DE69233053T2

DE69233053T2 - Steroid-sulfatase hemmende Verbindungen

Info

Publication number: DE69233053T2
Application number: DE69233053T
Authority: DE
Inventors: Barry Victor Lloyd Potter; Michael John Reed
Original assignee: Sterix Ltd
Current assignee: Sterix Ltd
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: SG73391A1; DE69233020T2; JPH07501515A; DK0921130T3; EP1099706B1; ATE246706T1; SK282186B6; NO2595A; GEP20022802B; EP0641355A1; HK1020672A1; GEP20022637B; RU2207134C2; GEP20022803B; ATE278704T1; DK0928609T3; GEP20063773B; NO20025725D0; NO940635L; SG103820A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen zur Verwendung als Steroidsulfataseinhibitoren.
Steroidvorläufer oder Pro-Hormone, die eine Sulfatgruppe in der 3-Position des Steroidkems aufweisen und die hierin nachfolgend einfach als Steroidsulfat bezeichnet werden, sind dafür bekannt, daß sie eine wichtige Rolle als Zwischenstufen im Steroidmetabolismus im menschlichen Körper spielen. Östronsulfat und Dehydroepiandrosteron (DHA)-Sulfat sind zum Beispiel dafür bekannt, daß sie eine wichtige Rolle als Zwischenstufen bei der Produktion von Östrogenen, wie Östron und Östradiol, im Körper spielen. Speziell ist zum Beispiel Östronsulfat dafür bekannt, daß es einen der wichtigsten zirkulierenden Östrogenvorläufer darstellt, insbesondere bei Frauen nach der Menopause, und Östronsulfataseaktivität ist in Brusttumoren 100- bis 1000-fach höher als diejenige von anderen Enzymen, die an der Östrogenbildung beteiligt sind (James, et al., Steroids, 50, 269-279 (1987)).
Nicht nur dieses, sondern Östrogene, wie Östron und Östradiol, insbesondere deren Überproduktion, sind stark an malignen Zuständen, wie Brustkrebs, beteiligt, siehe Brest Cancer, Treatment and Prognosis: Ed. R. A. Stoll, Seiten 156-172, Blackwell Scientific Publications (1986), und die Kontrolle der Östrogenproduktion ist das spezielle Ziel vieler Anti-Krebstherapien, sowohl Chemotherapie als auch chirurgische Therapie, z. B. Oöphorektomie und Adrenalektomie. Soweit es Endokrintherapie betrifft, haben sich Anstrengungen bisher in der Regel auf Aromataseinhibitoren konzentriert, d. h. Verbindungen, welche Aromataseaktivität hemmen, wobei diese Aktivität, wie es das anhängende Flußdiagramm (Fig. 1) zum Östrogenmetabolismus zeigt, an der Umwandlung von Androgenen, wie Androstendion und Testosteron, in Östron bzw. Östradiol beteiligt ist.
Pharmazie, Band 30, Nr. 1, Januar 1975, Berlin, DDR, Seiten 17-21, offenbart eine Anzahl an Verbindungen, die eine Sulfamatgruppe enthalten, welche an eine Steroidringstruktur gebunden ist. Die Sulfamatgruppe jeder dieser Verbindungen ist ein N,N-Dialkylaminosulfamat. Dieses Dokument lehrt, daß die offenbarten Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignet sein können.
Die DD-A-114806 offenbart (in Beispiel 10) eine N,N-Dialkylaminosulfamatgruppe, die an einen Steroidring gebunden ist.
Die GB-A-1 398 026 offenbart unter anderem Steroidester, die eine Sulfamatgruppe enthalten. Die Sulfamatgruppe kann ein N,N-Dialkylsulfamat sein.
Zeitschrift für Chemie, Band 14, Nr. 1, 1974, Leipzig, DE, Seiten 15-16, offenbart Verbindungen mit einem Steroidring und einer Sulfamatgruppe. Jede der offenbarten Sulfamatgruppen ist ein N,N- Dialkylsulfamat.
