DE69230917T2

DE69230917T2 - Verfahren zur detektion von hepatitis c

Info

Publication number: DE69230917T2
Application number: DE69230917T
Authority: DE
Inventors: R. Lesniewski; K. Leung
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1991-09-16
Filing date: 1992-09-16
Publication date: 2000-11-16
Anticipated expiration: 2012-09-17
Also published as: CA2119013A1; JPH06510861A; ATE191792T1; ES2145746T3; EP0642666A4; WO1993006247A1; JP3219409B2; AU2679492A; DE69230917D1; EP0642666B2; DE69230917T3; EP0642666B1; TW222686B; ES2145746T5; EP0642666A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf einen Assay zum Erkennen des Vorhandenseins und/oder der Menge eines Antikörpers, der immunologisch mit einem viralen Hepatitis-C- Antigen reaktiv ist, in einer Testprobe, und spezifischer, auf einen Assay zum Nachweis eines Komplexes aus einem Antikörper und einem Polypeptid, das mindestens ein Epitop eines viralen Hepatitis-C-Antigens enthält.
Akute Virushepatitis wird über eine gut definierte Gruppe von Patientensymptomen einschließlich Gelbsucht, Druckschmerzhaftigkeit der Leber und Anstieg des Serumpegels von Alaninaminotransferase und Aspartataminotransferase klinisch diagnostiziert. Weitere serologische Immunoassays werden im allgemeinen zur Diagnose des spezifischen Typs des verursachenden viralen Krankheitserregers durchgeführt. In früheren Zeiten wurde für Patienten, die Hepatitis-Symptome aufwiesen und nicht anderweitig mit einem Hepatitis-A-, Hepatitis-B-, Epstein-Barr- oder Zytomegalievirus infiziert waren, klinisch im Ausschlußverfahren diagnostiziert, an Non-A- Non-B-Hepatitis (NANBH) erkrankt zu sein. Die Krankheit kann zu einem chronischen Leberschaden führen.
Jedes einzelne der weithin bekannten, immunologisch charakterisierten Hepatitis-induzierenden Viren, Hepatitis-A- Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Hepatitis-D-Virus (HDV), gehört zu einer eigenen Familie von Viren und hat eine charakteristische virale Organisation, Proteinstruktur und Replikationsart.
Versuche zum Erkennen des NANBH-Virus auf Grund genomischer Ähnlichkeit mit einem der bekannten Hepatitis-Viren sind fehlgeschlagen, woraus geschlossen wurde, dass NANBH eine unterschiedliche Organisation und Struktur aufweist. Fowler et al., J. Med. Virol. 12: 205-213 (1983) und Weiner et al., J. Med. Virol. 21: 239-247 (1987).
Der Fortschritt in der Entwicklung von Assays zum Nachweis von Antikörpern, die für NANBH spezifisch sind, wurde insbesondere durch Schwierigkeiten bei der korrekten Identifizierung von Antigenen, die mit NANBH im Zusammenhang stehen, behindert. Siehe zum Beispiel J. Wands et al., U.S. Patent 4.870.076, Wands et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 83: 6608-6612 (1986), Ohori et al., J. Med. Virol. 12: 161-178 (1983), Bradley et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 84: 6277-6281 (1987), T. Akatsuka et al., J. Med. Virol. 20: 43-56 (1986), B. Seto et al., WO 90/02206, K. Takahashi et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 293 274, veröffentlicht am 30. November 1988, und R. Seelig et al., PCT Application PCT/EP88/00123.
In jüngster Zeit wurde ein weiteres Hepatitis-induzierendes Virus von M. Houghton et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 318 216, 31. Mai 1989, eindeutig als Hepatitis-C-Virus (HCV) identifiziert. Zu den verwandten Veröffentlichungen, die dieses Virus beschreiben, gehören G. Kuo et al., Science 244: 359-361 (1989) und Q. Choo et al., Science 244: 362-364 (1989). M. Houghton et al. berichten von der Isolation von cDNA-Sequenzen von HCV, die Antigene codieren, die immunologisch mit Antikörpern reagieren, die bei Patienten vorhanden sind, die mit NANBH infiziert sind, und begründen damit, dass HCV der virale Krankheitserreger von NANBH ist.
