DE69327454T2

DE69327454T2 - Analytisches verfahren

Info

Publication number: DE69327454T2
Application number: DE69327454T
Authority: DE
Inventors: Walter King; Jing Liu; Sonya Popoff; Eugene Serpe; Jyotsna Shah; James Smith
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2013-10-09
Also published as: WO1994010335A3; EP0625213B1; WO1994010335A2; DE69327454D1; US5629156A; EP0625213A1; JPH08503606A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Methoden und. Ausstattungen zum Nachweis von Zielmolekülen in Proben. Insbesondere können die Zielmoleküle Nucleinsäurefragmente von klinischen Proben sein. Die Ausführungsformen der Erfindung stellen Verfahren zum schnellen und empfindlichen Nachweis von Zielnucleinsäuren bereit.

Technischer Hintergrund

Der Nutzen des Nachweises von Zielnucleinsäuresequenzen ist in der klinischen Diagnostik bereits etabliert. Verschiedene Methodologien zum Nachweis von besonderen Zielnucleinsäuresequenzen als Diagnose auf die Anwesenheit von Zielorganismen wurden entwickelt. Diese umfassen Hybridisations-Gehaltsbestimmungen, welche auf eine oder mehrere, mit einem Schwanz versehenen, Nucleinsäuresonden basieren, welche in der Lage sind, Nucleinsäuresequenzen in der Zielnucleinsäure zu hybridisieren oder zu binden.
Die Hybridisations-Gehaltsbestimmungen, die bisher in entwickelt wurden, blieben aufgrund des Auftretens von künstlichem Signalen oder Hintergrundrauschen in ihrer Wirkung beschränkt, die während der Gehaltsbestimmung und dem Abgleich mit dem Signal erzeugt werden, das durch die abgefangenen Zielnucleinsäuren erzeugt wird. Beispielsweise wurden Sandwich-Hybridisations- Nachweisbestimmungen entwickelt, welche zwei separate Nucleinsäuresonden verwenden, die in der Lage sind, die korrelierenden Nucleinsäuresequenzen in der Zielnucleinsäure zu hybridisieren. Eine dieser Sonden, die Detektorsonde, ist ausgebildet, um einen nachweisbaren Makierungsanteil zu tragen, um den Nachweis des abgefangenen Zieles zu ermöglichen. Die zweite Sonde, die Abfangsonde, ist ausgebildet, um das Anbinden an einen Träger sowie das Ziel zu ermöglichen, um die Probenreinigung und die Isolation des abgefangenen Zieles zu erleichtern. Unter den Hybridisierungs- oder Abfangsbedingungen hybridisieren die zwei Sonden mit der Zielnucleinsäure, um einen ternären Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Komplex zu bilden. Das Einführen des Trägers unter Bindungsbedingungen führt zum Abfangen des ternären Komplexes durch den Träger. Die Detektorsonde kann dann isoliert und gemessen werden, um die Anwesenheit oder Quantität des Zieles in der Probe zu bestimmen.
Die Sensitivität von solchen Sandwich-Hybridisations-Nachweisverfahren ist bekanntermaßen begrenzt, weil die Detektorsonde, ungeachtet der Abwesenheit des Zieles in der Probe, direkt an den Gebaltsprüfungsträger bindet. Das Binden der Detekorsonde direkt an den Träger, in der Abwesenheit des Zieles, wird als nicht spezifische Bindung bezeichnet. Weiterhin kann die zu bestimmende Probe andere Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit der Sequenz haben, die als Ziel ausgewählt ist. Diese sind als Pseudoziele bekannt. Diese Pseudoziele können, wenn sie zu einem hohen Grad mit der Detektorsonde assoziert sind, ebenso nicht spezifisch mit dem Gehaltsprüfungsträger binden, und weiterhin können sie mit der Detekorsonde binden, wobei sie die Detektorsonde an den Träger in der Abwesenheit des Zieles binden und somit ein Hintergrundsignal erzeugen. Zusätzlich können Pseudoziele, die mit Detektorsonde assoziert sind, mit einigen Fehlanpassungen an die Abfangsonde hybridisieren und somit auf dem Gehaltsprüfungsträger abgefangen werden. Dieses Binden von Detektorsonde an den Träger durch eine Nucleinsäuresequenz, die ähnlich mit dem Ziel ist, wird als nicht spezifische Hybridisation bezeichnet. Nicht spezifische Bindung und nicht spezifische Hybridisation erzeugen ein nachweisbares Signal oder Rauschen, welches mit dem Signal kumuliert, welches durch das Abfangen von ternärem Komplex und Ziel erzeugt ist. Das Problem des Rauschens, aufgrund der nicht spezifischen Bindung und der nicht spezifischen Hybridisation, wird häufig durch die Anwesentheit eines Überschusses an Detekorsonde in der Gehaltsprüfungseinrichtung verschärft, welcher zur Erleichterung der schnellen und vollständigen Bildung der Ziel:Detektorsonde-Hybridisation vorhanden ist.
Übliche Sandwich-Hybridisations-Gehaltsprüfungsverfahren sind in der Lage Ziele bis zu einer Grenze von ungefähr 10&sup8; Zielen nachzuweisen. Jedoch versuchen diagnostische Gehaltsprüfungen oftmals die Anwesenheit von Zielen nachzuweisen, die in Konzentrationen in den Proben vorhanden sind, die deutlich geringer sind als die 10&sup8;-Ziele-Schwelle, die gegenwärtig durch konventionelle Gehaltsbestimmungen erreicht wird. Forscher versuchten das Rauschen von Sandwich-Hybridisations-Gehaltsbestimmungen auszuschalten oder wenigstens zu verringern. Ein Verfahren, im folgenden als reversibles Zielabfangen oder RTC (Reversible target capture) bezeichnet, ist wirkungsvoll bei der Verringerung solches Hintergrundrauschens. Das reversibles Zielabfangen beinhaltet Zyklen des Abfangens und Freigebens des ternären Komplexes an einer Reihe von Trägern.
Entsprechend der üblichen Probenpräparation werden zu Beginn Abfang- und Detektorsonden zu dem Probenmedium hinzugegeben, um die Zielnucleinsäure dem Nachweis auszusetzen. In der Anwesenheit des Zieles und nach dem Auferlegen der Bindungsbedingungen wird der ternäre Komplex gebildet. Nach Einführen eines geeigneten Trägers wird der ternäre Komplex mit dem Träger abgefangen. Jedoch bindet eine gewisse Menge der Detektorsonde nicht spezifisch an den Träger. Der Träger und der gebundene ternäre Komplex werden dann von dem Probenmedium entfernt, üblicherweise gewaschen und dann in ein zweites Probenmedium eingebracht. Dann werden Ablösebedingungen auferlegt, um ein Ablösen des ternären Komplexes von dem Träger zu bewirken. Der ursprüngliche Träger wird dann von dem zweiten Probenmedium entfernt, wobei etwas von der nicht spezifisch gebundenen Detektorsonde aus der Gehaltsbestimmungsanorndung (Assay) entfernt wird.
Danach wird ein zweiter Träger in das zweite Probenmedium eingebracht, abermals Bindungsbedingungen auferlegt und der ternäre Komplex, der das Ziel enthält, wird wieder abgefangen. Da einige der Detektorsonden, die nicht spezifisch an den ursprünglichen Träger binden, ebenso in das zweite Probenmedium, bei deren Unterwerfen unter die Ablösebedingungen, abgegeben werden können, sind diese folglich für eine nicht spezifische Bindung an den zweiten Träger verfügbar, was zusätzliche Zyklen der Ablösung und des Abfangens notwendig machen kann, um eine maximale Empfindlichkeit bei der Gehaltsprüfung zu erhalten. Üblicherweise sind drei Zyklen des Zielabfangens hinreichend, um das Rauschen und die Nachweisgrenzen bei einer konventionellen Sandwich-Hybridisations-Gehaltsprüfung zu verringern. Reversibles Zielabfangen und andere Verfahren, die auf die Verringerung des Rauschens gerichtet sind, daß aus nicht spezifischen Binden der Detektorsonde herrührt, sind detailliert in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 87309308.2 (Veröffentlichungs-Nr. 0265244), Analytical Biochemistry, 181, 345-359 (1989), und Analytical Biochemistry, 181, 360- 370 (1989) beschrieben.
Die WO-A-91 18177 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von einem gesuchten Oligo- oder Polynucleotid in einer Probe, das ein replizierbares und hybridisierbares, rekombinantes einsträngiges RNA-Sondenmolekül verwendet. Diese Sonde umfaßt eine Wiedererkennungsequenz, die sich an eine RNA-bezogene RNA-Polymerase anbietet, eine Sequenz die zur Initiation der Produktstrangsynthese durch die Polymerase notwendig ist und eine heterologe RNA-Sequenz, die bei einem spezifischen Abschnitt in der internen Region des rekommbinanten Moleküls eingeschoben ist und die mit den interessierenden Oligo- oder Polynucleotiden komplementär ist.
Die EP-A-0 425 217 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Campylobacter-Spezien in einer Probe mittels eines Hybridisationsassays. Die Assaystruktur besteht aus einer Lösungshybridisation von wenigstens zwei markierten Oligonucleotidsonden, wobei eine davon spezifisch zu einer Region der Campylobacter-rRNA ist, und dann dem Abfangen des erhaltenen Hybridkomplexes auf einem festen Träger, für den nachfolgenden Nachweis und die Quantifizierung.
Die WO-A-90 15159 beschreibt Nucleinsäuresonden, die in der Lage sind, rRNA von Chlamydia trachomatis zu hybridisieren und nicht die rRNA von nicht- Chlamydia. Verfahren zur Verwendung solcher Sonden zum Nachweis von Chlamydia trachomatis in klinischen Proben sind ebenso beschrieben.
Sandwich-Hybridisationsassays die mit einem reversiblen Zielabfangen ergänzt sind, sind in der Lage, die Nachweisgrenze auf ungefähr 10&sup6; Zielmoleküle zu erweitern. Ungeachtet des Erfolgs von diesem Techniken, haben jedoch Fachleute weiterhin nach weiteren Wegen zur Verstärkung der Nachweisempindlichkeit von den Gehaltprüfungen gesucht. Dies umfaßt die Verwendung von Vervielfältigungsschemas zur weiteren Vervielfältigung des Zielmoleküls oder des Signales, das durch das Assay erzeugt wird. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 88312135.2 (Veröffentlichungsnr. 0328829) beschreibt beispielsweise verbesserte Gehaltsprüfungsverfahren, welche die Zielpolynucleotide vor deren Nachweis vervielfältigen. Die Vervielfältigung wird enzymatisch vollendet, unter der Verwendung von Polymeraseenzymen. Beispielsweise können Ziel-DNA und das Enzym Kern-RNA-Polymerase verwendet werden, um RNA-Komplemente zu der Ziel-DNA zu bilden. Die RNA-Komplemente werden dann nachgewiesen. In ähnlicher Weise kann Ziel-RNA vor dem Nachweis durch Enzyme repliziert werden, wie Qβ-Replicase und reverse Transkriptase. Diese Techniken sind mit dem reversiblen Zielabfangen vollständig kompatibel und können zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Assays auf ungefähr 10 Zielmoleküle verwendet werden. Diese Techniken sind weitergehend in der EP-A-0 328 829 beschrieben.
Alternativ kann die Nachweisempfindlichkeit des Assays durch Verstärkung des Signals erhöht werden, das durch die Detektorsonde erzeugt wird oder insbesondere durch die Vervielfältigung der Detektorsonde selbst. Dies kann erreicht werden, indem sich midivariante (MDV-1) RNA, für die Verwendung als Detektorsonde, zu eigen gemacht wird. Midivariantartige RNAs können als Matrixen für Qβ-Replikase dienen und können dadurch repliziert werden. Daher können Detektorsonden zur Vervielfältigung durch Qβ-Replikase zusammengestellt werden, um so das Assay zu verbessern. Der Einsatz der Qβ-Replikasevervielfäliigung in Nucleinsäure-Sandwich-Hybridisationsassays zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit des Assays auf ungefähr 10&sup6; Zielmoleküle ist von Cahill et al., Clinical Chemistry, 37, 1482 (1991) beschrieben.
Ungeachtet der Fortschritte die bis heute gemacht wurden, verblieb die Nachweisempfindlichkeit von Nucleinsäure-Sandwich-Hybridisationsassays, aufgrund des Hintergrundrauschens, das während der Gehaltsbestimmung erzeugt wird, beschränkt. Daher wäre es vorteilhaft, die Nachweisempfindlichkeit der Gehaltsbestimmung bis zu einem Punkt anzuheben, wo die Nachweisempfindlichkeit der Gehaltsbestimmung durch die Fähigkeit des Assays beschränkt wird, allein das Signal von dem Zielmolekül nachzuweisen und nicht durch das Hintergrundrauschen, das während der Gehaltsbestimmung erzeugt wird. Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Sandwich-Hybridisationsassay mit gesteigerter Empfindlichkeit bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Sandwich-Hybridisationsassay bereitzustellen, bei dem die Empfindlichkeit des Assays durch das Signal begrenzt ist, das von dem Zielmolekül erzeugt wird und nicht durch das Hintergrundrauschen, das während der Gehaltsbestimmung erzeugt wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß eine deutlich höhere Empfindlichkeit von Sandwich-Hybridisationassays erhalten werden kann, wenn einige Veränderungen an dem Gehaltsprüfungsverfahren mit reversiblen Zielabfangen gemacht werden. Die Empfindlichkeit des neuen Assays ist durch das Signal begrenzt, das als Ergebnis der nachgewiesenen Zielmoleküle erzeugt wird und nicht durch Hintergrundrauschen. Die Einführung der neuen Gehaltsbestimmungsverfahren in ein Hybridisationsassay, das ein Signalverstärkungsschema verwendet, wie die Verwendung von Qβ-Replikase zur Replikation einer RNA-artigen Matrize in der Detek torsonde, ermöglicht, die Nachweisempfindlichkeit der Gehaltsbestimmung um den Faktor 103 zu verbessern. Somit kann die Empfindlichkeit um bis zu 3 Potenzen angehoben werden.
