DE60023740T2

DE60023740T2 - Halogenierte sulphamat-, phoshonat-, thiophosphonat-, sulphonat- und sulphonamid- verbindungen als inhibitoren von steroidsulfatase

Info

Publication number: DE60023740T2
Application number: DE60023740T
Authority: DE
Inventors: Michael John Reed; Barry Victor L. Potter; Hatem Hejaz; Atul Purohit
Original assignee: Sterix Ltd
Current assignee: Sterix Ltd
Priority date: 1999-12-13
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: ATE308556T1; AU2190601A; EP1237902B1; US6858597B2; EP1237902A1; JP2003517002A; DK1237902T3; JP4931312B2; WO2001044268A1; ES2250224T3; US20030134829A1; DE60023740D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung und eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindung oder Zusammensetzung in Therapieanwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hinweise legen nahe, daß Östrogene die Hauptmitogene sind, die an der Förderung des Wachstums von Tumoren in endokrinabhängigen Geweben, wie beispielsweise der Brust und dem Endometrium, beteiligt sind. Obwohl Plasmaöstrogenkonzentrationen in Frauen mit oder ohne Brustkrebs ähnlich sind, sind die Mengen an Östron und Östradiol in Brusttumor signifikant höher als in normalem Brustgewebe oder Blut. Man nimmt an, daß die in situ Synthese von Östrogen einen wichtigen Beitrag zu den hohen Mengen von Östrogenen in Tumoren leistet, und daher sind Inhibitoren der Östrogenbiosynthese, insbesondere spezifische Inhibitoren, von besonderem Wert für die Behandlung von endokrinabhängigen Tumoren.
In den vergangenen zwei Jahrzehnten bestand beträchtliches Interesse an der Entwicklung von Inhibitoren des Aromatasestoffwechselweges, welcher den Androgenvorläufer Androstendion in Östron umwandelt. Es gibt jedoch jetzt Hinweise, daß der Östronsulfatase-(E1-STS-) Stoffwechselweg, d.h. die Hydrolyse von Östronsulfat in Östron (E1S in E1) im Gegensatz zum Aromatasestoffwechselweg die Hauptquelle für Östrogen in Brusttumoren ist. Diese Theorie wird von einer geringen Reduzierung der Plasmaöstrogenkonzentration in postmenopausalen Frauen mit Brustkrebs, die mit Aromataseinhibitoren, wie beispielsweise Aminoglutethimid und 4-Hydroxyandrostendion, behandelt wurden, und auch durch die Tatsache, daß die Plasma-E1S-Konzentration in diesen mit Aromataseinhibitor behandelten Patienten relativ hoch bleibt, gestützt. Die lange Halbwertszeit von E1S im Blut (10–12 h) im Vergleich mit den unkonjugierten Östrogenen (20 Min.) sowie hohe Niveaus an Steroidsulfataseaktivität in der Leber und normalen und malignen Brustgeweben stützen diese Theorie ebenfalls.
Die PCT/GB92/01587 lehrt neue Steroidsulfataseinhibitoren und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese enthalten, für eine Verwendung in der Behandlung von östronabhängigen Tumoren, insbesondere Brustkrebs. Diese Steroidsulfataseinhibitoren sind Sulfamatester, wie bei spielsweise N,N-Dimethylöstron-3-sulfamat und vorzugsweise Östron-3-sulfamat (auch bekannt als "EMATE").
EMATE (2-Methoxyöstron-3-O-sulfamat), welches ein Analoges von Östron-3-O-sulfamat ist, hat die folgende Struktur:
Es ist bekannt, daß EMATE ein potenter E1-STS-Inhibitor ist, da es mehr als 99% Inhibition von E1-STS-Aktivität in intakten MCF-7-Zellen bei 0,1 mM zeigt. EMATE hemmt auch das E1-STS-Enzym in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise, was darauf hindeutet, daß es als ein auf aktive Stellen gerichteter Inaktivator wirkt. Obwohl EMATE ursprünglich für die Hemmung von E1-STS entworfen wurde, hemmt es auch Dehydroepiandrosteronsulfatase (DHA-STS), was ein Enzym ist, von dem man annimmt, daß es eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Biosynthese des östrogenen Steroids Androstendiol spielt. Es gibt nun auch Hinweise, die nahelegen, daß Androstendiol eine sogar noch größere Bedeutung als ein Promotor von Brusttumorwachstum hat. EMATE ist auch in vivo aktiv, da es zu einer nahezu vollständigen Hemmung der Aktivitäten von Rattenleber-E1-STS (99%) und -DHA-STS (99%) führte, wenn es entweder oral oder subkutan verabreicht wurde. Darüber hinaus wurde von EMATE gezeigt, daß es in Ratten eine das Gedächtnis verbessernde Wirkung hat. Studien in Mäusen haben eine Verbindung zwischen DHA-STS-Aktivität und der Regulierung eines Teils der Immunantwort nahegelegt. Man nimmt an, daß dies auch in Menschen auftreten könnte. Das verbrückende O-Atom in dem Sulfamatrest in EMATE ist für die hemmende Aktivität wichtig. Daher sind, wenn das 3-O-Atom durch andere Heteroatome ersetzt wird, wie beispielsweise in Östron-3-N-sulfamat und Östron-3-S-sulfamat, diese Analogen schwächere, nicht zeitabhängige Inaktivatoren.
Obwohl eine optimale Stärke der Hemmung von E1-STS in EMATE erreicht wurde, ist es möglich, daß Östron während der Sulfatasehemmung freigesetzt wird und daß EMATE und dessen östradiolverwandte östrogenartige Aktivität aufweisen können.
Ahmed et al. (Biochem Biophys Res Commun 27. Jan. 1999; 254(3): 811–5) berichten über eine Studie über das Struktur-Aktivitäts-Verhältnis von steroiden und nicht-steroiden Inhibitoren von STS.
Die vorliegende Erfindung will für die Hemmung von E1-STS sowie andere therapeutische Anwendungen geeignete neue Verbindungen bereitstellen.
ZUSAMMENGEFASSTE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß bestimmte Halogenverbindungen als wirksame Steroidsulfataseinhibitoren verwendet werden könnten.
Die Halogenverbindungen der vorliegenden Erfindung können andere Substituenten enthalten. Diese anderen Substituenten können z.B. die Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung weiter erhöhen und/oder die Stabilität verbessern (ex vivo und/oder in vivo).
AUSFÜHRLICHE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt mit einer Steroidringstruktur und mit der Formel
worin
Rh1 eine Halogengruppe ist,
Rh2 eine optionale Halogengruppe ist,
Rs eine Sulfamatgruppe ist und
worin die Steroidringstruktur ausgewählt ist unter einem von Östron, 4-OH-Östron, 6α-OH-Östron, 7α-Östron, 16α-OH-Östron, 16β-OH-Östron, 17-Desoxyöstron, 4-OH-17β-Östradiol, 6α-OH-17β-Östradiol, 7α-OH-17β-Östradiol, 4-OH-17α-Östriadiol, 6α-OH-17α-Östradiol, 7α-OH-17α-Östradiol, 16α-OH-17α-Östradiol, 16α-OH-17β-Östradiol, 16β-OH-17α-Östradiol, 16β-OH-17β-Östradiol, 17α-Östradiol, 17β-Östradiol, 17α-Ethinyl-17β-östradiol, 17β-Ethinyl-17α-östradiol, 17-Desoxyöstradiol, Östriol, 4-OH-Östriol, 6α-OH-Östriol, 7α-OH-Östriol und 17-Desoxyöstriol.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Medizin bereitgestellt.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Hilfsmittel enthält.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der/die mit STS in Verbindung steht, bereitgestellt.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der/die mit ungünstigen STS-Mengen in Verbindung steht, bereitgestellt.
Zur Vereinfachung der Bezugnahme werden diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Jedoch sind die Lehren unter jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf den jeweiligen speziellen Abschnitt beschränkt.
BEVORZUGTE ASPEKTE
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Brustkrebs geeignet.
Zwei bevorzugte Verbindungen sind 2-Iod-EMATE und 2-Brom-EMATE.
EINIGE VORTEILE
Ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Sulfamatverbindungen der vorliegenden Erfindung als STS-Inhibitoren wirken können.
Ein weiterer Vorteil der Verbindungen der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie in vivo potent sein können.
Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nicht-östrogene Verbindungen sein. Hierin bedeutet der Begriff "nicht-östrogen", daß etwas keine oder im wesentlichen keine Östrogen-aktivität aufweist.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß einige der Verbindungen nicht zu Verbindungen verstoffwechselt werden können, die hormonale Aktivität aufweisen oder induzieren.
Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch dahingehend vorteilhaft, daß sie oral aktiv sein können.
Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können für die Behandlung von Krebs, wie beispielsweise Brustkrebs, sowie (oder alternativ) von nicht malignen Zuständen, wie beispielsweise der Vorbeugung vor Autoimmunkrankheiten, insbesondere wenn Arzneimittel von einem frühen Alter an verabreicht werden müssen, geeignet sein.
Somit nimmt man von einigen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch an, daß sie andere therapeutische Anwendungen haben als zur Behandlung von endokrinabhängigen Krebsarten, wie beispielsweise die Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
STEROIDSULFATASE
Steroidsulfatase, die auch manchmal als Steroidsulfatase oder Sterylsulfatase oder kurz "STS" bezeichnet wird, hydrolysiert mehrere sulfatierte Steroide, wie beispielsweise Östronsulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Cholesterolsulfat. STS wurde die Enzymnummer EC 3.1.6.2 zugewiesen.
STS wurde kloniert und exprimiert. Siehe beispielsweise Stein et al. (J. Biol. Chem. 264: 13865–13872 (1989)) und Yen et al. (Cell 49: 443–454 (1987)).
STS ist ein Enzym, das mit einer Vielzahl von Krankheitszuständen in Verbindung gebracht wurde.
Zum Beispiel haben Arbeiter herausgefunden, daß ein vollständiges Fehlen von STS Ichthyose hervorruft. Gemäß einigen Arbeitern ist STS-Mangel ziemlich häufig in Japan. Die gleichen Arbeiter (Sakura et al., J Inherit Metab Dis 1997 Nov.; 20(6): 807–10) haben auch berichtet, daß allergische Erkrankungen, wie beispielsweise Bronchialasthma, allergische Rhinitis oder atopische Dermatitis, mit einem Steroidsulfatasemangel einhergehen können.
Zusätzlich zu Krankheitszuständen, die durch ein vollständiges Fehlen von STS-Aktivität hervorgerufen werden, kann auch eine erhöhte Menge an STS-Aktivität zu Krankheitszuständen führen. Wie es oben erwähnt wurde, gibt es z.B. starke Hinweise, die eine Rolle von STS bei Brustkrebswachstum und -metastasenbildung unterstützen.
STS wurde auch mit anderen Krankheitszuständen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel haben Le Roy et al. (Behav Genet 1999 März; 29(2): 131–6) festgestellt, daß es eine genetische Korrelation zwischen Steroidsulfatasekonzentration und einer Auslösung von Angriffsverhalten in Mäusen geben könnte. Die Autoren schlußfolgern, daß eine Sulfatisierung von Steroiden die Antriebskraft für ein komplexes Netzwerk sein könnte, einschließlich Genen, von denen durch Mutagenese gezeigt wurde, daß sie mit Aggression in Verbindung stehen.
STS-INHIBITION
Es wird angenommen, daß einige Krankheitszustände, die mit STS-Aktivität in Verbindung stehen, auf die Umwandlung eines nicht aktiven, sulfatisierten Östrons in ein aktives, nicht sulfatisiertes Östron zurückzuführen ist. Bei Krankheitszuständen, die mit STS-Aktivität in Verbindung stehen, wäre es wünschenswert, die STS-Aktivität zu hemmen.