In der kürzlich veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 9/13083 wurde ein Vorschlag unterbreitet, einen anderen Punkt in dem Östrogenstoffwechselweg anzuvisieren oder eher zwei verschiedene Punkte, nämlich die Umwandlung von DHA-Sulfat und Östronsulfat in DHA bzw. Östron durch Steroidsulfataseaktivität und die Verwendung von 3-Monoalkylthiophosphonat-Steroidestern als einen Steroidsulfataseinhibitor, spezieller Östron-3-Monomethylthiophosphonat.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die in der Lage sind, Steroidsulfataseaktivität in vitro und in vivo zu hemmen.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die verbesserte Aktivität als Steroidsulfataseinhibitoren sowohl in vitro und in vivo aufweisen.
Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung sind in den anhängenden Patentansprüchen definiert.
Die Erfindung gründet sich auf der Entdeckung neuer Verbindungen mit steroidsulfatasehemmender Aktivität, in einigen Fällen mit äußerst hohen Aktivitätsniveaus. Diese Verbindungen sind die Amidoschwefelsäureester von polyzyklischen Alkoholen, welche polyzyklische Alkohole sind, deren Sulfat ein Substrat für Enzyme mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2), die N-Alkyl- und N-Arylderivate von solchen Amidoschwefelsäureestern und von deren pharmazeutisch verträglichen Salzen ist.
Allgemein gesprochen sind die neuen Verbindungen dieser Erfindung Verbindungen der Formel (I), FORMEL (I)
worin R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl ausgewählt sind und
die Gruppe -O- Polyzyklus den Rest eines polyzyklischen Alkohols darstellt, dessen Sulfat ein Substrat für Enzyme mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) ist.
In den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist der Rest eines polyzyklischen Alkohols ein Rest eines Sterols.
Wie es hierin verwendet wird, bezieht sich die Bezugnahme auf polyzyklische Alkohole, deren Sulfat ein Substrat für Enzyme mit Steroidsulfataseaktivität ist, auf das Sulfat von polyzyklischen Alkoholen, d. h. die Derivate der Formel
welche, wenn sie mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei pH 7,4 und 37ºC inkubiert werden, einen Km- Wert kleiner als 50 uMol liefern.
Die Erfindung wird nun nur beispielhaft unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren beschrieben.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, welches die Stoffwechselwege, Enzyme und Steroidzwischenstufen zeigt, die mit der Produktion von Östradiol in vivo verbunden sind.
Die Aktivität der vorliegenden Verbindungen als Steroidsulfataseinhibitoren ist in den anhängenden Figuren erläutert:
Fig. 2 ist ein Histogramm, welches den dosisabhängigen hemmenden Effekt von Öströn-3- Sulfamat auf Steroidsulfataseaktivität in menschlichen MCF-7-Zellen in vitro zeigt.
Fig. 3 ist ein Histogramm, welches den dosisabhängigen hemmenden Effekt von Östron-3-N,N- Dimethylsutfamat auf Steroidsulfataseaktivität in menschlichen MCF-7-Zellen in vitro zeigt.
Fig. 4 ist ein Diagramm, welches die Log-Dosisantwortkurven für Östron-3-Sulfamat und Östron-3- N,N-Dimethylsulfamat auf Steroidsulfataseaktivität in menschlichen MCF-7-Zellen in vitro zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches den dosisabhängigen hemmenden Effekt von Östron-3-Sulfamat zusammen mit dessen IC&sub5;&sub0;-Wert (Konzentration, die erforderlich ist, um 50% Hemmung zu erzeugen) auf Steroidsulfataseaktivität in menschlichen Plazentamikrosomen in vitro zeigt.
Gemäß einem Gesichtspunkt liefert die vorliegende Erfindung als neue Verbindungen die Amidoschwefelsäureester von polyzyklischen Alkoholen, welche polyzyklische Alkohole sind, deren Sulfat ein Substrat für Enzyme mit Steroidsulfataseaktivität gemäß der bereits angegebenen Definition ist, und deren N-Alkyl-, N-Cycloalkyl-, N-Alkenyl- und N-Aryl-Derivate. Diese Verbindungen haben die Formel I, welche hierin zuvor angegeben ist.
