DE69328100T2

DE69328100T2 - Biodegradierbare führungskanäle zur verwendung als chirurgische hilfsmittel in gewebewiederherstellung

Info

Publication number: DE69328100T2
Application number: DE69328100T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Callegaro; Franco Dorigatti; Giorgio Favaro; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1993-08-03
Publication date: 2000-12-14
Anticipated expiration: 2013-08-04
Also published as: CA2140888A1; ATE190507T1; EP0652778B1; KR100261002B1; AU4706493A; JPH07509386A; WO1994003212A1; EP0652778A1; ES2144460T3; DE69328100D1; JP3579707B2; AU690891B2; IT1259141B; CA2140888C; ITPD920144A0; ITPD920144A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft biodegradierbare Führungskanäle, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zu ihrer Verwendung in verschiedenen chirurgischen Anwendungen, besonders in der Mikrochirurgie anatomischer Stellen, wo Unterbrechungen und/oder ein Verlust von Substanz aufgetreten sind.

BESCHREIBUNG DES BETREFFENDEN FACHGEBIETS

Forschung, um alternative chirurgische Techniken zur Behandlung insbesondere von Läsionen peripherer Nerven und verschiedener Stellen der Anatomie, wo Unterbrechungen und/oder ein Verlust von Substanz aufgetreten sind, wie in der Sehnenchirurgie, zu identifizieren, wurde in der Literatur beschrieben. Die meisten der bisher durchgeführten Untersuchungen richteten sich spezifisch auf die Behandlung einer Verletzung peripherer Nerven, wie nachstehend genauer beschrieben. Besondere Beachtung gilt jetzt jedoch der Sehnenchirurgie, für die die Verwendung von Gelatineröhrchen, Cellophan oder Polyethylenstrukturen, die Abstossungsreaktionen hervorrufen, schon beschrieben wurde. In jüngerer Zeit wurden Materialien, die aus regenerierter, oxidierter Cellulose zusammengesetzt sind, untersucht (Meislin R. J. et al., J. of Applied Biomaterials 1, 13-19, 1990).
Ein beachtlicher Teil solcher Forschung richtete sich jedoch auf den Einsatz von Führungskanälen oder röhrenförmigen Ersatzstücken zur Verwendung als Unterstützungen in der Regeneration geschädigter Nerven bei der Behandlung von Verletzungen peripherer Nerven.
Diese röhrenförmigen Ersatzstücke erlauben, daß die zwei getrennten Nervenenden in Nähe zueinander gehalten werden, so daß sie es auf diese Weise dem Nerven ermöglichen, unter geeigneten biologischen Bedingungen zu regenerieren. Darüberhinaus hemmten oder verzögerten diese Röhren die Effekte der mit dem Bindegewebe verbundenen Infiltration. Einige Führungskanäle oder Ersatzstücke, die für diese Zwecke aus verschiedenen Polymeren oder deren Derivaten hergestellt wurden, sind schon bekannt (Ducker et al., Vol. 28, J. Neurosurg., 582-587, 1968; Midgley et al., Vol. 19, Surgical Forum, 519-528, 1968; Lundborg et al., Vol. 41, J. Neuropath. in Exp. Neurol., 412-422, 1982; Molander et al., Vol. 5, Muscle & Nerve, 54-58, 1982; Uzman et al., Vol. 9, J. Neurosci. Res. 325-338, 1983; Nyilas et al., Vol. 29, Transactions Am. Soc. Artif. Internal Organs, 307-313, 1983; und U. S. Patent 4,534,349, 1985).
Um die funktionelle Wiederherstellung des geschädigten Nerven zu erhöhen, sind röhrenförmige Ersatzstücke mit biologischen Polymeren und Gemischen derselben, üblicherweise für die Nervenreparatur verwendet, hergestellt worden (Madison et al., Vol. 44, Brain Res., 325-334, 1985; Yannas et al., Vol. 11, Trans. soc. Biomat. 146, 1985; Williams et al., Vol. 264, J. Comp. Neurol. 284-290, 1987). Die Möglichkeit des Einschlusses verschiedener Wachstumsfaktoren in diese röhrenförmigen Ersatzstücke ist studiert worden (Politis et al., Vol. 253, Brain Res. 1-12, 1982; Aebischer et al., PCT WO 90/05552). Die Nachteile, Wachstumsfaktoren in diese röhrenförmigen Ersatzstücke mittels bekannter Verfahren einzuschließen, liegen an der Tatsache, daß sie in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind; ihre Halbwertszeiten werden eher in Stunden als in Wochen gemessen, wobei die Messung in Wochen die zur vollständigen Nervenregeneration notwendige Zeit wäre. Unter diesen Bedingungen kann die Freisetzung dieser Faktoren nicht gesteuert werden, und sie werden oft in Bolusform verabreicht, was keine ausreichend lang andauernde für die Regeneration erforderliche Stimulierung der Nervenzellen erlaubt.
Ein weiterer Schritt vorwärts im Gebiet röhrenförmiger Ersatzstücke stellt die Herstellung von Polymeren dar, mit denen es möglich ist, biokompatible und biodegradierbare Ersatzstücke herzustellen, die gemäß des Grades chemischer Modifikation des natürlichen Polymers und der Art des verwendeten Ersatzes an Ort und Stelle bleiben (Favaro G. et al., XXXVI Trans. Am. Soc. Artif. Organs, M291-M294, 1990).
In diesem Fall werden die zwei Nervenstümpfe auch innerhalb des röhrenförmigen Kanals durch Nähte befestigt. Darüberhinaus haben diese Materialien den zusätzlichen Vorteil, eine Führung zur Nervenregeneration bereitzustellen, mit der Möglichkeit, das neue Wachstum in geeigneter Umgebung stattinden zu lassen, sobald das verwendete Material absorbiert wurde. WO-A-9213579 offenbart biodegradierbare und bioabsorbierbare Führungskanäle, umfassend Hyaluronsäureester und verflochten in einer Röhrenform auf sechs Nadeln.
Verschiedene Verfahren wurden zur Herstellung von Führungskanälen mit biokompatiblen und bioabsorbierbaren Materialien vorgeschlagen. Die einfachste und schnellste Technik ist die Extrusion einer Lösung eines biokompatiblen und bioabsorbierbaren Materials durch geeignete Löcher.
Grenzen der Verwendung von Führungskanälen, die mit einigen biokompatiblen und bioabsorbierbaren Materialien und durch Extrusion oder andere Herstellungsverfahren hergestellt sind, ist ihre mehr oder weniger ausgeprägte Neigung zu reißen, wenn die Nervenstümpfe an sie angenäht werden.
Es besteht daher ein Bedarf an biokompatiblen und bioabsorbierbaren Führungskanälen mit besonderen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften, insbesondere für die Führungskanäle, die spezifische trophische Faktoren und/oder Verbindungen mit Bioaktivität für ein spezifisches anatomisches Ziel enthalten, die es ihnen erlauben, mit großem Vorteil in der Chirurgie und Mikrochirurgie der peripheren Nerven oder anderer anatomischer Gebiete verwendet zu werden, in denen Unterbrechungen und/oder ein Verlust von Substanz aufgetreten sind und in denen es notwendig ist, das Auftreten und Wiederauftreten von postoperativen Verwachsungen zu verhindern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt daher Führungskanäle verflochtener röhrenförmiger Membranen, gebildet durch eine Flechttechnik, mit wertvollen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften bereit. Kraft des jetzt gemachten technologischen Fortschritts können die neuen Führungskanäle der vorliegenden Erfindung mit besonderen Festigkeiten, viel geringeren Dicken und der Möglichkeit, die Querschnitte davon zu variieren, hergestellt werden. Darüberhinaus können diese verflochtenen röhrenförmigen Membranen biologisch aktive Moleküle enthalten, die im Zuge des Abbaus der Röhre freigesetzt werden sollen, wie pharmakologisch auf periphere Nerven wirkende Wachstumsfaktoren und/oder irgendwelche Substanzen oder Verbindungen mit spezifischer Bioaktivität auf anatomische Ziele des Führungskanals.
Die physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften der neuen Führungskanäle können zu großem Vorteil in einer großen Vielzahl von chirurgischen und mikrochirurgischen Situationen bei peripheren Nerven und solchen anatomischen Regionen verwendet werden, wo insbesondere dank der physikalisch-chemischen Eigenschaften der primären Komponente der Röhren die Verwendung der Führungskanäle sehr vorteilhaft sein kann aufgrund ihrer Fähigkeit, das Auftreten und Wiederauftreten postchirurgischer Verwachsung, wie in der Sehnenchirurgie, zu verhindern.
Ein weiterer Bereich der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der ausführlichen Beschreibung und den nachstehend bereitgestellten Abbildungen sichtbar werden. Es sollte jedoch verstanden werden, daß die ausführliche Beschreibung und spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung andeuten, zur Veranschaulichung angegeben sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die obenstehenden und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung, die in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen durchgeführt wird, besser verstanden werden.
Fig. 1 ist ein schematisches Schaubild des Apparats, der zur Herstellung der zusammengesetzten Führungskanäle der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Fig. 2 zeigt die Reabsorption in vivo des zusammengesetzten Führungskanals, der in Beispiel 10 verwendet wird, zehn Tage nach Implantation.
Fig. 3 zeigt die axonale Regeneration des beschädigten Nervs vier Wochen nach Implantation des zusammengesetzten Kanals, der in Beispiel 10 verwendet wird.
Fig. 4 zeigt die Wiederverbindung des Nerven in Neurorrhaphy peripherer Nerven unter Verwendung des Führungskanals in Beispiel 11. Die histologische Beobachtung wurde 20 Tage nach der Operation durchgeführt.
Fig. 5 zeigt die Anwesenheit regenerierter Axone in Höhe des Transplantats, die durch Verwendung des Führungskanals in Beispiel 11 erhalten wurden. Die Anwesenheit von Axonen wurde durch die Verwendung von Antineurofilament-Antikörpern gezeigt. Die Beobachtung wurde 20 Tage nach der Operation durchgeführt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung wird bereitgestellt, um dem Fachmann zu helfen, die vorliegende Erfindung durchzuführen. Trotzdem sollte die folgende ausführliche Beschreibung nicht aufgefaßt werden, die vorliegende Erfindung übermäßig einzuschränken.
Die Führungskanäle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen biokompatible und bioabsorbierbare Materialien, die Ausmaße zwischen 5 und 150 mm Länge, vorzugsweise 20 mm, einen Innendurchmesser zwischen 1 und 15 mm, vorzugsweise 1.5-3 mm, eine Dicke zwischen 50 und 1,000 um, vorzugsweise 400 um, und ein Gewicht zwischen 8 und 80 mg, vorzugsweise 20 mg, entsprechend 4-40 mg/cm, vorzugsweise 10 mg/cm, besitzen.
Die Führungskanäle sind aus einer Matrix biokompatiblen und bioabsorbierbaren Materials zusammengesetzt, in die eine röhrenförmige Verstärkungsstruktur eines einzelnen Fadens oder verflochtene Fäden des gleichen oder verschiedener biokompatibler und bioabsorbierbarer Materialien eingebettet sind. Die Verstärkungsstruktur, die als Schutz gegen Zerreißen, verursacht durch Nahtfäden oder chirurgische Nadeln, und als eine Verstärkung dient, ist aus einem Faden zusammengesetzt, der mit den üblichen Verfahren trockener oder nasser Extrusion hergestellt wurde und einfädig oder mehrfädig sein kann, möglicherweise verdreht oder verbunden mit anderen Fäden, die aus anderen Materialien bestehen, solange sie auch biokompatibel und bioabsorbierbar sind.
Dieser Faden muß ein minimalen Wert von etwa 120 Denier (UNI 8517/84), eine minimale Zugfestigkeit beim Zerreißen von etwa 0.6 gr/Denier und eine minimale Dehnung von etwa 3% (UNI 1932/86) besitzen. Die minimale Anzahl von Fäden, aus denen das Gewebe besteht, beträgt 8, die bevorzugte Anzahl 16, so daß eine besonders widerstandsfähige Struktur erhalten wird. Das Denier dieses Fadens kann zwischen 120 Denier und 600 Denier liegen; die Zugfestigkeit beim Zerreißen kann zwischen 0.6 gr/Denier bis 3.5 gr/Denier liegen; die minimale Dehnung kann zwischen 3% und 10% liegen; und die Anzahl von Fäden, aus denen das röhrenförmige Gewebe besteht, kann zwischen 8 und 16 liegen.
Die Matrix biokompatiblen und bioabsorbierbaren Materials bedeckt die Verstärkungsröhre vollständig. Um die Dicke des Führungskanals zu verändern und um ein besonders feines Produkt zu erhalten, kann der Führungskanal mit der polymeren Matrix durch Aufsprühen bedeckt werden. Wie vorstehend diskutiert, umfassen sowohl die röhrenförmige Struktur als auch die Matrix biokompatible und bioabsorbierbare Materialien.
Diese Führungskanäle umfassen semisynthetische Materialien, die von natürlichen sauren Polysacchariden stammen, wie semisynthetische Derivate der Hyaluronsäure (HY), insbesondere Esterderivate derselben, wie in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0216453 und in dem U. S. Patent Nr. 4,851,521 beschrieben. Ein Charakteristikum, das diese Materialien besonders geeignet zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung macht, besteht darin, daß sie keinerlei Abstossungserscheinungen hervorrufen, da sie nicht immunogen sind, und keinerlei thrombotische Wirkung hervorrufen. Die Führungskanäle der vorliegenden Erfindung können sowohl von vollständigen Estern und partiellen Estern der Hyaluronsäure erhalten werden, d. h. wasserunlösliche Produkte mit dem beachtlichen Vorteil, Produkte oder Biomaterialien zu bilden, die im Körper absorbierbar sind (d. h. bioabsorbierbar) und die im Organismus selbst abbaubar sind, wobei sie in Polymere umgewandelt werden, die in der Natur vorkommen (d. h. sie sind biokompatibel). Solche HY- Ester können verwendet werden, um sowohl die röhrenförmige Verstärkungstruktur als auch die umgebende polymere Matrix zu bilden.
Darüberhinaus sind biologisch aktive Moleküle, die verwendet werden können, wenn nötig, um Führungskanäle gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, insbesondere solche Faktoren, die die Regeneration, das Wachstum und/oder die Heilung von geschädigtem Nervengewebe erhöhen oder stimulieren. In der Tat sind verschiedene Faktoren, die die Nervenregeneration stimulieren und verstärken, bekannt (Wolicke et al., Vol. 83, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 3012-3016, 1986; Rydel et al., Vol. 1, J. Neurosci. 3639-3653, 1988; Levi- Montalcini, Vol. 237, Science, 1154-1162, 1987 und darin zitierte Referenzen; Brooker et al., Muscle and Nerve 13, 785-800, 1990).
Solche Wachstumsfaktoren schließen Nervenwachstumsfaktor (NGF), basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) in seiner sauren oder basischen Form, ciliären neurotrophischen Faktor (CNTF), aus dem Gehirn stammenden neurotrophischen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4 (NT-4) ein. Solche Wachstumsfaktoren können mittels rekombinanter DNA-Techniken erhalten werden und können in verkürzten, chimären oder monomeren Formen verwendet werden.
Darüberhinaus können Führungskanäle gemäß der vorliegenden Erfindung Verbindungen mit spezifischer Bioaktivität für das anatomische Ziel, an dem die Führungskanäle verwendet werden sollen, enthalten, wie es in Fällen von Führungskanälen für geschädigte Nerven geschehen kann, die von der Verwendung einer Struktur profitieren, die Moleküle enthält, wie natürliche Ganglioside oder innere Ester der Ganglioside, wie in EP 0072722 beschrieben, oder Ester- oder Amidderivate von Gangliosiden, wie in EP 0167449 beschrieben.
Diese biologisch aktiven Moleküle können in den Führungskanal durch Koextrusion mit dem Faden, den die röhrenförmige Verstärkungsstruktur umfaßt, oder durch ihre Solubilisierung in der Matrixlösung eingefügt werden.