Frühere Bemühungen, die auf eine Verringerung des Hintergrundrauschens in Sandwich-Hybridisationsassays zielten, waren auf die Verringerung des Rauschens gerichtet, das von dem nicht spezifischen Binden der markierten Detektorsonde an dem Träger herrührte, die in dem Assay verwendet wurde. Obwohl Techniken wie das reversible Zielabfangen ein solches Rauschen sehr wirkungsvoll reduzieren, verbleibt ein Restrauschen bei der Gehaltsbestimmung. Es wurde nun gefunden, daß dieses Restrauschen deutlich bis zu dem Punkt reduziert werden kann, an dem es vollständig beseitigt ist. Es wurde gefunden, daß dieses Restrauschen durch die Verwendung von zwei oder mehreren eigenständigen Abfangsonden und durch Modifikationen der RTC-Struktur beseitigt werden kann.
Es wird davon ausgegangen, daß die neuen Assaystrukturen das Rauschen, aufgrund des nicht spezifischen Bindens der Detektorsonde an die Abfangsonde, beseitigen. Ältere Methoden des reversiblen Zielabfangens verwenden eine einzelne Abfangsonde und behalten den ternären Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde- Komplex während der Gehaltsprüfung bei. Dementsprechend wird die Detektorsonde, die nicht spezifisch an die Abfangsonde bindet, während des Zielablösens und der abermaligen Zyklen des RTCs mitgeschleppt und ist am Ende der Gehaltsbestimmung anwesend, um ein Rauschen in Konkurrenz mit dem Signal zu erzeugen, das von dem abgefangenen Ziel herrührt. Dieses Rauschen, das in dem Assay während des Zielablösens und Wiederabfangens verbleibt, wird als Zyklusrauschen bezeichnet. Die Verfahren die hierin beschrieben werden, entfernen wirkungsvoll das Zyklusrauschen ebenso wie das Rauschen, das von dem nicht spezifischen Binden der Detektorsonde an den Träger herrührt. Im Ergebnis können diese Methoden ein Sandwich-Hybridisationsassay bereitstellen, das vollständig frei von Hintergrundrauschen ist.
Die Erfindung umfaßt zwei Klassen an Zweifach-Abfangassays. Das Klasse I Verfahren umfaßt die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einer ersten Abfangsonde und einer Detektorsonde, welche in der Anwesenheit des Zielmoleküles an das Zielmolekül binden, um einen ternären erste Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Komplex zu bilden; Abtrennen des Ziel:Detektorsonde-Abschnittes des ternären Komplexes von der ersten Abfangsonde; Inkontaktbringen der Probe mit einer zweiten Abfangsonde welche an das Zielmolekül bindet, um einen ternären zweite Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Komplex zu bilden; Minimieren des Anteils an Detektorsonde die nicht spezifisch an die zweite Abfangsonde bindet; und Überwachen durch wiederholtes Messen des zweiten ternären Komplexes auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein der Detektorsonde.
Das Klasse II Verfahren umfaßt die Schritte des Inkontaktbringens der Proben mit einer ersten Sonde und einer zweiten Abfangsonde, welche in der Anwesenheit des Zielmoleküls an das Ziel bindet, um einen Zielkomplex zu bilden; Minimieren des Anteils an zweiter Abfangsonde in der Probe; Inkontaktbringen der Probe mit der Detektorsonde und frischer erster Abfangsonde, welche in der Anwesenheit des Zielmoleküles an das Ziel bindet, um einen quaternären Komplex zu bilden, welcher einen zweiten Zielkomplex der zweiten Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde umfaßt und die erste Abfangsonde bindet; Minimieren des Anteils an Detektorsonde, die an die zweite Abfangsonde des zweiten Zielkomplexes gebunden ist; und Überwachen durch wiederholtes Messen des zweiten Zielkomplexes auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein an Detektorsonde.
Insbesondere umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Klasse I Verfahrens die Schritte des Inkontaktbringens des hinsichtlich des Zielmoleküls zu vermessenden Probemediums mit einer ersten Abfangsonde und einer Detektorsonde, welche, in der Anwesenheit des Zielmoleküls, an das Ziel binden, um einen ersten ternären Komplex aus erster Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde zu bilden; Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Träger, wobei der erste Träger die erste Abfangsonde bindet und wobei der erste ternäre Komplex an den Träger gebunden wird; Abtrennen in einem beträchtlichen Umfange des ersten Trägers und der ersten Abfangsonde von dem zweiten Medium; Einführen eines zweiten Trägers und einer zweiten Abfangsonde in das zweite Medium, um einen zweiten ternären Komplex der zweiten Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde zu bilden, der an den zweiten Träger gebunden ist; Abtrennen des zweiten Trägers und des zweiten ternären Komplexes von dem zweiten Medium im wesentlichen Umfange; Einbringen des zweiten Trägers und des zweiten ternären Komplexes in ein drittes Medium und Ablösen des zweiten ternären Komplexes von dem zweiten Träger; Abtrennen in einem beträchtlichen Umfange des zweiten Trägers von dem dritten Medium; und Nachweis der Anwesenheit des Zieles in dem dritten Medium. Zusätzliche Zyklen des Abfangen und Ablösens des Zieles können durchgeführt werden, wenn sie notwendig sind, um die Verringerung des Rauschens zu vervollständigen, das auf der nicht spezifischen Bindung der Detektorsonde an den Träger beruht.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Klasse II Verfahrens umfaßt die Schritte des Inkontaktbringens der zu bestimmenden Proben mit einer ersten Abfangsonde und einer zweiten Abfangsonde, worin die ersten und zweiten Abfangsonden an das Zielmolekül binden, um einen Zielkomplex zu bilden; Inkontaktbringen der Probe mit einem zweiten Träger, welcher an die zweite Abfangsonde bindet, um dabei den Zielkomplex an den zweiten Träger zu binden; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des zweiten Trägers und des gebundenen Zielkomplexes von der Probe; Einbringen des zweiten Trägers und des gebundenen Zielkomplexes in ein zweites Medium und Ablösen des Zielkomplexes von dem zweiten Träger; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des zweiten Trägers von dem zweiten Medium; Inkontaktbringen des zweiten Mediums mit einem ersten Träger, welcher an die erste Abfangsonde bindet, um dabei den Zielkomplex zu binden; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des er sten Trägers und des gebundenen Zielkomplexes von dem zweiten Medium; Einführen des ersten Trägers und des gebundenen Komplexes in ein drittes Medium und Ablösen des zweiten Abfangsonde:Ziel-Abschnittes des ersten Zielkomplexes von dem ersten Träger und der ersten Abfangsonde; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des ersten Trägers und der ersten Abfangsonde von dem dritten Medium; Inkontaktbringen des dritten. Mediums mit Detektorsonde und frischer erster Abfangsonde, welche in der Anwesenheit des Zielmoleküles an das Ziel bindet, um einen quaternären Komplex zu bilden, der einen zweiten Zielkomplex der zweite Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde und gebundene erste Abfangsonde umfaßt; Inkontaktbringen des dritten Mediums mit frischem erstem Träger, welcher mit der ersten Abfangsonde bindet, um den quaternären Komplex zu binden; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des ersten Trägers und des gebundenen quaternären Komplexes von dem dritten Medium; Einführen des ersten Trägers und des gebundenen quaternären Komplexes in ein viertes Medium und Ablösen des zweiten Zielkomplexes von dem ersten Träger und der ersten Abfangsonde; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des ersten Trägers und der gebundenen ersten Abfangsonde von dem vierten Medium; Inkontaktbringen des vierten Mediums mit zweitem Träger, welcher an die Abfangsonde bindet; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des zweiten Trägers und des gebundenen zweiten Zielkomplexes von dem vierten Medium; Einbringen des zweiten Trägers und des gebundenen zweiten Zielkomplexes in ein fünftes Medium und Ablösen des zweiten Zielkomplexes von dem zweiten Träger; Abtrennen in einem wesentlichen Umfange des zweiten Trägers von dem fünften Medium; und Überwachung durch wiederholtes Messen des zweiten Zielkomplexes auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein der Detektorsonde.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt, zum Zwecke des Vergleichs aneinandergestellt, die Ergebnisse von einer Matrix von Experimenten, die die Erzeugung von Signal und Rauschen für Nucleinsäure-Hybridisationsassays demonstrieren, jeweils für Zielmoleküle von Chlamydia trachomatis unter Verwendung der erfindungsgemäßen Klasse I Methodologie für duales Abfangen und der Standardmethodologie für reversibles Zielabfangen.
Fig. 2 zeigt, zum Zwecke des Vergleichs aneinandergestellt, die Ergebnisse von einer Matrix von Experimenten, die die Erzeugung von Signal und Rauschen für Nucleinsäure-Hybridisationsassays demonstrieren, jeweils für Ziele von Chlamydia trachomatis unter der Verwendung einzelner Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Klasse I Methodologie fair duales Abfangen.
Fig. 3 zeigt, zum Zwecke des Vergleichs aneinandergestellt, die Ergebnisse von einer Matrix von Experimenten, die die Erzeugung von Signal und Rauschen für Nucleinsäure-Hybridisationsassays demonstrieren, jeweils für Zielmoleküle von Chlamydia trachomatis unter Verwendung der erfindungsgemäßen Klasse II Methodologie für duales Abfangen und einer vergleichbaren Standardmethodologie für reversibles Zielabfangen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß die Empfindlichkeit von Sandwich-Assays beträchtlich gesteigert werden kann, unter der Verwendung von Nachweismethoden, welche Modifikationen von konventionellen Sandwich-Assays sind, die die reversible Zielabfang-Technik verwenden, wie sie beispielsweise in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 87309308.2 beschrieben ist. Die hier offenbarten Verfahren beseitigen im wesentlichen das Hintergrundrauschen, das sonst während der Nachweisbestimmung auftritt und somit die Nachweisempfindlichkeit des Assays beschränkt. Hierdurch erweitern die offenbarten Verfahren die Empfindlichkeit der Gehaltsbestimmungen um bis zu 3 Größenordnungen und führen zu Gehaltsbestimmungen, deren Empfindlichkeit durch das Ansprechen auf das wahre Signal begrenzt ist und nicht durch Rauschen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind im allgemeinen mit Sandwich-Assays kompatibel. Sie sind besonders vorteilhaft in Sandwich-Hybridisationsassays auf Nucleinsäure-Zielmoleküle. Die Verfahren sind ebenso für Ausstattungen, die Automation und den Einsatz von Instrumenten zugänglich. Somit erlauben die offenbarten Verfahren eine schnelle, bequeme und empfindliche Sandwich-Gehaltsbestimmung bei konventionellen Bestimmungszielen.
Die hierin offenbarten Verfahren zur Gehaltsbestimmung sind vorteilhaft, da sie auf eine bisher nicht gewürdigte Rauschkomponente des Sandwich-Assays gerichtet sind. Früher wurden Gehaltsbestimmungsverfahren entwickelt, um das Rauschen zu verringern, das von dem nicht spezifischen Binden von Detektorsonden an die Träger, die in Sandwich-Assays verwendet wurden, und an Materialien in der Probe herrührte, welche irgendwie ähnlich mit den jeweils aktuellen Zielen sind. In Nucleinsäure-Hybridisationsassays können dies Nucleinsäuresequenzen sein, welche einige Ähnlichkeiten mit den Zielmolekül aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Gehaltsbestimmungsverfahren werden grundsätzlich als Klasse I- und Klasse II-Assays mit dualen Abfangen bezeichnet. Im Gegensatz zur bisherigen Sandwich-Assays, welche eine einfache Abfangsonde für die Gehaltsbestimmung verwenden, verwenden Assays mit dualem Abfangen multiple Abfangsonden in dem Assay. Obwohl es notwendig ist, daß die Abfangsonden in der Lage sind sowohl an die Träger als auch die Ziele zu binden, die in dem Assay verwendet werden, ist es weiterhin ein Merkmal der Erfindung, daß die Abfangsonden so für die Verwendung in dem Assay aufgebaut und ausgewählt sind, daß einige etwas stärker an den Assayträger als an das Zielmolekül binden und so von dem Zielmolekül abgetrennt werden können, während die Bindung an den Träger beibehalten wird, während andere Abfangsonden stärker an das Zielmolekül als an den Träger binden und so von dem Träger abgetrennt werden können, während die Bindung zu dem Zielmolekül beibehalten wird.
