ミン等でインビトロ処理する方法（G. O. Humpherys et
al., Molec. gen. Genet., 145, 101-108 (1976)等参
照）、及びプラスミドを保持する微生物を紫外線照射ま
たはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて
いる変異剤によって処理する方法が挙げられるが、イン
ビトロ処理する方法が好ましい。
【００１５】変異処理したプラスミドの自律複製能は、
同プラスミドに抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子
を搭載させておくと、コリネ型細菌細胞中でのマーカー
遺伝子の表現型によって、判別することができる。すな
わち、変異処理したプラスミドで形質転換したコリネ型
細菌を、例えば適当な濃度で抗生物質を添加した培地で
培養したときに、生育することができれば同プラスミド
は自律複製可能であり、生育することができなければ同
プラスミドは自律複製することができない。
同プラスミドに抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子
を搭載させておくと、コリネ型細菌細胞中でのマーカー
遺伝子の表現型によって、判別することができる。すな
わち、変異処理したプラスミドで形質転換したコリネ型
細菌を、例えば適当な濃度で抗生物質を添加した培地で
培養したときに、生育することができれば同プラスミド
は自律複製可能であり、生育することができなければ同
プラスミドは自律複製することができない。
【００１６】マーカー遺伝子としては、ストレプトコッ
カス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が挙げられ
る。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマ
イシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
スペクチノマイシン耐性遺伝子が挙げられる。これらの
遺伝子は、市販のベクターpDG783、pDG646、pDG1513又
はpDG1726（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gen
e, 167, 335-337(1995)）から調製することができる。
これらのベクターは、Bacillus Genetic Stock Center,
The Ohio State University, Department of Biochemi
stry（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 4321
0 USA)から入手できる。
カス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が挙げられ
る。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマ
イシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子および
スペクチノマイシン耐性遺伝子が挙げられる。これらの
遺伝子は、市販のベクターpDG783、pDG646、pDG1513又
はpDG1726（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gen
e, 167, 335-337(1995)）から調製することができる。
これらのベクターは、Bacillus Genetic Stock Center,
The Ohio State University, Department of Biochemi
stry（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 4321
0 USA)から入手できる。
【００１７】例えば、カナマイシン耐性遺伝子は、pDG7
83を鋳型として、配列番号１及び２に示す塩基配列を有
するプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクシ
ョン（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.
J. et al., Trends Genet.,5,185 (1989)参照）を行う
ことによって、取得することができる。
83を鋳型として、配列番号１及び２に示す塩基配列を有
するプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクシ
ョン（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.
J. et al., Trends Genet.,5,185 (1989)参照）を行う
ことによって、取得することができる。
【００１８】マーカー遺伝子は、本発明のプラスミドを
用いてコリネ型細菌の染色体に目的遺伝子を効率よく組
み込む為には、コリネ型細菌中に１コピー存在するだけ
で十分な薬剤耐性を示す薬剤耐性遺伝子を含むことが好
ましい。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシ
ン耐性遺伝子は、コリネ型細菌中に１コピー存在するだ
けで十分な薬剤耐性を示す。具体的には、本発明のプラ
スミドを保持するコリネ型細菌は、好適な条件では少な
くとも25μg/mlのカナマイシンを含む培地で生育するこ
とが期待できる。
用いてコリネ型細菌の染色体に目的遺伝子を効率よく組
み込む為には、コリネ型細菌中に１コピー存在するだけ
で十分な薬剤耐性を示す薬剤耐性遺伝子を含むことが好
ましい。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシ
ン耐性遺伝子は、コリネ型細菌中に１コピー存在するだ
けで十分な薬剤耐性を示す。具体的には、本発明のプラ
スミドを保持するコリネ型細菌は、好適な条件では少な
くとも25μg/mlのカナマイシンを含む培地で生育するこ
とが期待できる。
【００１９】また、本発明のプラスミドは、エシェリヒ
ア・コリ等のエシェリヒア属細菌中でプラスミドを自律
複製可能にする複製制御領域をさらに含むことが好まし
い。このように、本発明のプラスミドにエシェリヒア・
コリで機能する複製制御領域を持たせてシャトルベクタ
ーとすることにより、プラスミドの調製、目的遺伝子を
搭載させた組換えプラスミドの調製等の操作をエシェリ
ヒア・コリを用いて行うことができる。また、pAM330又
はその誘導体をシャトルベクターとした後に変異処理を
行い、温度感受性プラスミドを取得することもできる。
ア・コリ等のエシェリヒア属細菌中でプラスミドを自律
複製可能にする複製制御領域をさらに含むことが好まし
い。このように、本発明のプラスミドにエシェリヒア・
コリで機能する複製制御領域を持たせてシャトルベクタ
ーとすることにより、プラスミドの調製、目的遺伝子を
搭載させた組換えプラスミドの調製等の操作をエシェリ
ヒア・コリを用いて行うことができる。また、pAM330又
はその誘導体をシャトルベクターとした後に変異処理を
行い、温度感受性プラスミドを取得することもできる。
【００２０】エシェリヒア・コリで機能するプラスミド
としては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHS
G298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、p
MW219、pMW218等が挙げられる。
としては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHS
G298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、p
MW219、pMW218等が挙げられる。
【００２１】プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及
び連結、形質転換、ＰＣＲ、プライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知ら
れている通常の方法を採用することができる。これらの
方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniati
s, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sec
ond Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)等に記載されている。
び連結、形質転換、ＰＣＲ、プライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知ら
れている通常の方法を採用することができる。これらの
方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniati
s, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sec
ond Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)等に記載されている。
【００２２】本発明のプラスミドとして具体的には、実
施例で得られた温度感受性プラスミドp48K、pSFKT1、pS
FKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT5及びpSFKT6が挙げられ
る。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくと
も２５℃では自律複製することができ、３７℃では自律
複製できない。
施例で得られた温度感受性プラスミドp48K、pSFKT1、pS
FKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT5及びpSFKT6が挙げられ
る。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくと
も２５℃では自律複製することができ、３７℃では自律
複製できない。
【００２３】p48Kは、配列表の配列番号１７に示す野生