Vorzugsweise enthält die polyzyklische Gruppe einschließlich aller Substituenten maximal etwa 40 Kohlenstoffatome, noch eher nicht mehr als etwa 30. Bevorzugte Polyzyklen sind solche, die eine Steroidringstruktur enthalten, nämlich ein Cyklopentanophenanthren-Gerüst. Vorzugsweise ist die Sulfamyl- oder substituierte Sulfamylgruppe an dieses Gerüst an der 3-Position gebunden, d. h. Verbindungen der Formel II: FORMEL (II)
worin R&sub1; und R&sub2; wie oben definiert sind und das Ringsystem ABCD einen substituierten oder unsubstituierten, gesättigten oder ungesättigten Steroidkern, vorzugsweise Östron oder Dehydroepiandrosteron, darstellt.
Andere geeignet Steroidringsysteme sind:
Substituierte Östrone, nämlich
2-OH-Östron,
2-Methoxy-Östron,
4-OH-Östron,
6α-OH-Östron,
7α-OH-Östron,
16α-OH-Östron,
16β-OH-Östron;
Östradiole und substituierte Östradiole, nämlich
2-OH-17β-Östradiol,
2-Methoxy-17β-Östradiol,
4-OH-17β-Östradiol,
6α-OH-17β-Östradiol,
7α-OH-17β-Östradiol,
16α-OH-17α-Östradiol,
16β-OH-17α-Östradiol,
16β-OH-17β-Östradiol,
17α-Östradiol,
17β-Östradiol,
17α-Ethinyl-17β-Östradiol;
Östriole und substituierte Östriole, nämlich
Östriol,
2-OH-Östriol,
2-Methoxy-Östriol,
4-OH-Östriol,
6α-OH-Östriol,
7α-OH-Östriol;
Substituierte Dehydroepiandrosterone, nämlich
6α-OH-Dehydroepiandrosteron,
7α-OH-Dehydroepiandrosteron,
16α-OH-Dehydroepiandrosteron,
16β-OH-Dehydroepiandrosteron.
Ganz allgemein kann das Steroidringsystem ABCD eine Vielzahl sich nicht störender Substituenten enthalten. Speziell kann das Ringsystem ABCD einen oder mehrere Hydroxy-, Alkyl-, insbesondere niedrigere (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl-, z. B. Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl- und andere Pentyl-Isomere, und n-Hexyl- und andere Hexyl-Isomere, Alkoxy-, insbesondere niedrigere (C&sub1;-C&sub6;)-Alkoxy-, z. B. Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- usw., Alkinyl-, z. B. Ethinyl-, oder Halogen-, z. B. Fluoro-Substituenten enthalten.
Andere geeignete nicht steroidische Ringsysteme umfassen Diethylstilboestrol, Stilboestrol und andere Ringsysteme, die Sulfate mit Km-Werten geringer als 50 uMol mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 liefern.
Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung einen oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten enthalten, welche vorzugsweise zusammen oder jeweils maximal 10 Kohlenstoffatome enthalten. Wenn R&sub1; und/oder R&sub2; Alkyl ist, sind die bevorzugten Varianten solche, bei denen R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander unter niedrigeren Alkylgruppen ausgewählt sind, die von 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten, d. h. Methyl, Ethyl, Propyl usw. Vorzugsweise sind R&sub1; und R&sub2; beide Methyl. Wenn R&sub1; und/oder R&sub2; Aryl ist, sind typische Varianten Phenyl und Tolyl (-PhCH&sub3;; o-, m- oder p-). Wenn R&sub1; und R&sub2; Cycloalkyl darstellen, sind typische Varianten Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl usw. Wenn sie miteinander verbunden sind, stellen R&sub1; und R&sub2; typischerweise eine Alkylengruppe dar, welche eine Kette von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen liefert, die wahlweise von einem oder mehreren Heteroatomen oder -gruppen unterbrochen ist, z. B. -O- oder -NH- unter Bereitstellung eines 5-, 6- oder 7-gliedrigen Heterozyklus, z. B. Morpholino, Pyrrolidono oder Piperidino.
In die Gruppen Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl schließen wir substituierte Gruppen mit ein, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, welche die sulfatasehemmende Aktivität der in Rede stehenden Verbindung nicht stören. Beispiele für nicht störende Substituenten umfassen Hydroxy, Amino, Halo, Alkoxy, Alkyl und Aryl.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln III und IV: FORMEL (III) FORMEL (IV)