In dem Klasse I-Assay mit dualem Abfangen können beispielsweise die Abfangsonden an die gleichen oder unterschiedliche Regionen an dem Zielmolekül binden, aber sie können ebenso so aufgebaut sein, daß die erste Abfangsonde leichter von dem Zielmolekül abgetrennt werden kann, als von dem Träger an den sie bindet, während die zweite Abfangsonde leichter von dem Träger abgetrennt werden kann als von dem Zielmolekül. Zu Beginn werden die erste Abfangsonde und die Detektorsonde mit der Probe in Kontakt gebracht und es ihnen ermöglicht mit dem Zielmolekül zu binden, um einen ersten ternären Komplex zu bilden. Als nächstes wird ein erster Träger, welcher an die erste Abfangsonde bindet, mit der Probe in Kontakt gebracht. Das Zielmolekül und die Detektorsonde werden dann durch die erste Abfangsonde an dem Träger abgefangen. Der erste Träger und der gebundene erste ternäre Komplex werden im wesentlichen Umfange von dem Probenmedium abgetrennt und in ein zweites Medium eingebracht. Danach werden das Zielmolekül und der Detektorsondenabschnitt von dem ternären Komplex abgelöst und von der ersten Abfangsonde und dem Träger abgetrennt, welche dann von dem zweiten Medium entfernt werden. Voraussichtlich wird, durch die Entfernung des Trägers der ersten Abfangsonde, die Detektorsonde entfernt, die nicht spezifisch an den Träger und die Abfangsonde bindet, wodurch das Hintergrundrauschen aus dem Assay entfernt wird.
Als nächstes wird das Zielmolekül und die Detektorsonde dadurch wieder abgefangen, daß zuerst zweite Abfangsonde eingeführt wird, um einen zweiten ternären Komplex zu bilden und dann ein zweiter Träger in das zweite Probenmedium eingeführt wird. Danach kann der zweite Träger und der zweite ternäre Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Komplex in ein drittes Medium zur Bearbeitung überführt werden. Anschließend kann der zweite Träger von dem zweiten ternären Komplex und von dem dritten Medium abgetrennt werden. Der ternäre Komplex wird dann durch wiederholtes Messen auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Detektorsonde überprüft. Wenn in der Originalprobe Zielmoleküle vorhanden sind, wird Detektorsonde nachgewiesen. Voraussichtlich entfernt die Abtrennung des zweiten Trägers von dem dritten Medium die Detektorsonde, die nicht spezifisch an den zweiten Träger gebunden ist.
Das Abfangen und Ablösen unter der Verwendung von ersten und zweiten Abfangsonden kann in jeder Reihenfolge durchgeführt werden. Darüberhinaus können weitere Zyklen des Abfangens und Ablösens entweder unter der Verwendung der Abfangsonde oder einer anderen Abfangsonde durchgeführt werden, um das Hintergrundrauschen soweit benötigt weiter zu verringern. Wie in Beispiel 1 dargestellt, beseitigt ein Zyklus, unter der Verwendung der ersten Abfangssonde, und zwei Zyklen, unter der Verwendung der zweiten Abfangsonde, faßt vollständig das Hintergrundrauschen.
In ähnlicher Weise, verwendet das Klasse II-Verfahren mit dualem Abfangen ebenso separate Abfangsonden, um das Hintergrundrauschen zu entfernen. In diesem Verfahren binden die gesonderten Abfangsonden einzelne Bereiche auf dem Zielmolekül. Die gesonderten Abfangsonden sind wieder so ausgeformt, daß die Einen stärker an den Träger binden als an das Zielmolekül, während die Anderen stärker an das Zielmolekül als an den Träger binden. Darüberhinaus sind die Abfangsonden und Träger so ausgewählt, daß nur eine minimale Kreuzreaktivität zwischen ihnen besteht. Die erste Abfangsonde und der erste Träger sind so ausgewählt, daß sie eine minimale Affinität an den zweiten Träger bzw. die zweite Abfangsonde aufweisen.
In dem Klasse II-Verfahren sind zu Beginn der Gehaltsprüfung beide Abfangsonden an das Zielmolekül gebunden. Eine der Abfangsonden wird für den Zyklus des Zielabfangens und Ablösens bei der Beendigung der Gehaltsprüfung verwendet. Demgemäß werden Schritte unternommen, um den Anteil des Überschusses dieser Abfangsonde in dem Assay zu minimieren, d. h. jeglicher Abfangsonde, die nicht spezifisch an das Zielmolekül bindet, vor dem Einbringen der Detektorsonde in das Assay.
Beispielsweise werden die ersten und zweiten Abfangsonden mit dem Ziel kombiniert und daran gebunden, um einen Zielkomplex zu bilden. Überschüssige erste Abfangsonde, die nicht an das Ziel gebunden ist, kann durch Abfangen des Zielkomplexes mit einem zweiten Träger entfernt werden, der spezifisch für die zweite Abfangsonde ist, aber keine Affinität zu der ersten Abfangsonde aufweist. Der zweite Träger und der abgefangene Zielkomplex kann von dem Probenmedium abgetrennt werden und in ein zweites Medium zur weiteren Behandlung überführt werden. Die zweite Abfangsonde ist so ausgebildet, daß sie stärker an das Zielmolekül bindet als an den zweiten Träger. Somit kann der Zielkomplex von dem zweiten Träger abgetrennt werden. Der zweite Träger kann von dem zweiten Medium entfernt werden.
Danach kann der Zielkomplex mit einem ersten Träger abgefangen werden, der spezifisch für die erste Abfangsonde ist. Diese erste Abfangsonde ist aufgebildet, um stärker an den ersten Träger als an das Ziel zu binden. Somit kann der erste Träger und der abgefangene Zielkomplex von dem zweiten Medium abgetrennt werden und in ein drittes Medium zur weiteren Behandlung eingebracht werden. Das Ziel und die zweite Abfangsonde können dann von dem ersten Träger und der ersten Abfangsonde abgelöst werden. Der erste Träger und die erste Abfangsonde können dann von dem dritten Medium entfernt werden, wobei voraussichtlich überschüssige zweite Abfangsonde entfernt wird, die nicht spezifisch an den ersten Träger bindet und welche Rauschen in der Gehaltsbestimmung verursachen kann.
Als nächstes können das Zielmolekül und die zweite Abfangsonde wieder abgefangen werden, mittels der frischen Zugabe von erster Abfangsonde, in der An wesenheit von Detektorsonde, und anschließend einem ersten Träger. Der erste Träger und der abgefangene quaternäre Komplex umfassen einen zweiten Zielkomplex der zweite Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde, und die gebundene erste Abfangsonde kann von dem dritten Medium abgetrennt werden und in ein viertes Probenbehandlungsmedium eingebracht werden. Als nächstes kann der zweite Zielkomplex von dem ersten Träger und der ersten Abfangsonde abgelöst werden. Dieser kann von dem Probenmedium abgetrennt werden, wobei überschüssige Detektorsonde entfernt wird, die nicht spezifisch an den ersten Träger und die erste Abfangsonde bindet und wodurch das Hintergrundrauschen in dem Assay verringert wird.
Als nächstes können einer oder mehrere Zyklen des Abfangens und Ablösens des zweiten Zielkomplexes, mit dem korrespondierenden zweiten Träger zum weiteren Verringern des Hintergrundrauschens, durchgeführt werden. Weiterhin können einer oder mehrere Zyklen des Abfangens und Ablösens, unter der Verwendung der ersten Abfangsonde und des ersten Trägers, ebenso durchgeführt werden. Die zusätzlichen Zyklen des Abfangens und Ablösens können in jeder Reihenfolge durchgeführt werden.
Abschließend wird der zweite Zielkomplex auf das Vorhandensein oder Nicht- Vorhandensein von Detektorsonde durch wiederholtes Messen geprüft, welche das Anwesendsein oder Abwesendsein des Zielmoleküles in der Ursprungsprobe anzeigt.
Dem Fachmann ist bewußt, daß das Binden von Sonden an Träger und Zielmoleküle durch das Auferlegen von geeigneten Bindungsbedingungen erleichtert wird. Dementsprechend kann das Ablösen von Zielmolekülen und Sonden von Trägern durch Auferlegen von Ablösebedingungen erleichtert werden. Bindungs- und Ablösebedingungen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Veränderung der Probentemperatur und der Salzkonzentrationen in den Probenlösungen. Dem Fachmann ist ebenso bekannt, das Waschschritte zwischen den Abfang- und Ablöseschritten in beiden Assays mit dualem Abfangen eingeschoben werden können, um das Hintergrundrauschen weiter zu verringern. Den Fachleuten ist weiterhin bekannt, daß Abfangsonden häufig getrennt von den korrespondierenden Trägern für die Zwecke des Assays, um die Komplexbildung zu erleichtern, hinzugegeben werden. Jedoch können Abfangsonden und Träger zusammen hinzugegeben werden, ohne sonstige Störung der Leistungsfähigkeit der Gehaltsprüfung.
Die erfindungsgemäßen Verfahren des dualen Abfangens sind kompatibel mit herkömmlichen Sandwich-Assayverfahren. Die Verfahren sind kompatibel mit einem weiten Angebot an Trägern wie Filter, Tauchstäbchen und dispergierbaren Partikel. Die Verfahren sind kompatibel mit herkömmlichen Sandwich-Assay-Zielen, wie Antigenen und Nucleinsäuresequenzen und deren korrespondierenden Antikörpern und nucleinsäurebindenden Partnern als Sonden. Die Verfahren sind kompatibel mit herkömmlichen Markierungsanteilen und Nachweisschemas.
Die Verfahren des dualen Abfangens sind besonders geeignet für Nucleinsäurehybridisationsassays. Die Verfahren werden ebenso gut für Assays auf DNA- und RNA-Ziele angewendet. Nucleinsäuresonden und Träger können leicht mit den Bindungscharakteristiken zusammengestellt werden, die für duales Abfangen benötigt werden. Zum Beispiel können zielspezifische Nucleinsäuresequenzen mit einem Mitglied eines Ligantenbindungepaares derivatisiert werden, so wie Biotin. Wenn sie in Verbindung mit Trägern verwendet werden, die mit dem anderen Mitglied des Ligantenbindungapaares derivatisiert sind, wie Streptavidin für Biotin, werden solche Sonden sowohl an das Ziel als auch den Träger so binden, daß die Bindung zu dem Träger stärker ist als zu dem Ziel. Somit können Bedingungen auferlegt werden, wobei die Sonde sich von dem Ziel abtrennt, aber nicht von den Partikeln. In ähnlicher Weise können derartige Sonden und Träger durch die Derivatisierung von zielspezifischen Nucleinsäuresequenzen mit Deazadesoxyguanosin-Resten und den korrespondierenden Trägern mit Desoxycytidien-Resten hergestellt werden. Dem Fachmann ist bekannt, daß andere Sonde-Träger-Kombinationen mit den erforderlichen Eigenschaften erdacht werden können.
Sonden, welche stärker an das Ziel als an den Träger binden, sind bekannt und werden routinemäßig in herkömmlichen Sandwich-Hybridisationsassys verwendet. Beispielsweise können spezifische Nucleinsäuresquenzen mit homopolymeren Schwänzen von spezifischen Nucleotidresten wie Desoxyadenylatresten dA derivatisiert werden. Wenn sie in Verbindung mit Trägern verwendet werden, die mit Desoxythymidinresten dT derivatisiert sind, werden solche Sonden mit dA-Schwanz sowohl an das Ziel als auch an den dT-derivatisierten Träger binden, so daß die Bindung zu dem Ziel stärker ist als zu dem Träger. Somit können Bedingungen auferlegt werden, wobei die Sonde sich von dem Träger, aber nicht von dem Ziel, abtrennt.
Nucleinsäurehybridisationsassays sind ebenso mit Trägern kompatibel, welche in dem Probenmedium diserpergierbar sind. Solche Träger sind besonders vorteilhaft, weil sie eine schnelle Hybridisation zwischen Abfangsonde und Träger ermöglichen und somit einen schnelleren Gehaltsbestimmungsvorgang. Dem Fachmann ist es jedoch klar, daß es schwierig sein kann alle diese Träger von dem Probenmedium abzufangen und abzutrennen. Nichtsdestotrotz wird der Fachmann in der Lage sein, im wesentlichen alle dieser Träger abzutrennen, ohne die Gehaltsbestimmung zu gefährden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch der Verwendung als Zusammenstellungen (Kits) zugänglich. Solche Zusammenstellungen umfassen die Bereitstellung von ersten und zweiten Abfangsonden, die für die Verwendung in den Klasse I- oder Klasse II Verfahren spezifisch sind. Die Zusammenstellungen umfassen ebenso eine Bereitstellung an Detektorsonde. Alle Sonden sind für das nachzuweisende Ziel spezifisch. Weiterhin können die Kits Bereitstellung von geeigneten Trägern und Reagenzien zum Erleichtern des Bindens, Ablösens und Waschens während der Gehaltsbestimmung umfassen.