HERSTELLUNG DER FÜHRUNGSKANÄLE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Die Führungskanäle der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung der Technik des Verflechtens von Fäden hergestellt, um eine Struktur zu erhalten, die besonders widerstandsfähig sowohl gegen statische als auch dynamische Beanspruchung ist. Gemäß des verwendeten Verfahrens wird der Faden auf Spulen aufgerollt, die zur Verwendung auf der Fädelmaschine geeignet sind. Die Anzahl der verwendeten Spulen variiert zwischen 8 und 16 gemäß der/des erforderlichen Widerstandsfähigkeit, Gewichts und Größe des fertigen Führungskanals. Die Spulen werden in die entsprechende Stelle auf der Maschine eingesetzt, die dann angeschaltet wird. Das verwobene röhrenförmige Produkt wird dann in 200 mm- Abschnitte geschnitten und auf einem Stahlstab plaziert (AISI 316 elektropoliert). Dieser Apparat ist im Schaubild der Fig. 1 dargestellt.
Unter Verwendung der in Fig. 1 dargestellten Maschine wird der Stahlstab, über den eine verflochtene Röhre übergezogen ist, in seiner Achse montiert und mittels des Motors rotiert (2). Die polymere Matrix wird entweder durch Verteilen der polymeren Lösung über das rotierende System und anschließender Entfernung jedes Überschusses oder durch Aufsprühen der Lösung mittels des mit (3) angedeuteten Sprühmittels, das sich entlang des Stahlstabs mittels eines Motors (4) auf und ab bewegt, aufgetragen. Dieses letztere System ermöglicht die bessere Steuerung der Dicke des Führungskanals, so daß sehr dünne Führungskanäle gemacht werden können.
Die Motoren werden mittels eines automatisierten Systems (5) betrieben.
Nur zur Veranschaulichung werden einige Beispiele, nachstehend beschrieben, der Materialien, des Apparats und des Verfahrens, die zur Herstellung der Führungskanäle gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gegeben.