worin R&sub1; und R&sub2; H oder C&sub1;-C&sub5;-Alkyl sind, d. h. Östron-3-Sulfamat und Dehydroepiandrosteron-3- Sulfamat und deren N-(C&sub1;-C&sub5;)-Alkylderivate, insbesondere die Dimethylderivate mit R&sub1;=R&sub2;=CH&sub3;.
Die Amidoschwefelsäureester dieser Erfindung werden durch Umsetzen des polyzyklischen Alkohols, z. B. Östron oder Dehydroepiandrosteron, mit einem Sulfamoylchlorid R&sub1;R&sub2;NSO&sub2;Cl hergestellt, d. h. nach dem Reaktionsschema I. REAKTIONSSCHEMA I
Bedingungen zur Durchführung von Reaktionsschema I sind folgende:
Natriumhydrid und ein Sulfamoylchlorid werden zu einer gerührten Lösung von Östron in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0ºC hinzugegeben. Anschließend läßt man die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen, woraufhin das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird auf eine kaltgesättigte Lösung von Natriumbikarbonat gegossen, und die resultiere wäßrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet. Filtration, gefolgt von Lösungsmittelverdampfen im Vakuum und gemeinsamem Verdampfen mit Toluol liefert einen rohen Rückstand, der durch Flash- Chromatographie weiter gereinigt wird.
Wo es notwendig ist, können funktionale Gruppen in dem polyzyklischen Alkohol (Sterol) in bekannter Art und Weise geschützt und die Schutzgruppe oder -gruppen am Ende der Reaktion entfernt werden.
Für eine pharmazeutische Verabreichung können die Steroidsulfataseinhibitoren dieser Erfindung in jeder geeigneten Art und Weise unter Verwendung herkömmlicher pharmazeutischer Formulierungstechniken und pharmazeutischer Träger, Bindemittel, Verdünnungsmittel, usw. und üblicherweise für die parenterale Verabreichung formuliert werden. Ungefähre wirksame Dosisraten liegen im Bereich von 100 bis 800 mg/Tag, abhängig von den individuellen Aktivitäten der jeweiligen Verbindungen und für einen Patienten mit durchschnittlichem (70 kg) Körpergewicht. Üblichere Dosisraten für die bevorzugten und aktiveren Verbindungen werden im Bereich von 200 bis 800 mg/Tag, bevorzugt 200 bis 500 mg/Tag, besonders bevorzugt von 200 bis 250 mg/Tag liegen. Sie können als Einzeldosisprogramm, in einem Programm mit aufgeteilter Dosis und/oder in einem Programm mit mehreren Dosen über mehrere Tage gegeben werden. Für die orale Verabreichung können sie in Tabletten, Kapsein, als Lösung oder Suspension mit 100 bis 500 mg Verbindung pro Dosiseinheit formuliert sein. Alternativ und bevorzugt werden die Verbindungen für die parenterale Verabreichung in einem geeigneten parenteral verabreichbaren Träger und zur Bereitstellung einzelner täglicher Dosisraten im Bereich von 200 bis 800 mg, vorzugsweise 200 bis 500, besonders bevorzugt 200 bis 250 mg, formuliert. Diese wirksamen täglichen Dosen werden jedoch in Abhängigkeit von der dem aktiven Bestandteil innewohnenden Aktivität und von dem Körpergewicht des Patienten variieren, wobei solche Variationen innerhalb des Fachwissens und der Einschätzung des Arztes liegen.
Für spezielle Anwendungen wird in Betracht gezogen, daß die Steroidsulfataseinhibitoren dieser Erfindung in Kombinationstherapien entweder mit einem anderen Sulfataseinhibitor oder zum Beispiel in Kombination mit einem Aromataseinhibitor, wie zum Beispiel 4-Hydroxyandrostendion (4- OHA) verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden präparativen Beispiele und Testdaten erläutert:

Beispiel 1

Herstellung von Östron-3-Sulfamat

Natriumhydrid (60% Dispersion; 2 eq) und Sufamoylchlorid (2 eq) wurden zu einer gerührten Lösung von Östron (1 eq) in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0ºC hinzugegeben. Anschließend ließ man die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen, woraufhin das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde auf eine kaltgesättigte Lösung von Natriumbikarbonat gegossen, und die resultierende wäßrige Phase wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet. Filtration, gefolgt von Lösungsmittelverdampfen im Vakuum und gemeinsamem Verdampfen mit Toluol lieferte einen rohen Rückstand, welcher mittels Flash-Chromatographie weiter gereinigt wurde.
Eine Analyse zeigte die folgenden Daten:
δ¹H (270 MHz; CD&sub3;OD): 0,91 (s, 3H, C&sub1;&sub8;-Me), 1,40-2,55 (Reihe von m, 13H), 2,90-2,92 (m, 2H), 7,04 (br d, 2H, J = 10,44 Hz), 7,33 (br d, 1H, J = 8,42 Hz).
δ¹³C (67,8 MHz; CD&sub3;OD): 14,53 (q, C&sub1;&sub8;-Me), 22,80 (t), 27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t), 33,05 (t), 37,01 (t), 39,76 (d), 45,73 (s, C&sub1;&sub8;), 51,86 (d), 120,76 (d), 123,54 (d), 127,89 (d), 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C=O).
m/z (%): 349 (9) (m&spplus;), 270 (100), 213 (26), 185 (43), 172 (31), 159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24). Mikroanalyse:

Beispiel 2

Herstellung von Östron-3-N-Methyllsulfamat

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen daß Sulfamoylchlorid durch die gleiche Menge N-Methylsulfamoylchlorid ersetzt wurde
Eine Analyse zeigte die folgenden Daten:
δ¹H (270 MHz; CDCl&sub3;): 0,91 (s, 3H, C&sub1;&sub8;-Me), 1,28-1,68 (m, 6H), 1,93-2,60 (Reihe von m, 7H), 2,90- 2,95 (m, 2H), 2,94 (d, 3H, J = 5,13 Hz, MeN-), 4,68-4,71 (br m, austauschbar, 1H, -NH), 7,02-7,07 (m, 2H), 7,26-7,32 (m, 1H).
m/z (%): 364 [M + H]&spplus;

Beispiel 3

Herstellung von Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen daß Sulfamoylchlorid durch die gleiche Menge N,N-Dimethylsulfamoylchlorid ersetzt wurde.
Eine Analyse zeigte die folgenden Daten:
δ¹H (270 MHz; CDCl&sub2;): 0,92 (s, 3H, C&sub1;&sub8;-Me), 1,39-1,75 (m, 5H), 1,95-2,60 (Reihe von m, 6H), 2,82 (s, 3H, MeN-), 2,96-3,00 (m, 4H), 2,98 (s, 3H, MeN-), 7,04 (br d, 2H, J = 7,69 Hz), 7,29 (br d, 1H, J = 7,88 Hz).
m/z (%): 377 [M]&spplus; Mikroanalyse:

Beispiel 4

Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in MCF-7-Zellen durch Östron-3-Sulfamat