BEISPIELE

Materialien

Paramagnetische Partikel, die mit Oligo-dT&sub1;&sub4; und dC&sub1;&sub4; derivatisiert wurden, wurden für die Verwendung in den Beispielen wie folgt präpariert. Sub-Micron Eisenoxidpartikeln (Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA) wurden unter Verwendung der Methode, wie sie von Morrissey, Anal. Biochem., 181: 345-349 (1989) beschrieben wurden, mit dT&sub1;&sub4; oder dC&sub1;&sub4;-Oligomeren derivatisiert. Die Perlen wurden für 4 Stunden bei 65ºC in einem Perlenblockierungspuffer blockiert [100 mM Tris 4,9% BSA (Rinderserumalbumin, Sigma Fraktion 5, 0,5% Sarkosyl (Sigma), 10 mM EDTA, 0,05% Bronopol (Inolex, Philadelphia, PA), 0,01% Antischaummittel [Dow-Corning FG-10], pH 7,8]. Die fertige Partikelsuspension hatte 0,25% (G/V) Feststoffe, mit einer Bindungskapazität von 300 umol (Desoxyadenylat) dA&sub5;&sub0; pro mg. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Partikel aus dem Puffer entfernt und sie wurden zu einem Gehalt von 0,045% in frischem Perlenblockierungspuffer und Perlenblockierungspuffer plus 4M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) aufbereitet.
Paramagnetische Partikel die mit Streptavidin derivatisiert wurden, wurden von Promega (Madison, WI) erhalten. Gereinigte 16S rRNA von Chlamydia trachomatis wurde als Ziel in allen Beispielen verwendet. Die 16S rRNA wurde unter Verwendung üblicher Techniken gereinigt.
Verschiedene Nucleinsäuresequenzen wurden in die Sonden aufgenommen, die in den Beispielen verwendet wurden. Dies sind:
Die Nucleinsäuresquenzen 3018, 781 und 1660 wurden unter Verwendung herkömmlicher Beta-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie und herkömmlicher Nucleinsäuresynthetisierungsausstattung hergestellt, wie dem 380-B Synthetisierer von Applied Biosystems, Foster City, CA. Die Sequenzen wurden wie folgt für die Verwendung als Abfang- und Detektorsonden modifiziert.
Die Sequenz 3018 (Sequenz ID Nr. 1) wurde biotiniert um die Sonde B-3018 zu bilden, nämlich mittels einer ersten Modifikation des 5'-Endes der Sequenz 3018 (Sequenz ID Nr. 1) um ein primäres Amin zu enthalten. Dies wurde vorvollständigt durch die Addition eines Aminoproypyl-modifizierten Cystidinphosphoramitids. Die Entschützung der Phosphate und der Nucleotidbasen wurde mittels Standardverfahren vollendet. Die rohen Gemische der Oligonucleotide wurden durch Reversphasen-HPLC gereinigt. Die aminomodifizierten Oligonucleotide wurden mit Biotin markiert, unter Verwendung des Fluo Reporter Biotin Labelling Kit, F-2610 der Molecular Probes, Inc.
Die Sequenzen 781 (Sequenz ID Nr. 2) und 1660 (Sequenz ID Nr. 3) wurden mit Schwänzen versehen, von ungefähr 150 Desoxyadenylat-Resten an dem 3'-Ende von jeder Sequenz, um die dA-781 und dA-1660 Sonden zu bilden. Dies wurde vervollständigt durch die Inkubation mit terminaler Desoxynucleotidyl-Transfe rase (Life Sciences, Inc.), gefolgt durch das Verfahren nach Nelson et al. Methods in Enzymologie, 68: 41-47, 1979. Die Sequenz 3018 (Sequenz ID Nr. 1) wurde ebenso mit einem Schwanz von ungefähr 150 Deazadesoxyguansosin-Resten (C7dG) an ihrem 3'-Ende der Sequenz versehen, um die Sonde C7dG-3018 zu bilden. Vervollständigt wurde dies unter Verwendung des Verfahrens, das von Nelson et al. beschrieben wurde.
Die Sequenz C29 (Sequenz ID Nr. 4) wurde ohne weitere Modifikationen in allen Beispielen als Detektorsonde verwendet. Die RNA-Sequenz C29 (Sequenz ID Nr. 4) wurde von einer DNA-Sequenz, die komplementär zu C29 (Sequenz ID Nr. 4) ist, hergestellt, die durch übliche Verfahren separiert wurde. Die komplementäre Sequenz wurde in einen Transkriptasevektor geklont. C29 wurde von der geklonten DNA transkribiert, unter Verwendung eines T&sub7;-RNA-Polymerasekits von Promega.
Die Beispiele 1-3 zeigen Matrixexperimente, die verschiedene Ausführungsformen, Merkmale und Vorteile der Erfindung zeigen. Zum Beispiel stellt Beispiel 1 einen aneinandergestellten Vergleich der erfindungsgemäßen Klasse I-Methodologie mit dualem Abfangen mit einer Standardmethodologie mit reversiblem Zielabfangen dar. Das Beispiel zeigt zum Zwecke des Vergleichs den Nachweis von Zielen unter Verwendung dieser Gehaltsprüfungsmethodologien und ebenso die verschiedenen Bestandteile des Hintergrundrauschens, das während dieser Gehaltsbestimmungen erzeugt wurde. Beispiel 1 zeigt das Rauschen, daß während der Gehaltsbestimmung erzeugt, wird und daß zurückführbar ist auf das nicht spezifische Binden der Detektorsonde an den Träger und von Detektorsonde an Abfangsonde.