Die Ester der Hyaluronsäure

Für die vorliegende Erfindung geeignete Ester der Hyaluronsäure sind Ester der Hyaluronsäure mit aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Alkoholen, in denen alle (sogenannte "vollständige Ester") oder nur ein Teil (sogenannte "partielle Ester") der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure verestert sind, und Salze der partiellen Ester mit Metallen oder mit organischen Basen, die biokompatibel oder vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus gesehen verträglich sind.
Die geeigneten Ester sind bevorzugt Ester, die sich von Alkoholen ableiten, die ihrerseits keine nennenswerte pharmakologische Wirkung besitzen, wie z. B. die gesättigten Alkohole der aliphatischen Reihen oder einfache Alkohole der cycloaliphatischen Reihen.
In den vorstehend erwähnten Estern, in denen einige der Carboxylgruppen frei bleiben (d. h. partielle Ester), können diese mit Metallen oder organischen Basen in Salze überführt werden, wie mit Alkali- oder Erdalkalimetallen oder mit Ammonium oder stickstoffhaltigen organischen Basen.
Die meisten der Ester der Hyaluronsäure ("HY"), im Gegensatz zu HY selbst, besitzen einen gewissen Grad an Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln. Diese Löslichkeit hängt vom Prozentsatz veresterter Carboxylgruppen und vom Typ der mit der Carboxylgruppe verbundenen Alkylgruppe ab. Daher besitzt eine HY-Verbindung, deren Carboxylgruppen alle verestert sind, bei Raumtemperatur gute Löslichkeit in z. B. Dimethylsulfoxid (der Benzylester von HY löst sich in DMSO zu 200 mg/ml). Die meisten der vollständigen Ester von HY besitzen auch, im Gegensatz zu HY und besonders seinen Salzen, geringe Löslichkeit in Wasser und sind im wesentlichen unlöslich in Wasser. Aufgrund der Löslichkeitscharakteristika zusammen mit besonderen und bemerkenswerten viskoelastischen Eigenschaften sind die HY-Ester zur Verwendung als Nervenführungskanäle besonders bevorzugt.
Alkohole der aliphatischen Reihen zur Verwendung als esterifizierende Komponenten der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure zur Verwendung als Führungskanäle gemäß der vorliegenden Erfindung sind z. B. solche mit einem Maximum von 34 Kohlenstoffatomen, die gesättigt oder ungesättigt sein können und die gegebenenfalls auch durch andere freie funktionelle oder funktionell modifizierte Gruppen substituiert sein können, wie Amin-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Keton-, Mercaptan- oder Carboxylgruppen oder durch von diesen abgeleitete Gruppen, wie Hydrocarbyl- oder Di-hydrocarbylamingruppen (die Bezeichnung "Hydrocarbyl" wird verwendet werden, um nicht nur monovalente Radikale von Kohlenwasserstoffen, wie der C"H2"+1-Typ, zu bezeichnen, sondern auch bivalente oder trivalente Radikale, wie "Alkylene" (CnH&sub2;n) oder "Alkylidene" (C"H2n)), Ether- oder Estergruppen, Acetal- oder Ketalgruppen, Thioether- oder Thioestergruppen und veresterte Carboxyl- oder Carbamidgruppen und durch eine oder mehrere Hydrocarbylgruppen, durch Nitrilgruppen oder durch Halogene substituierte Carbamide.
Von den obenstehend erwähnten Gruppen, die Hydrocarbylreste enthalten, sind diese bevorzugt niedrigere aliphatische Radikale, wie Alkyle, mit einem Maximum von 6 Kohlenstoffatomen. Solche Alkohole können auch in der Kohlenstoffatomkette durch Heteroatome unterbrochen sein, wie Sauerstoff-, Stickstoff- und. Schwefelatome. Bevorzugt sind Alkohole, die mit einer oder zwei der funktionellen Gruppen substituiert sind.
Alkohole der obenstehend erwähnten Gruppe, die bevorzugt verwendet werden, sind solche mit einem Maximum von 12 und besonders 6 Kohlenstoffatomen, in denen die Hydrocarbylatome in den obenstehend erwähnten Amin, Ether, Ester, Thioether, Thioester, Acetal- oder Ketalgruppen Alkylgruppen mit einem Maximum von 4 Kohlenstoffatomen darstellen. In den veresterten Carboxyl- oder substituierten Carbamidgruppen sind die Hydrocarbylgruppen Alkyle mit derselben Anzahl von Kohlenstoffatomen, in denen in den Amid- oder Carbamidgruppen Alkylenamin- oder Alkylencarbamidgruppen mit einem Maximum von 8 Kohlenstoffatomen sein können. Von diesen Alkoholen sind besonders gesättigte und nicht-substituierte Alkohole, wie die Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Isopropylalkohole, normaler Butylalkohol, Isobutylalkohol, tertiärer Butylalkohol, die Amyl-, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Nonyl- und Dodecylalkohole und vor allem solche mit einer linearen Kette, wie normale Octyl- und Dodecylalkohole, bevorzugt. Von den substituierten Alkoholen dieser Gruppe sind die bivalenten Alkohole geeignet, wie Ethylenglycol, Propylenglycol und Butylenglycol, die trivalenten Alkohole, wie Glycerin, die Aldehydalkohole, wie Tartronialkohol, die Carboxylalkohole, wie Milchsäuren, z. B. Glycolsäure, Maleinsäure, Tartarsäure, Citronensäure, die Aminoalkohole, wie normaler Aminoethanol, Aminopropanol, normaler Aminobutanol und ihre dimethylierten und diethylierten Derivate in der Aminfunktion, Cholin, Pyrrolidinylethanol, Piperidinylethanol, Piperazinylethanol und die entsprechenden Derivate von normalem Propyl- oder normalem Butylalkohol, Monothioethylenglycol oder seine Alkylderivate, wie die Ethylderivate in der Mercaptanfunktion.
Von den höheren gesättigten aliphatischen Alkoholen werden Cetylalkohol und Myricylalkohol bevorzugt, aber für das Ziel der vorliegenden Erfindung sind die höheren ungesättigten Alkohole mit einer oder zwei Doppelbindungen besonders wichtig, wie besonders die in vielen essentiellen Ölen enthaltenen mit einer Affinität zu Terpen, wie Citronellol, Geraniol, Nerol, Nerolidol, Linalool, Farnesol und Phytol. Von den ungesättigten niedrigeren Alkoholen ist es notwendig, Allylalkohol und Propargylalkohol in Betracht zu ziehen. Von den araliphatischen Alkoholen werden solche mit nur einem Benzolrest, in denen die aliphatische Kette ein Maximum von 4 Kohlenstoffatomen hat, wobei der Benzolrest durch 1 bis 3 Methyl- oder Hydroxylgruppen oder durch Halogenatome, besonders durch Chlor-, Brom- und Iodatome, substituiert sein kann und die aliphatische Kette durch eine oder mehrere Funktionen aus der Gruppe freier Amingruppen oder mono- oder dimethylierter Amingruppen oder durch Pyrrolidin- oder Piperidingruppen substituiert sein kann, bevorzugt. Von diesen Alkoholen werden am meisten Benzylalkohol und Phenetylalkohol bevorzugt.
Die Alkohole der cycloaliphatischen oder aliphatischen-cycloaliphatischen Reihen können von mono- oder polycylclischen Kohlenwasserstoffen stammen, können bevorzugt ein Maximum von 34 Kohenstoffatomen haben, können unsubstituiert sein und können einen oder mehrere Substituenten enthalten, wie die obenstehend für die aliphatischen Alkohole erwähnten. Von den von cyclischen aus 1 Ring bestehenden Kohlenwasserstoffen stammenden Alkoholen werden solche mit einem Maximum von 12 Kohlenstoffatomen bevorzugt, die Ringe mit bevorzugt zwischen 5 und 7 Kohlenstoffatomen, die substituiert sein können, z. B. durch ein bis drei niedrigere Alkylgruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylgruppen. Als spezifische Alkohole dieser Gruppe werden die folgenden am meisten bevorzugt: Cyclohexanol, Cyclohexandiol, 1,2,3-Cyclohexantriol und 1,3,5-Cyclohexantriol (Phloroglucit), Inosit und die Alkohole, die von p-Methan stammen, wie Carvomenthol, Menthol und a-ylerpineol, 1-Terpineol, 4-Terpineol und Piperitol oder das Gemisch von diesen Alkoholen, bekannt als "Terpineol", 1,4- und 1,8-Terpin. Von diesen Alkoholen, die von Kohlenwasserstoffen mit kondensierten Ringen stammen, wie Thujan, Pinan oder Comphan, werden die folgenden bevorzugt: Thujanol, Sabinol, Pinolhydrat, D- und L- Borneol und D- und L-Isoborneol.