Hierin umfaßt der Begriff "hemmen" das Reduzieren und/oder Eliminieren und/oder Maskieren und/oder Verhindern der schädlichen Wirkung von STS.
STS-INHIBITOR
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung als ein STS-Inhibitor wirken.
Hierin bedeutet der Begriff "Inhibitor", wie er hierin in Bezug auf die Verbindung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Verbindung, die STS-Aktivität hemmt, wie beispielsweise Reduzierung und/oder Eliminierung und/oder Maskierung und/oder Verhinderung der schädlichen Wirkung von STS. Der STS-Inhibitor kann als ein Antagonist wirken.
Die Fähigkeit von Verbindungen, Östronsulfataseaktivität zu hemmen, kann untersucht werden, indem man entweder intakte MCF-7-Brustkrebszellen oder Plazentamikrosome verwendet. Darüber hinaus kann ein Tiermodell verwendet werden. Details über geeignete Testprotokolle werden in den folgenden Abschnitten angegeben. Es ist festzuhalten, daß auch andere Tests verwendet werden können, um STS-Aktivität und somit STS-Hemmung zu bestimmen. Zum Beispiel kann auch auf die Lehren der WO-A-99/50453 verwiesen werden.
Für einige Anwendungen ist die Verbindung vorzugsweise weiter gekennzeichnet durch das Merkmal, daß, wenn die Sulfamatgruppe durch eine Sulfatgruppe unter Bildung eines Sulfatderivats substituiert wäre, dann das Sulfatderivat durch ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) hydrolysierbar wäre, d.h. wenn es mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 37°C inkubiert würde.
Wenn die Sulfamatgruppe der Verbindung durch eine Sulfatgruppe unter Bildung einer Sulfatverbindung zu ersetzen wäre, dann wäre diese Sulfatverbindung in einer bevorzugten Ausführungsform durch ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) hydrolysierbar und würde einen Km-Wert von weniger als 200 mmolar, vorzugsweise weniger als 150 mmolar, vorzugsweise weniger als 100 mmolar, vorzugsweise weniger als 75 mmolar, vorzugsweise weniger als 50 mmolar, liefern, wenn sie mit Steroidsulfatase EC 3.1.6.2 bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 37°C inkubiert würde.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung durch ein Enzym mit Steroidsulfataseaktivität (EC 3.1.6.2) nicht hydrolysierbar.
Für einige Anwendungen besitzt die Verbindung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise wenigstens eine etwa 100-fache Selektivität für ein gewünschtes Ziel (z.B. STS), vorzugsweise wenigstens eine etwa 150-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, vorzugsweise eine wenigstens etwa 200-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, vorzugsweise eine wenigstens etwa 250-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, vorzugsweise eine wenigstens etwa 300-fache Selektivität für das gewünschte Ziel, vorzugsweise eine wenigstens etwa 350-fache Selektivität für das gewünschte Ziel.
Es ist festzuhalten, daß die Verbindung der vorliegenden Erfindung zusätzlich oder alternativ zu ihrer Fähigkeit, STS-Aktivität zu hemmen, andere vorteilhafte Eigenschaften haben kann.
SULFAMATGRUPPE
Der Begriff "Sulfamat", wie er hierin verwendet wird, umfaßt einen Ester von Sulfamidsäure oder einen Ester eines N-substituierten Derivats von Sulfamidsäure oder ein Salz davon.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wird als eine Sulfamatverbindung bezeichnet.
Typischerweise hat die Sulfamatgruppe die Formel (R1)(R2)N-S(O)(O)-O-, worin vorzugsweise R1 und R2 unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen davon ausgewählt sind oder zusammen Alkylen darstellen, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl optional ein oder mehrere Heteroatome oder -gruppen enthält.
Wenn sie substituiert sind, können die N-substituierten Verbindungen dieser Erfindung einen oder zwei N-Alkyl-, N-Alkenyl-, N-Cycloalkyl- oder N-Aryl-Substituenten, von denen einer oder jeder vor zugsweise maximal 10 Kohlenstoffatome aufweist, enthalten. Wenn R1 und/oder R2 Alkyl ist/sind, sind die bevorzugten Gruppen solche, bei denen R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander unter niederen Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, d.h. Methyl, Ethyl, Propyl etc. R1 und R2 können beide Methyl sein. Wenn R1 und/oder R2 Aryl ist/sind, sind typische Gruppen Phenyl und Tolyl (PhCH3; o). Wenn R1 und R2 Cycloalkyl repräsentieren, sind typische Gruppen Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl etc. Wenn sie miteinander verbunden sind, repräsentieren R1 und R2 typischerweise eine Alkylengruppe, die eine Kette mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen liefert, welche optional durch ein oder mehrere Heteroatome oder -gruppen unterbrochen ist, z.B. liefert sie einen 5-gliedrigen Heterozyklus, z.B. Morpholino, Pyrolidino oder Piperidino.
Innerhalb der Gruppen Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl sind substituierte Gruppen eingeschlossen, die als Substituenten darin eine oder mehrere Gruppen enthalten, welche die Sulfatasehemmende Aktivität der betreffenden Verbindung nicht stören. Beispielsweise umfassen nicht störende Substituenten Hydroxy, Amino, Halogen, Alkoxy, Alkyl und Aryl.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist wenigstens einer von R1 und R2 H.
In einigen weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind sowohl R1 als auch R2 H.
TEST ZUR BESTIMMUNG VON STS-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG VON KREBSZELLEN (PROTOKOLL 1)
Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in MCF-7-Zellen
Steroidsulfataseaktivität wird in vitro unter Verwendung intakter humaner MCF-7-Brustkrebszellen gemessen. Diese hormonabhängige Zellinie wird umfangreich zur Untersuchung der Kontrolle des Wachstums von menschlichen Brustkrebszellen verwendet. Sie besitzt erhebliche Steroidsulfataseaktivität (Maclndoe et al. Endocrinology, 123, 1281–1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901–905 (1992)) und ist in den USA von der American Type Culture Collection (ATCC) und in Großbritannien (z.B. von The Imperial Cancer Research Fund) erhältlich.
Die Zellen werden in minimalem essentiellem Medium (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Schottland) gehalten, welches 20 mM HEPES, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren und 0,075% Natriumbicarbonat enthält. Bis zu 30 Replikate von 25 cm² Gewebekulturflaschen werden mit etwa 1 × 10⁵ Zellen/Flasche unter Verwendung des oben genannten Mediums besät. Die Zellen werden bis zu 80% Konfluenz gezüchtet, und das Medium wird an jedem dritten Tag gewechselt.
Intakte Monolagen von MCF-7-Zellen in dreifachen 25 cm² Gewebekulturflaschen werden mit Earlescher ausgeglichener Salzlösung (EBSS von ICN Flow, High Wycombe, UK) gewaschen und für 3–4 Stunden bei 37°C mit 5 pmol (7 × 10⁵ dpm) [6,7-3H]-Östron-3-sulfat (spezifische Aktivität von 60 Ci/mmol von New England Nuclear, Boston, Mass., USA) in serumfreiem MEM (2,5 ml) zusammen mit Östron-3-sulfamat (11 Konzentrationen: 0,1 fM, 0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 0,01 mM, 0,1 mM, 1 mM) inkubiert. Nach der Inkubation wird jede Flasche gekühlt, und das Medium (1 ml) wird in separate Röhrchen pipettiert, die [14C]-Östron (7 × 10³ dpm) (spezifische Aktivität von 97 Ci/mmol von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, UK) enthalten. Das Gemisch wird sorgfältig für 30 Sekunden mit Toluol (5 ml) geschüttelt. Experimente haben gezeigt, daß > 90% [14C]-Östron und < 0,1% [3H]-Östron-3-sulfamat durch diese Behandlung aus der wäßrigen Phase entfernt werden. Ein Teil (2 ml) der organischen Phase wird abgenommen, eingedampft und der 3H- und 14C-Gehalt des Rückstandes durch Szintillationsspektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-sulfat wurde anhand der erhaltenen 3H-Zähler (korrigiert hinsichtlich der Volumina des verwendeten Mediums und der verwendeten organischen Phase und hinsichtlich Gewinnung von zugegebenem [14C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrats berechnet. Jeder Ansatz von Experimenten umfaßt Inkubationen von Mikrosomen, die aus einer bezüglich Sulfatase positiven, menschlichen Plazenta (Positivkontrolle) hergestellt wurden, und Flaschen ohne Zellen (zur Untersuchung der auftretenden nicht-enzymatischen Hydrolyse des Substrates). Die Anzahl von Zellkernen pro Flasche wird unter Verwendung eines Coulter-Zählers nach Behandlung der Zellmonolagen mit Zaponin bestimmt. Eine Flasche in jedem Ansatz wird dazu verwendet, den Zellmembranstatus und die Lebensfähigkeit unter Anwendung des Trypan-Blau-Ausschlußverfahrens zu untersuchen (Philips, H. J. (1973) In: Tissue culture and applications [Hrsg.: Kruse, D. F. & Patterson, M. K.]; S. 406–408; Academic Press, New York).
Die Ergebnisse für Steroidsulfataseaktivität sind als der Mittelwert ±1 SD von dem gesamten während der Inkubationsdauer (20 Stunden) gebildeten Produkt (Östron + Östradiol) ausgedrückt, berechnet für 106 Zellen und für Werte, die statistische Signifikanz zeigen, als ein Prozentsatz der Reduktion (Hemmung) gegenüber Inkubationen, die kein Östron-3-sulfamat enthalten. Der ungepaarte Student T-Test wurde dazu verwendet, die statistische Signifikanz von Ergebnissen zu testen.
TEST ZUR BESTIMMUNG VON STS-AKTIVITÄT UNTER VERWENDUNG VON PLAZENTAMIKROSOMEN (PROTOKOLL 2)
Hemmung von Steroidsulfataseaktivität in Plazentamikrosomen
Hinsichtlich Sulfatase positive menschliche Plazenta von zeitlich normal verlaufenden Schwangerschaften werden mit Scheren zerkleinert und einmal mit kaltem Phosphatpuffer (pH 7,4, 50 mM) gewaschen und anschließend in kaltem Phosphatpuffer erneut suspendiert (5 ml/g Gewebe). Eine Homogenisierung wird mit einem Ultra-Turrax-Homogenisierer unter Anwendung von drei 10- sekündigen Stößen, unterbrochen von 2-minütigen Kühlperioden in Eis, erreicht. Kerne und Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (4°C) bei 2000 g für 30 Minuten entfernt, und Anteile (2 ml) des Überstandes werden bei 20°C gelagert. Die Proteinkonzentration der Überstände wird nach dem Verfahren von Bradford bestimmt (Anal. Biochem., 72, 248–254 (1976)).
Inkubationen (1 ml) werden unter Verwendung einer Proteinkonzentration von 100 mg/ml, einer Substratkonzentration von 20 mM [6,7-3H]-Östron-3-sulfat (spezifische Aktivität von 60 Ci/mmol von New England Nuclear, Boston, Mass., USA) und bei einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Wenn es notwendig ist, werden acht Konzentrationen von Verbindungen verwendet: 0 (d.h. Kontrolle), 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM, 1,0 mM. Nach der Inkubation wird jede Probe gekühlt, und das Medium (1 ml) wurde in separate Röhrchen pipettiert, die [14C]-Östron (7 × 10³ dpm) (spezifische Aktivität von 97 Ci/mmol von Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, UK) enthielten. Das Gemisch wird sorgfältig für 30 Sekunden mit Toluol (5 ml) geschüttet. Die Experimente haben gezeigt, daß > 90% [14C]-Östron und < 0,1% [3H]-Östron-3-sulfat durch diese Behandlung aus der wäßrigen Phase entfernt werden. Ein Anteil (2 ml) der organischen Phase wurde abgenommen, eingedampft und der 3H- und 14C-Gehalt des Rückstandes durch Szintillationsspektrometrie bestimmt. Die Masse an hydrolysiertem Östron-3-sulfat wird anhand der erhaltenen 3H-Zähler (korrigiert hinsichtlich der Volumina des verwendeten Mediums und der verwendeten organischen Phase und hinsichtlich Gewinnung von zugegebenem [14C]-Östron) und der spezifischen Aktivität des Substrates berechnet.