Beispiel 1.

Dieses Beispiel vergleicht Signal und Rauschen der erfindungsgemäßen Klasse I- Methodologie mit dualem Abfangen mit dem von Standardmethodologien mit reversiblem Zielabfangen bei dem Nachweis von Chlamydia trachomatis. Die Assays mit dualem Abfangen verwenden B-3018 und dA-781 Abfangsonden. Die RTC-Assays verwenden nur die dA-781 Abfangsonde. Die Gehaltsbestimmungen werden wie folgt durchgeführt.
Fünf Lösungen wurden vorbereitet:
Lösung 1 wurde hergestellt, um 700 Mikroliter an 1,4 * 10&sup6; gereinigten Zielmolekülen, 70 ng B-3018 Abfangsonde, 1,4 * 10¹² Molekülen mit der C29 Detektorsonde in 4M Guanidinhydrochlorid (GuHCl), 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 2 wurde hergestellt, um 700 Mikroliter an 1,4 * 10&sup6; gereinigten Zielmolekülen, 70 ng dA-781 Abfangsonde, 1,4 * 10¹² Molekülen mit der C29 Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 3 wurde hergestellt, um 700 Mikroliter an 1,4 * 10¹² Molekülen an C29 Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8, und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 4 wurde hergestellt, um 1600 Mikroliter an 160 ng B-3018 Abfangsonde, 3,2 * 10¹² Molekülen an C29 Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8, und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 5 wurde hergestellt, um 1600 Mikroliter an 160 ng dA-781 Abfangsonde, 3,2 * 10¹² Molekülen an C29 Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8, und 16 mM EDTA zu enthalten.
Ein 8(A-H) · 12(1-12) 96 Lochgestell für 1,5 ml Polypropylenröhrchen (Micronics, Flow Laboratories, McLean, VA) wurde vorbereitet. Aliquote von 50 Mikrolitern der Lösungen 1 bis 5 wurden wie folgt in die Röhrchen zugegeben:
50 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Sonden) der Lösung 1 wurden zu den Röhrchen A-B 1-6 hinzugegeben.
50 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Sonden) der Lösung 2 wurden zu den Röhrchen A-B 7-12 hinzugegeben.
50 ul der Lösung 3 wurden zu den Röhrchen C 1-12 hinzugegeben.
50 ul der Lösung 4 wurden zu den Röhrchen D-H 1-6 hinzugegeben.
50 ml der Lösung 5 wurden zu den Röhrchen D-H 7-12 hinzugegeben.
Der Inhalt des Gestells kann wie folgt schematisch dargestellt werden.
(Tabellenlegende) Dual Capture = duales Abfangen
target = Ziel
Alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um dem Chlamydia- Ziel zu ermöglichen mit der Detektorsonde und der Abfangsonde zu hybridisieren. Nachfolgend zu der Inkubation wurde eine 350 ul Suspension an 0,023% streptavidinderivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer [4% BSA (Rinderserumalbumin, Sigma Fraktion 5), 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,01% Antischaummittel], pH 8,0 zu jedem der Röhrchen A-H 1-6 hinzugegeben. 100 ul Suspension an 0,045% dt&sub1;&sub4; derivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer enthaltend 4M GuHCl wurde zu jedem der Röhrchen A-H 7- 12 hinzugegeben. Nach dem Mischen auf einem Schütteltisch, wurden die Röhrchen bei 37C für 5 Minuten inkubiert, um den ternären Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Komplex abzufangen. Die Partikel und die abgefangenen ternären Komplexe wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt, unter Verwendung einer magnetischen Abtrennungsvorrichtung, wie sie im US- Patent Nr. 4,988,618, Lee et al., beschrieben wurde, auf welche hiermit Bezug genommen wird. Die Überschüsse wurden abgesaugt.
Als nächstes wurden die Partikel gewaschen, um die Detektorsonde zu entfernen, die nicht an dem Ziel gebunden ist. 200 ul an Waschpuffer [300 mM NaCl, 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,1% Antischaummittel], pH 8,1 wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Die Röhrchen wurden gemischt und bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert. Die Partikel und abgefangenen ternären Komplexe wurden an den Seiten der Röhrchen wie oben beschrieben gesammelt. Die Überstände wurden abgesaugt. Die Partikel wurden zweimal in der gleichen Weise gewaschen.
Als nächstes wurden 1604 Guanidinthiocyanat (GuSCH)-Puffer [2,5M GuSCH, 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,5% BSA], pH 7,8 zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Dies führte zu dem Ablösen des Ziel: Detektorprobe-Abschnittes des ternären Komplexes in den Röhrchen A-H 1-6 und dem Ablösen des ternären Abfangprobe:Ziel:Detektorsonde-Komplex in den Röhrchen A-H 7-12. Die B-3018 Abfangsonde verbleibt gebunden an die Streptavidinpartikel in den Röhrchen A-H 1-6. Nach 5 Minuten wurden die Partikel an den Seiten der Röhrchen gesammelt, unter Verwendung einer oben beschriebenen magnetischen Abtrennvorrichtung. Die Überstände wurden in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 40 ul an 500 ng/ml dA-781 Abfangsonde in 10 mM Tris, 1 mM EDTA zu jedem Überstand der Röhrchen A-H 1-6 hinzugegeben. Vierzig Mirkoliter des 10 mM Tris und 1 mM EDTA wurden zu jedem Überstand der Röhrchen A-H 7-12 hinzugegeben. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um der dA-781 Abfangsonde zu ermöglichen zu dem Ziel:Detektorsonde- Segment in Röhrchen A-H 1-6 zu hybridisieren. Dreihundert Mikroliter 0,05% dT&sub1;&sub4;-Partikel in Perlenblockierungspuffer wurde zu allen Röhrchen hinzugegeben. Die ternären Komplexe wurden auf den dT&sub1;&sub4;-Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden, wie oben beschrieben, an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt.
Als nächstes wurden die ternären Komplexe von den Partikeln abgelöst, durch die Zugabe von 100 ul Ablösepuffer [25 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,2 % Sarkasyl, 0,05% Bronopol und 0,05% BSA], pH 8,1, wie dies oben beschrieben ist. Die Überstände mit abgelösten ternären Komplexen wurden in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 200 ul einer Suspension von 0,045% Oligo-dT&sub1;&sub4;-Partikeln in Puffer A [4% BSA, 4M GuHCl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,1% Antischaummittel], pH 7,8 zu jedem der Überstände hinzugegeben. Die ternären Komplexe wurden, wie oben beschrieben, auf den Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden, wie oben beschrieben, an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt.
Die Partikel wurden dann zweimal in pre-Amp Waschpuffer [300 mM Kcl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA], pH 8,0 gewaschen. Die Überstände wurden abgesaugt. Als nächstes wurden 150 ul an pre-Amp Ablösepuffer [50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40] zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC inkubiert. Dies führte zu dem Ablösen der ternären Komplexe. Die Partikel wurden, wie zuvor beschrieben, von den Überständen abgetrennt.
Die Anwesenheit des Zieles wurde durch die Replikation der MDV-artigen C29 Detektorsonde mit Qβ-Replikase, in der Anwesenheit von interkalierendem Farb- Propidiumiodid und dem Messen der Zeit, die notwendig ist um ein positives Ansprechen zu erzeugen, bestimmt. Insbesondere wurden 100 ul des Überstandes von jedem Röhrchen zu 100 ul eines Gemisches aus 220 mM Tris pH 7,8, 40 mM MgCl&sub2;, 600 uM jedes der Nucleotidtriphospate ATP, CTP, GTP und UTP (Pharmacia), 50 ng Propidiumiodid und 1 ug gereinigter Qβ-Replicase (spezifischer Aktivität von 2.000 Einheiten/mg) hinzugegeben. Die Qβ-Replicase wurde erhalten, wie dies im US-Patent Nr. 5,141,857 beschrieben ist, welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Die Röhrchen wurden verschlossen und bis zur Messung auf Eis gelegt.
Die 96 Röhrchen wurden gleichzeitig behandelt. Jedes Röhrchen wurde bei 37ºC ± 0,25ºC gehalten. Jedes Röhrchen wurde bei 510 nm bestrahlt und bei 610 nm gelesen, jeweils alle 40 Sekunden über eine Zeitdauer von 45 Minuten. Die abgegeben Fluoreszenz wurde auf ihre Ansprechzeit nummerisch analysiert. Die Ansprechzeit wurde als der Schnittpunkt des Fluoressenzansprechens mit der Basislinie (kein Ansprechen) angenommen. Der Schnittpunkt wurde unter Verwendung des dritten Polynominals um das Fluoressenz zu fitten, bestimmt. Die Basislinie war der Durchschnitt. Die Ansprechzeit stellt eine quantifizierbare Bestimmung der Anwesenheit des Zieles dar, da es inversproportional zu dem log der Matrixmoleküle in der Probe ist. Cahil et al. Clin. Chem. 37: 1482-1485, 1991.
Fig. 1 zeigt die kumulativen Ergebnisse für jedes Verfahren. Die Figur zeigt die Wirkungen, die durch die Assays erzeugt wurden, jeweils unter Verwendung des erfindungsgemäßen Formates mit dualem Abfangen und dem Standard RTC- Format. Weiterhin zeigt Fig. 1 die Ansprechzeiten, die durch die Assays erzeugt werden, in der Anwesenheit von Zielmolekül (richtiges Signal) und in der Abwesenheit von Zielmolekül (Rauschen).
Zehn der 12 Röhrchen für das Verfahren mit dualem Abfangen und enthaltend Zielmolekül (A-B 1-6) wurden vermessen. Alle 10 erzeugten ein positives Ansprechen. Dies wird durch die Flecken in der Spalte oberhalb von T angezeigt. Elf der 12 Röhrchen für das Standard RTC-Verfahren, die Zielmolekül enthalten (A-B 7- 12), wurden vermessen. Alle 11 zeigten ein positives Ansprechen.
Dreiundzwanzig der dreißig Röhrchen für das duale Abfangverfahren, die Abfangsonden und Detektorsonden aber kein Zielmolekül (D-H 1-6) enthalten, wurden vermessen. Nur 1 von den 23 erzeugte ein positives Ansprechen. Dies ist durch den Fleck in der Spalte oberhalb CN angezeigt. Die Wirkung ist auf das Zyklusrauschen zurückzuführen, daß von dem nicht spezifischen Binden der C29 Detektorsonde an die Abfangsonden herrührt. Achtundzwanzig von den 30 Röhrchen für das Standard RTC-Verfahren enthaltend Abfangsonde und Detektorsonde, aber keinerlei Ziel (D-H 7-12) wurde gemessen. Alle 28 erzeugten ein positives Ansprechen, die auf das Zyklusrauschen zurückzuführen ist.
Alle 6 der 6 Röhrchen für jedes Gehaltsbestimmungsverfahren enthaltend C29 Detektorsonde, aber kein Ziel oder Abfangsonde (duales Abfangen: C 1-6; RTC: C 7-12) wurden gemessen. Das Ansprechen ist hier zurückzuführen auf das nicht spezifische Binden und/oder die Hybridisation der Detektorsonde and die Träger, die in der Gehaltsbestimmung verwendet wurden. Jedoch zeigt keines der Röhrchen für eines der Verfahren ein positives Ansprechen. Dies ist durch die Abwesenheit von Flecken in der Spalte oberhalb NSH angezeigt.
Die Ergebnisse, die in Fig. 1 abgebildet sind, zeigen die Überlegenheit der Klasse I-Methodologie mit dualem Abfangen über die Standard RTC-Methodologie. Wie Fig. 1 zeigt, sind beide Methodologien in der Lage, das Signal nachzuweisen, das in der Anwesenheit von Zielmolekülen erzeugt wird. In ähnlicher Weise sind beide Verfahren in der Lage, das Hintergrundsignal (Rauschen) zu beseitigen, das durch nicht spezifisches Binden der Detektorsonde an die Assayträger erzeugt wird. Jedoch ist die Methodologie mit dualem Abfangen, bei der Beseitigung oder der wesentlichen Reduzierung des Hintergrundsignales, das von dem zyklischen Rauschen herrührt, deutlich überlegen. Fig. 1 zeigt, daß solches zyklische Rauschen, das bei dem RTC-Verfahren beobachtet wird, vergleichbar ist mit dem Signal, das durch 10&sup5; Zielmoleküle erzeugt wird. Somit ist die Empfindlichkeit der Gehaltsbestimmung durch das zyklische Rauschen auf ungefähr 10&sup5; Zielmoleküle beschränkt Im Gegensatz dazu ist das zyklische Rauschen, das in dem dualen Abfangassay erzeugt wird, im wesentlichen vollständig beseitigt und klar unterscheidbar von dem Signal, das durch die 10&sup5; Zielmoleküle erzeugt wird. Fig. 1 zeigt, daß das duale Abfangassay deutlich empfindlicher ist, als die Standard RTC-Verfahren.