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HY-ESTERN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

METHODE A:

Die Ester der Hyaluronsäure können mittels Verfahren hergestellt werden, die er se für die Veresterung von Carboxylsäuren bekannt sind, z. B. durch Behandlung von freier Hyaluronsäure mit den gewünschten Alkoholen in Gegenwart von katalysierenden Substanzen, wie starke anorganische Säuren oder ionische Austauscher des Säuretyps oder mit einem verethernden Agens, das den gewünschten alkoholischen Rest in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen einführen kann. Als veresternde Agenzien ist es möglich, die in der Literatur bekannten zu verwenden, wie besonders die Ester von verschiedenen anorganischen Säuren oder von organischen Sulfonsäuren, wie Hydrazide, das sind Hydrocarbylhalogenide, wie Methyl- oder Ethyliodid, oder neutrale Sulfate oder Hydrocarbylsäuren, Sulfite, Carbonate, Silikate, Phosphite oder Hydrocarbylsulfonate, wie Methylbenzol oder p-Toluolsulfonat oder Methyl- oder Ethylchlorosulfonat. Die Reaktion kann in einem geeigneten Lösungsmittel stattfinden, wie z. B. ein Alkohol, bevorzugt der entsprechend der in die Carboxylgruppe einzuführenden Alkylgruppe. Aber die Reaktion kann auch in nicht-polaren Lösungsmitteln stattfinden, wie Ketone, Ether, wie Dioxan, oder aprotische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid. Als Base ist es möglich z. B. ein Hydrat eines Alkali- oder Erdalkalimetalls oder Magnesium- oder Silberoxid oder ein basisches Salz eines dieser Metalle, wie ein Carbonat, und von den organischen Basen eine tertiäre Stickstoffbase, wie Pyridin oder Collidin, zu verwenden. Anstelle der Base ist es auch möglich, einen Ionenaustauscher des Basentyps zu verwenden.
Eine andere Veresterungsmethode verwendet die Metallsalze oder Salze mit organischen Stickstoffbasen, z. B. Ammonium oder Ammonium-substituierte Salze.
Bevorzugt werden Salze der Alkali- oder Erdalkalimetalle verwendet, aber jedes andere metallische Salz kann verwendet werden. Die veresternden Agenzien sind in diesem Fall auch die obenstehend erwähnten, und dasselbe trifft für die Lösungsmittel zu. Es ist vorzuziehen, aprotische Lösungsmittel zu verwenden, z. B. Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
In den gemäß dieses Verfahrens oder gemäß des anschließend beschriebenen Verfahrens erhaltenen Estern können freie Carboxylgruppen der partiellen Ester in Salze überführt werden, wenn gewünscht, auf per se bekannte Art.

METHODE B:

Die Hyaluronsäureester können auch mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das aus der Behandlung eines quartären Ammoniumsalzes der Hyaluronsäure mit einem verethernden Agens besteht, bevorzugt in einem aprotischen organischen Lösungsmittel.
Als organische Lösungsmittel wird es bevorzugt, aprolische Lösungsmittel, wie Dialkylsulfoxide, Dialkycarboxamide, wie insbesondere niedrigere Alkyldialkylsulfoxide, besonders Dimethylsulfoxid, und niedrigere Alkyldialkylamide von niedrigeren aliphatischen Säuren, wie Dimethyl- oder Diethylformamid oder Dimethyl- oder Diethylacetamid, zu verwenden.
Andere Lösungsmittel werden jedoch in Betracht gezogen, die nicht immer aprotisch sind, wie Alkohole, Ether, Ketone, Ester, besonders aliphatische oder heterocyclische Alkohole und Ketone mit einem niedrigeren Siedepunkt, wie Hexafluorisopropanol, Trifluorethanol und N-Methylpyrrolidon.
Die Reaktion erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von zwischen etwa 0ºC und 100ºC, besonders zwischen etwa 25ºC und 75ºC, z. B. bei etwa 30ºC.
Die Veresterung wird bevorzugt durch Zugabe des veresternden Agens zu dem obenstehend erwähnten Ammoniumsalz zu einem der obenstehend erwähnten Lösungsmittel, z. B. zu Dimethylsulfoxid, nach und nach durchgeführt.
Als alkylierendes Agens ist es möglich, die obenstehend erwähnten zu verwenden, besonders die Hydrocarbylhalogene, z. B. Alkylhalogene. Als quartäre Ausgangsammoniumsalze wird es bevorzugt, die niedrigeren Ammoniumtetraalkylate mit Alkylgruppen bevorzugt zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatomen zu verwenden. Meistens wird das Hyaluronat von Tetrabutylammonium verwendet. Es ist möglich, diese quartären Ammoniumsalze durch Reaktion eines metallischen Salzes der Hyaluronsäure, bevorzugt eines der obenstehend erwähnten, besonders das Natrium- oder Kaliumsalz, in wäßriger Lösung mit einem in ein Salz überführtes Sulfonharz mit einer quartären Ammoniumbase herzustellen.
Eine Variation des vorstehend beschriebenen Verfahrens besteht in der Reaktion eines Kalium- oder Natriumsalzes der Hyaluronsäure, suspendiert in einer geeigneten Lösung wie Dimethylsulfoxid, mit einem geeigneten alkylierenden Agens in Gegenwart katalytischer Mengen eines quartären Ammoniumsalzes, wie das Iodid von Tetrabutylammonium.
Für die Herstellung von Hyaluronsäureestern ist es möglich, Hyaluronsäuren jeden Ursprungs zu verwenden, wie z. B. die aus natürlichem Startmaterial, z. B. aus Hahnenkämmen, extrahierten Säuren. Die Herstellung solcher Säuren ist in der Literatur beschrieben; bevorzugt werden gereinigte Hyaluronsäuren verwendet. Besonders verwendet werden Hyaluronsäuren, die molekulare Abschnitte der gesamten; Säuren umfassen, die direkt durch Extraktion der organischen Materialien mit Molekulargewichten, die innerhalb eines großen Bereiches variieren, z. B. von etwa 90%-80% (MW = 11.7 bis 10.4 Millionen) bis 0.2% (MW = 30,000) des Molekulargewichts der gesamten Säure., die ein Molekulargewicht von 13 Millionen hat, bevorzugt zwischen 5% und 0.2%, erhalten wurden. Solche Fraktionen können durch verschiedene in der Literatur beschriebene Verfahren erhalten werden, wie durch hydrolytische, oxidative, enzymatische oder physikalische Verfahren, wie mechanische oder Strahlungs-Verfahren. Ursprüngliche Extrakte werden daher oft nach den gleichen wie den veröffentlichten Verfahren gebildet (z. B. siehe den Artikel von Balazs et al. in "Cosmetics & Toiletries"). Die Trennung und Reinigung der erhaltenen molekularen Fraktionen werden mittels bekannter Techniken erreicht, z. B. durch molekulare Filtration. Zusätzlich nützlich sind gereinigte Fraktionen, erhältlich von Hyaluronsäure, wie z. B. die in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0138572 beschriebenen.
Die Überführung von HY in Salze mit den obenstehenden Metallen für die Herstellung von Startsalzen für das spezielle obenstehend beschriebene Veresterungsverfahren wird auf eine er se bekannte Art durchgeführt, z. B. durch Reaktion von HY mit der berechneten Basenmenge, z. B. mit alkalischen Hydraten oder mit basischen Salzen solcher Metalle, wie Carbonate oder Bicarbonate.
In den partiellen Estern ist es möglich, alle übrigen Carboxylgruppen oder nur einen Teil von ihnen in Salze zu überführen, wobei die Basenmenge so dosiert wird, daß der gewünschte stöchiometrische Grad an Versalzung erhalten wird. Mit dem richtigen Grad an Versalzung ist es möglich, Ester mit einem weiten Bereich verschiedener Dissoziationskonstanten, die daher den gewünschten pH-Wert in Lösung oder in situ zu dem Zeitpunkt der therapeutischen Applikation ergeben, zu erhalten.

Herstellungsbeispiele:

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Hyaluronsäureestern, die für die Führungskanäle der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Beispiel 1 - Herstellung des (partiellen) Propylesters der Hyaluronsäure (HY) - 50% veresterte Carboxylgruppen - 50% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g des HY-Tetrabutylammoniumsalzes mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 1.8 g (10.6 m.Eq.) Propyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei einer Temperatur von 30ºC gehalten.
Eine 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthaltende Lösung wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 7.9 g der partiellen Propylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 2 - Herstellung des (partiellen) Isopropylesters der Hyaluronsäure (HY) - 50% veresterte Carboxylgruppen - 50% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g des HY-Tetrabutylammoniumsalzes mit einem Molekulargewicht von 160,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 1.8 g (10.6 m.Eq.) Isopropyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 7.8 g der partiellen Isopropylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 3 - Herstellung des (partiellen) Ethylesters der Hyaluronsäure (HY) - 75% veresterte Carboxylgruppen - 25% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g des HY-Tetrabutylammoniumsalzes mit einem Molekulargewicht von 250,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 2.5 g (15.9 m.Eq.) Ethyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 7.9 g der partiellen Ethylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1ß61)] durchgeführt.