TIERTESTMODELL ZUR BESTIMMUNG VON STS-AKTIVITÄT (PROTOKOLL 3)
Hemmung von Östronsulfataseaktivität in vivo
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Tiermodells, insbesondere in Ratten, denen die Eierstöcke operativ entfernt wurden, untersucht werden. In diesem Modell stimulieren Verbindungen, die östrogenartig sind, das Gebärmutterwachstum.
Die Verbindung (0,1 mg/kg/Tag für 5 Tage) wird den Ratten oral verabreicht, wobei eine weitere Gruppe von Tieren nur Träger (Propylenglycol) erhalten. Am Ende der Studie wurden Proben von Lebergewebe erhalten und die Östronsulfataseaktivität unter Verwendung von 3H-Östronsulfat als das Substrat untersucht, wie es zuvor beschrieben wurde (siehe PCT/GB95/02638).
TIERTESTMODELL ZUR BESTIMMUNG VON ÖSTROGENAKTIVITÄT (PROTOKOLL 4)
Fehlen von Östrogenität in vivo
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines Tiermodells, insbesondere in Ratten, denen die Eierstöcke operativ entfernt wurden, untersucht werden. In diesem Modell stimulieren Verbindungen, die östrogenartig sind, das Gebärmutterwachstum.
Die Verbindung (0,1 mg/kg/Tag für 5 Tage) wurde den Ratten oral verabreicht, wobei eine weitere Gruppe von Tieren nur Träger (Propylenglycol) erhielt. Am Ende der Studie wurden die Gebärmuttern erhalten und gewogen, wobei die Ergebnisse als Gebärmuttergewicht/Gesamtkörpergewicht × 100 ausgedrückt werden.
Verbindungen, die keine signifikante Wirkung auf das Gebärmutterwachstum besitzen, sind nicht östrogen.
THERAPIE
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Mittel, d.h. in Therapieanwendungen, eingesetzt werden.
Der Begriff "Therapie" umfaßt heilende Wirkungen, lindernde Wirkungen und prophylaktische Wirkungen.
Die Therapie kann an Menschen oder Tieren, vorzugsweise an weiblichen Tieren, durchgeführt werden.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und optional einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Bindemittel (einschließlich Kombinationen davon) enthält.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können für eine Anwendung beim Menschen oder Tier in der Human- und Veterinärmedizin vorgesehen sein und werden typischerweise eines oder mehrere von einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Bindemittel umfassen. Geeignete Träger oder Verdünnungsmittel für eine therapeutische Verwendung sind auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannt und beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro Aufl. 1985) beschrieben. Die Wahl des pharmazeutischen Trägers, Bindemittels oder Verdünnungsmittels kann hinsichtlich des beabsichtigten Verabreichungsweges und gemäß pharmazeutischer Standardpraxis erfolgen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als oder zusätzlich zu dem Träger, Bindemittel oder Verdünnungsmittel jegliche geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Beschichtungsmittel und Lösungsverbesserer enthalten.
Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und sogar Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorgesehen sein. Beispiele für Konservierungsmittel umfassen Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure. Antioxidantien und Suspendiermittel können ebenfalls verwendet werden.
In Abhängigkeit von den verschiedenen Auslieferungssystemen kann es verschiedene Anforderungen an die Zusammensetzung/Formulierung geben. Zum Beispiel kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für eine Verabreichung unter Verwendung einer Minipumpe oder über einen Schleimhautweg, z.B. als ein Nasenspray oder Aerosol für die Inhalation oder eine aufnehmbare Lösung, oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injizierbaren Form für die Verabreichung über z.B. einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert ist, formuliert sein. Alternativ kann die Formulierung so ausgelegt sein, daß sie über beide Wege verabreicht werden kann.
Wenn das Mittel mukosal durch die Magen-Darm-Schleimhaut verabreicht werden soll, sollte es in der Lage sein, während des Durchgangs durch den Magen-Darm-Trakt stabil zu bleiben; z.B. sollte es beständig gegen proteolytischen Abbau, stabil bei saurem pH-Wert und beständig gegen die Detergenswirkungen von Galle sein.
Wenn es geeignet ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in der Form eines Suppositoriums oder Pessars, topisch in der Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Staubpuders unter Verwendung eines Hautpflasters, oral in der Form von Tabletten, die Bindemittel, wie beispielsweise Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovula entweder alleine oder im Gemisch mit Bindemitteln oder in der Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Geschmacks- oder Farbstoffe enthalten, verabreicht werden, oder sie können parenteral, z.B. intravenös, intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Für eine parenterale Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in der Form einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet werden, die andere Substanzen enthalten können, z.B. genügend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung isotonisch zu Blut zu machen. Für eine bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in der Form von Tabletten oder Pastillen verabreicht werden, die in einer herkömmlichen Art und Weise formuliert sein können.
KOMBINATIONSARZNEIMITTEL
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit einem oder mehreren anderen aktiven Mitteln, wie beispielsweise einem oder mehreren anderen pharmazeutisch aktiven Mitteln, verwendet werden.
Zum Beispiel können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen STS-Inhibitoren und/oder anderen Inhibitoren, wie beispielsweise einem Aromataseinhibitor (wie beispielsweise 4-Hydroxyandrostendion (4-OHA)), und/oder Steroiden, wie beispielsweise den natürlich vorkommenden Sterneurosteroiden Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) und Pregnenolonsulfat (PS), und/oder anderen strukturell ähnlichen organischen Verbindungen verwendet werden.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem Modifizierer für die biologische Antwort verwendet werden.
Der Begriff Modifizierer für die biologische Antwort ("BRM") umfaßt Zytokine, Immunmodulatoren, Wachstumsfaktoren, Hämatopoese regulierende Faktoren, koloniestimulierende Faktoren, chemotaktische, hämolytische und thrombolytische Faktoren, Zelloberflächenrezeptoren, Liganden, Leukozytenadhäsionsmoleküle, monoklonale Antikörper, präventive und therapeutische Impfstoffe, Hormone, Komponenten der extrazellulären Matrix, Fibronektin etc. Für einige Anwendungen ist der Modifizierer der biologischen Antwort vorzugsweise ein Zytokin. Beispiele für Zytokine umfassen Interleukine (IL), wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19, Tumornekrosefaktor (TNF), wie beispielsweise TNF-α, Interferon alpha, beta und gamma, TGF-β. Für einige Anwendungen ist das Zytokin vorzugsweise Tumornekrosefaktor (TNF). Für einige Anwendungen kann der TNF jede Art von TNF sein, wie beispielsweise TNF-α, TNF-β, einschließlich Derivaten oder Gemischen davon. Bevorzugter ist das Zytokin TNF-α. Lehren hinsichtlich TNF kann man auf dem Gebiet finden, wie beispielsweise in der WO-A-98/08870 und der WO-A-98/13348.
VERABREICHUNG
Typischerweise wird ein Arzt die tatsächliche Dosierung, die für ein individuelles Subjekt am geeignetsten sein wird, bestimmen, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und dem Ansprechen des jeweiligen Patienten variieren. Die nachfolgenden Dosierungen sind beispielhaft für den Durchschnittsfall. Es kann natürlich individuelle Fälle geben, bei denen höheren oder geringeren Dosierungsbereichen der Vorzug gegeben wird.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für parenterale, mukosale, intramuskuläre, intravenöse, sub kutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert sein. Abhängig vom Bedarf kann das Mittel in einer Dosis von 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht, wie beispielsweise von 0,1 bis 10 mg/kg, bevorzugter von 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht, verabreicht werden.
Weiter beispielhaft können die Mittel der vorliegenden Erfindung gemäß einer Vorschrift von 1- bis 4-mal pro Tag, vorzugsweise ein- oder zweimal pro Tag, verabreicht werden. Die spezielle Dosismenge und die Häufigkeit der Dosierung für einen jeweiligen Patienten kann variiert werden und wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der verwendeten speziellen Verbindung, der Stoffwechselstabilität und der Dauer der Wirkung dieser Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, der Nahrung, dem Modus und der Zeit der Verabreichung, der Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Wirkstoffkombination, der Schwere des jeweiligen Zustands und dem Wirt, welcher der Therapie unterzogen wird.
Neben den typischen Verabreichungsmodi, wie sie oben angegeben sind, umfaßt der Begriff "verabreicht" auch eine Verabreichung durch Techniken, wie beispielsweise lipidvermittelte Transfektion, Liposome, Immunliposome, Lipofektin, kationische Gesichtsamphiphile (CFA) und Kombinationen davon. Die Wege für solche Verabreichungsmechanismen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf mukosale, nasale, orale, parenterale, gastrointestinale, topische oder sublinguale Wege.
Der Begriff "verabreicht" umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf Verabreichung über einen Schleimhautweg, z.B. als ein Nasenspray oder ein Aerosol für die Inhalation oder als eine aufnehmbare Lösung, einen parenteralen Weg, bei dem die Verabreichung mittels einer injizierbaren Form erfolgt, wie beispielsweise über einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg.
Somit können die STS-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung für eine pharmazeutische Verabreichung in jeder geeigneten Art und Weise unter Verwendung herkömmlicher pharmazeutischer Formulierungstechniken und pharmazeutischer Träger, Hilfsmittel, Bindemittel, Verdünnungsmittel etc. und üblicherweise für eine parenterale Verabreichung formuliert sein. Ungefähre effektive Dosisraten können im Bereich von 1 bis 1000 mg/Tag, wie beispielsweise von 10 bis 900 mg/Tag oder gar von 100 bis 800 mg/Tag, in Abhängigkeit von den individuellen Aktivitäten der jeweiligen Verbindungen und für einen Patienten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht (70 kg) liegen. Üblichere Dosisraten für die bevorzugten und aktiveren Verbindungen werden im Bereich von 200 bis 800 mg/Tag, bevorzugter 200 bis 500 mg/Tag, besonders bevorzugt von 200 bis 250 mg/Tag liegen. Sie können in Einzeldosierungsvorschriften, aufgeteilten Dosierungsvorschriften und/oder mehreren Dosierungsvorschriften, die über mehrere Tage andauern, gegeben werden. Für eine orale Verabreichung können sie in Tabletten, Kapseln, Lösung oder Suspension, die von 100 bis 500 mg Verbindung pro Dosierungseinheit enthalten, verabreicht werden. Alternativ und bevorzugt werden die Verbindungen für eine parenterale Verabreichung in einem geeigneten parenteral verabreichbaren Träger formuliert und in einzelnen täglichen Dosierungsraten im Bereich von 200 bis 800 mg, vor zugsweise 200 bis 500 mg, besonders bevorzugt 200 bis 250 mg gegeben. Diese effektiven täglichen Dosierungen werden jedoch in Abhängigkeit von der dem aktiven Bestandteil innewohnenden Aktivität und von dem Körpergewicht des Patienten variieren, wobei solche Variationen innerhalb des Fachwissens und der Beurteilung des Arztes liegen.
ZELLZYKLUS
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können für ein Verfahren zur Behandlung einer Zellzyklusstörung geeignet sein.