Beispiel 2

Dieses Beispiel vergleicht Signal und zyklisches Rauschen für ausgewählte Ausführungsformen des Klasse I-Verfahrens mit dualem Abfangen, bei dem Nachweis von Chlamydia trachomatis. Eine Gruppe von Gehaltsbestimmungen wurde, unter Verwendung von B-3018 und dA-781-Abfangsonden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die zweite Gruppe von Gehaltsbestimmungen wurde, unter Verwendung von C7dG-3018 und dA-781-Abfangsonden durchgeführt. Beide Gruppen verwendeten C29-Detektorsonden. Die Gehaltsbestimmungen wurden wie folgt durchgeführt.
Fünf Lösungen wurden vorbereitet:
Lösung 1 wurde hergestellt, um 1400 ul an 1,4 * 10&sup6; gereinigten Zielmolekülen, 140 ng B-3018-Abfangsonde, 2,8 * 10¹² Moleküle der C29-Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 2 wurde hergestellt, um 1400 ul an 1,4 * 10&sup6; gereinigtem Zielmolekülen, 140 ng G7dG-3018-Abfangsonde, 2,8 * 10¹² Moleküle der C29-Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 3 wurde hergestellt, um 1400 ul an 2,8 * 10¹² Molekülen der C29-Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 4 wurde hergestellt, um 3200 ul an 320 ng B-3018-Abfangsonde, 6,4 * 10¹² Moleküle an C29-Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 5 wurde hergestellt, um 3200 ul an 320 ng C7dG-3018-Abfangsonde, 6,4 * 10¹² Moleküle an C29-Detektorsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Ein 8(A-H) · 12(1-12) 96 Lochgestell für 1,5 ml Polypropylenröhrchen (Micronics, Flow Laboratories) wurde vorbereitet. Aliquote von 100 Mikrolitern der Lösungen 1-5 wurden zu den Röhrchen wie folgt hinzugegeben:
100 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Sonden) der Lösung 1 wurden zu den Röhrchen A und B 1-6 hin zugegeben.
109 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Sonden) der Lösung 2 wurden zu den Röhrchen A und B 7-12 hinzugegeben.
100 ul der Lösung 3 wurden zu den Röhrchen C 1-12 hinzugegeben.
100 ul der Lösung 4 wurden zu den Röhrchen D-H 1-6 hinzugegeben.
100 ul der Lösung 5 wurden zu den Röhrchen D-H 7-12 hinzugegeben.
Somit zeigen die Röhrchen A-H 1-6 die Facetten des dualen Abfangverfahrens unter Verwendung der B-3018-Abfangsonde; die Röhrchen A-H 7-12 zeigen die Facetten des Verfahrens unter Verwendung der C7dG-3018-Abfangsonde.
Alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um dem Chlamydia- Ziel zu ermöglichen mit der Detektorsonde und der Abfangsonde zu hybridisieren. Nachfolgend zu der Inkubation wurde eine 300 gl Suspension an 0,027% Streptavidin derivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer [4% BSA (Rinderserumalbumin, Sigma Fraktion 5), 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,01% Antischaummittel], pH 8,0 zu jedem der Röhrchen A-H 1-6 hinzugegeben. 20 ul Suspension an 0,045% d(C)&sub1;&sub4; derivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer enthaltend 4M GuHCl wurde zu jedem der Röhrchen A-H 7- 12 hinzugegeben. Nach dem Mischen auf einem Schütteltisch wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, um den ternären Abfangsonde:Ziel:Detektorsonde-Hybriden abzufangen. Die Partikel wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt, unter Verwendung einer magnetischen Abtrennungsvorrichtung, wie sie im US-Patent Nr. 4,988,618, beschrieben wurde. Die Überschüsse wurden abgesaugt.
Als nächstes wurden die Partikel gewaschen, um die Detektorsonde zu entfernen, die nicht an dem Ziel gebunden ist. 200 ul an Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt/Ablösepuffer [25 mM NaCl, 0,2% Sarkosyl, 25 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,05% BSA, 0,05% Bronopol], pH 8,1 wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Die Röhrchen wurden auf einem Schütteltisch 30 Sekunden gemischt und bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert. Die Partikel und abgefangenen Hybride wurden wie oben beschrieben an den Seiten der Röhrchen mit einer magnetischen Abtrennvorrichtung gesammelt. Die Überstände wurden abgesaugt. Die Partikel wurden zweimal in der gleichen Weise gewaschen.
Als nächstes wurden 100 ul Guanidinthiocyanat (GuSCH)-Puffer [2,5M GuSCH, 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,5% BSA], pH 7,8 zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert. Dies führte zu dem Ablösen des Ziel: Detektorsonde-Abschnittes des ternären Komplexes, da die B-3018 und C7dG-3018 Abfangsonden von dem Ziel, aber nicht von den Partikeln abdissozierten. Nach 5 Minuten wurden die Partikel an den Seiten der Röhrchen gesammelt, unter Verwendung einer oben beschriebenen magnetischen Abtrennvorrichtung. Die Überstände wurden in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 50 ul an 300 ng/ml dA-781 Abfangsonde in 10 mM EDTA zu jedem Überstand hinzugegeben. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 3VC inkubiert, um der dA-781 Abfangsonde zu ermöglichen zu dem Ziel:Detektorsonde-Segment zu hybridisieren. Zweihundert Mikroliter 0,05% dT&sub1;&sub4;-Partikel in Perlenblockierungspuffer wurde zu allen Röhrchen hinzugegeben. Die ternären Komplexe wurden auf den dT&sub1;&sub4;-Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden wie oben beschrieben an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt. Die Partikel wurden mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt [300 mM NaCl, 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,1% Antischaummittel] pH 8,1, gewaschen, um die Detektorsonde zu entfernen, die nicht an das Ziel gebunden ist.
Als nächstes wurden die ternären Komplexe in 100 ul Ablösepuffer/Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt abgelöst, wie dies oben beschrieben ist. Die abgelösten Überstände wurden in saubere Röhrchen überfuhrt. Zu jedem Röhrchen wurden 200 ul einer Suspension von dT&sub1;&sub4;-Partikeln in Puffer A [4% BSA, 4M GuHCl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,1% Antischaummittel], pH 7,8 hinzugegeben. Die ternären Komplexe wurden, wie oben beschrieben, auf den Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden, wie oben beschrieben, an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt.
Die Partikel wurden dann zweimal in Waschpuffer mit hohem Salzgehalt gewaschen. Die ternären Komplexe wurden dann in 100 ul des Ablösepuffers/Waschpuffers mit niedrigem Salzgehalt abgelöst. Die abgelösten Überstände wurden in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 200 ul einer Suspension von dT&sub1;&sub4;-Partikeln in Puffer A zu jedem der Überstände hinzugegeben und die ternären Komplexe abgefangen. Die Partikel wurden wie zuvor an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt. Die Partikel wurden dann zweimal in Pre-Amp-Puffer [300 uM KCl, 50 uM Tris, 1 mM EDTA], pH 8,0, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Abschließend wurden die ternären Komplexe in 1504 Pre-Amp-Ablösepuffer [50 mM Tris, 1 mM EDTA und 0,5% NP-40], wie zuvor beschrieben, abgelöst. Die Partikel wurden von den Überständen, wie zuvor beschrieben, abgetrennt.
Die Anwesenheit von Zielmolekülen wurde wie in Beispiel 1 bestimmt. Fig. 2 zeigt die kumulativen Ergebnisse für jedes Verfahren, in Bezug auf das Ansprechen, das durch die Anwesenheit von Zielmolekülen (Spalte T) und durch Zyklusrauschen (Spalte CN) erzeugt wird.
Alle 12 der 12 Röhrchen für jedes Gehaltsbestimmungsverfahren enthaltend Zielmolekül, Abfang- und Detektorsonde (Röhrchen A-B 1-6 verwenden B-3018 Abfangsonde und A-B 7-12 verwenden C7dG-3018 Abfangsonde) wurden gemessen. Alle Röhrchen zeigen ein positives Ansprechen.
Alle von den Röhrchen, enthaltend Abfang- und Detektorsonden aber kein Ziel (D-H 1-6 für B-3018 Abfangsonde, D-H 7-12 für C7dG-3018 Abfangsonde) wurden vermessen. Nur 7 der 30 Röhrchen, verwendend B-3018 Abfangsonde erzeugten ein positives Ansprechen. Nur 3 der 30 Röhrchen verwendet C7dG- 3018 Abfangsonde erzeugten ein positives Ansprechen. Dieses Ansprechen ist dem Zyklusrauschen zuzuweisen.
Die Ergebnisse in Fig. 2 zeigen, daß die Assays in ihrer Befähigung Signale zu unterscheiden vergleichbar sind, die von Zielmolekülen herrühren relativ zu den Signalen, die dem Zyklusrauschen zuzuordnen sind.