型複製制御領域を含む塩基配列において、塩基番号1255
のCがTに置換される変異、塩基番号1534のCがTに置換さ
れる変異、塩基番号1866のGがAに置換される変異、塩基
番号2058のGがAに置換される変異、塩基番号2187のCがT
に置換される変異、及び塩基番号3193のGがAに置換され
る変異を有する。また、pSFKT1、pSFKT2、pSFKT3、pSFK
T4、pSFKT5及びpSFKT6は、上記変異を順に一つずつ有す
る。本発明のプラスミドは、上記変異の任意の２〜５個
の組み合わせを有するものであってもよい。配列番号１
７に示す塩基配列中にはオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）が一つ存在する。上記の変異のうち、塩基番
号1534のCからTへの置換によって、このＯＲＦによって
コードされるアミノ酸配列（配列番号１８に示す）にお
いてＮ末端から７３番目のプロリンがセリンに置換され
る。他の塩基置換は、前記アミノ酸配列においてアミノ
酸置換を起こさない。前記プロリンがセリン以外の他の
アミノ酸に置換され、コリネ型細菌が生育可能な温度範
囲において低温では自律複製でき、高温では自律複製で
きない温度感受性複製制御領域を含むプラスミドも、本
発明のプラスミドに含まれる。
型複製制御領域を含む塩基配列において、塩基番号1255
のCがTに置換される変異、塩基番号1534のCがTに置換さ
れる変異、塩基番号1866のGがAに置換される変異、塩基
番号2058のGがAに置換される変異、塩基番号2187のCがT
に置換される変異、及び塩基番号3193のGがAに置換され
る変異を有する。また、pSFKT1、pSFKT2、pSFKT3、pSFK
T4、pSFKT5及びpSFKT6は、上記変異を順に一つずつ有す
る。本発明のプラスミドは、上記変異の任意の２〜５個
の組み合わせを有するものであってもよい。配列番号１
７に示す塩基配列中にはオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）が一つ存在する。上記の変異のうち、塩基番
号1534のCからTへの置換によって、このＯＲＦによって
コードされるアミノ酸配列（配列番号１８に示す）にお
いてＮ末端から７３番目のプロリンがセリンに置換され
る。他の塩基置換は、前記アミノ酸配列においてアミノ
酸置換を起こさない。前記プロリンがセリン以外の他の
アミノ酸に置換され、コリネ型細菌が生育可能な温度範
囲において低温では自律複製でき、高温では自律複製で
きない温度感受性複製制御領域を含むプラスミドも、本
発明のプラスミドに含まれる。
【００２４】本発明のプラスミドから温度感受性複製制
御領域を取り出し、それを用いて遺伝子置換用ベクター
を調製することができる。複製制御領域は、プラスミド
の自律複製に関与する酵素がコードされる領域及びこれ
らの酵素が認識して複製反応が開始される複製開始点
（ori領域）を含む。複製制御領域は、これらの領域を
認識しない制限酵素でプラスミドを消化することにより
切り出すことができ、切り出された複製制御領域を連結
したＤＮＡは、レプリコンとして機能することができ
る。このようにして本発明のプラスミドから構築される
誘導体も、本発明に含まれる。
御領域を取り出し、それを用いて遺伝子置換用ベクター
を調製することができる。複製制御領域は、プラスミド
の自律複製に関与する酵素がコードされる領域及びこれ
らの酵素が認識して複製反応が開始される複製開始点
（ori領域）を含む。複製制御領域は、これらの領域を
認識しない制限酵素でプラスミドを消化することにより
切り出すことができ、切り出された複製制御領域を連結
したＤＮＡは、レプリコンとして機能することができ
る。このようにして本発明のプラスミドから構築される
誘導体も、本発明に含まれる。
【００２５】本発明のプラスミドは、相同組換えを利用
したＤＮＡ断片の染色体への組み込み、遺伝子置換又は
遺伝子破壊に利用することができる。例えばＤＮＡ断片
の染色体への組み込みは、次のようにして行うことがで
きる。本発明のプラスミドに、コリネ型細菌の染色体上
に存在するＤＮＡ配列と相同な配列を有するＤＮＡ断片
を連結して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラ
スミドでコリネ型細菌を形質転換する。形質転換体を低
温で培養して、前記ＤＮＡ断片と同ＤＮＡ断片と相同な
配列を有するコリネ型細菌の染色体上に存在するＤＮＡ
配列との間に相同組換えを生じさせ、前記ＤＮＡ断片が
プラスミドとともに染色体上に組み込まれた細菌を選択
する。
したＤＮＡ断片の染色体への組み込み、遺伝子置換又は
遺伝子破壊に利用することができる。例えばＤＮＡ断片
の染色体への組み込みは、次のようにして行うことがで
きる。本発明のプラスミドに、コリネ型細菌の染色体上
に存在するＤＮＡ配列と相同な配列を有するＤＮＡ断片
を連結して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラ
スミドでコリネ型細菌を形質転換する。形質転換体を低
温で培養して、前記ＤＮＡ断片と同ＤＮＡ断片と相同な
配列を有するコリネ型細菌の染色体上に存在するＤＮＡ
配列との間に相同組換えを生じさせ、前記ＤＮＡ断片が
プラスミドとともに染色体上に組み込まれた細菌を選択
する。
【００２６】上記のようにして得られたコリネ型細菌を
培養して、前記染色体に組み込まれたＤＮＡ断片と染色
体上に元来存在するＤＮＡ配列との間に相同組換えを生
じさせると、染色体上に元来存在するＤＮＡ配列はプラ
スミドとともに染色体から切り出される。切り出された
ＤＮＡ配列は、コリネ型細菌を高温で培養すると、同細
菌細胞から脱落する。こうして、導入したＤＮＡ断片と
染色体上のＤＮＡ配列を置換することができる。
培養して、前記染色体に組み込まれたＤＮＡ断片と染色
体上に元来存在するＤＮＡ配列との間に相同組換えを生
じさせると、染色体上に元来存在するＤＮＡ配列はプラ
スミドとともに染色体から切り出される。切り出された
ＤＮＡ配列は、コリネ型細菌を高温で培養すると、同細
菌細胞から脱落する。こうして、導入したＤＮＡ断片と
染色体上のＤＮＡ配列を置換することができる。
【００２７】尚、本発明において低温又は高温とは、相
対的な概念であり、コリネ型細菌が生育可能な温度であ
れば特にこれらの温度の境界は制限されない。コリネ型
細菌は、通常20℃〜36℃で生育することができる。前記
低温と高温との境界は、例えば30℃〜32℃の範囲内、よ
り具体的には約31℃である。好ましくは、低温は10〜27
℃であり、より好ましくは20〜25℃である。また、好ま
しくは高温は31〜37℃であり、より好ましくは33〜36℃
である。
対的な概念であり、コリネ型細菌が生育可能な温度であ
れば特にこれらの温度の境界は制限されない。コリネ型
細菌は、通常20℃〜36℃で生育することができる。前記
低温と高温との境界は、例えば30℃〜32℃の範囲内、よ
り具体的には約31℃である。好ましくは、低温は10〜27
℃であり、より好ましくは20〜25℃である。また、好ま
しくは高温は31〜37℃であり、より好ましくは33〜36℃
である。
【００２８】組換えプラスミドをコリネバクテリウム属
細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転
換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M. and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159(19
70)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan, C.H., Wilso
n, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., Mo
lec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., War
d,J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978);
Hinnen, A., Hicks, J.B.and Fink, G.R., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。
本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス
法（特開平2-207791号公報参照）である。
細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転
換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M. and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159(19
70)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan, C.H., Wilso
n, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., Mo
lec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., War
d,J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978);
Hinnen, A., Hicks, J.B.and Fink, G.R., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。
本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス
法（特開平2-207791号公報参照）である。
【００２９】本発明のプラスミドを導入する宿主コリネ
型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていた
が現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み
（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、また
コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウ
ム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以
下のものが挙げられる。
型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていた
が現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み
（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、また
コリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウ
ム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以
下のものが挙げられる。
【００３０】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
【００３１】＜１＞ストレプトコッカス・フェカリスの
薬剤耐性遺伝子を持つベクターの構築 ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺
伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRによ
り増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている
（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331
-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に
示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout
- Fleuryet al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型と
してPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロ
モーターを含むDNA断片を増幅した。
薬剤耐性遺伝子を持つベクターの構築 ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺
伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRによ
り増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている
（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331
-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に
示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout
- Fleuryet al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型と
してPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロ
モーターを含むDNA断片を増幅した。
【００３２】上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて
精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平
滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kit
により行なった。このDNA断片と、配列番号３および４
に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al
: Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って
得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片と
を、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligat
ion kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エ
シェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社
製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ
-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナ
マイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/
L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒
天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株
を得た。
精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平
滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kit
により行なった。このDNA断片と、配列番号３および４
に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al
: Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って
得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片と
を、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligat
ion kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エ
シェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社
製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ
-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナ
マイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/
L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒
天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株
を得た。
【００３３】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用
いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１
に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付け
た。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に
保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、
lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適し
ている。
書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用
いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１
に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付け
た。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に
保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、
lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適し
ている。
【００３４】＜２＞シャトルベクターpSFK6の構築 温度感受性複製制御領域の取得の材料として、エシェリ
シア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製
可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプ
ラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素
HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上
記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結し
た。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の
方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用い
た。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含む
M-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/
L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)に
て行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー
分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミド
DNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限
酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6