Wie es in "Molecular Cell Biology", 3. Aufl., Lodish et al., Seiten 177–181, diskutiert wird, können verschiedene eukaryontische Zellen mit ziemlich unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen und sich teilen. Hefezellen können sich z.B. alle 120 Minuten teilen, und die ersten Teilungen von befruchteten Eiern zu den embryonalen Zellen von Seeigeln und Insekten dauern nur 1530 Minuten, weil eine große vorhandene Zelle aufgeteilt wird. Jedoch benötigen die meisten wachsenden Pflanzen- und Tierzellen 10 bis 20 Stunden, um ihre Anzahl zu verdoppeln, und einige verdoppeln sich mit einer viel langsameren Geschwindigkeit. Viele Zellen in Erwachsenen, wie beispielsweise Nervenzellen und gestreifte Muskelzellen, teilen sich überhaupt nicht; andere, wie die Fibroblasten, die die Heilung von Wunden unterstützen, wachsen auf Anforderung, sind aber ansonsten ruhend.
Dennoch muß jede eukaryontische Zelle, die sich teilt, bereit sein, gleiches genetisches Material an zwei Tochterzellen zu übergeben. DNA-Synthese in Eukaryonten findet nicht während des gesamten Zellteilungszyklus statt, sondern ist auf einen Teil davon vor der Zellteilung beschränkt.
Das Verhältnis zwischen eukaryontischer DNA-Synthese und Zellteilung wurde in Kulturen von Säugerzellen, die alle zu Wachstum und Teilung in der Lage waren, sorgfältig analysiert. Im Gegensatz zu Bakterien wurde herausgefunden, daß eukaryontische Zellen nur einen Teil ihrer Zeit mit DNA-Synthese verbringen, und diese wird Stunden vor der Zellteilung (Mitose) abgeschlossen. Somit tritt eine zeitliche Lücke nach der DNA-Synthese und vor der Zellteilung auf; eine weitere Lücke wurde nach der Teilung und vor der nächsten Runde der DNA-Synthese gefunden. Diese Analyse führte zu der Schlußfolgerung, daß der eukaryontische Zellzyklus aus einer M-(mitotischen)Phase, einer G₁-Phase (der ersten Lücke), der S-(DNA-Synthese-)Phase, einer G₂-Phase (der zweiten Lücke) und zurück zu M besteht. Die Phasen zwischen Mitosen (G₁, S und G₂) sind gemeinsam als die Interphase bekannt.
Viele sich nicht teilende Zellen in Geweben (z.B. alle ruhenden Fibroblasten) unterbrechen den Zyklus nach der Mitose und unmittelbar vor der DNA-Synthese; man sagt, daß solche "ruhenden" Zellen den Zellzyklus verlassen haben und sich in dem G₀-Zustand befinden.
Es ist möglich, Zellen zu identifizieren, wenn sie sich in einer der drei Interphasestadien des Zellzyklus befinden, indem man einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) verwendet, um ihren relativen DNA-Gehalt zu messen: eine Zelle, die sich in G₁ befindet (vor der DNA-Synthese), besitzt eine definierte Menge x an DNA, während S (DNA-Replikation) besitzt sie zwischen x und 2x, und wenn sie sich in G₂ (oder M) befindet, hat sie 2x DNA.
Die Stadien der Mitose und Zytokinese in einer Tierzelle sind die folgenden:
(a) Interphase.
Das G₂-Stadium der Interphase geht dem Beginn der Mitose unmittelbar voran. Während der S-Phase wurde chromosomale DNA repliziert und an Protein gebunden, aber man sieht die Chromosome noch nicht als unterscheidbare Strukturen. Der Nukleolus ist die einzige Kernunterstruktur, die unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist. In einer diploiden Zelle vor der DNA-Replikation gibt es zwei morphologische Chromosome von jedem Typ, und man sagt, daß die Zelle 2n ist. In G₂ nach der DNA-Replikation ist die Zelle 4n. Es gibt vier Kopien von jeder chromosomalen DNA. Da die Schwesterchromosome noch nicht voneinander getrennt wurden, werden sie als Schwesterchromatide bezeichnet.
(b) Frühe Prophase.
Zentriole, jedes mit einem neu gebildeten Tochterzentriol, beginnen damit, sich in Richtung entgegengesetzter Pole der Zelle zu bewegen; die Chromosome kann man als lange Fäden sehen. Die Kernmembran beginnt sich in kleine Vesikel aufzulösen.
(c) Mittlere und späte Prophase.
Die Chromosomenkondensation ist abgeschlossen; jede sichtbare Chromosomenstruktur besteht aus zwei Chromatiden, die an ihren Zentromeren zusammengehalten werden. Jedes Chromatid enthält eines der zwei neu replizierten Tochter-DNA-Moleküle. Die mikrotubuläre Spindel beginnt, strahlenförmig von den Bereichen in der Nähe der Zentriole, die sich näher zu ihren Polen hin bewegen, wegzuführen. Einige Spindelfasern reichen von Pol zu Pol; die meisten gehen zu Chromatiden und haften an Kinetochoren.
(d) Metaphase.
Die Chromosome bewegen sich in Richtung des Äquators der Zelle, wo sie in der äquatorialen Ebene ausgerichtet werden. Die Schwesterchromatide haben sich noch nicht getrennt.
(e) Anaphase.
Die zwei Schwesterchromatide trennen sich zu unabhängigen Chromosomen. Jedes enthält ein Zentromer, das über eine Spindelfaser mit einem Pol, zu dem es sich bewegt, verknüpft ist. Somit wird eine Kopie von jedem Chromosom an jede Tochterzelle gegeben. Gleichzeitig verlängert sich die Zelle, wie auch die Spindeln von Pol zu Pol. Die Zytokinese beginnt, wenn sich die Spaltfurche auszubilden beginnt.
(f) Telophase.
Neue Membrane bilden sich um die Tochterkerne herum; die Chromosome entwinden sich und werden weniger deutlich, der Nukleolus wird wieder sichtbar, und die Kernmembran bildet sich um jeden Tochterkern herum. Die Zytokinese ist nahezu abgeschlossen, und die Spindel verschwindet, während die Mikrotubuli und andere Fasern depolymerisieren. Während der ganzen Mitose wächst die "Tochter"zentriole an jedem Pol, bis sie volle Länge besitzt. In der Telophase wird die Verdoppelung jeder der ursprünglichen Zentriolen abgeschlossen, und neue Tochterzentriolen werden während der nächsten Interphase erzeugt.
(g) Interphase.
Nach dem Abschluß der Zytokinese tritt die Zelle in die G₁-Phase des Zellzyklus ein und läuft wieder durch den Zyklus.
Es ist klar, daß der Zellzyklus ein äußerst wichtiger Zellvorgang ist. Abweichungen vom normalen Zellzyklus können zu einer Vielzahl medizinischer Störungen führen. Verstärkter und/oder unbeschränkter Zellzyklus kann zu Krebs führen. Verminderter Zellzyklus kann zu degenerativen Zuständen führen. Die Verwendung der Verbindung der vorliegenden Erfindung kann ein Mittel zur Behandlung solcher Störungen und Zustände bereitstellen.
Somit kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung für eine Verwendung in der Behandlung von Zellzyklusstörungen, wie beispielsweise Krebsarten, einschließlich hormonabhängiger und hormonunabhängiger Krebsarten, geeignet sein.
Darüber hinaus kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Krebsarten, wie beispielsweise Brustkrebs, Eierstockkrebs, Gebärmutterschleimhautkrebs, Sarkomen, Melanomen, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs etc. und anderen festen Tumoren, geeignet sein.
Für einige Anwendungen wird der Zellzyklus gehemmt und/oder verhindert und/oder arretiert, wobei der Zellzyklus vorzugsweise verhindert und/oder arretiert wird. In einem Aspekt kann der Zellzyklus in der G₂/M-Phase gehemmt und/oder verhindert und/oder arretiert werden. In einem Aspekt kann der Zellzyklus irreversibel verhindert und/oder gehemmt und/oder arretiert werden, wobei der Zellzyklus vorzugsweise irreversibel verhindert und/oder arretiert wird.
Der Begriff "irreversibel verhindert und/oder gehemmt und/oder arretiert" bedeutet nach Anwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, daß nach Entfernung der Verbindung die Wirkungen der Verbindung, nämlich Verhinderung und/oder Hemmung und/oder Arretierung des Zellzyklus, nach wie vor beobachtbar sind. Insbesondere bedeutet der Begriff "irreversibel verhindert und/oder gehemmt und/oder arretiert", daß mit einer interessierenden Verbindung behandelte Zellen, wenn sie gemäß dem hierin angegebenen Zellzyklustestprotokoll untersucht werden, weniger Wachstum nach dem Stadium 2 des Protokolls I als Kontrollzellen zeigen. Details über dieses Protokoll sind unten angegeben.
Somit liefert die vorliegende Erfindung Verbindungen, welche eine Hemmung des Wachstums von bezüglich Östrogenrezeptor positiven (ER+) und ER negativen (ER–) Brustkrebszellen in vitro durch Verhinderung und/oder Hemmung und/oder Arretierung des Zellzyklus verursachen und/oder einen Rückgang von durch Nitrosomethylharnstoff (NMU) induzierte Brusttumore in intakten Tieren (d.h. solchen, denen die Eierstöcke nicht operativ entfernt wurden) verursachen und/oder Zellzyklus in Krebszellen verhindern und/oder hemmen und/oder arretieren und/oder in vivo durch Verhinderung und/oder Hemmung und/oder Arretierung des Zellzyklus wirken und/oder als ein Zellzyklusagonist wirken.
ZELLZYKLUSTEST (PROTOKOLL 5)
Verfahren
Stufe 1
MCF-7-Brustkrebszellen werden in Multiwell-Kulturplatten mit einer Dichte von 10⁵ Zellen/Well ausgesät. Die Zellen werden anhaften und bis zu etwa 30% Konfluenz wachsen gelassen, woraufhin sie wie folgt behandelt werden:
Kontrolle – keine Behandlung
Interessierende Verbindung (COI) 20 μM
Die Zellen werden für 6 Tage in Wachstumsmedium, welches die COI enthält, gezüchtet mit einem Wechsel des Mediums/COI alle 3 Tage. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellzahlen unter Verwendung eines Coulter-Zellzählers gezählt.
Stufe 2
Nach der Behandlung von Zellen für einen Zeitraum von 6 Tagen mit der COI werden die Zellen erneut mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/Well ausgesät. Es werden keine weiteren Behandlungsmittel hinzugefügt. Die Zellen werden für weitere 6 Tage in der Gegenwart von Wachstumsmedium weiter wachsen gelassen. Am Ende dieses Zeitraums werden die Zellzahlen erneut gezählt.
KREBS
Wie es angegeben wurde, können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung einer Zellzyklusstörung nützlich sein. Eine spezielle Zellzyklusstörung ist Krebs.
Krebs bleibt eine Hauptursache für die Sterblichkeit in den meisten westlichen Ländern. Bislang entwickelte Krebstherapien haben eine Blockierung der Wirkung oder Synthese von Hormonen zur Hemmung des Wachstums von hormonabhängigen Tumoren einbezogen. Jedoch wird derzeit eine aggressivere Chemotherapie für die Behandlung von hormonabhängigen Tumoren verwendet.
Daher würde die Entwicklung eines Arzneimittels für eine Anti-Krebsbehandlung von hormonabhängigen und/oder hormonunabhängigen Tumoren, das einige oder alle der mit Chemotherapie einhergehenden Nebenwirkungen nicht aufweist, einen großen therapeutischen Fortschritt darstellen.