Steroidsulfatase ist definiert als: Sterylsulfatase EC 3.1.6.2.
Steroidsulfataseaktivität wurde in vitro unter Verwendung intakter menschlicher MCF-7- Brustkrebszellen gemessen. Diese hormonabhängige Zellinie wird in weitem Maße zur Untersuchung der Regulierung des Wachstums von menschlichen Brustkrebszellen verwendet. Sie zeigt deutliche Steroidsulfataseaktivität (Maclndoe et al., Endocrinviogy, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905(1992)) und ist in den USA von der American Type Culture Collection (ATCC) und im Vereinigten Königreich (z. B. von The Imperial Cancer Research Fund) erhältlich. Die Zellen wurden in Minimal Essential Medium (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Schottland) gehalten, welches 20 mM HEPES, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin, nicht essentielle Aminosäuren und 0,075% Natriumbikarbonat enthielt. Bis zu 30 Replikate von 25 cm² Gewebekulturflaschen wurden mit etwa 1 · 10&sup5; Zellen/Flasche unter Verwendung des oben genannten Mediums beimpft. Die Zellen wurden bis zu 80% Konfluenz gezüchtet, und das Medium wurde jeden dritten Tag gewechselt.
Intakte Monolayer von MCF-7-Zellen in dreifachen 25 cm² Gewebekulturflaschen wurden mit Earle's Baianced Salt Solution (EBSS von ICN Flow, High Wycombe, UK) gewaschen und für 3-4 Stunden bei 37ºC mit 5 umol (7 · 10&sup5; dpm) [6,7-³H]-Östron-3-Sulfat (spezifische Aktivität von 60 Ci/mmol von New England Nuclear, Boston, Massachusetts, USA) in serumfreiem MEM (2,5 ml) zusammen mit Östron-3-Sulfamat (11 Konzentrationen: 0; 1 fM, 0,01 pM; 0,1 pM, 1 pM, 0,01 nM; 0,1 nM; 1 nM; 0,01 uM; 0,1 uM; 1 uM) inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Flasche gekühlt, und das Medium (1 ml) wurde in getrennte Röhrchen pipettiert, welche [¹&sup4;C]-Östron (7 · 10³ dpm) (spezifische Aktivität 97 Ci/mmol von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, UK) enthielten. Das Gemisch wurde sorgfältig für 30 Sekunden mit Tuluol (5 ml) geschüttelt. Die Experimente zeigten, daß > 90% [¹&sup4;C]-Östron und < 0,1% [³H]-Östron-3-Sulfat durch diese Behandlung aus der wäßrigen Phase entfernt worden waren. Ein Teil (2 ml) der organischen Phase wurde entnommen, verdampft und der ³H- und ¹&sup4;C-Gehalt des Rückstandes durch Szintillationsspektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-Sulfat wurde aus den erhaltenen ³H-Zählern (korrigiert bezüglich der Volumina des Mediums und der verwendeten organischen Phase und hinsichtlich der Ausbeute an hinzugefügtem [¹&sup4;C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet. Jeder Ansatz von Exprimenten umfaßte Inkubationen von Mikrosomen, die aus einer sulfatasepositiven humanen Plazenta (Positivkontrolle) hergestellt waren, und von Flaschen ohne Zellen (um auftretende nichtenzymatische Hydrolyse des Substrats zu untersuchen). Die Anzahl an Zellkernen pro Flasche wurde unter Verwendung eines Coulter-Zählers nach Behandlung der Zell-Monolayer mit Zaponin bestimmt. Eine Flasche in jedem Ansatz wurde verwendet, um den Zellmembranstatus und die Überlebensfähigkeit unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlußmethode (Phillips, H. J. (1973) in: Tissue culture and applications, [Kruse, D. F. & Patterson, M. K.], Seiten 406-408, Academic Press, New York) zu untersuchen.
Die Daten für Östron-3-Sulfamat sind in Tabelle I und den Fig. 2 und 4 gezeigt. Ergebnisse für Steroidsulfataseaktivität sind angegeben als das Mittel ±1 Standardabweichung des gesamten Produkts (Östron + Östradiol), das während des lnkubationszeitraums (20 Stunden) gebildet wurde, berechnet für 10&sup6; Zellen und für Werte, die statistische Signifikanz zeigen, als eine prozentuale Verminderung (Hemmung) gegenüber Inkubationen, die kein Östron-3-Sulfamat enthielten. Zur Untersuchung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse wurde der ungepaarte Student-t-Test verwendet. TABELLE I
Mittel ±1 Standardabweichung, n = 3 *p ≤ 0,05 *** p ≤ 0,001

Beispiel 5

Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in MCF-7-Zellen durch Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat

Ein identisches Versuchsprotokoll, wie das in Beispiel 4 beschriebene, wurde zur Generierung von Ergebnissen für Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat verwendet mit der Ausnahme, daß die Inkubationen Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat (5 Konzentrationen: 0; 0,001 uM; 0,01 uM; 0,1 uM; 1 uM) anstelle von Östron-3-Sulfamat enthielten.
Die Ergebnisse für Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat sind in Tabelle II und Fig. 3 gezeigt und in einer identischen Art und Weise wie in Tabelle I bzw. Fig. 2 ausgedrückt. Zusätzlich ist die Log- Dosisantwortkurve in Fig. 4 mit Östron-3-Sulfamat verglichen. TABELLE II
Mittel ±1 Standardabweichung, n = 3 *p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001

Beispiel 6

Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in MCF-7-Zellen durch Vorbehandlung mit Östron-3-Dimethylsulfamat und Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat

Zur Bestimmung des Effektes der Vorbehandlung von MCF-7-Zellen mit Östron-3-Sulfamat bzw. Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat wurde ein ähnliches Versuchsprotokoll wie dasjenige, das in Beispiel 4 beschrieben ist, verwendet.
Intakte Monolayer wurden anfänglich für 2 Stunden bei 37ºC mit 0,1 uM Östron-3-Sulfamat, Östron- 3-N,N-Dimethylsulfamat oder mit Medium alleine (Kontrolle) inkubiert. Das Medium, in dem die Zellen gebadet wurden, wurde anschließend durch Absaugen entfernt, und die Zellen wurden dreimal nacheinander mit 5 ml Medium bei jedem Mal gewaschen. Die erhaltenen "gewaschenen" Zellen wurden dann resuspendiert und für 3-4 Stunden bei 37ºC in Medium inkubiert, welches 5 umol (7 · 10&sup5; dpm) [6,7-³H]-Östron-3-Sulfat enthielt. Alle anderen Einzelheiten waren mit denjenigen, die in den Beispielen 3 und 4 beschrieben sind, identisch.
Die Ergebnisse für Östron-3-Sulfamat und Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat sind in Tabelle III gezeigt und in einer ähnlichen Art und Weise wie in Tabelle I ausgedrückt. TABELLE III
Mittel ±1 Standardabweichung, n = 3 *p ≤ 0,05 *** p ≤ 0,001

Beispiel 7

Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in Plazentamikrosomen durch Östron-3-Sulfamat

Bezüglich Sulfatase positive menschliche Plazenta von normal verlaufenen Schwangerschaften (Entbindungsstation, St. Mary's Hospital, London) wurden mit Scheren sorgfältig in Stücke geschnitten und einmal mit kaltem Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mM) gewaschen und anschließend in kaltem Phosphatpuffer (5 ml/g Gewebe) resuspendiert. Homogenisierung wurde mit einem Ultra-Turrax- Homogenisierer erreicht, wobei drei 10-sekündige Stöße, getrennt durch 2 Minuten lange Kühlzeiträume in Eis, angewendet wurden. Kerne und Zelitrümmer wurden durch Zentrifugieren (4ºC) bei 2000 g für 30 Minuten entfernt, und Anteile (2 ml) des Überstandes wurden bei -20ºC gelagert. Die Proteinkonzentration der Überstände wurde nach dem Verfahren von Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)) bestimmt.
Inkubationen (1 ml) wurden unter Verwendung einer Proteinkonzentration von 100 ug/ml, einer Substratkonzentration von 20 uM [6,7-³H]-Östron-3-Sulfat (spezifische Aktivität von 60 Ci/mmol von New England Nuclear, Boston, Massachusetts, USA) und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Es wurden acht Konzentrationen an Östron-3-Sulfamat verwendet: 0 (d. h. Kontrolle); 0,05 uM; 0,1 uM; 0,2 uM; 0,4 uM; 0,6 uM; 0,8 uM; 1,0 uM. Nach der Inkubation wurde jede Probe gekühlt, und das Medium (1 ml) wurde in getrennte Röhrchen pipettiert, welche [¹&sup4;C]-Östron (7 · 10³ dbm) (spezifische Aktivität von 97 Ci/mmol von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, UK) enthielten. Das Gemisch wurde sorgfältig für 30 Sekunden mit Toluol (5 ml) geschüttelt. Die Experimente zeigten, daß > 90% [¹&sup4;C]-Östron und < 0,1% [³H]-Östron-3-Sulfat durch diese Behandlung aus der wäßrigen Phase entfernt worden waren. Ein Teil (2 ml) der organischen Phase wurde abgenommen, verdampft und der ³H- und ¹&sup4;C-Gehalt des Rückstandes durch Szintillationsspektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-Sulfat wurde aus den erhaltenen ³H-Zählern (korrigiert bezüglich der Volumina des Mediums und der verwendeten organischen Phase und bezüglich der Ausbeute an hinzugegebenem [¹&sup4;C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet.
Die Ergebnisse für Östron-3-Sulfamant sind in Tabelle IV und Fig. 5 gezeigt. Die Ergebnisse für Steroidsulfataseaktivität sind in Tabelle IV als Gesamtprodukt (Östron + Östradiol), das während der Inkubationsdauer (Zeit) gebildet wurde, und als eine prozentuale Verminderung (Hemmung) gegenüber Inkubationen, die kein Östron-3-Sulfamat enthielten, welche als Kontrolle dienten, ausgedrückt. Die Ergebnisse für die Steroidsulfataseaktivität sind in Fig. 4 als Prozentsatz der Verminderung (Hemmung) gegenüber der Kontrolle gegen die Konzentration von Östron-3-Sulfamat ausgedrückt und umfassen den berechneten IC&sub5;&sub0;-Wert (d. h. die Konzentration an Östron-3-Sulfamat, welche 50% Hemmung im Verhältnis zur Kontrolle liefert) von 0,07 uM. TABELLE IV
Mittel von 2 Bestimmungen