と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリと
コリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐
性を付与する。
シア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製
可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプ
ラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素
HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上
記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結し
た。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の
方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用い
た。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含む
M-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/
L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)に
て行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー
分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミド
DNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限
酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6
と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリと
コリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐
性を付与する。
【００３５】pK1の構築に用いた配列番号３、４に示す
プライマーはそれぞれEcoRV、StuI部位を有しているの
で、pSFK6をEcoRV、StuIで分解することによりカナマイ
シン耐性遺伝子のみを取り除くことができる。カナマイ
シン耐性遺伝子を取り除いたpSFK6と、ストレプトコッ
カス・フェカリス由来エリスロマイシン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、又はスペクチノマイシン耐
性遺伝子を有するpDG646、pDG1513、及びpDG1726（Anne
-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337
(1995)）をそれぞれBamHIとClaI、ClaIとEcoRI、PstIと
BamHIで切断し、平滑末端化したものとを連結し、pSFE
6、pSFT6、pSFS6を得た。これらはそれぞれ宿主にエリ
スロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、又はスペク
チノマイシン耐性を付与する。
プライマーはそれぞれEcoRV、StuI部位を有しているの
で、pSFK6をEcoRV、StuIで分解することによりカナマイ
シン耐性遺伝子のみを取り除くことができる。カナマイ
シン耐性遺伝子を取り除いたpSFK6と、ストレプトコッ
カス・フェカリス由来エリスロマイシン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、又はスペクチノマイシン耐
性遺伝子を有するpDG646、pDG1513、及びpDG1726（Anne
-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337
(1995)）をそれぞれBamHIとClaI、ClaIとEcoRI、PstIと
BamHIで切断し、平滑末端化したものとを連結し、pSFE
6、pSFT6、pSFS6を得た。これらはそれぞれ宿主にエリ
スロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、又はスペク
チノマイシン耐性を付与する。
【００３６】＜３＞温度感受性複製制御領域をもつプラ
スミドの取得 pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒ
ドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humphery
s et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108(1976)等
参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2B
プレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転
換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)
にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート
上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラ
スミドを回収しp48Kと命名した。
スミドの取得 pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒ
ドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humphery
s et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108(1976)等
参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2B
プレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転
換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)
にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート
上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラ
スミドを回収しp48Kと命名した。
【００３７】＜４＞温度感受性複製制御領域の塩基配列
の決定 野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および
温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kにつ
いて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定し
た。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてA
BI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結
果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御
領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。
pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領
域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号１
７に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感
受性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号１９に示
す。また、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによっ
てコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８及び２０
に示す。温度感受性複製制御領域では、配列上の1255番
目のCがTに、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、20
58番目のGがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがA
に変異している。このうちアミノ酸変異を伴うものは15
34番目の変異点のみであり、プロリンからセリンへの置
換を引き起こす。
の決定 野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および
温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kにつ
いて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定し
た。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてA
BI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結
果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御
領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。
pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領
域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号１
７に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感