Es ist bekannt, daß Östrogene nach ihrer Synthese einer Anzahl von Hydroxylierungs- und Konjugationsreaktionen unterzogen werden. Bis vor kurzem wurde angenommen, daß diese Reaktionen Teil eines Stoffwechselprozesses sind, der Östrogene endgültig wasserlöslich macht und ihre Eliminierung aus dem Körper verbessert. Es ist nun klar, daß einige Hydroxymetaboliten (z.B. 2-Hydroxy und 16-Alpha-Hydroxy) und Konjugate (z.B. Östronsulfat, E1S) zur Bestimmung einiger der komplexen Wirkungen, die Östrogene im Körper haben, wichtig sind.
Arbeiter haben die Bildung von 2- und 16-hydroxylierten Östrogenen in Bezug auf Zustände, die das Risiko von Brustkrebs verändern, untersucht. Es gibt nun Hinweise darauf, daß Faktoren, welche die 2-Hydroxylaseaktivität verstärken, mit einem verminderten Krebsrisiko einhergehen, während solche, die die 16-Alpha-Hydroxylierung verstärken, das Risiko von Brustkrebs erhöhen können. Weiteres Interesse an der biologischen Rolle von Östrogenmetaboliten wurde durch die zunehmenden Anzeichen angeregt, daß 2-Methoxyöstradiol ein endogener Metabolit mit antimitotischen Eigenschaften ist. 2-MeOE2 wird aus 2-Hydroxyöstradiol (2-OHE2) durch Catecholöstrogenmethyltransferase, einem Enzym, das im ganzen Körper weit verbreitet ist, gebildet wird.
Arbeiter haben gezeigt, daß 2-MeOE2 in vivo das Wachstum von Tumoren, die aus der subkutanen Injektion von Meth A-Sarkom, B16-Melanom oder bezüglich MDA-MB-435-Östrogenrezeptor negativen (ER-) Brustkrebszellen hervorgehen, hemmt. Es hemmt auch die Endothelzellproliferation und -migration und die Angiogenese in vitro. Es wurde vorgeschlagen, daß die Fähigkeit von 2-MeOE2, Tumorwachstum in vivo zu hemmen, eher auf dessen Fähigkeit, tumorinduzierte Angiogenese zu hemmen, als auf eine direkte Hemmung der Proliferation von Tumorzellen zurückzuführen sein kann.
Der Mechanismus, mit dem 2-MeOE2 seine potenten antimitogenen und antiangiogenen Wirkungen ausübt, wird nach wie vor untersucht. Es gibt Nachweise dafür, daß es bei hohen Konzentrationen die Mikrotubulipolymerisation hemmen und als ein schwacher Inhibitor von Colchicinbindung an Tubulin wirken kann. Kürzlich wurde jedoch gefunden, daß Tubulinfilamente in Zellen bei Konzentrationen, die Mitose blockieren, nicht depolymerisiert waren, sondern eine identische Morphologie hatten wie diejenige, die man nach Taxolbehandlung sieht. Es ist daher möglich, daß 2-MeOE2 wie Taxol, ein Arzneimittel, das für die Brust- und Eierstockkrebstherapie eingesetzt wird, durch Stabilisierung der Mikrotubulidynamik wirkt.
Obwohl die Identifizierung von 2-MeOE2 als eine neue Therapie bei Krebs einen wichtigen Fortschritt darstellt, ist die Bioverfügbarkeit von oral verabreichten Östrogenen gering. Darüber hinaus können sie während ihres ersten Durchtritts durch die Leber ausgiebigem Stoffwechsel unterworfen sein. Als Teil eines Forschungsprogramms zur Entwicklung eines Steroidsulfataseinhibitors für die Brustkrebstherapie wurde Östron-3-O-sulfamat (EMATE) als ein potenter, aktiver, ortsgerichteter Inhibitor identifiziert. Unerwarteterweise zeigte EMATE, daß es potente Östrogeneigenschaften mit seiner oralen, auf den Uterus wirkenden Aktivität in Ratten, die 100-mal höher war als diejenige von Östradiol, besitzt. Von seiner erhöhten Östrogenität wird angenommen, daß es von seiner Absorption durch rote Blutzellen (rbcs) herrührt, die es während seines Durchtritts durch die Leber vor Inaktivierung schützt und die als ein Reservoir für seine langsame Freisetzung für einen längeren Zeitraum wirkt. Eine Anzahl von am A-Ring modifizierten Analogen wurde synthetisiert und getestet, einschließlich 2-Methoxyöstron-3-O-sulfamat. Obwohl diese Verbindung als ein Steroidsulfataseinhibitor gleich stark wie EMATE war, besaß es keine Östrogenität.
Wir nehmen an, daß die Verbindung der vorliegenden Erfindung ein Mittel für die Behandlung von Krebsarten und insbesondere Brustkrebs bereitstellt.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung beim Blockieren des Wachstums von Krebsarten, einschließlich Leukämien und festen Tumoren, wie beispielsweise Brust-, Endometrium-, Prostata-, Eierstock- und Pankreastumoren, nützlich sein.
THERAPIE BEZÜGLICH ÖSTROGEN
Wir nehmen an, daß einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Kontrolle von Östrogenmengen im Körper, insbesondere bei Frauen, geeignet sein können. Somit können einige der Verbindungen zur Bereitstellung eines Mittels zur Fruchtbarkeitskontrolle geeignet sein, wie beispielsweise als eine orale empfängnisverhütende Tablette, Pille, Lösung oder Pastille. Alternativ könnte die Verbindung in der Form eines Implantats oder als ein Pflaster vorliegen.
Somit können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung für eine Behandlung von mit Östrogen in Verbindung stehenden hormonellen Zuständen geeignet sein.
Darüber hinaus oder alternativ kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung bei einer Behandlung von hormonellen Zuständen zusätzlich zu solchen, die mit Östrogen in Verbindung stehen, geeignet sein. Daher kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung auch zur Beeinflussung von Hormonaktivität und zur Beeinflussung einer Immunantwort in der Lage sein.
NEURODEGENERATIVE KRANKHEITEN
Wir nehmen an, daß einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten und ähnlichen Zuständen geeignet sein können.
Zum Beispiel wird angenommen, daß STS-Inhibitoren bei der Verbesserung der Gedächtnisfunktion von Patienten, die unter Krankheiten leiden, wie beispielsweise Amnesie, Kopfverletzungen, Alzheimer'scher Krankheit, epileptischer Demenz, präseniler Demenz, posttraumatischer Demenz, seniler Demenz, vaskulärer Demenz und Demenz nach Schlaganfall, oder von Individuen, die aus anderen Gründen eine Gedächtnisverbesserung anstreben, geeignet sein.
TH1
Wir nehmen an, daß einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei Implikationen von TH1 geeignet sein können.
Zum Beispiel wird angenommen, daß die Gegenwart von STS-Inhibitoren im Makrophagen oder anderen Antigen-präsentierenden Zellen zu einer verminderten Fähigkeit von sensibilisierten T-Zellen, eine TH1-Antwort (viel IL-2, IFN?, wenig IL-4) bereitzustellen, führen kann. Der normale regulatorische Einfluß anderer Steroide, wie beispielsweise Glucocorticoiden, würde daher überwiegen.
ENTZÜNDUNGSZUSTÄNDE
Wir nehmen an, daß einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei einer Behandlung von Entzündungszuständen geeignet sein können, wie beispielsweise Zuständen, die mit einem oder mehreren der folgenden einhergehen: Autoimmunität, einschließlich z.B. rheumatoider Arthritis, Typ I- und -II-Diabetes, systemischem Lupus erythematosus, Multipler Sklerose, Myasthenia gravis, Thyroiditis, Vasculitis, ulzerativer Colitis und Morbus Crohn, Hautkrankheiten, z.B. Psoriasis und Kontaktdermatitis, Transplantat-versus-Wirt-Krankheit, Ekzem, Asthma und Organabstoßung nach Transplantation.
Zum Beispiel wird angenommen, daß STS-Inhibitoren die normale physiologische Wirkung von DHEA oder verwandten Steroiden auf Immun- und/oder Entzündungsreaktionen verhindern können.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung eines Medikaments zur Aufdeckung eines endogenen, glucocorticoidartigen Effekts geeignet sein.
ANDERE THERAPIEN
Es sollte auch klar sein, daß die Verbindung/Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch andere wichtige medizinische Anwendungen haben kann.
Zum Beispiel kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung der in der WO-A-99/52890 aufgeführten Krankheiten geeignet sein.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung der in der WO-A-98/05635 aufgeführten Krankheiten geeignet sein. Zur Vereinfachung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Auflistung nun angegeben: Krebs, Entzündung oder Entzündungskrankheit, dermatologische Störungen, Fieber, kardiovaskuläre Effekte, Blutung, Gerinnungs- und Akutphasenreaktion, Kachexie, Anorexie, akute Infektion, HIV-Infektion, Schockzustände, Transplantat-versus-Wirt-Reaktionen, Autoimmunerkrankung, Reperfusionsverletzung, Meningitis, migräne- und aspirinabhängige Anti-Thrombose; Tumorwachstum, -invasion und -ausbreitung, Angiogenese, Metastasen, maligne, Aszites- und maligner Pleuraerguß; Hirnischämie, ischämische Herzkrankheit, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoporose, Asthma, Multiple Sklerose, Neurodegeneration, Alzheimer'sche Krankheit, Atherosklerose, Schlaganfall, Vaskulitis, Morbus Crohn und ulzerative Colitis; Periodontitis, Gingivitis; Psoriasis, atopische Dermatitis, chronische Geschwüre, Epidermolysis bullosa; Hornhautulzeration, Retinopathie und Operationswundenheilung; Rhinitis, allergische Konjunktivitis, Ekzem, Anaphylaxie; Restenose, kongestives Herzversagen, Endometriose, Atherosklerose oder Endosklerose.
Zusätzlich oder alternativ kann die Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung der in der WO-A-98/07859 aufgeführten Krankheiten sein. Zur Vereinfachung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Auflistung nun angegeben: Zytokin- und Zellproliferations-/differenzierungsaktivität, immunosuppressive oder immunstimulierende Aktivität (z.B. zur Behandlung von Immuninsuffizienz, einschließlich Infektion mit menschlichem Immunschwächevirus; Regulierung von Lymphozytenwachstum; Behandlung von Krebs und vielen Autoimmunerkrankungen und zur Verhinderung von Transplantatabstoßung oder zum Induzieren von Tumorimmunität); Regulierung von Hämatopoese, z.B. Behandlung von myeloiden oder lymphoiden Erkrankungen;, Förderung des Wachstums von Knochen-, Knorpel-, Sehnen,- Bänder- und Nervengewebe, z.B. zur Hei lung von Wunden, Behandlung von Verbrennungen, Geschwüren und parodontaler Erkrankung und Neurodegeneration; Hemmung oder Aktivierung von Follikel-stimulierendem Hormon (Modulierung der Fruchtbarkeit); chemotaktische/chemokinetische Aktivität (z.B. zum Mobilisieren spezifischer Zelltypen zu verletzten oder infizierten Stellen); hämostatische und thrombolytische Aktivität (z.B. zur Behandlung von Hämophilie und Schlaganfall); entzündungshemmende Aktivität (zur Behandlung z.B. von septischem Schock oder Morbus Crohn); als antimikrobielle Mittel; Modulatoren von z.B. Stoffwechsel oder Verhalten; als Analgetika; zur Behandlung spezifischer Mangelerkrankungen; zur Behandlung von z.B. Psoriasis, in der Human- oder Veterinärmedizin.