Beispiel 4 - Herstellung des (partiellen) Methylesters der Hyaluronsäure (HY) - 75% veresterte Carboxylgruppen -25% in Salze überführt Carboxylgruppen (Na)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 80,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 2.26 g (15.9 m.Eq.) Methyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 7.8 g der partiellen Methylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 5 - Herstellung des Methylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 120,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 3 g (21.2 m.Eq.) Methyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
8 g Ethylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 6 - Herstellung des Ethylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 85,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 3.3 g (21.2 m.Eq.) Ethyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
8 g Ethylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 7 - Herstellung des Propylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 3.6 g (21.2 m.Eq.) Propyliodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
8.3 g Propylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode vom R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 8 - Herstellung des (partiellen) Butylesters der Hyaluronsäure (HY) - 50% veresterte Carboxylgruppen - 50% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g des HY-Tetrabutylammoniumsalzes mit einem Molekulargewicht von 620,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 1.95 g (10.6 m.Eq.) n-Butyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 8 g der partiellen Butylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs (Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 9 - Herstellung des (partiellen) Ethoxycarbonylmethylesters der Hyaluronsäure (HY) -75% veresterte Carboxylgruppen -25% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 180,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 2 g Tetrabutylammoniumiodid und 1.84 g (15 m.Eq.) Ethylchloracetat werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 24 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 10 g der partiellen Ethoxycarbonylmethylesterverbindung des Titels werden erhalten.
Quantitative Bestimmung der Ethoxylestergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 10 - Herstellung des n-Pentylesters von Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 620,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 3.8 g (25 m.Eq.) n-Pentylbromid und 0.2 g Iodidtetrabutylammonium werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
8.7 g n-Pentylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben auf den Seiten 169-172 von Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, durchgeführt.

Beispiel 11- Herstellung des Isopentylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25 ºC solubilisiert. 3.8 g (25 m.Eq.) Isopentylbromid und 0.2 g Tetrabutylammoniumiodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
8.6 g Isopentylesterprodukt, das im Titel bezeichnet ist, werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird gemäß der Methode, beschrieben auf den Seiten 169-172 von Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, durchgeführt.

Beispiel 12 - Herstellung des Benzylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25 ºC solubilisiert. 4.5 g (25 m.Eq.) Benzylbromid und 0.2 g Tetrabutylammoniumiodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
9 g Benzylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird gemäß der Methode, beschrieben auf den Seiten 169-172 von Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, durchgeführt.

Beispiel 13 - Herstellung des β-Phenylethylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 125,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.6 g (25 m.Eq.) 2-Bromethylbenzol und 185 mg Tetrabutylammoniumiodid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird so gebildet, das dann filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
9.1 g β-Phenylethylester des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird gemäß der Methode, beschrieben auf den Seiten 169-172 von Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, durchgeführt.

Beispiel 14 - Herstellung des Benzylesters der Hyaluronsäure (HY)

3 g des Kaliumsalzes der HY mit einem Molekulargewicht von 162,000 werden in 200 ml Dimethylsulfoxid suspendiert; 120 mg Tetrabutylammoniumiodid und 2.4 g Benzylbromid werden zugegeben.
Die Suspension wird unter Rühren 48 Stunden bei 30ºC gehalten. Das resultierende Gemisch wird langsam in 1,000 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 150 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
3.1 g Benzylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird gemäß der Methode, beschrieben auf den Seiten 169-172 von Siggia 5. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, durchgeführt.

Beispiel 15 - Herstellung des partiellen Benzylesters (HYAFF 11 p10, p25, p50 und p75) der Hyaluronsäure

Die partiellen Benzylester der Hyaluronsäure, HYAFF 11 p10, p25, p50 und p75, können wie obenstehend in Methode B beschrieben hergestellt werden. Die Veresterung kann durch Zugabe des veresternden Agens nach und nach zum quartären Ammoniumsalz der Hyaluronsäure, die mit einem verethernden Agens in dem geeigneten organischen Lösungsmittel behandelt wurde, durchgeführt werden.
Die Überführung der Hyaluronsäure in Salze zur Herstellung von Startersalzen zur Veresterung und die Überführung der restlichen Carboxylgruppen in Salze in den partiellen Benzylestern wird auch in Methode B beschrieben.

Beispiel 16 - Herstellung des (partiellen) Propylesters der Hyaluronsäure (HY) - 85% veresterte Carboxylgruppen - 15% in Salze überführte Carboxylgruppen (Na)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 165,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 250C solubilisiert. 2.9 g (17 m.Eq.) Propyliodid werden zugegeben, und die resultierende Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Eine Lösung, die 62 ml Wasser und 9 g Natriumchlorid enthält, wird dann zugegeben, und das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und dreimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit Aceton gewaschen und zuletzt 8 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird.
Das Produkt wird dann in 550 ml Wasser, das 1% Natriumchlorid enthält, gelöst, und die Lösung wird langsam in 3,000 ml Aceton unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und zweimal mit 500 ml Aceton/Wasser, 5 : 1, und dreimal mit 500 ml Aceton gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 8 g der partiellen Propylesterverbindung des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.

Beispiel 17 - Herstellung des n-Octylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.1 g (21.2 m.Eq.) 1-Bromoctan werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9.3 g Octylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 18 - Herstellung des Isopropylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 2.6 g (21.2 m.Eq.) Isopropylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 mi Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum-getrocknet wird. 8.3 g Isopropylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode von R. H. Cundiff und P. C. Markungs [Anal. Chem. 33, 1028-1030 (1961)] durchgeführt.
Beispiel 19 - Herstellung des 2,6-Dichlorbenzylesters der Hyaluronsäure (HY)
12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 5.08 g (21.2 m.Eq.) 2,6-Dichlorbenzylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9.7 g 2,6- Dichlorbenzylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.
Beispiel 20 - Herstellung des 4-tert Butylbenzylesters der Hyaluronsäure (HY)
12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.81 g (21.2 m.Eq.) 4-tert Butylbenzylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9.8 g des 4-tert Butylbenzylesterprodukts des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia 5. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 21 - Herstellung des Heptadecylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 6.8 g (21.2 m.Eq.) Heptadecylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Etlhylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum-getrocknet wird. 11 g Heptadecylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia 5. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 22 - Herstellung des Octadecylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g des HY-Tetrabutylammoniumsalzes mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 7.1 g (21.2 m.Eq.) Octadecylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 11 g Heptadecylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.
Beispiel 23 - Herstellung des 3-Phenylpropylesters der Hyaluronsäure (HY) 12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.22 g (21.2 m.Eq.) 3-Phenylpropylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9 g 3- Phenylpropylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia 5. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 24 - Herstellung des 3,4,5-Trimethoxybenzylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.6 g (21.2 m.Eq.) 3,4,5-Trimethoxybenzylchlorid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 10 g 3,4,5- Trimethoxybenzylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 25 - Herstellung des Cinnamylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.2 g (21.2 m.Eq.) Cinnamylbromid werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9.3 g Cinnamylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 26 - Herstellung des Decylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.7 g (21.2 m.Eq.) 1-Bromdecan werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9.5 g Decylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia S. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

Beispiel 27 - Herstellung des Nonylesters der Hyaluronsäure (HY)

12.4 g HY-Tetrabutylammoniumsalz mit einem Molekulargewicht von 170,000, entsprechend 20 m.Eq. einer monomeren Einheit, werden in 620 ml Dimethylsulfoxid bei 25ºC solubilisiert. 4.4 g (21.2 m.Eq.) 1-Bromnonan werden zugegeben, und die Lösung wird 12 Stunden bei 30ºC gehalten.
Das resultierende Gemisch wird langsam in 3,500 ml Ethylacetat unter konstantem Rühren gegossen. Ein Präzipitat wird gebildet, das filtriert und viermal mit 500 ml Ethylacetat gewaschen und zuletzt 24 Stunden bei 30ºC Vakuum getrocknet wird. 9 g Nonylesterprodukt des Titels werden erhalten. Quantitative Bestimmung der Estergruppen wird unter Verwendung der Methode, beschrieben in Siggia 5. und Hanna J. G., "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", 4. Ausgabe, John Wiley and Sons, Seiten 169-172, durchgeführt.

BIOLOGISCH AKTIVE FAKTOREN

Die für die Führungskanäle der vorliegenden Erfindung geeigneten aktiven Faktoren sind besonders solche Faktoren, die die Regeneration, das Wachstum oder die Heilung von Nervengewebe verstärken, fördern oder stimulieren. Es gibt verschiedene Faktoren, von denen bekannt ist, daß sie die Nervenregeneration stimulieren und verstärken, beschrieben z. B. in Wolicke et al., Vol. 83, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 3012-3016, 1986; Rydel et al., Vol. 1, J. Neurosci. 3639-3653, 1988; Levi-Montalcini, Vol. 237, Science, 1154-1162, 1987, einschließlich der darin enthaltenen Referenzen; und Brooker et al., Muscle and Nerv 13, 785- 800, 1990.
Wichtige Wachstumsfaktoren sind: Nervenwachstumsfaktor (NGF); Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) in seiner sauren (a-FGF) oder basischen (b-FGF) Form; ciliärer neurotropher Faktor (CNTF), dem Gehirn entstammender neurotropher Faktor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3). Es gibt auch Substanzen, wie Ganglioside oder ihre synthetischen und semisynthetischen Derivate, die die biologische Aktivität dieser Wachstumsfaktoren fördern oder verstärken (Vantini et al., Brain Res. 448, 252-258, 1988). Geeignet z. B. sind natürlich vorkommende Ganglioside, innere veresterte Gangliosidderivate, wie in EP Patent Nr. 0072722 beschrieben, und Ester- und Amidderivate der Ganglioside, wie in EP Patent Nr. 0167449 beschrieben.
Darüberhinaus sind die Wachstumsfaktoren bevorzugt menschliche aktive Faktoren und können mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden.