受性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号１９に示
す。また、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによっ
てコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８及び２０
に示す。温度感受性複製制御領域では、配列上の1255番
目のCがTに、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、20
58番目のGがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがA
に変異している。このうちアミノ酸変異を伴うものは15
34番目の変異点のみであり、プロリンからセリンへの置
換を引き起こす。
【００３８】＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベ
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FKに導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法
（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res.,
20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に
示す。1255番目のC→Tの変異を導入するために、配列番
号５および６に示すプライマーの組み合わせと、配列番
号７および８に示すプライマーの組み合わせを用いて、
pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物
はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収
することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は
宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDN
Aを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として
配列番号９および１０に示すプライマーを用いてPCR反
応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解し、
アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA断片
を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分解
し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのDNA
断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結し、
エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造
社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/ml
を含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニー
を釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形
質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調製し、
塩基配列を決定し、配列番号１１に示す配列の1255番目
のCがTに変異していることを確認した。このプラスミド
をpSFKT1と名付けた（ず ３）。同様に、表１に示すプ
ライマーの組み合わせにて、5種類の変異が一つずつ導
入されたプラスミド、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT
5、pSFKT6を得た。
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FKに導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法
（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res.,
20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に
示す。1255番目のC→Tの変異を導入するために、配列番
号５および６に示すプライマーの組み合わせと、配列番
号７および８に示すプライマーの組み合わせを用いて、
pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物
はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収
することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は
宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDN
Aを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として
配列番号９および１０に示すプライマーを用いてPCR反
応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解し、
アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA断片
を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分解
し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのDNA
断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結し、
エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造
社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/ml
を含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロニー
を釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形
質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調製し、
塩基配列を決定し、配列番号１１に示す配列の1255番目
のCがTに変異していることを確認した。このプラスミド
をpSFKT1と名付けた（ず ３）。同様に、表１に示すプ
ライマーの組み合わせにて、5種類の変異が一つずつ導
入されたプラスミド、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT
5、pSFKT6を得た。
【００３９】
【表１】
【００４０】＜６＞温度感受性変異を有するシャトルベ
クターの構築 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
をpSFKT2で形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM
2Bプレートに塗布し25℃にて二晩培養した。出現したコ
ロニーを釣り上げ、単コロニー分離した後、CM2B液体培
地に接種し、カナマイシン非存在下で25℃および34℃に
て培養し、15世代分裂後のプラスミドの保持率を調べ
た。その結果、表２に示すように、15世代分裂後、25℃
ではプラスミドが脱落していないのに対し、34℃ではプ
ラスミドが保持されないことが確認できた。
クターの構築 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
をpSFKT2で形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM
2Bプレートに塗布し25℃にて二晩培養した。出現したコ
ロニーを釣り上げ、単コロニー分離した後、CM2B液体培
地に接種し、カナマイシン非存在下で25℃および34℃に
て培養し、15世代分裂後のプラスミドの保持率を調べ
た。その結果、表２に示すように、15世代分裂後、25℃
ではプラスミドが脱落していないのに対し、34℃ではプ
ラスミドが保持されないことが確認できた。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌由来の新規
な温度感受性プラスミドが提供される。本プラスミド
は、従来知られている他のプラスミドとコリネ型細菌細
胞中で共存することができるので、そのようなプラスミ
ドを保持する微生物の育種等に有用である。
な温度感受性プラスミドが提供される。本プラスミド
は、従来知られている他のプラスミドとコリネ型細菌細
胞中で共存することができるので、そのようなプラスミ
ドを保持する微生物の育種等に有用である。
【００４３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> コリネ型細菌の温度感受性プラスミド（Temperature Sensitive Plasmid for Coryneform Bacteria） <130> P-6261 <141> 1999-03-16 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００４４】 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 1 cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32
【００４５】 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 2 cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30