Zusätzlich oder alternativ kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung der in der WO-A-98/09985 aufgeführten Krankheiten sein. Zur Vereinfachung der Bezugnahme wird ein Teil dieser Auflistung nun angegeben: Makrophagen-hemmende und/oder T-Zellen hemmende Aktivität und somit entzündungshemmende Aktivität; antiimmune Aktivität, d.h. inhibitorische Wirkung gegen eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort, einschließlich einer Antwort, die nicht mit Entzündung assoziiert ist; Hemmung der Fähigkeit von Makrophagen und T-Zellen, an extrazelluläre Matrixkomponenten und Fibronektin anzuhaften; sowie der nach oben ausgeglichenen fas-Rezeptorexpression in T-Zellen; zur Hemmung unerwünschter Immunreaktion und Entzündung einschließlich Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis, mit Überempfindlichkeit assoziierter Entzündung, allergischer Reaktionen, Asthma, systemischem Lupus erythematosus, Collagenkrankheiten und anderer Autoimmunerkrankungen, Entzündung, assoziiert mit Atherosklerose, Arteriosklerose, atherosklerotischer Herzkrankheit, Reperfusionsverletzung, Herzstillstand, Myokardinfarkt, vaskulären Entzündungsstörungen, Atemnotsyndrom oder anderen kardiopulmonären Erkrankungen assoziierte Entzündung, mit peptischem Geschwür, ulzerativer Colitis und anderen Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts, hepatischer Fibrose, Leberzirrhose oder anderen hepatischen Erkrankungen, Thyroiditis oder anderen glandulären Erkrankungen, Glomerulonephritis oder anderen renalen und urologischen Erkrankungen, Otitis oder anderen oto-rhino-laryngologischen Erkrankungen, Dermatitis oder anderen Hautkrankheiten, parodontalen Erkrankungen oder anderen Zahnerkrankungen, Orchitis oder Epididimo-Orchitis, Unfruchtbarkeit, orchidalem Trauma oder anderen mit dem Immunsystem in Beziehung stehenden Hodenerkrankungen, Plazentadysfunktion, Plazentainsuffizienz, habituelle Fehlgeburt, Eklampsie, Präeklampsie und andere immun- und/oder entzündungsbezogenen gynäkologischen Erkrankungen, hintere Uveitis, intermediäre Uveitis, vordere Uveitis, Konjunktivitis, Chorioretinitis, Uveoretinitis, Sehnervenentzündung, intraokuläre Entzündung, z.B. Retinitis oder zystoides Makulaödem, sympathische Ophthalmie, Skleritis, Retinitis pigmentosa, Immun- und Entzündungskomponenten von degenerativer Fondus-Erkrankung, Entzündungskomponenten von okularem Trauma, Augenentzündung, verursacht durch Infektion, proliferative Vitreo-Retinopathien, akute ischämische optische Neuropathie, übermäßige Narbenbildung, z.B. nach Glaukomfilteroperation, Immun- und/oder Entzündungsreaktion auf Augenimplantate und andere Immun- und entzündungsbezogene Augenerkrankungen, Entzündung, assoziiert mit Autoimmunerkrankungen oder Zuständen oder Störungen, bei denen sowohl im Zentralnervensystem (ZNS) oder in irgendeinem anderen Organ, Immun- und/oder Entzündungssuppression vorteilhaft wären, Parkinson'scher Krankheit, Komplikationen und/oder Nebenwirkungen bei der Behandlung von Parkinson'scher Krankheit, AIDS-bezogener Demenz, komplexer HIV-bezogener Enzephalopathie, Devicscher Krankheit, Sydenham'sche Chorea, Alzheimer'scher Krankheit und anderer degenerativer Erkrankungen, Zuständen oder Störungen des ZNS, Entzündungskomponenten von Schlaganfall, Post-Polio-Syndrom, Immun- und Entzündungskomponenten von psychischen Störungen, Myelitis, Enzephalitis, subakuter sklerosierender Panenzephalitis, Enzephalomyelitis, akuter Neuropathie, subakuter Neuropathie, chronischer Neuropathie, Guillaim-Barre-Syndrom, Huntington'scher Krankheit, Sydenham'scher Chorea, Myasthenia gravis, Pseudotumor cerebri, Down-Syndrom, Huntington'scher Krankheit, amyotrohper Lateralsklerose, Entzündungskomponenten von ZNS-Kompression oder ZNS-Trauma oder Infektionen des ZNS, Entzündungskomponenten von muskulären Atrophien und Dystrophien, und immun- und entzündungsbezogener Erkrankungen, Zustände oder Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems, posttraumatische Entzündung, septischer Schock, Infektionskrankheiten, Entzündungskomplikationen oder Nebenwirkungen von chirurgischen Eingriffen, Knochenmarktransplantation oder anderen Transplantationskomplikationen und/oder Nebenwirkungen, Entzündungs- und/oder Immunkomplikationen und Nebenwirkungen von Gentherapie, z.B. aufgrund von Infektion mit einem viralen Träger, oder mit AIDS assoziierte Entzündung, zur Unterdrückung oder Hemmung einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort, zur Behandlung oder Verbesserung von Monozyten oder Leukozyten proliferierenden Erkrankungen, z.B. Leukämie, durch Reduzieren der Menge an Monozyten oder Lymphozyten für die Prävention und/oder Behandlung von Transplantatabstoßung bei der Transplantation natürlicher oder künstlicher Zellen, Gewebe und Organe, wie Hornhaut, Knochenmark, Organen, Linsen, Schrittmachern, natürlichem oder künstlichem Hautgewebe.
VERBINDUNGSHERSTELLUNG
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch Umsetzen eines geeigneten Alkohols mit einem geeigneten Chlorid hergestellt werden. Zum Beispiel können die Sulfamatverbindungen der vorliegenden Erfindung durch Umsetzen eines geeigneten Alkohols mit einem geeigneten Sulfamoylchlorid der Formel R1R2NSO₂Cl hergestellt werden.
Typische Bedingungen zur Durchführung der Reaktion sind die folgenden.
Natriumhydrid und ein Sulfamoylchlorid werden zu einer gerührten Lösung des Alkohols in wasserfreiem Dimethylformamid bei 0°C zugegeben. Anschließend läßt man die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen, woraufhin das Rühren für weitere 24 Stunden fortgesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird in eine kalte gesättigte Lösung von Natriumbicarbonat gegossen, und die resultierende wäßrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Filtration, gefolgt von Lösungsmittelverdampfung unter Vakuum und gleichzeitiges Verdampfen mit Toluol liefert einen rohen Rückstand, der durch Flash-Chromatographie weiter gereinigt wird.
Vorzugsweise wird der Alkohol in geeigneter Weise vor der Umsetzung mit dem Sulfamoylchlorid derivatisiert. Wenn es notwendig ist, können die funktionalen Gruppen in dem Alkohol auf bekannte Weise geschützt und die Schutzgruppe oder -gruppen am Ende der Reaktion entfernt werden.
Vorzugsweise werden die Sulfamatverbindungen gemäß den Lehren von Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059–2068) hergestellt.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassend liefert die vorliegende Erfindung neue Verbindungen für eine Verwendung als Steroidsulfataseinhibitoren und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren beschrieben.
1 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema.
2 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema.
3 zeigt eine Verbindungsformel.
4 zeigt eine Tabelle mit Daten.
5 zeigt ein Diagramm.
6 zeigt eine Verbindungsformel.
7 zeigt eine Tabelle mit Daten.
8 zeigt ein Diagramm.
9 zeigt ein Diagramm.
10 zeigt eine Verbindungsformel.
11 zeigt eine Verbindungsformel.
12 zeigt ein Diagramm.
13 zeigt ein Diagramm.
Die folgenden Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe 3, 6, 10 und 11) wurden nach dem in 2 gezeigten allgemeinen Syntheseschema hergestellt. Speziell wurden die Verbindungen 1, 2, 3, 5, 6, 8 und 9 (siehe Schema 1 in 1) hergestellt, wie es bei Page et al. (Tetrahedron 1990; 46; 2059–2068) beschrieben ist.
Die Verbindungen wurden dann nach den oben genannten Protokollen getestet. Die Ergebnisse (siehe 4, 5, 7, 8, 9, 12 und 13) zeigten, daß sie als STS-Inhibitoren wirken konnten.
Die IC₅₀ jeder der Verbindungen 4, 7, 10 und 13 wurde ebenfalls abgeleitet. Diese Werte sind nachfolgend angegeben.
Östronacetat (1)
Ein Gemisch aus Östron (10 g, 36,82 mmol), Acetanhydrid (17,5 ml) und Pyridin (75 ml) wurde unter Rückfluß für 2 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum aufkonzentriert und anschließend mit Eiswasser abgeschreckt. Das Präzipitat, das sich bildete, wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus wäßrigem Ethanol (95%) umkristallisiert unter Erhalt von 1 als weiße Kristalle (11,2 g, 97%); Smp. 115–118°C, TLC (Chloroform/Aceton, 8:1): R∫ 0,83, vmax (KBr) 1770, 1720 (C=O), cm^–1, δ_H (400 MHz, CDCl₃) 0,91 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,42–2,19 (11H, m), 2,29 (3H, s, CH ₃CO), 2,38–2,54 (2H, m), 2,9 (2H, t, J = 4,43 Hz, C-6-CH ₂), 6,81 (1H, d, J_C-2-H,C-4-H = 2,14 Hz, C-4-H), 6,86 (1H, dd, J_C-4-H,C-2-H = 2,44 Hz und J_C-1-H,C-2-H = 8,54 Hz, C-2-H), und 7,28 (1H, d, J_C-2-H,C-1-H = 8,24 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 466,2 [10, (M + H + NBA)⁺], 313,2 [65, (M + H)⁺], 270,2 [100, (M + H + CH₃CO)⁺]; MS M/Z (FAB–) 269,2 [100, (M – CH₃CO)^–]. Gefunden C, 76,9; H, 7,83 C₂₀H₂₄O₃ erfordert C, 76,89; H, 7,74%.
2-Bromöstronacetat (2)
Zu einer Lösung von 1 (2,0 g, 6,402 mmol) in Trifluoressigsäure (TFA, 50 ml) wurde Thalliumtrifluoracetat (6,958 g, 12,80 mmol) hinzugefügt, und das resultierende Gemisch wurde bei 0°C unter Stickstoff für 24 h gerührt. Nach dem Entfernen von TFA unter reduziertem Druck bei < 40°C wurde der kristalline Östron-Thallium(III)-Komplex, der erhalten wurde, zweimal mit 1,2-Dichlorethan gewaschen. Anschließend wurden zu diesem gewaschenen Komplex 1,4-Dioxan (30 ml) und Kupferbromid (8,58 g, 38,41 mmol) hinzugefügt, und das resultierende Gemisch wurde unter Rückfluß für 3 h erhitzt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde anschließend Wasser (100 ml) zu diesem gewaschenen Komplex hinzugefügt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde Wasser (100 ml) zu dem erhaltenen Rückstand hinzugefügt, und das Rohprodukt wurde in Dichlormethan (3 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Ethylacetat/Hexan, 1:4) fraktioniert und der erhaltene helle weiße Feststoff (2,05 g) wurde weiter durch Umkristallisierung aus Methanol gereinigt unter Erhalt von 2 als farblose Kristalle (1,79 g, 72%; Smp. 229–231°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und Ethylacetat/Hexan, 4:1): R∫s 0,89 bzw. 0,62; vmax (KBr) 1770, 1730 (C=O) cm^–1; δ_H (400 MHz, CDCl₃) 0,91 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,25–2,3 (12H, m), 2,34 (3H, s, CH ₃CO), 2,5 (1H, m), 2,86 (2H, t, J = 4,58 Hz, C-6-CH ₂), 6,85 (1H, s, C-4-H) und 7,49 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB+) 545,2 [90, (M + H + NBA)⁺], 391,2 [100, (M)⁺], 348,1 [90, (M – CH₃CO)⁺], 330,1 (10); Acc. MS (FAB+) 391,08559 C₂₀H₂₄BrO₃ erfordert 391,09088. Gefunden C, 61,2; H, 5,89; C₂₀H₂₃BrO₃ erfordert C, 61,39; H, 5,92%.