Beispiel 3

Dieses Beispiel vergleicht Signal und zyklisches Rauschen von erfindungsgemäßen Klasse II Methodologien mit dualem Abfangen mit denen von vergleichbaren RTC-Verfahren. Die Klasse II Assays mit dualem Abfangen verwenden B-3018 und dA-1660 Abfangsonden. Diese Sonden hybridisieren ausschließlich mit Sequenzen des Zieles Chlamydia trachomatis 16S rRNA. Die Nucleinsäuresequenz 1660 (Sequenz ID Nr. 3) ist eine universelle Sequenz gegenüber 16S eubakterieller rRNA. Die RTC-Assays verwenden nur dA-1660 Abfangsonden. Die Assays wurden wie folgt durchgeführt.
Neun Lösungen wurden wie folgt vorbereitet:
Lösung 1 wurde hergestellt, um 110 ul an 1,1 * 10&sup7; gereinigten Zielmolekülen, 110 ng B-3018 Abfangsonde und 110 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 2 wurde hergestellt, um 1100 ul an 1,1 * 10&sup7; gereinigten Zielmolekülen und 110 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 3 wurde hergestellt, um 1100 ul an 1,1 * 10&sup6; gereinigten Zielmolekülen, 110 ng B-3018 Abfangsonde und 110 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 4 wurde hergestellt, um 100 ul an 1,1 * 10&sup7; gereinigten Zielmolekülen und 110 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 5 wurde hergestellt, um 1600 ul an 160 ng B-3018 Abfangsonde und 160 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 6 wurde hergestellt, um 1600 ul an 160 ng dA-1660 Abfangsonde in 4M GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 7 wurde hergestellt, um 1100 ul an 4 mM GuHCl, 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA zu enthalten.
Lösung 8 wurde hergestellt, um 2500 ul an 750 ng B-3018 Abfangsonde und 3,8 * 10¹² Zielmoleküle der C29 Detektorsonde in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, zu enthalten.
Lösung 9 wurde hergestellt, um 2500/11 an 750 ng dA-781 Abfangsonde und 3,8 * 10¹² Zielmoleküle der C29 Detektorsonde in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8, zu enthalten.
Acht (A-H) · 10 (1-10) Löcher eines 8 · 12 (96) Lochgestelles für 1,5 ml Propylenröhrchen wurden bestückt. Aliquote von 100 ul der Lösungen 1-7 wurden wie folgt zu den Röhrchen hinzugegeben:
100 ul (10&sup6; Zielmoleküle plus Abfangsonden) Lösung 1 wurden zu den Röhrchen A-B 1-5 hinzugegeben.
100 ul(10&sup6; Zielmoleküle plus Abfangsonden) Lösung 2 wurden zu den Röhrchen A-B 6-10 hinzugegeben.
100 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Abfangsonden) Lösung 3 wurden zu den Röhrchen C-D 1-5 hinzugegeben.
100 ul (10&sup5; Zielmoleküle plus Abfangsonden) Lösung 4 wurden zu den Röhrchen C-D 6-20 hinzugegeben.
100 ul Lösung 5 wurde zu den Röhrchen E-G 1-5 hinzugegeben.
100 ul Lösung 6 wurde zu den Röhrchen E-G 6-10 hinzugegeben.
100 ul Lösung 7 wurde zu dem Röhrchen H 1-10 hinzugegeben.
Alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um dem Chlamydia- Ziel zu ermöglichen mit den Abfangsonden zu hybridisieren. Nachfolgend zu der Inkubation, wurde eine 200 ul-Suspension an 0,045% d(T)14 derivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer pH 7,8 enthaltend 4M GuHCl zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen auf einem Schütteltisch, wurden die Röhrchen bei 3VC für 5 Minuten inkubiert, um die Abfangsond:Zielmoleküle- Hybride abzufangen. Die Partikel wurden an den Seiten der Röhrchen, unter Verwendung einer magnetischen Abtrennvorrichtung, wie zuvor beschrieben, gesammelt. Die Überstände wurden abgesaugt.
Als nächstes wurden die Partikel gewaschen, um die Abfangsonde zu entfernen, die nicht an das Ziel gebunden ist. 20u1 eines Waschpuffers mit hohem Salzgehalt [300 mM NaCl, 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5 BSA, 0,1% Antischaummittel], pH 8,1 wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Die Röhrchen wurden auf einem Schütteltisch gemischt und bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert. Die Partikel und abfangenen Hybride wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt, unter Verwendung einer magnetischen Abtrennvorrichtung, wie sie in der US-A-4,988,618 beschrieben ist. Die Überstände wurde abgesaugt. Die Partikel und Hybride wurden wieder in dem gleichen Waschpuffer mit hohem Salzgehalt gewaschen.
Als nächstes wurden 100 ul Ablösepuffer/Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt [25 mM NaCl, 0,2% Sarkosyl, 25 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,1 Bronopol], pH 8,1 zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen für 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Zielabfangsonden-Hybride von den Partikeln abzulösen. Die Partikel wurde an der Seite der Röhrchen gesammelt. Die Überstände wurden in neue Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 100 ul einer Suspension von 0,04% streptavidinderivatisierten paramagnetischen Partikeln in einem Perlenblockierungspuffer, ebenfalls enthaltend 1M GuHCl, zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, um die Zielabfangsonde- Hybride wieder abzufangen. Die Partikel wurden dann an der Seite der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt. Die Partikel und abgefangenen Hybride wurden dann jeweils einmal mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt und Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt gewaschen, um die Abfangsonde zu entfernen, die nicht an das Ziel gebunden ist.
Als nächstes wurden 100 ul an Guanidinthiocyanat (GuSCH)-Puffer [2,5M GuSCN, 100 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,5% BSA], pH 7,8 zu allen Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, um die Ziel:dA-1660 Abfangsonde-Hybride abzulösen. Unter diesen Bedingungen verbleibt die B-3018 Abfangsonde, die in den Klasse II-Assays mit dualem Abfangen verwendet wird, an die Streptavidinpartikel gebunden. Die Partikel wurden dann an den Seiten der Röhrchen gesammelt, wie zuvor beschrieben. Die Überstände wurden in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 50 ul der Lösung 8 (enthaltend B-3018 Abfangsonde und Detektorsonde) zu den Röhrchen A-H 1-5 hinzugegeben. In ähnlicher Weise wurden 5041 der Lösung 9 (enthaltend dA-781 Abfangsonde und Detektorsonde) zu den Röhrchen A-H 6-10 hinzugegeben. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, um den ternären Abfangsonde:Zielmolekül: Detektorsonde-Komplexen zu ermöglichen sich zu bilden.
Als nächstes wurden 150 ul einer Suspension an 0,04% streptavidinderivatisieren Partikeln in Perlenblockierungspuffer zu jedem der Röhrchen A-H 1-5 hinzugegeben. In ähnlicher Weise wurden 30u1 einer Suspension an 0,05% d(T)&sub1;&sub4; derivatisierten Partikeln in Perlenblockierungspuffer zu jedem der Röhrchen A- H 6-10 hinzugegeben. Die Röhrchen wurden bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, um den ternären Komplexen zu ermöglichen, an die Partikel gebunden zu werden. Die Partikel und abgefangenen ternären Komplexe wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt, wie zuvor beschrieben. Die Überstände wurden dann abgesaugt. Die Partikel wurden dann, wie zuvor beschrieben, mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt gewaschen, um die Detektorsonde zu entfernen, die nicht an das Zielmolekül gebunden ist.
Als nächstes wurden 1004 an 2,5M GuSCH-Puffer zu allen Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen bei 37ºC für 5 Minuten inkubiert, um die ternären Komplexe abzulösen. Insbesondere ist in den Röhrchen A- H 1-5 der ternäre dA-1660 Abfangsonde:Zielmolekül:Detektorsonde-Komplex in den Puffer freigesetzt, während die B-3018 Abfangsonde an die Partikel gebunden bleibt. In den Röhrchen A-H 6-10 enthält der Komplex die zwei Abfangsonden, das Zielmolekül und die Detektorsonde. Die Partikel wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände in saubere Röhrchen überführt.
Als nächstes wurden 2004 einer Suspension an 0,045% dT&sub1;&sub4; Partikel in Perlenblockierungspuffer zu jedem der Überstände hinzugegeben. Die Komplexe wurden, wie zuvor beschrieben, auf den Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden an den Seiten der Röhrchen gesammelt und die Überstände abgesaugt. Die Partikel wurden zweimal in Waschpuffer mit hohem Salzgehalt gewaschen. Die ternären Komplexe wurden dann in 100 ul Ablösepuffer/Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt freigesetzt. Die Überstände wurden in saubere Röhrchen überfuhrt.
Als nächstes wurden 2004 einer Suspension an dT&sub1;&sub4; Partikeln in Puffer A zu jedem der Überstände hinzugegeben. Die Komplexe wurden, wie oben beschrieben, wieder auf den Partikeln abgefangen. Die Partikel wurden dann von den Überständen abgetrennt und zweimal in Pre-Amp-Waschpuffer [300 mM KCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA], pH 8,0 gewaschen. Die ternären Abfangsonde:Zielmolekül:Detektorsonde-Komplexe wurden in 150 ul Pre-Amp-Ablösepuffer [50 mM Tris, 1 mM EDTA und 0,5% NP-40] freigesetzt, wie oben be schrieben. Die Partikel wurden, wie zuvor beschrieben, von den Überständen abgetrennt.
Die Anwesenheit von Zielmolekülen wurde in den Beispielen 1 und 2 bestimmt. Fig. 3 zeigt in den Spalten T&sup6;, T&sup5; bzw. CN die kumulativen Ergebnisse jedes Verfahrens, mit Bezug auf das Ansprechen, das durch die Anwesenheit von 10&sup6; Zielmolekülen (A-B 1-10) und 10&sup5; Zielmolekülen (C-D 1-10) und durch Zyklusrauschen (E-G 1-10) erzeugt wird.
Alle 10 der 10 Röhrchen für jedes Klasse II Assay mit dualem Abfangen mit Zielen (10&sup6; und 10&sup5; Ziele), Abfang- und Detektorsonden wurden vermessen. Alle Röhrchen zeigen ein positives Ansprechen. Alle 10 Röhrchen für das RTC-Assayverfahren mit 10&sup6; Zielmolekülen, Abfang- und Detektorsonden wurden vermessen. Alle 10 zeigen ein positives Ansprechen. 9 der 10 Röhrchen für das RTC- Verfahren mit 10&sup5; Zielen, Abfang- und Detektorsonde wurden vermessen. Alle 9 zeigen ein positives Ansprechen.
14 der 15 Röhrchen enthaltend Abfang- und Detektorsonden, aber keine Zielmoleküle, wurden mit jedem Assayverfahren vermessen. Nur eins der 14 Röhrchen zeigte bei der Verwendung des Klasse II-Verfahrens mit dualem Abfangen ein positives Ansprechen. Im Gegensatz dazu, zeigten alle 14 der 14 Röhrchen bei der Verwendung des vergleichbaren RTC Verfahrens ein positive Ansprechen. Es ist besonders wichtig, daß dieses Signal, daß dem Zyklusrauschen zuzuordnen ist, vergleichbar und unterscheidbar von dem wahren Signal ist, das durch 10&sup5; Zielmoleküle erzeugt wird. Dementsprechend ist die Nachweisempfindlichkeit des hier gezeigten RTC-Verfahrens durch das Zyklusrauschen beschränkt. Die Empfindlichkeit des Klasse II-Verfahrens mit dualem Abfangen ist jedoch nicht derartig beschränkt und übersteigt leicht 10&sup5; Zielmoleküle.