【００４６】 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 3 gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26
【００４７】 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 4 aggccttttt ttaaggcagt tattg 25
【００４８】 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 5 aaacccgggc tacgtctgat gctttgaatc 30
【００４９】 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 6 tttgatcccc cgttaacgtc aacaacc 27
【００５０】 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 7 ttttcccggg agcttgccac accccgag 28
【００５１】 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 8 aagacaacgg gcacaacatc cgcac 25
【００５２】 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 9 gggggtcatc tctggctgaa ttgg 24
【００５３】 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 10 gtctgacgat gaactcaagg catttgagg 29
【００５４】 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 11 aaaaccgcgt ctaaagggtc gtac 24
【００５５】 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 12 gcgttcgtct tggtcacgtg gg 22
【００５６】 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 13 ttggtgcatc aaacaagatg tag 23
【００５７】 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 14 tgtcctacat cttgtttgat gcaccaa 27
【００５８】 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 15 gaggttttca ccgttctgca tgcc 24
【００５９】 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 16 aactcaccgc cctgcaattc aac 23
【００６０】 <210> 17 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 17 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 ccctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacacccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca cct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gcg ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aag ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tcc tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcgaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc ttcggctagt ttttgcttct ccgctttgat gagttggtca acttcgtgtt 3998 gggagaggtc gtttttcacg atgcgtcgaa tgtggtcgtt gtgggtgctg agttggtgtg 4058 agaggtagtg gggttctggg atttcggcga gttggtcgag gttggtgtag tgcgggttgc 4118 ggcctggttg gttgggttcg ctggggaggt cgatgtatcc ggttgagtct ccggcgtggt 4178 tgaagtgaat taggcgttgg tagccgtatt cctggttggg gaggtacgac agaatgagga 4238 agtttggtgc ttctcctgca atgagtcgtg cgtgttcgta gttcggtact gggtcgtgct 4298 cggggagaat gttcttttgg gtcatggctt ctctttctgt tgctctgtaa gtccgtatgt 4358 gggcatggga aagccccggc aaccctttgg gtcaaccggg gctagatagt cgcttagaat 4418 ggcttctagg ctgcgtctcg gggtgtggc 4447
【００６１】 <210> 18 <211> 427 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 18 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425
【００６２】 <210> 19 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 19 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 tcctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacatccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca tct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gca ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aaa ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tct tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcaaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc ttcggctagt ttttgcttct ccgctttgat gagttggtca acttcgtgtt 3998 gggagaggtc gtttttcacg atgcgtcgaa tgtggtcgtt gtgggtgctg agttggtgtg 4058 agaggtagtg gggttctggg atttcggcga gttggtcgag gttggtgtag tgcgggttgc 4118 ggcctggttg gttgggttcg ctggggaggt cgatgtatcc ggttgagtct ccggcgtggt 4178 tgaagtgaat taggcgttgg tagccgtatt cctggttggg gaggtacgac agaatgagga 4238 agtttggtgc ttctcctgca atgagtcgtg cgtgttcgta gttcggtact gggtcgtgct 4298 cggggagaat gttcttttgg gtcatggctt ctctttctgt tgctctgtaa gtccgtatgt 4358 gggcatggga aagccccggc aaccctttgg gtcaaccggg gctagatagt cgcttagaat 4418 ggcttctagg ctgcgtctcg gggtgtggc 4447
【００６３】 <210> 20 <211> 427 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 20 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425
【図１】プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図２】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpSFKT1の構築過程を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２
１）
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】前記マーカー遺伝子としては、ストレプト
コッカス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が好まし
く、具体的にはカナマイシン耐性遺伝子、テトラサイク
リン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子が
挙げられる。
コッカス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が好まし
く、具体的にはカナマイシン耐性遺伝子、テトラサイク
リン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子が
挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】マーカー遺伝子としては、ストレプトコッ
カス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が挙げられ
る。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子遺伝子、テト