Die mit HCV assoziierten cDNA-Sequenzen wurden von einer cDNA- Bibliothek isoliert, die aus der RNA hergestellt wurde, die aus gesammeltem Serum eines Schimpansen mit chronischer HCV- Infektion erhalten wurde. Die cDNA-Bibliothek enthielt cDNA- Sequenzen einer ungefähren mittleren Größe von etwa 200 Basenpaaren. Die cDNA-Bibliothek wurde auf codierte Epitope gescreent, die in Klonen exprimiert wurden, und die sich an Antikörper in Seren von Patienten binden konnten, die zuvor an NANBH gelitten hätten.
In der europäischen Patentanmeldung beschrieben M. Houghton et al. auch die Herstellung mehrerer Superoxiddismutasefusionspolypeptide (SOD) und die Verwendung dieser SOD-Fusionspolypeptide für die Entwicklung eines HCV- Screening-Assays. Das komplexeste SOD-Fusionspolypeptid, das in der europäischen Patentanmeldung beschrieben und als C100-3 bezeichnet wurde, enthält laut dieser Beschreibung 154 Aminosäuren von humaner SOD am Amino-Terminus, 5 Aminosäurereste, die von der Expression eines synthetischen DNA- Adapters mit einer restriktiven Stelle, EcoRI, abstammen, 363 Aminosäuren, die von der Expression eines klonierten HCV-cDNA- Fragments abstammen, und 5 carboxy-terminale Aminosäuren, die von einer MS2-Klonierungsvektornukleotidsequenz abstammen. Die DNA-Sequenz, die dieses Polypeptid codiert, wurde unter Verwendung eines Plasmids in Hefezellen transformiert. Die transformierten Zellen würden kultiviert und exprimierten ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht 54.000, das durch differentielle Extraktion auf etwa 80% Reinheit gereinigt wurde. Andere SOD-Fusionspolypeptide mit der Bezeichnung SOD-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1; und SOD-NANBH&sub8;&sub1; wurden in rekombinanten Bakterien exprimiert. Die E. coli-Fusionspolypeptide wurden durch differentielle Extraktion und Chromatographie unter Verwendung von Anionen- und Kationenaustauschersäulen gereinigt. Durch die Reinigungsprozeduren konnte SOD-NANB&sub5;&submin;&sub1;&submin;&sub1; mit etwa 80% Reinheit und SOD-NANBH&sub8;&sub1; mit etwa 50% Reinheit hergestellt werden.
Die rekombinanten SOD-Fusionspolypeptide, die von M. Houghton et al. beschrieben wurden, wurden auf Mikrotitervertiefungen oder Polystyrolkügelchen aufgebracht und für die Untersuchung von Serumproben verwendet. Kurz gesagt wurden beschichtete Mikrotitervertiefungen mit einer Probe in einem Verdünnungsmittel inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikrotitervertiefungen gewaschen und dann unter Verwendung entweder eines radioaktiv markierten Schaf-Anti-Human- Antikörpers oder eines Maus-Anti-Human-IgG-HRP ("horseradish" = Meerrettich-Peroxidase)-Konjugats entwickelt. Diese Assays wurden zum Nachweis sowohl der postakuten Phase sowie der chronischen Phase der HCV-Infektion verwendet. Wegen der präparativen Verfahren erforderte die Assay-Spezifität die Zugabe von Hefe- oder E. Coli-Extrakten zu den Proben, um unerwünschte immunologische Reaktionen mit allen Hefe- oder E. coli-Antikörpern, die in Serumproben vorhanden sind, zu verhindern.
Leung, T. et. al., EP-A-0 445 423, zeigen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörpers gegen ein HCV-Antigen in einer Probe, bei denen die Probe mit einem Polypeptid, das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, in Kontakt gebracht wird. Unter den veröffentlichten Polypeptiden befindet sich das Polypeptid von Aminosäure 380 bis 436 des HCV-Genoms.
Miyamura, T. et al., EP-A-0 419 182, berichten von einem Immunoassay zum Nachweis des Vorhandenseins von Anti-HCV- Antikörpern in einer Testprobe, bestehend aus (a) Inkubation der Testprobe unter Bedingungen, die die Bildung von Antigen- Antikörper-Komplexen ermöglichen, mit einem immunogenen Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines HCV-Isolats enthält, das im wesentlichen homolog zu einem Isolat ist, das aus der Gruppe J1 und J7 gewählt ist, wobei sich die Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz des HCV-Isolats HCV1 unterscheidet; und (b) Nachweis des Antigen-Antikörper- Komplexes, der das immunogene Polypeptid enthält.