Sequenzauflistung

(1) Allgemeine Informationen:
(i) Anmelder: Shah, Jyotsna
King, Walter
Liu, Jing
Smith, James
Popoff, Sonya
Serpe, Eugene
(ii) Titel der Erfindung: Gehaltsbestimmungsverfahren
(iii) Anzahl der Sequenzen: 4
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adresse: Amoco Corporation, c/o Patents and Licensing
(B) Stadt: Chicago
(C) Staat: Illinois
(D) Land: USA
(E) PLZ: 60601
(v) Computerlesbare Form:
(A) Medium: 3,5 inch/800 Kb-Diskette im Macintoshformat; Doppelseitig, doppelte Dichte
(B) Computer: Macintosh LC
(C) Betriebssystem: Macintosh 7.0.1
(D) Software: MacWrite II (MacWrite II und nur Textdaten)
(vi) gegenwärtige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: (noch nicht verfügbar)
(B) Anmeldetag: 09. Oktober 1992
(C) Klassifikation: (noch nicht verfügbar)
(vii) frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: N/A
(B) Anmeldetag: N/A
(viii) Anwalt/Agent-Informationen:
(A) Name: Norval B. Galloway
(B) Registrierungsnummer: 33,595
(C) Referenznummer: 32455
(ix) Telekommunikationsinformationen:
(A) Telefon: (312) 856-7180
(B) Telefax: (312) 856-4972
(C) Telex:
(2) Informationen für die Sequenz ID Nr. 1:
(i) Sequenzcharakteristik:
(A) Länge: 26 Nucleotide
(B) Typ: Nucleinsäuresequenz
(C) Strängigkeit: einsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA-Sonde
(A) Beschreibung: Chlamydia trachomatis, spezifische Sonde für 16S ribusomale RNA, für erstes Abfangen.
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: GTS-Oligo-Nummer 3018
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID Nr. 1:
CCTTAACGT TACTCGGATG CCCAAA 26
(2) Informationen für Sequenz ID Nr. 2:
(i) Sequenzcharakteristik:
(A) Länge: 36 Nucleotide
(B) Typ: Nucleinsäuresequenz
(C) Strängigkeit: einsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA-Sonde
(A) Beschreibung: Chlamydia trachomatis, spezifische Sonde für 16S ribusomale RNA, für zweites Abfangen.
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: GTS-Oligo-Nummer 781
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID Nr. 2:
CTTTAACGTT ACTCGGATGC CCAAATATCG CCACAT 36
(2) Informationen für Sequenz ID Nr. 3:
(i) Sequenzcharakteristik:
(A) Länge: 45 Nucleotide
(B) Typ: Nucleinsäuresequenz
(C) Strängigkeit: einsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA-Sonde
(A) Beschreibung: Bakterielle Sonde auf die Mehrheit von eubakterieller- 16S-Ribosomale RNA, für Klasse II-Assays.
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: GTS-Oligo-Nummer 1660
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID Nr. 1:
CTGCTGCCTC CCGTAGGAGT TTGGGCCGTGTCTCAGTTCC AGTGT 45
(2) Information zu Sequenz ID Nr. 4:
(i) Sequenzcharakteristik:
(A) Länge: 280 Nucleotide
(B) Typ: Nucleinsäureseguenz
(C) Strängigkeit: einsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: RNA-Sonde
(A) Beschreibung: Chlamydia-16S ribusomale RNA-Detektorsonde, replizierbar durch Q-Beta RepliKase, in vitro.
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: GTS-Oligo-Nummer 1126, C29-RNA-Molekül (xi) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID Nr. 4:

Claims

1. Ein Verfahren zur Gehaltsprüfung einer Probe auf eine Zielnucleinsäure umfassend die Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einer ersten Abfangsonde und einer Detektorsonde, wobei die erste Abfangsonde und die Detektorsonde jeweils ein Nucleinsäuresegment umfassen, welches, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, an die Zielnucleinsäure bindet, um einen ternären erste Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex zu bilden und wobei die Detektorsonde durch das Enzym Qβ-Replikase vervielfältigbar ist;

b) Abtrennen des ternären erste Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes aus der Probe und Einbringen des ternären Komplexes in ein zweites Medium;

c) Abtrennen des Zielnucleinsäure:Detektorsonde-Segmentes des ternären Komplexes von der ersten Abfangsonde;

d) Inkontaktbringen des zweiten Mediums mit einer zweiten Abfangsonde, welche eine Nucleinsäure umfaßt, die, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, an die Zielnucleinsäure bindet, um einen ternären zweite Abfangsonde:Zielnucleinsäure:Detektorsonde-Komplex zu bilden;

e) Abtrennen des ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes von dem zweiten Medium;

f) Vervielfältigen der Detektorsonde mit Qβ-Replikase, wie sie in dem abgetrennten ternären zweite Abfangsonde:Zielnucleinsäure: Detektorsonde- Komplex vorhanden ist und;

g) Überwachung durch wiederholtes Messen auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein der Vervielfältigung der Detektorsonde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Schritte umfaßt:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Träger, welcher an die erste Abfangsonde bindet;

b) Abtrennen des ersten Trägers und des gebundenen ternären Abfangsonde:Zielnucleinsäure:Detektorsonde-Komplexes von der Probe und Einbringen des Trägers und des gebundenen ternären Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes in das zweite Medium;

c) Abtrennen des Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Segmentes des ternären Komplexes von dem ersten Träger und der gebundenen Abfangsonde;

d) Inkontaktbringen des zweiten Medium, mit der zweiten Abfangsonde, die, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, mit der Zielnucleinsäure bindet um den ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde- Komplex zu bilden und einem zweiten Träger, welcher mit der zweiten Abfangsonde bindet;

e) Abtrennen des zweiten Trägers und des gebundenen ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes aus dem zweiten Medium und Einbringen dieser in ein drittes Medium; und

f) Abtrennen des zweiten Trägers von dem ternären zweite Abfangsonde:Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß darin ein oder mehrere dispergierbare Träger verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen oder mehrere Zyklen mit den Schritten umfaßt:

a) Inkontaktbringen des Mediums enthaltend den ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex mit einem neuen Träger, wobei der neue Träger an die zweite Abfangsonde bindet;

b) Abtrennen des neuen Trägers und des gebundenen ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes von dem Medium, das den ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde- Komplex enthält;

c) Einführen des neuen Trägers und des gebundenen ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes in ein neues Medium und Freisetzen des ternären zweiten Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes von dem neuen Träger; und

d) Abtrennen des neuen Trägers von dem neuen Medium.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß darin der Zielabschnitt ein Polynucleotid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger dispergierbar sind.

7. Ein Verfahren zur Gehaltsprüfung einer Probe auf Zielnucleinsäure umfassend die Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einer ersten Abfangsonde und einer zweiten Abfangsonde, wobei die erste und zweite Abfangsonde jeweils ein Nucleinsäuresegment umfassen, welches, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, an die Zielnucleinsäure bindet, um einen Ziel-Komplex zu bilden;

b) Inkontaktbringen der Probe mit einem zweiten Träger der an die zweite Abfangsonde bindet;

c) Abtrennen des zweiten Trägers und des gebundenen Ziel-Komplexes von der Probe und Einbringen des zweiten Trägers und des gebundenen Ziel- Komplexes in ein zweites Medium;

d) Abtrennen des Ziel-Komplexes von dem zweiten Träger und Abtrennen des zweiten Trägers von dem zweiten Medium;

e) Inkontaktbringen des zweiten Mediums mit einem ersten Träger, welcher an die erste Abfangsonde bindet;

f) Abtrennen des ersten Trägers und des gebundenen Ziel-Komplexes von dem zweiten Medium und Einbringen des ersten Trägers und des gebundenen Ziel-Komplexes in ein drittes Medium;

g) Abtrennen des zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure-Segmentes des Ziel- Komplexes von dem ersten Träger und der ersten Abfangsonde sowie Abtrennen des ersten Trägers und der ersten Abfangsonde von dem dritten Medium;

h) Inkontaktbringen des dritten Mediums mit frischer erster Abfangsonde und einer Detektorsonde, welche durch das Enzym Qβ-Replikase vervielfältigbar ist und die ein Nucleinsäuresegment umfaßt, das, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, an die Zielnucleinsäure bindet, um einen quaternären Komplex der ersten Abfangsonde, der zweiten Abfangsonde und der Detektorsonde, gebunden an die Zielnucleinsäure, bildet;

i) Inkontaktbringen des dritten Mediums mit frischem ersten Träger, welcher mit der ersten Abfangsonde bindet;

j) Abtrennen des ersten Trägers und des gebundenen quaternären Komplexes von dem dritten Medium und Einbringen des ersten Trägers und des gebundenen quaternären Komplexes in ein viertes Medium;

k) Abtrennen des ersten Trägers und der gebundenen ersten Abfangsonde von dem zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex und Abtrennen des ersten Trägers und der gebundenen ersten Abfangsonde von dem vierten Medium;

l) Vervielfältigen der Detektorsonde, wie sie in dem zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex vorhanden ist, mit Qβ-Replikase; und

m) Überprüfung durch wiederholtes Messen auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von vervielfältigter Detektorsonde.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen oder mehrere Zyklen mit den Schritten umfaßt:

b) Abtrennen des neuen Trägers und des gebundenen zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes von dem Medium, enthaltend den ternären zweite Abfangsonde:Zielnucleinsäure:Detektorsonde-Komplex;

c) Einbringen des neuen Trägers und des gebundenen ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes in ein neues Medium und Abtrennen des ternären zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes von dem neuen Träger; und

d) Abtrennen des neuen Trägers von dem Medium, das den zweite Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger dispergierbar sind.

10. Eine Zusammenstellung zur Durchführung einer Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, das die Zusammenstellung umfaßt:

eine Bereitstellung von ersten Abfangsonden;

eine Bereitstellung von Detektorsonden; und

eine Bereitstellung von zweiten Abfangsonden;

wobei die erste Abfangsonde und die Detektorsonde jeweils Nucleinsäuresegmente umfassen, die, in der Anwesenheit von Zielnucleinsäure, an die Zielnucleinsäure binden, um einen ternären erste Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex zu bilden und wobei die Detektorsonde durch das Enzym Qβ-Replikase vervielfältigbar ist; wobei die zweiten Abfangsonden eine Nucleinsäure umfassen, die, in der Anwesenheit eines Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplexes, an die Zielnucleinsäure binden, um einen ternären Abfangsonde: Zielnucleinsäure: Detektorsonde-Komplex zu bilden; und

wobei die ersten und zweiten Abfangsonden unterschiedlich voneinander sind, aber spezifisch zu dem gleichen Zielabschnitt sind.