ラサイクリン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性
遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、市販のベクタ
ーpDG783、pDG1513又はpDG1726（Anne-Marie Guerout-F
leury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）から調製す
ることができる。これらのベクターは、Bacillus Genet
ic Stock Center, The Ohio State University, Depart
ment of Biochemistry（484 West Twelfth Avenue, Col
umbus, Ohio 43210 USA)から入手できる。
カス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子が挙げられ
る。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子遺伝子、テト
ラサイクリン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性
遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、市販のベクタ
ーpDG783、pDG1513又はpDG1726（Anne-Marie Guerout-F
leury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）から調製す
ることができる。これらのベクターは、Bacillus Genet
ic Stock Center, The Ohio State University, Depart
ment of Biochemistry（484 West Twelfth Avenue, Col
umbus, Ohio 43210 USA)から入手できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】pK1の構築に用いた配列番号３、４に示す
プライマーはそれぞれEcoRV、StuI部位を有しているの
で、pSFK6をEcoRV、StuIで分解することによりカナマイ
シン耐性遺伝子のみを取り除くことができる。カナマイ
シン耐性遺伝子を取り除いたpSFK6と、ストレプトコッ
カス由来テトラサイクリン耐性遺伝子、又はスペクチノ
マイシン耐性遺伝子を有するpDG1513、及びpDG1726（An
ne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-33
7(1995)）をそれぞれClaIとEcoRI、PstIとBamHIで切断
し、平滑末端化したものとを連結し、pSFT6、pSFS6を得
た。これらはそれぞれ宿主にテトラサイクリン耐性、又
はスペクチノマイシン耐性を付与する。
プライマーはそれぞれEcoRV、StuI部位を有しているの
で、pSFK6をEcoRV、StuIで分解することによりカナマイ
シン耐性遺伝子のみを取り除くことができる。カナマイ
シン耐性遺伝子を取り除いたpSFK6と、ストレプトコッ
カス由来テトラサイクリン耐性遺伝子、又はスペクチノ
マイシン耐性遺伝子を有するpDG1513、及びpDG1726（An
ne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-33
7(1995)）をそれぞれClaIとEcoRI、PstIとBamHIで切断
し、平滑末端化したものとを連結し、pSFT6、pSFS6を得
た。これらはそれぞれ宿主にテトラサイクリン耐性、又
はスペクチノマイシン耐性を付与する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベ
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FKに導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法
（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res.,
20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に
示す。1255番目のC→Tの変異を導入するために、配列番
号５および６に示すプライマーの組み合わせと、配列番
号７および８に示すプライマーの組み合わせを用いて、
pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物
はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収
することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は
宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDN
Aを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として
配列番号１５および１６に示すプライマーを用いてPCR
反応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解
し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA
断片を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分
解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのD
NA断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結
し、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝
酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μ
g/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロ
ニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得
た。形質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調
製し、塩基配列を決定し、配列番号１７に示す配列の12
55番目のCがTに変異していることを確認した。このプラ
スミドをpSFKT1と名付けた（図３）。同様に、表１に示
すプライマーの組み合わせにて、5種類の変異が一つず
つ導入されたプラスミド、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pS
FKT5、pSFKT6を得た。
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FKに導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方法
（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Res.,
20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以下に
示す。1255番目のC→Tの変異を導入するために、配列番
号５および６に示すプライマーの組み合わせと、配列番
号７および８に示すプライマーの組み合わせを用いて、
pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増幅産物
はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから回収
することにより精製した。ゲルからのDNA断片の回収は
宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。精製したDN
Aを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型として
配列番号１５および１６に示すプライマーを用いてPCR
反応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで完全分解
し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.2KbのDNA
断片を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluIで完全分
解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.8KbのD
NA断片を回収した。得られたDNA断片を混合して連結
し、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝
酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μ
g/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現したコロ
ニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得
た。形質転換株からアルカリ法を用いてプラスミドを調
製し、塩基配列を決定し、配列番号１７に示す配列の12
55番目のCがTに変異していることを確認した。このプラ
スミドをpSFKT1と名付けた（図３）。同様に、表１に示
すプライマーの組み合わせにて、5種類の変異が一つず
つ導入されたプラスミド、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pS
FKT5、pSFKT6を得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】＜６＞シャトルベクターの温度感受性の確
認 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