Kuo et al., Science, Vol. 244, 21. April 1989, Seite 262-264, geben die Verwendung von antigenen HCV-Peptiden zum Nachweis von HCV-Antikörpern bekannt, berichten jedoch nicht von Peptiden von E2/NS1 für diesen Zweck.
Hijikata et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 175, Nr. 1, 28. Februar 1991, Seite 220- 228, vergleichen die Sequenzen der vermeintlichen Glykoproteinregion mehrerer Klone und beobachten die Existenz einer hypervariablen Region von Aminosäure 391 bis 400.
Kremsdorf et al., Journal of General Virology, Vol. 72, 1991, Seite 2557-2561, geben die Klonierung des E2/NS1-Gens von einem französischen HCV-Isolat bekannt und beobachten eine signifikante genetische Variabilität der Sequenz in bezug auf die Sequenz von amerikanischen und japanischen Isolaten.
Ortho Diagnostics Systems Inc. haben einen Untersuchungsimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV- Antigene entwickelt. Das Ortho-Assayverfahren ist ein dreistufiger Test für Serum/Plasma, der in einer Mikrovertiefung ausgeführt wird, die mit dem rekombinanten Hefe/Hepatitis-C- Virus-SOD-Fusionspolypeptid C100-3 beschichtet ist.
In der ersten Stufe wird eine Testprobe direkt in der Testvertiefung verdünnt und für eine bestimmte Zeit inkubiert. Wenn Antikörper gegen HCV-Antigene in der Probe vorhanden sind, werden auf der Oberfläche der Mikrovertiefung Antigen- Antikörper-Komplexe gebildet. Wenn keine Antikörper vorhanden sind, werden keine Kompexe gebildet, und die ungebundenen Serum- oder Plasmaproteine werden in einem Waschschritt entfernt.
In der zweiten Stufe wird ein Anti-Human-IgG-Maus-monoklonales- Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat zu der Mikrovertiefung hinzugegeben. Das Konjugat lagert sich spezifisch an den Antikörperteil der Antigen-Antikörper-Komplexe an. Wenn keine Antigen-Antikörper-Komplexe vorhanden sind, wird das ungebundene Konjugat ebenfalls in einem Waschschritt entfernt.
In der dritten Stufe wird ein Enzymnachweissystem, das sich aus o-Phenylendiamin-2HCl (OPD) und Wasserstoffperoxid zusammensetzt, zu der Testvertiefung hinzugegeben. Wenn gebundenes Konjugat vorhanden ist, wird das OPD oxidiert, was zu einem farbigen Endprodukt führt. Nach Bildung des farbigen Endprodukts wird verdünnte Schwefelsäure zu der Mikrovertiefung hinzugegeben, um die farbbildende Nachweisreaktion zu stoppen. Die Intensität des farbigen Endprodukts wird mit einem Mikrovertiefungsableser gemessen. Der Assay kann zum Screenen von Patientenserum und -plasma verwendet werden.
Es ist nachgewiesen, dass HCV durch kontaminiertes Blut, und kontaminierte Blutprodukte übertragen werden kann. Bei Transfusionspatienten leiden 10% an Post-Transfusions-Hepatitis. Davon sind etwa 90% das Ergebnis von Infektionen, die als HCV diagnostiziert wurden. Zur Prävention der Übertragung von HCV durch Blut und Blutprodukte werden zuverlässige, sensitive und spezifische Diagnose- und Prognosewerkzeuge benötigt, mit denen Träger des Hepatitis-C-Virus sowie kontaminiertes Blut und kontaminierte Blutprodukte erkannt werden können. Daher besteht ein Bedarf an einem HCV-Assay, der zuverlässige und effiziente Reagenzien und Verfahren verwendet zum genauen Nachweis des Vorhandenseins von HCV-Antikörpern in Proben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert einen verbesserten Assay zum Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörpers gegen ein HCV- Antigen in einer Testprobe durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Polypeptid, das mindestens ein Epitop eines HCV- Antigens enthält, wobei die Polypeptide aus der Gruppe gewählt sind, die aus p380JH1, p380.LG, p380J und p408J besteht.