Beispiel 28 - Herstellung eines Gangliosidgemisches, Cronassial®

1000 Gramm infiziertes Rinderhirn, gemahlen und in destilliertem Wasser suspendiert, werden in Kontakt mit 300 bis 600 ml Aceton (Verhältnis 1 : 5, Gewicht/Volumen) etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren gelassen. Die Lösung wird dann bei 6000xg bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 7ºC zentrifugiert, bis die Präzipitation vollständig ist. Das Lösungsmittel wird dann entfernt, und 180-350 ml eines Gemisches von Methylenchlorid/Methanol/Natriumhydroxid werden zu dem nassen Pulver, das in ein geeignetes Glasgefäß gegeben wurde, zugegeben, und das Gemisch wird wieder mindestens 3 Stunden bei einer Temperatur zwischen 30ºC und 35ºC auf dem Magnetrührer gelassen. Man läßt es schließlich abkühlen und zentrifugiert es dann 20 Minuten bei 6000xg und +10ºC. Die flüssige Phase wird durch einen Filtrationstrichter bei einer Temperatur von +4ºC filtriert. Eine geeignete Menge Calciumchlorid und Aceton wird zu der Flüssigkeit zugegeben, unter Rühren etwa 30 Minuten belassen und bei 6000xg und +10ºC zentrifugiert. Man läßt das Präzipitat (Rohmaterial 1) schließlich über Nacht und dann 5 Stunden unter hohem Vakuum trocknen.
Gewonnenes Rohmaterial 1 wird in 10 bis 18 rnl eines Gemisches von Wasser/Chloroform/Methanol resuspendiert. Der pH-Wert wird auf etwa 12 mit 5 N NaOH eingestellt. Das Gemisch wird für 4 bis 8 Stunden auf zwischen 38º und 43ºC erhitzt und gerührt. Am Ende dieser Zeit, nachdem das Gemisch abgekühlt war, wurde es mit 6 N HCl neutralisiert, und die erforderliche Menge Wassern-Butanol/Chloroform wird zugegeben. Das Gemisch wird dann 15 bis 30 Minuten gerührt und zwischen 2 und 4 Stunden stehen gelassen. Zuletzt wird die untere organische Phase weggeworfen, Aceton und Natriumchlorid werden zu den restlichen wäßrigen Phasen zugegeben, und sie werden für etwa 30 Minuten gerührt und 20 Minuten bei 6000xg und +15ºC zentrifugiert (Rohmaterial 2).
Das Produkt wird in einem hohem Vakuum getrocknet, in 6 bis 15 ml absolutem Methanol resuspendiert und dann für etwa 2 Stunden heiß gehalten, während die Lösung von Zeit zu Zeit gerührt wird. Die Suspension wird dann schnell bei 6000xg zentrifugiert, und der Überstand wird etwa 2 Stunden in einen Gefrierschrank gestellt. Die opaleszierende weiße Lösung wird dann bei 0ºC und 600xg zentrifugiert, und das Präzipitat wird in einem hohen Vakuum getrocknet. Das Produkt wird in 1 N Natriumhydroxid gesammelt und mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur in Kontakt mit der Lösung gelassen. Zuletzt wird der pH-Wert der Suspension auf einen ungefähren pH-Wert von 9 gebracht und die Suspension wird durch eine Membran, die eine Molekularausschlußgewicht von 10 kd besitzt, gegen ein geeignetes Volumen destillierten Wassers dialysiert. Eine geeignete Menge Natriumchlorid und Aceton wird zugegeben, und das Dialysat wird bei +5ºC und 6000xg zentrifugiert und dann unter hohem Vakuum getrocknet (Endprodukt). Die Probe wird in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7.2, aufgenommen und bei +121ºC 30 Minuten sterilisiert, um das fertige, sterilisierte Produkt herzustellen.

Beispiel 29 - Herstellung des Monosialogangliosids GM&sub1; Sygen®

Das Monosialogangliosid ist eine biologische Substanz, die aus Rinderhirn erhalten wird, mit der folgenden Strukturformel:
Das Natriumsalz des Monosialotetrahexosylgangliosids GM&sub1; kann als ein hochreines Produkt nach dem Verfahren, beschrieben von Tettamanti et al., Biochimica et Biophysica Acta, 296 (1973) 160-170, isoliert oder von Fidia S. p.A., Abano Terme, Italien erhalten werden.
Ausgehend von gefrorenen Rinderhirnen ergibt ein mehrschrittiges Trennungsverfahren auf der Grundlage von Lösungsmittelextraktion, Flüssig/Flüssig- Trennung, Phospholipidentfernung durch Methanolyse und molekulare Filtration ein hochreines Gangliosidgemisch, das Gangliosid GM&sub1; in einem Prozentsatz zwischen etwa 18 und 24% verglichen mit einem Referenzarbeitsstandard mit bekannter Struktur und Reinheit enthält. Diese Verbindung wird aus dem Gemisch durch ein Zwei-Schritt- Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographieverfahren abgetrennt, wobei eine Endausbeute von etwa 75% des theoretischen Wertes erreicht wird. Die erhaltene Substanz wird in das Natriumsalz umgewandelt, dialysiert und präzipitiert. Das Präzipitat wird wieder in Wasser gelöst, der Sterilfiltration unterzogen und lyophilisiert. Die Reinheit der erhaltenen Verbindung ist größer als 98% bezogen auf das Trockengewicht im Photodensitometertest, verglichen mit einem Referenzarbeitsstandard mit bekannter Struktur und Reinheit.

Beispiel 30 - Reinigung des inneren Gangliosidestergemisches, Sinassial®

Ein Gemisch von Gangliosiden wird durch Extraktion aus Rindergehirnen erhalten, und 5 g dieses Gemisches werden in 50 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Dann werden 4 g des Harzes vom Typ wasserfreies Styrol (Sulfonsäure, 50-100 Mesh, H&spplus;-Form) zu dem Gemisch zugegeben, und das resultierende Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Diese Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz wandelt alle Gangliosidcarboxylatgruppen in -COOH (Carboxyl)gruppen um. Vollständige Umwandlung der Carboxylatgruppen wird durch eine geeignete physikalische Analysenmethode, wie atomare Absorption, bestätigt. Das Harz wird dann unter Saugen filtriert, und die Lösung wird mit 1.5 g Dicyclohexylcarbodümid behandelt und eine Stunde stehen gelassen.
Der Dicyclohexylharnstoff, der präzipitiert, wird durch Filtration entfernt, und die restliche Lösung wird mit 100 ml Aceton behandelt, was die Präzipitation der inneren Gangliosidesterderivate bewirkt. Das Verfahren ergibt 4.6 g inneres Esterprodukt (etwa 90- 95% des theoretischen Wertes).

Herstellung von Nervenführungskanälen

BEISPIEL 31

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden HYAFF 11 (vollständiger Benzylester von HY, 100% verestert) umfaßt und die Matrix aus HYAFF 11p75 (Benzylester von HY, 75% verestert) besteht, wird mittels des folgenden Verfahrens erhalten.
Ein Faden aus vollständigen HYAFF 11-Estern, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19%a Dehnung wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 1.5 mm, welches der gewünschte Innendurchmesser des zusammengesetzten Führungskanals ist, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit erhalten. Das System, umfassend den Stahlstab mit der darüber gezogenen Röhre aus Fäden wird in Position gesetzt, wie in Fig. 1 gezeigt. Der Apparat wird bei einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Eine Menge HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid-Lösung mit einer Konzentration von 135 mg/ml wird über das rotierende System verteilt. Die überschüssige Lösung wird mit einem Spatel entfernt, und das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der mittels der obenstehenden Technik hergestellte Kanal ist 20 mm lang, 300 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 1.5 mm und besitzt ein Gewicht von 40 mg, entsprechend 20 mg/cm.