Beispiel 8

Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in Lebermikrosompräparationen aus Ratten, die mit subkutanem Östron-3-Sulfamat behandelt wurden

Vier Gruppen von 3 weiblichen Wistar-Ratten (Gewichtsbereich von 80-110 g) wurden 100 ul subkutane Injektionen (einmal täglich für 7 Tage; Träger: Propylenglykol) von einem der folgenden verabreicht:
Propylenglykol (Trägerkontrolle),
Östron-3-Sulfamat (10 mg/kg/Tag),
Östron-3-Sulfat (10 mg/kg/Tag) (Substratkontrolle),
Östron-3-Sulfat (10 mg/kg/Tag) + Östron-3-Sulfamat (10 mg/kg/Tag).
Am achten Tag wurden alle Ratten getötet, und die Lebern wurden durch Sektion entnommen. Lebermikrosomenpräparationen wurden nach einem Protokoll hergestellt, das zu demjenigen identisch ist, das in Beispiel 6 beschrieben ist, ausgenommen, daß der Gewebeausgangsstoff Rattenleber war und daß Doppelexperimente zur Bestimmung von Steroidsulfataseaktivität unter Verwendung von [6,7-³H]-Östron-3-Sulfat und [7-³H]-Dehydroepiandrosteron-3-Sulfat als getrennte Substrate durchgeführt wurden.
Die Ergebnisse für die Steroidsulfataseaktivität sind in Tabelle V gezeigt und als Gesamtprodukt, das während der Inkubationsdauer gebildet wurde, in der Form des Mittels ±1 Standardabweichung ausgedrückt. Die Ergebnisse für Inkubationen von Gewebe, das aus Gruppen von Ratten erhalten wurde, die mit Östron-3-Sulfamat behandelt wurden, sind auch als eine prozentuale Verminderung (Hemmung) der Steroidsulfataseaktivität im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen ausgedrückt. TABELLE V
Mittel ±1 Standardabweichung, n = 3
*** p ≤ 0,001
E&sub1;-S = Östron-3-Sulfamat
DHA-S = Dehydroepiandrosteron-3-Sulfat
E&sub1;-SO&sub3;NH&sub2; = Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat

Claims

1. Gereinigte Verbindung mit einer Steroidringstruktur und einer Sulfamatgruppe mit der Formel

worin R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl und Aryl ausgewählt sind,

worin wenigstens eines unter R&sub1; und R&sub2; H ist,

wobei die Verbindung ein Inhibitor für ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (E. C.3.1.6.2) ist und

wobei, wenn die Sulfamatgruppe an der Verbindung unter Bilddung eines Sulfatverbindung gegen eine Sulfatgruppe ersetzt und mit einem Steroidsulfataseenzym (E. C.3.1.6.2) bei einem pH-Wert von 7,4 und 37ºC inkubiert würde, man einen Km-Wert kleiner als 50 uM erhalten würde.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin das Sterol ein 3-Sterol ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Sterol aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Östron, Dehydroepiandrosteronen, substituierten Östronen und substituierten Dehydroepiandrosteronen besteht.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander unter H oder einem C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl ausgewählt sind, wobei jedoch wenigstens eines von R&sub1; und R&sub2; H ist.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander unter H oder einem C&sub1;-C&sub5;-Alkyl ausgewählt sind, wobei jedoch wenigstens eines von R&sub1; und R&sub2; H ist.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander unter H oder einem Methyl ausgewählt sind, wobei jedoch wenigstens eines von R&sub1; und R&sub2; H ist.

7. Gereinigte Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R&sub1; gleich H und R&sub2; gleich H sind.

8. Gereinigte Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine Verbindung mit der Formel

ist, worin die Gruppe Polyzyklus den Rest eines 3-Sterols darstellt und worin R&sub1; und R&sub2; H sind.

9. Östron-3-Sulfamat.

10. Östron-3-N-Monomethylsulfamat.

11. Östron-3-N,N-Dimethylsulfamat.