をpSFKT2で形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM
2Bプレートに塗布し25℃にて二晩培養した。出現したコ
ロニーを釣り上げ、単コロニー分離した後、CM2B液体培
地に接種し、カナマイシン非存在下で25℃および34℃に
て培養し、15世代分裂後のプラスミドの保持率を調べ
た。その結果、表２に示すように、15世代分裂後、25℃
ではプラスミドが脱落していないのに対し、34℃ではプ
ラスミドが保持されないことが確認できた。
認 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
をpSFKT2で形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM
2Bプレートに塗布し25℃にて二晩培養した。出現したコ
ロニーを釣り上げ、単コロニー分離した後、CM2B液体培
地に接種し、カナマイシン非存在下で25℃および34℃に
て培養し、15世代分裂後のプラスミドの保持率を調べ
た。その結果、表２に示すように、15世代分裂後、25℃
ではプラスミドが脱落していないのに対し、34℃ではプ
ラスミドが保持されないことが確認できた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 木村 英一郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA80 CA01 DA06 DA10 EA04 FA15 FA20 4B065 AA22X AA22Y AA24X AA26X AA49Y AA99Y AB01 AC10 AC14 BA16 CA23 CA41 CA60
Claims (12)
- 【請求項１】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＴＣＣ１３８６９が保持するプラスミドｐＡＭ３
３０に由来する複製制御領域であって、コリネ型細菌中
で、同細菌が生育可能な温度範囲において低温では自律
複製でき、高温では自律複製できない温度感受性複製制
御領域と、マーカー遺伝子とを含むプラスミド。 - 【請求項２】 前記マーカー遺伝子がストレプトコッカ
ス属細菌に由来する抗生物質耐性遺伝子である請求項１
記載のプラスミド。 - 【請求項３】 エシェリヒア属細菌中で自律複製可能に
する複製制御領域をさらに含む請求項１又は２記載のプ
ラスミド。 - 【請求項４】 前記低温と高温との境界が、３０℃〜３
２℃の範囲内にある請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項５】 コリネ型細菌中で少なくとも２５℃では
自律複製することができ、３７℃では自律複製できない
請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項６】 前記ストレプトコッカス属細菌に由来す
る抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、エ
リスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝
子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子から選ばれる請
求項２記載のプラスミド。 - 【請求項７】 前記温度感受性複製制御領域は、配列表
の配列番号１７に示す塩基配列中に含まれ、かつ、同塩
基配列において塩基番号１２５５のＣがＴに置換される
変異、塩基番号１５３４のＣがＴに置換される変異、塩
基番号１８６６のＧがＡに置換される変異、塩基番号２
０５８のＧがＡに置換される変異、塩基番号２１８７の
ＣがＴに置換される変異、及び塩基番号３１９３のＧが
Ａに置換される変異から選ばれる変異を有することを特
徴とする請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項８】 前記温度感受性複製制御領域は、配列番
号１８に示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７３の
プロリンが他のアミノ酸に置換される変異を有するアミ
ノ酸配列をコードするコード領域を含むことを特徴とす
る請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項９】 配列表の配列番号１７に示す塩基配列中
に含まれるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴＣＣ１３８６９が保持するプラスミドｐＡＭ３３０
に由来する複製制御領域であって、同塩基配列において
塩基番号１２５５のＣがＴに置換される変異、塩基番号
１５３４のＣがＴに置換される変異、塩基番号１８６６
のＧがＡに置換される変異、塩基番号２０５８のＧがＡ
に置換される変異、塩基番号２１８７のＣがＴに置換さ
れる変異、及び塩基番号３１９３のＧがＡに置換される
変異から選ばれる変異を有し、コリネ型細菌が生育可能
な温度範囲において低温では自律複製でき、高温では自
律複製できない温度感受性複製制御領域。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１７に示す塩基配列
中に含まれるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＴＣＣ１３８６９が保持するプラスミドｐＡＭ３３
０に由来する複製制御領域であって、同塩基配列に含ま
れるコード領域によりコードされるアミノ酸配列におい
てＮ末端から７３番目のプロリンが他のアミノ酸に置換
される変異を有し、コリネ型細菌が生育可能な温度範囲
において低温では自律複製でき、高温では自律複製でき
ない温度感受性複製制御領域。 - 【請求項１１】 ＤＮＡ断片が染色体上に組み込まれた
コリネ型細菌の創製方法であって、下記工程を含む方
法： （ａ）請求項３記載のプラスミドに、コリネ型細菌の染
色体上に存在するＤＮＡ配列と相同な配列を有するＤＮ
Ａ断片を連結して得られる組換えプラスミドを、コリネ
型細菌細胞に導入し、（ｂ）前記細菌を、前記プラスミ
ドが自律複製できる温度で培養して、前記ＤＮＡ断片
と、同ＤＮＡ断片と相同な配列を有するコリネ型細菌の
染色体上に存在するＤＮＡ配列との間に相同組換えを生
じさせ、そして（ｃ）前記ＤＮＡ断片が前記プラスミド
とともに染色体上に組み込まれた細菌を選択する。 - 【請求項１２】 さらに下記工程を含む請求項９記載の
方法： （ｄ）前記細菌を培養して、前記染色体に組み込まれた
ＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片と相同な配列を有するコ
リネ型細菌の染色体上に元来存在するＤＮＡ配列との間
に相同組換えを生じさせ、（ｅ）前記細菌を高温で培養
して、染色体上に元来存在するＤＮＡ配列と前記プラス
ミドを染色体から脱落させ、そして（ｆ）染色体上のＤ
ＮＡ配列が前記ＤＮＡ断片に置換された細菌を選択す
る。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11069896A JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 1999-03-16 | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
| US09/521,668 US6303383B1 (en) | 1999-03-16 | 2000-03-08 | Temperature sensitive plasmid for coryneform bacteria |
| BR0001326-9A BR0001326A (pt) | 1999-03-16 | 2000-03-15 | Plasmìdeo, região de controle de replicação sensìvel a temperatura, e, processo para criar uma bactéria corineforme |
| DE60037949A DE60037949D1 (de) | 1999-03-16 | 2000-03-16 | Thermosensitives Plasmid für coryneforme Bakterien |
| EP00105326A EP1038966B1 (en) | 1999-03-16 | 2000-03-16 | Temperature sensitive plasmid for coryneform bacteria |
| DE60037949T DE60037949T4 (de) | 1999-03-16 | 2000-03-16 | Thermosensitives Plasmid für coryneforme Bakterien |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11069896A JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 1999-03-16 | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000262288A true JP2000262288A (ja) | 2000-09-26 |
Family
ID=13415936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11069896A Pending JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 1999-03-16 | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6303383B1 (ja) |
| EP (1) | EP1038966B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000262288A (ja) |
| BR (1) | BR0001326A (ja) |
| DE (2) | DE60037949T4 (ja) |
Cited By (10)
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