BEISPIEL 32

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden ein Gemisch von HYAFF 11 (80%) und HYAFF 11p75 (20%) umfaßt und die Matrix aus HYAFF 11p75 zusammengesetzt ist, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden aus vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, und ein HYAFF 11p75- Faden, 150 Denier, minimale Zugfestigkeit beim Zerreißen von 0.9 gr/Denier und 20% Dehnung, werden mittels eines Drehungsmechanismus verbunden, um einen Faden zu bilden, der aus den zwei Produkten zusammengesetzt ist. Der Faden wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 1.5 mm, der identisch zu dem gewünschten Innendurchmesser der zusammengesetzten Röhre ist, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 8 Haltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab mit der darüber gezogenen verwobenen Röhre wird auf dem in Fig. 1 beschriebenen Apparat in Position gesetzt. Der Apparat wird bei einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Eine Menge HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid-Lösung bei einer Konzentration von 135 mg/ml wird über das rotierende System verteilt. Die überschüssige Lösung wird mit einem Spatel entfernt, und das System wird von dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der nach der obenstehenden Technik hergestellte Kanal ist 20 mm lang, 400 u,m dick, besitzt einen Innendurchmesser von 1.5 mm und wiegt 30 mg, entsprechend 15 mg/cm.

BEISPIEL 33

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden ein Gemisch aus vollständigem HYAFF 11 umfaßt und die Matrix HYAFF 11p75 umfaßt, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden aus vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 3 mm, der identisch zu dem gewünschten Innendurchmesser der zusammengesetzten Röhre ist, gewunden. Die Röhre wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit gewoben.
Das System, umfassend den Stahlstab mit der Röhre verflochtener Fäden darum, wurde auf den Apparat wie in Fig. 1 gezeigt eingesetzt, aber mit einem Lösungssprühmittel anstelle des den Faden verteilenden Halters. Der Apparat wird mit: einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Eine Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml wird durch Aktivierung des Sprühmittels für 30 Sekunden, während es sich entlang der Länge des Stahlstabs bewegt, verteilt. Während dieser Zeit bewegt sich das Sprühmittel viermal entlang der Länge des in der Herstellung befindlichen Führungskanals. Das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß dem obenstehenden Verfahrens hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 180 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 3 mm und wiegt 24 mg, entsprechend 12 mg/cm.

BEISPIEL 34

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden vollständigen HYAFF 11 umfaßt, die Matrix HYAFF 11p75 umfaßt und die menschlichen Nervenwachstumsfaktor enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten. Ein Faden von vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 1.5 mm, der der gewünschte Innendurchmesser der zusammengesetzten Röhre ist, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab bedeckt mit dem gewobenen Produkt, wird auf dem in Fig. 1 gezeigten Apparat eingesetzt. Der Apparat wird bei einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Eine Menge einer Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 0.5 mg, der Untereinheit B von menschlichem NGF gelöst wurde, wird auf dem rotierenden System verteilt.
Die überschüssige Lösung wird mit einem Spatel entfernt, und das System wird von dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 300 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 1.5 mm und wiegt 40 mg, entsprechend 20 mg/cm.

BEISPIEL 35

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden vollständigen HYAFF 11 umfaßt, die Matrix HYA:FF 11p75 umfaßt, und die CNTF-Wachstumsfaktor enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden aus vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 1.5 mm, der dem gewünschten Innendurchmesser des zusammengesetzten Führungskanals entspricht, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab und die Röhre aus Fäden, wird auf dem Apparat wie in Fig. 1 gezeigt positioniert. Der Apparat wird mit einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Eine Menge HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid-Lösung in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 0.5 mg, CNTF-Wachstumsfaktor gelöst wurde, wird über das rotierende System verteilt. Jeder Überschuß an Lösung wird mit einem Spatel entfernt, und das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 300 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 1.5 mm und wiegt 40 mg; , entsprechend 20 mg/em.

BEISPIEL 36

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden ein Gemisch aus vollständigem HYAFF 11, enthaltend eine geeignete Menge des Wachstumsfaktors BDNF, enthält, und die Matrix HYAFF 11p75 enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden aus vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 3 mm, der dem gewünschten Innendurchmesser des zusammengesetzten Führungskanals entspricht, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Fadenhaltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab bedeckt mit der gewobenen Röhre, wird auf den Apparat wie in Fig. 1 gezeigt eingesetzt, wobei ein Lösungssprühmittel anstelle des Fadenhalters angebracht wurde. Der Apparat wird bei einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Die Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 0.5 mg, des Wachstumsfaktors BDNF gelöst wurde, wird für 30 Sekunden auf die Röhre gesprüht, während sich das Sprühmittel vor und zurück entlang des Stahlstabs bewegt.
Während dieser Zeit bewegt sich das Sprühmittel viermal entlang der Länge des Führungskanals. Das System wird dann aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 180 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 3 mm und wiegt 24 mg, entsprechend 12 mg/ml.

BEISPIEL 37

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden vollständigen HYAFF 11 umfaßt, die Matrix HYAFF 11p75 umfaßt und die eine geeignete Menge des Gangliosidgemisches Cronassial® enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden von vollständigem HYAFF 11-Ester, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 1.5 mm, der dem gewünschten Innendurchmesser der zusammengesetzten Röhre entspricht, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Fadenhaltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab bedeckt mit der gewobenen Röhre, wird auf den in Fig. 1 gezeigten Apparat aufgebracht. Der Apparat wird mit einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Das rotierende System wird mit einer Menge einer Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 20 mg, Gangliosidgemisch Cronassial® gelöst wurde, beschichtet.
Die überschüssige Lösung wird mit einem Spatel entfernt, und das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 300 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 1.5 mm und wiegt 40 mg, entsprechend 20 mg/cm.

BEISPIEL 38

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden ein Gemisch von vollständigem HYAFF 11, enthaltend eine geeignete Menge Monosialogangliosidfraktion GM1, Sygen®, enthält, und die Matrix HYAFF 11p75 enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden von vollständigem HYAFF 11, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 gr/Denier und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 3 mm, der dem gewünschten Innendurchmesser der zusammengesetzten Röhre entspricht, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab mit der Röhre aus Fäden darum, wird auf dem Apparat wie in Fig. 1 gezeigt aufgebracht, mit einem Lösungssprühmittel an der Stelle des Fadenhalters. Der Apparat wird mit einer Geschwindigkeit von 115 rpm rotiert. Eine Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 20 mg, der Monosialogangliosidfraktion GMI, bekannt als Sygen® gelöst wurde, wird durch Aktivierung des Sprühmittels für 30 Sekunden verteilt, während es sich entlang der Länge des Stahlstabs auf und ab bewegt. Während dieser Zeit bewegt sich das Sprühmittel viermal entlang der Länge des Stabs. Das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 180 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 3 mm und wiegt 24 mg, entsprechend 12 mg/cm.

BEISPIEL 39

Ein Führungskanal mit einer zusammengesetzten Faden/Polymermatrix-Struktur, in der der Faden ein Gemisch von vollständigem HYAFF 11, enthaltend eine geeignete Menge des semisynthetischen Gangliosidgemisches Sinassial®, enthält, und die Matrix HYAFF 11p75 enthält, wird nach dem folgenden Verfahren erhalten.
Ein Faden aus vollständigem HYAFF 11, 250 Denier, mit einer minimalen Zugfestigkeit beim Zerreißen von 1.5 und 19% Dehnung, wird um einen elektropolierten AISI-316 Stahlstab mit einem Außendurchmesser von 3 mm, der dem gewünschten Innendurchmesser des zusammengesetzten Führungskanals entspricht, gewunden. Das gewobene Produkt wird mittels einer Maschine mit 16 Haltern pro operativer Einheit erhalten.
Das System, umfassend den Stahlstab, bedeckt von der gewobenen Röhre, wird auf dem Apparat in Fig. 1 aufgebracht, mit einem Lösungssprühmittel an der Stelle des Fadenhalters. Der Apparat wird mit einer Geschwindigkeit von 115 Upm rotiert. Die Lösung von HYAFF 11p75/Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 135 mg/ml, in der eine geeignete Menge, z. B. 20 mg, des Gangliosidgemisches Sinassial® gelöst wurde, wird durch Aktivierung des Sprühmittels für 30 Sekunden verteilt, während es sich entlang der Länge des Stahlstabs auf und ab bewegt. Während dieser Zeit bewegt sich das Sprühmittel viermal entlang der Länge des Stabes. Das System wird aus dem Apparat entfernt und in absoluten Ethanol getaucht. Nach Festwerden wird der Führungskanal von dem Stahlstab entfernt und in der Größe zugeschnitten.
Der gemäß der obenstehenden Technik hergestellte Führungskanal ist 20 mm lang, 180 um dick, besitzt einen Innendurchmesser von 3 mm und wiegt 24 mg, entsprechend 12 mg/cm.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Führungskanäle können z. B. als Führungen für die periphere Nervenregeneration (vgl. Beispiel 40) oder als Hilfsmittel bei der peripheren Neurorrhaphie (vgl. Beispiel 41) verwendet werden. Mit spezifischem Bezug auf den vorstehenden Gebrauch können diese Führungskanäle an den Stümpfen der geschädigten Nerven durch Nahtfäden befestigt werden, ohne dadurch die Funktion des Führungskanals oder seine Fähigkeit, axonales Wachstum entlang seines Inneren zu führen, zu beeinflussen.
Um die Verwendung der Führungskanäle der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und um ihre Funktion und Bioabsorbierbarkeit zu zeigen, wurden die folgenden Tests durchgeführt.