2-Bromöstron (3)
Ein Gemisch aus 3 (1,5 g, 3,832 mmol), Kaliumcarbonat (2,65 g, 19,17 mmol) in Methanol (70 ml) wurde unter Rückfluß für 3 h erhitzt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde Wasser (50 ml) zu dem erhaltenen Rückstand hinzugefügt, und das Rohprodukt wurde mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft unter Erhalt eines gelben Feststoffs (1,3 g), welcher durch Umkristallisierung aus Ethylacetat/Petrolether (60–80°C) (3:2) gereinigt wurde unter Erhalt von 3 als hellgelbe Kristalle (1,23 g, 93%); Smp. 190–193°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und 4:1): R∫s 0,51 bzw. 0,64; vmax (KBr) 1710 (C=O) cm^–1; δ_H (400 MHz, CDCl₃) 0,87 (3H, s, CH ₃), 1,4–2,52 (13H, m), 2,84 (2H, m, C-6-CH ₂), 5,32 (1H, br s, ausgetauscht mit D₂O, OH), 6,73 (1H, s, C-4-H) und 7,52 (1H, s, C-1-H); δ_C (400 MHz, CDCl₃) 13,81 (q, C-18), 21,56 (t), 25,89 (t), 26,26 (t), 29,9 (t), 31,54 (t), 31,91 (t), 38,04 (d), 43,6 (d), 47,93 (s, C13), 50,38 (d), 114,94 (d, C-4), 135,04 (d, C-1), 128,84 (s), 130,92 (s), 139,02 (s) 152,7 (s, C-3) und 220 (s, C-17-C=O); MS m/z (FAB+) 502,1 (20, (M + NBA)⁺], 349,1 [100, (M)⁺], 271,0 (20); MS m/z (FAB–) 502,2 [40, (M + NBA)^–], 348,1 [100, (M – H)^–]; Acc. MS (FAB+) 348,07532 C₁₈H₂₁BrO₂ erfordert 348,07249. Gefunden C, 60,72; H, 59,4. C₁₈H₂₁BrO₂ erfordert C, 61,9; H, 6,06%.
2-Bromöstron-3-O-sulfamat (4)
Nach Sulfamoylierung lieferte 3 (500 mg, 1,431 mmol) ein Rohprodukt (620 mg), welches durch Flash-Chromatographie (Chloroform/Aceton, 8:1) fraktioniert wurde. Der erhaltene beige Rückstand (510 mg) wurde durch Umkristallisierung aus Aceton/Hexan (1:2) weiter gereinigt unter Erhalt von 3 als beige Kristalle (405 mg, 66%); Smp. > 155°C (dec.); TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und 4:1): R∫s 0,43 bzw. 0,61; vmax (KBr) 3500, 3300 (NH₂), 1730 (C=O), 1390 (SO₂N) cm^–1; δ_H (400 MHz, Aceton-d₆) 0,92 (3H, s, CH ₃), 1,41–2,49 (13H, m), 2,86 (2H, m, C-6-H ₂), 7,27 (1H, s, C-4-H), 7,32 (2H, br s, ausgetauscht mit D₂O, OSO₂NH ₂) und 7,55 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB+) 428,1 [100, (M)⁺], 349,2 [40, (M + H – SO₂NH₂)⁺]; MS m/z (FAB–) 580,2 [M + H + NBA], 48,1 [100, (M)^–], 349,1 [30, (M + H – SO₂NH₂)^–]; Acc. MS (FAB+) 428,04299 C₁₈C₂₃BrNO₄S erfordert 428,05311. Gefunden C, 49,1; H, 5,18; N, 3,60; C₁₈H₂₂BrNO₄S erfordert C, 50,47, H, 5,18; N, 32,7%.
2-Iodöstronacetat (5)
Dieses wurde aus 1 (5,0 g, 16,01 mmol) auf die gleiche Weise hergestellt, wie auch 2 hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß Kupferiodid (18,29 g, 96,03 mmol) verwendet wurde. Das erhaltene Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie mit Ethylacetat/Hexan (1:4) gereinigt, und der erhaltene gelbe Feststoff (6,25 g) wurde durch Umkristallisierung aus Methanol weiter gereinigt unter Erhalt von 5 als hellgelbe Kristalle (5,89 g, 84%); Smp. 170–172°C (die Kristalle wurden bei > 145°C braun); TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und Ethylacetat, 4:1): R∫s 0,8 bzw. 0,67; vmax (KBr) 1770, 1730 (C=O), δ_H (400 MHz, CDCl₃) 0,92 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,4–2,31 (12H, m), 2,34 (3H, s, CH ₃CO), 2,5 (1H, m), 2,87 (2H, t, J = 4,27 Hz, C-6-CH ₂), 6,82 (1H, s, C-4-H) und 7,69 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB+) 592,1 [20, (M + H – NBA)⁺], 439,1 [80, (M + H)⁺], 396,1 [100, (M + H – CH₃CO)⁺], 270,2 (40); Acc. MS (FAB+) 439,07667 C₂₀H₂₄IO₃ erfordert 439,07702. Gefunden C, 54,2; H, 5,3 C₂₀H₂₃IO₃ erfordert C, 54,81; H, 5,29%.
2-Iodöstron (6)
Dieses wurde aus 5 (4,0 g, 9,126 mmol) auf die gleiche Weise hergestellt, wie dessen Bromanaloges 3 hergestellt wurde. Das erhaltene gelbe Rohprodukt wurde aus Methanol umkristallisiert unter Erhalt von 6 als hellgelbe Kristalle (3,29 g, 91%); Smp. 207–209°C (die Kristalle wurden bei > 169°C braun); TLC (Chloroform/Aceton, 8:1): R∫ 0,75; vmax (KBr) 3400 (OH), 1730 (C=O) cm^–1; δ_H (270 MHz, CDCl₃) 0,91 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,4–2,56 (13H, m), 2,83 (2H, m, C-6-CH ₂), 5,24 (1H, s, ausgetauscht mit D₂O, C-3-OH), 6,74 (1H, s, C-4-H) und 7,52 (1H, s, C-1-H); δ_C (400 MHz, CDCl₃) 13,82 (1, C-18), 21,57 (t), 25,89 (t), 26,26 (t), 29,98 (t), 31,57 (t), 31,81 (t), 39,0 (d), 43,9 (d), 48,3 (s, C13), 50,38 (d), 116,54 (d, C-4), 138,14 (d, C-1), 129,64 (s), 131,92 (s), 138,02 (s), 153,6 (s, C-3) und 220 (s, C-17, C=O); S m/z (FAB+) 550,1 [20, (M + H – NBA)⁺], 396,1 [100, (M)⁺], 271,2 (40); MS m/z (FAB–) 549,2 [20, (M + NBA)^–], 395,1 [100, (M – H)^–]; Acc. MS (FAB+) 397,0651 C₁₈H₂₂IO₂ erfordert 397,06646. Gefunden C, 53,7; H, 5,34 C₁₈H₂₂IO₂ erfordert C, 54,56; H, 5,34%.
2-Iodöstron-3-O-sulfamat (7)
Nach Sulfamoylierung lieferte 6 (500 mg, 1,262 mmol) ein Rohprodukt, welches durch Flash-Chromatographie (Chloroform/Aceton, 8:1) fraktioniert wurde. Der erhaltene beige Rückstand (450 mg) wurde durch Umkristallisierung aus Aceton/Hexan (1:2) weiter gereinigt unter Erhalt von 7 als beige Kristalle (342 mg, 57%); Smp. > 145°C (dec.); TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und 4:1): R∫s 0,61 bzw. 0,73; vmax (KBr) 3500, 3200 (NH₂), 1720 (C=O), 1390 (SO₂) cm^–1; δ_H (400 MHz, Aceton-d₆) 0,92 (3H, s, CH ₃), 1,4–2,53 (13H, m), 2,83 (2H, m, C-6-H ₂), 7,25 (1H, s, C-4-H), 7,32 (2H, br s, ausgetauscht mit D₂O, OSO₂NH ₂) und 7,76 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB+) 629,1 [40, (M + H – NBA)⁺], 476,1 [100, (M + H)⁺], 396,1 [40, (M + H – SO₂NH₂)⁺]; MS m/z (FAB–) 628,1 [35, (M + NBA)^–], 474,1 [100, (M – H)^–], 395,1 [20, (M – SO₂NH₂)^–]; Acc. MS (FAB+) 476,03874 C₁₈H₂₃INO₄S erfordert 476,03926. Gefunden C, 45,8; H, 4,74; N, 2,85; C₁₈H₂₂INO₄S erfordert C, 45,48; H, 4,66; N, 2,95%.
Die Titelverbindung, die in 6 bildhaft dargestellt ist, wird manchmal als "2-Iod-EMATE" bezeichnet. Die Ergebnisse für diese Verbindung sind in den 7 und 8 wiedergegeben.
2-Chloröstronacetat (8)
Dieses wurde aus 1 (500 mg, 1,603 mmol) auf die gleiche Weise hergestellt, wie 2 hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß Kupferchlorid (475 mg, 4,798 mmol) verwendet wurde. Das erhaltene Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie mit Ethylacetat/Hexan (1:4) gereinigt, und der erhaltene hellgelbe Feststoff (526 mg) wurde durch Umkristallisierung aus Methanol weiter gereinigt unter Erhalt von 8 als weiße Kristalle (436 mg, 78%); Smp. 195–197°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und Ethylacetat, 4:1): R∫s 0,78 bzw. 0,67; vmax (KBr) 1770, 1730 (C=O), δ_H (400 MHz, CDCl₃) 0,90 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,38–2,29 (12H, m), 2,33 (3H, s, CH ₃CO), 2,5 (1H, m), 2,87 (2H, m, C-6-CH ₂), 6,85 (1H, s, C-4-H) und 7,34 (1H, s, C-1-H).
2-Chloröstron (9)
Dieses wurde aus 8 (400 mg, 1,15 mmol) auf die gleiche Weise hergestellt, wie dessen Bromanaloges 3 hergestellt wurde. Das erhaltene hellgelbe Rohprodukt wurde aus Methanol umkristallisiert unter Erhalt von 9 als weiße Kristalle (320 mg, 90%); Smp. 221–223°C; TLC (Chloroform/Aceton, 8:1): R∫ 0,70; vmax (KBr) 3400 (OH), 1730 (C=O) cm^–1; δ_H (270 MHz, CDCl₃) 0,91 (3H, s, C-18-CH ₃), 1,4–2,54 (13H, m), 2,84 (2H, m, C-6-CH ₂), 5,27 (1H, s, ausgetauscht mit D₂O, C-3-OH), 6,71 (1H, s, C-4-H) und 7,31 (1H, s, C-1-H).
2-Chloröstron-3-O-sulfamat (10)
Nach Sulfamoylierung lieferte 6 (200 mg, 655 μmol) ein Rohprodukt, welches durch Flash-Chromatographie (Chloroform/Aceton, 8:1) fraktioniert wurde. Der erhaltene beige Rückstand (190 mg) wurde durch Umkristallisierung aus Aceton/Hexan (1:2) weiter gereinigt unter Erhalt von 10 als weiße Kristalle (170 mg, 68%); Smp. > 163°C (dec.); TLC (Chloroform/Aceton, 8:1 und 4:1): R∫s 0,63 bzw. 0,74; vmax (KBr) 3500, 3200 (NH₂), 1720 (C=O), 1390 (SO₂) cm^–1; δ_H (400 MHz, CDCl₃/DMSO-d₆; 10:1) 0,93 (3H, s, CH ₃), 1,4–2,51 (13H, m), 2,86 (2H, m, C-6-H ₂), 7,01 (2H, br s, ausgetauscht mit D₂O, OSO₂NH ₂), 7,25 (1H, s, C-4-H) und 7,35 (1H, s, C-1-H).
2-Fluoröstronacetat (11)
Östron (1,50 g, 5,5 mmol) und N-Fluorpyridiniumtriflat (2,74 g, 11,0 mmol) in 1,1,2-Trichlorethan (24 ml) wurden unter Stickstoff für 24 h unter Rückfluß gekocht. Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand in Wasser gegossen und mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft unter Erhalt eines rohen braunen Öls, welches in Pyridin (10,5 ml) gelöst und mit Acetanhydrid (2,62 ml) unter Rückflußkochen für 2 h behandelt wur de. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand in Eiswasser gegossen. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter Erhalt eines rohen Feststoffs eingedampft. Reinigung mittels Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Petrolether (Sdp. 60–80°C): Ethylacetat (9:1 bis 7:3) als Elutionsmittel lieferte nach Eindampfen 0,85 g eines Rohgemischs. Umkristallisierung aus Petrolether (Sdp. 60–80°C): absolutem Ethanol (2:8) lieferte als erstes Produkt vorherrschend das 2-Fluoröstronacetat 11 (Reinheit 75-80%, abgeschätzt anhand von ¹H-NMR)(215 mg, 12% Ausbeute) als farblose Kristalle.
Literatur siehe P. C. Bulman Page, F., Hussain, J. L. Maggas, P. Morgan und B. Kevin Park, Tetrahedron, 46, 2059–2068, 1990.
C₂₀H₂₃FO₃
MW 330,39
Smp. 83–88°C (litt. 88–90)
¹H-NMR 270 MHz (CDCl₃): 0,91 (s, 3H, C-18-CH ₃), 1,38–1,75 (m, 6H), 1,90–2,45 (m, 6H), 2,32 (s, 3H, CH₃) 2,46–2,57 (m, 1H), 2,80–2,95 (m, 2H, C-6-H), 6,83 (d, 1H, J = 8,3 Hz, C-4-H), 7,07 (d, 1H, J = 13,2 Hz, C-1-H).
M/S m/z (+ve FAB, rel. Int.): 331,1 (59, M⁺ + 1), 288,1 (100), 270,1 (22).
HRMS (+ve FAB) m/z berechnet für C₂₀H₂₃FO₃ (M⁺ + 1) 331,170948, gefunden 331,170464.
2-Fluoröstron (12)
2-Fluoröstronacetat 11 (185 mg, 0,56 mmol) wurde in Methanol (5 ml) gelöst und durch Erhitzen mit K₂CO₃ (387 mg, 5 Äquiv.) für 3 h unter Rückfluß deacetyliert. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde Wasser (25 ml) hinzugefügt und das Produkt mit Dichlormethan (3 × 20 ml) extrahiert. Der Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Umkristallisierung aus Petrolether (Sdp. 60–80°C): Absolutem Ethanol (2:8) lieferte 2-Fluoröstron (121 mg, durch ¹H-NMR geschätzte Reinheit von 75%) als farblose Kristalle (Smp. 220–227°C). Weitere Reinigung mittels präparativer HPLC, Lösungsmittel MeOH:H₂O = 60:40, Fluß 20 ml/min., Column Waters Radialpak C18 100 × 25 mm, Detektion bei 254 und 270 nm, lieferte nach Verdampfen der Lösungsmittel 2-Fluoröstron 12 als einen weißen Feststoff (72 mg, 45% Ausbeute).
Literatur siehe P. C. Bulman Page et al. Tetrahedron, 46, 2059–2068, 1990.
C₁₈H₂₁FO₂
MW 288,36
Smp. 220–223°C [Litt. 220–222 (Petrolether-absoluter Ethanol)]
¹H-NMR 400 MHz (CDCl₃): 0,78 (s, 3H, C-18-CH ₃), 1,37–1,79 (m, 6H), 1,91–2,40 (m, 6H), 2,46–2,56 (m, 1H), 2,80–2,90 (m, 2H, C-6-H), 5,02 (d, 1H, ausg. D₂O, J = 3,9 Hz, -OH), 6,72 (d, 1H, J) 9,4 Hz, C-4-H), 6,98 (d, 1H, J = 12,5 Hz, C-1-H).
¹⁹F-NMR 376 MHz (CDCl₃): –144,50 (t, 1F, J = 9,2 Hz).
HPLC-Wässer: Elutionsmittel MeOH:H₂O = 60:40, Fluß 2 ml/min., Column Waters Radialpak C18 8 × 100 mm, Detektion bei 270 nm, 2-Fluoröstron RT = 11,69 min., 96,85%, Verunreinigung RT = 9,69 min., 3,15%.
M/S m/z (+ve FAB, rel. Int.): 289,0 [100, (M⁺ + 1)], 149,0 (33), 120,0 (35).
M/S m/z (–ve FAB, rel. Int.): 287,1,0 [100, (M^– - 1)], 200,0 (25), 140,0 (25), 123,0 (43).
HRMS (+ve FAB) m/z berechnet für C₁₈H₂₁FO₂, M⁺ 288,152558, gefunden 288,151993.
2-Fluoröstron-3-O-sulfamat (13)
Zu einer gerührten Lösung von 2-Fluoröstron 12 (65 mg, 0,23 mmol) in wasserfreiem DMF (7 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre wurde bei Raumtemperatur DMBP (139 mg, 0,68 mmol) und anschließend eine 0,68 M Lösung von Sulfamoylchlorid in Toluol (1,61 ml, 1,13 mmol) über eine Spritze hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Wasser (50 ml) und Ethylacetat (60 ml) wurden hinzugefügt, und nach Trennung wurde die organische Schicht mit Salzlösung (3 × 50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie (Säulendurchmesser = 2,5 cm, h = 20 cm) unter Verwendung von Chloroform:Aceton = 8:1 als Elutionsmittel gereinigt unter Erhalt von 2-Fluoröstron-3-O-sulfamat 13 als ein weißer Feststoff (47 mg, 57% Ausbeute).
C₁₈H₂₂NO₄FS
MW 367,44
Smp. 189–193°C
¹H-NMR 40 MHz (CDCl₃): 0,91 (s, 3H, C-18-CH ₃), 1,36–1,70 (m, 6H), 1,92–2,36 (m, 6H), 2,46–2,57 (m, 1H), 2,80–2,95 (m, 2H, C-6-H), 5,03 (s breit, 2H ausg. D₂O, -NH ₂), 7,11 (d, 1H, J = 9,7 Hz, C-4-H), 7,13 (d, 1H, J = 15,5 Hz, C-1-H).
¹⁹F-NMR 376 MHz (CDCl₃): –113,24 (dd, 1F, J = 15,5 Hz und J = 9,7 Hz)
M/S m/z (+ve FAB, rel. Int.): 367,0 (100, M⁺), 350,0 (30), 288,1 (49), 258,0 (32), 243,1 (38), 178 (34), 133,0 (30), 97,0 (35).
M/S m/z (–ve FAB, rel. Int.): 366,0 [100, (M – H)^–], 77,9 (21).

HRMS (+ve FAB) m/z berechnet für C₁₈H₂₂NO₄S M⁺ 367,125358, gefunden 367,126663
Rf 0,32 (CHCl₃:Aceton = 8:1), SM Rf 0,58
Hemmung von Östronsulfataseaktivität durch Halo-EMATE in Plazentamikrosomen
Eine bezüglich Sulfatase positive menschliche Plazenta wurde als eine Quelle für Plazentamikrosome verwendet. Das Gewebe wurde homogenisiert und Kerne und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 2000 × g für 30 Min. entfernt. Plazentamikrosome wurden durch Zentrifugation des erhaltenen Überstands bei 100.000 × g für 1 h erhalten.
Für Inhibitionsstudien wurden Plazentamikrosome (125 μg/ml) in der Abwesenheit oder Gegenwart von Inhibitoren (1 pM – 1,0 μM) bis ³H-Östronsulfat (E1S, 2 × 10⁵ dpm, eingestellt auf 20 μM mit unmarkiertem E1S) für 60 Min. inkubiert. [4-¹⁴C-E1) (7 × 103 dpm) wurde hinzugefügt, um Verluste bei dem Verfahren und durch mittels Lösungsmittelaufteilung unter Verwendung von Toluol abgetrennte freie und sulfatierte Steroide zu korrigieren. Ein Teil des Lösungsmittels wurde entfernt, und der ³H- und¹⁴C-Gehalt durch Flüssigszintillationsspektrometrie bestimmt.
Die erhaltenen Daten sind in 12 wiedergegeben.
Weitere Daten sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Wirkung von Halo-EMATE auf T47D-Zellwachstum (Plattentest)
Bezüglich T47D-Rezeptor positive Brustkrebszellen wurden in eine 96-Well Zellkulturplatte ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 70% wachsen gelassen. Die Zellen wurden entweder mit Träger (Kontrollen, Tetrahydrofuran in Medium) oder mit Halo-EMATE (1 oder 10 μM) behandelt und für weitere 24 h kultiviert. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Wirkungen der Arzneimittel auf die Zellzahlen unter Verwendung eines Mikrotiterplattentests (Cell Titre 96 Zellproliferationstest, Promega) bestimmt. In diesem Test wurde die Umwandlung von Substrat durch unbehandelte Zellen am Ende des Kultivierungszeitraums auf 100% gesetzt.
Die erhaltenen Daten sind in 14 wiedergegeben.
Weitere Daten sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

+: hat eine Wirkung auf die Zellmorphologie

Claims

Verbindung mit einer Steroidringstruktur und mit der Formel
worin Rh1 eine Halogengruppe ist, Rh2 eine optionale Halogengruppe ist, Rs eine Sulfamatgruppe ist und worin die Steroidringstruktur ausgewählt ist unter einem von Östron, 4-OH-Östron, 6α-OH-Östron, 7α-Östron, 16α-OH-Östron, 16β-OH-Östron, 17-Desoxyöstron, 4-OH-17β-Östradiol, 6α-OH-17β-Östradiol, 7α-OH-17β-Östradiol, 4-OH-17α-Östradiol, 6α-OH-17α-Östradiol, 7α-OH-17α-Östradiol, 16α-OH-17α-Östradiol, 16α-OH-17β-Östradiol, 16β-OH-17α-Östradiol, 16β-OH-17β-Östradiol, 17α-Östradiol, 17β-Östradiol, 17α-Ethinyl-17β-östradiol, 17β-Ethinyl-17α-östradiol, 17-Desoxyöstradiol, Östriol, 4-OH-Östriol, 6α-OH-Östriol, 7α-OH-Östriol und 17-Desoxyöstriol.
Verbindung nach Anspruch 1 mit einer Steroidringstruktur und mit der Formel
worin Rh1, Rh2 und Rs wie in Anspruch 1 definiert sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Gruppe Rs die Formel
hat, worin R1 und R2 unabhängig voneinander unter H, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl und Aryl oder Kombinationen davon ausgewählt sind oder zusammen Alkylen repräsentieren, wobei das oder jedes Alkyl oder Cycloalkyl oder Alkenyl optional ein oder mehrere Heteroatome oder -gruppen enthält.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei wenigstens eines von R1 und R2 H ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei jedes von R1 und R2 H ist.
Verbindung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Verwendung in der Medizin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 optional im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel oder Hilfsmittel umfaßt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der/die mit Steroidsulfatase in Verbindung steht.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Therapie eines Zustands oder einer Krankheit, der/die mit ungünstigen Steroidsulfatasemengen in Verbindung steht.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Behandlung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Krebs Brustkrebs ist.