BEISPIEL 40

Zehn Ratten, jede mit einem Gewicht von 250-300 gr, deren Ischiasnerven im mittleren Abschnitt durchgeschnitten worden waren, wurden verwendet. 2 mm des Nervs wurden entfernt, so daß eine 8 mm-Lücke nach spontanem Schwund blieb. Beide Stümpfe, proximal und distal, wurden in einen Führungskanal eingefügt (beschrieben in Beispiel 34), der mit Kochsalzlösung gefüllt worden war. Der Führungskanal wurde an Ort und Stelle mit einem Nylonnahtfaden (9-0) fixiert. Der Führungskanal erwies sich als intakt nach dem Nähen. 90 Tage nach der Operation wurde die Funktion des regenerierten Nervs getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Führungskanal in der Lage war, axonales Wachstum zu verstärken und zu lenken.
Weitere Untersuchungen an den regenerierten Nerven zeigten die Bioabsorbierbarkeit der verwendeten Führungskanäle (Fig. 2) und die sich ergebende Wiedergewinnung der Nervenfunktion (Fig. 3).

BEISPIEL 41

Führungskanäle wurden als Hilfsmittel bei der peripheren Nervenneurorrhaphie in einem Transplantationsversuch in Ratten verwendet. Diese chirurgische Technik ist besonders interessant und kann vorteilhaft aus den folgenden Gründen angewendet werden:
i) sie verringert die Menge an erforderlichem Nähmaterial, das normalerweise um die wiederverbundene Stelle unabsorbiert bleibt;
ii) sie schafft eine Barriere gegen zelluläre Elemente, wie Fibroblasten, die für den Nerven selbst fremd sind; und
iii) sie erlaubt Transplantate verschiedener Größen vom geschädigten Nerven zur Wiederverbindung, dank der Verwendung kegelförmiger Führungskanäle.
Die zur Untersuchung der Funktion und Bioabsorbierbarkeit der Führungskanäle der vorliegenden Erfindung entworfenen Versuche (insbesondere der in Beispiel 31 beschriebene Führungskanal) wurden in blutsverwandten Ratten, die ungefähr 3C10 gr wogen, durchgeführt. Die Transplantation wurde gemäß der beschriebenen Technik erzielt. Der Ischiasnerv der Empfängerratte wurde geschnitten, um eine Lücke von etwa 15 mm zu erzeugen. Der Ischiasnerv der Spenderratte wurde in die Lücke ohne Nähte plaziert, aber durch Zusammenhalten des geschädigten Nerves und des Transplantats innerhalb des Führungskanals. Das Transplantat wurde dann an den Führungskanal, ohne eine Lücke zu lassen, mit zwei epineuralen Stichen angenäht.
Die von Gruppen von 10 Ratten, die einer Neurorrhaphie unterzogen wurden, erhaltenen vorläufigen Ergebnisse zeigten eine hervorragende Wiederverbindung des Nervs (Fig. 4) und die Gegenwart regenerierter Axone im Transplantat (Fig. 5) nach 20 Tagen, wobei zu diesem Zeitpunkt der Führungskanal fast vollständig absorbiert worden war. Darüberhinaus zeigte der Versuch, daß der Führungskanal in der Lage ist, die Bildung von Verwachsungen zu verhindern.

Anwendungen der vorliegenden Führungskanäle

Die zusammengesetzten Führungskanäle der vorliegenden Erfindung können als Medizinprodukte zur peripheren Nervenregeneration verwendet werden, besonders in der Mikrochirurgie der Hand, um die Kontinuität des durch traumatische Ereignisse oder chirurgische Eingriffe unterbrochenen Nervs wiederherzustellen, und in der Behandlung geschädigter Sehnen, besonders in der plastischen Chirurgie, um die von der Tenorrhaphy kommende Sehnenfunktion wiederherzustellen, und insbesondere in der Chirurgie der Hand und des Fußes nach traumatischen Ereignissen oder chirurgischen Eingriffen.

Claims

1. Medizinprodukt zur Verwendung bei der Behandlung von geschädigtem Nervengewebe, welches einen röhrenförmigen, biokompatiblen und bioabsorbierbaren Verbundstoff umfaßt, umfassend:

eine Matrix umfassend einen biokompatiblen, bioabsorbierbaren, wasserunlöslichen Ester der Hyaluronsäure;

eine röhrenförmige Verstärkungsstruktur, umfassend verflochtene Fäden, gebildet durch eine Flechttechnik unter Verwendung einer Maschine, welche 8 bis 16 Fadenhalter pro operativer Einheit hat, umfassend einen biokompatiblen, bioabsorbierbaren, wasserunlöslichen Ester der Hyaluronsäure; und gegebenenfalls

mindestens ein biologisch oder pharmakologisch aktives Molekül, wobei dieses biologisch oder pharmakologisch aktive Molekül ein Molekül ist, das das Wachstum, die Regeneration und/oder die Heilung von geschädigtem Nervengewebe erhöht und/oder stimuliert.

2. Medizinprodukt nach Anspruch 1, wobei der Ester der Hyaluronsäure ein vollständiger oder partieller Ester der Hyaluronsäure mit einem pharmakologisch inaktiven Alkohol ist.

3. Medizinprodukt nach Anspruch 2, wobei der Alkohol ein aliphatischer, araliphatischer, cycloaliphatischer oder heterocyclischer Alkohol ist.

4. Medizinprodukt nach Anspruch 3, wobei der aliphatische Alkohol ein C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;- aliphatischer Alkohol ist.

5. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Ester ein vollständiger Ester der Hyaluronsäure ist.

6. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Ester ein partieller Ester der Hyaluronsäure ist.

7. Medizinprodukt nach Anspruch 3, wobei der araliphatische Alkohol Benzylalkohol ist.

8. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Ester der Hyaluronsäure ein Ester der Hyaluronsäure ist, welcher zu 75% mit Benzylalkohol verestert ist.

9. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das biologisch oder pharmakologisch aktive Molekül mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nervenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor in seiner sauren oder basischen Form, ciliärem neuronotrophischem Faktor, biologisch aktivem verkürztem ciliärem neuronotrophischem Faktor, aus dem Gehirn stammendem neurotrophischem Faktor, Neurotrophin-3, Neurotrophin-4, einem Gangliosid, einem Gangliosidderivat, einem Gangliosidgemisch, einem Gemisch von Gangliosidderivaten und einem Gemisch von beliebigen der vorgenannten Gruppenmitglieder.

10. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die verflochtenen Fäden ein Denier im Bereich von 120 Denier bis 600 Denier, eine Zugfestigkeit beim Zerreißen im Bereich von 0,6 gr/Denier bis 3,5 gr/Denier, eine minimale Dehnung im Bereich von 3% bis 10% haben und eine Anzahl von Fäden im Bereich von 8 bis 16 ist.

11. Medizinprodukt nach Anspruch 10, wobei das Medizinprodukt eine Länge im Bereich von 5 bis 150 mm, einen Innendurchmesser im Bereich von 1 bis 15 mm, eine Dicke im Bereich von 50 um bis 1000 um und ein Gewicht im Bereich von 8 mg bis 80 mg hat, entsprechend 4 bis 40 mg/cm.

12. Medizinprodukt nach Anspruch 11, wobei das Medizinprodukt eine Länge von 20 mm, einen Innendurchmesser von 1, 5 bis 3 mm, eine Dicke von 400 um und ein Gewicht von 20 mg hat, entsprechend 10 mg/cm.

13. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung in der Chirurgie und Mikrochirurgie.

14. Medizinprodukt nach Anspruch 13, wobei das Medizinprodukt an anatomischen Stellen verwendet wird, wo Unterbrechungen und/oder Verlust von Substanz aufgetreten sind.

15. Medizinprodukt nach Anspruch 14, wobei die anatomische Stelle ein geschädigter peripherer Nerv oder eine geschädigte Sehne ist.

16. Medizinprodukt nach Anspruch 15, wobei das Medizinprodukt zur Regeneration von Nerven oder als Hilfsmittel bei der Neurorrhaphie verwendet wird.

17. Medizinprodukt nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Verhinderung von postoperativen Verwachsungen und deren Wiederauftreten.

18. Verfahren zur Herstellung des Medizinproduktes nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend das Überziehen der röhrenförmigen Verstärkungsstruktur, die verflochtene Fäden umfaßt, die einen biokompatiblen, bioabsorbierbaren, wasserunlöslichen Ester der Hyaluronsäure umfassen, mit einer Lösung eines biokompatiblen, bioabsorbierbaren, wasserunlöslichen Esters der Hyaluronsäure, welche gegebenenfalls mindestens ein biologisch oder pharmakologisch aktives Molekül enthält, unter Verwendung eines elektrolytisch polierten Stahlzylinders, welcher die rotierende röhrenförmige Verstärkungsstruktur bei einem Rotationsminimum von 100 Upm hält.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Überziehen durch Aufsprühen der Lösung geschieht.

20. Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei dessen Herstellung die Koextrusion von mindestens einem biologisch oder pharmakologisch aktiven Molekül mit den Fäden umfaßt, welche die röhrenförmige Verstärkungsstruktur umfaßt.