Eine Assayform gemäß dieser Erfindung liefert einen Konfirmationsassay zum eindeutigen Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der immunologisch reaktionsfähig mit einem HCV-Virus ist. Kurz gesagt wird eine flüssige Probe verwendet, um erste und zweite Aliquote herzustellen. Die Aliquote werden dann mit mindestens zwei Polypeptiden in Kontakt gebracht, die die Duplikate einer fortlaufenden Aminosäuresequenz sind, die vermutlich in Proteinen enthalten ist, die von Klonen exprimiert werden, die HCV-cDNA-Sequenzen enthalten, die mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthalten, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind. Zuletzt wird der Antikörper-Antigen-Komplex nachgewiesen. Das erste Aliquot und das zweite Aliquot werden mit mindestens einem Polypeptid in Kontakt gebracht, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p308JH1, p380.LG, p380J und p408J besteht, unter dem Vorbehalt, dass das/die Peptid(e), die für das erste Aliquot verwendet werden, nicht für das zweite Aliquot verwendet werden.
Eine andere Assayform liefert einen Assay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, und besteht aus dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer festen Phase, an die mindestens ein Polypeptid gebunden ist, das aus der Gruppe gewählt ist bestehend aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J, das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind, sowie Nachweis des Antikörper-Polypeptid-Komplexes.
Eine weitere Assayform liefert einen Assay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, und besteht aus dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind, sowie Nachweis des Antikörper-Polypeptid-Komplexes als ein Hinweis auf eine chronische HCV-Infektion.
Eine wiederum andere Assayform liefert einen Immunodot-Assay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, indem eine Probe gleichzeitig mit mindestens zwei Polypeptiden in Kontakt gebracht wird, die aus der Gruppe bestehend aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J gewählt sind, von denen jedes verschiedene Epitope eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen dem Antikörper und mindestens einem der Polypeptide geeignet sind, sowie Nachweis des Antikörper- Polypeptid-Komplexes durch Umsetzung des Komplexes mit farbbildenden Reagenzien.
Eine weitere Assayform liefert einen Kompetitivassay, dessen Aufgabe darin besteht, zu bestätigen, dass positive Ergebnisse nicht falsch sind, durch Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, wobei die Probe zur Herstellung erster und zweiter immunologisch äquivalenter Aliquote verwendet wird. Das erste Aliquot wird mit einem festen Träger in Kontakt gebracht, der ein gebundenes Polypeptid aufweist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung mit dem Antikörper geeignet sind, zur Bildung eines nachweisbaren Antikörper-Polypeptid-Komplexes, und das zweite Aliquot wird zuerst mit ungebundenem Polypeptid in Kontakt gebracht, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, und dann mit dem gleichen festen Träger in Kontakt gebracht, der gebundenes Polypeptid aufweist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht.
In allen Assays wird die Probe, insbesondere Serum oder Plasma, vorzugsweise verdünnt, bevor sie mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, das an einen festen Träger absorbiert ist. Es ist jedoch denkbar, dass für die Untersuchung einiger Testproben eine unverdünnte oder sogar konzentrierte Probe möglicherweise bevorzugt werden könnte. Proben können aus unterschiedlichen biologischen Proben wie Vollblut, Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin und Lymphozyten oder Zellkulturüberständen erhalten werden. Feste Trägermaterialien können Cellulosematerialien wie Papier und Nitrocellulose sein, natürliche und synthetische polymere Materialien wie Polyacrylamid, Polystyrol und Baumwolle, Siliziumchips, poröse Gele sein wie Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine, Partikel, die in der Lage sind, eine Ladung zu bilden wie jene, die für Ioneneinfangassays verwendet werden, und anorganische Materialien wie desaktiviertes Aluminium, Magnesiumsulfat und Glas. Geeignete feste Trägermaterialien können in Assays in vielen bestens bekannten physikalischen Konfigurationen verwendet werden einschließlich Mikrotitervertiefungen, Reagenzgläsern, Kügelchen, Streifen, Membranen und Mikropartikeln, entweder magnetisch oder unmagnetisch. Ein bevorzugter fester Träger für einen Nicht-Immunodot-Assay ist ein Polystyrolkügelchen. Ein bevorzugter fester Träger für einen Immunodot-Blot-Assay ist Nitrocellulose.
Geeignete Verfahren und Reagenzien zum Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes in einem Assay der vorliegenden Erfindung sind kommerziell erhältlich oder auf dem einschlägigen Gebiet bekannt. Repräsentative Verfahren können Nachweisreagenzien, z. B. enzymatische, radioisotopische, fluoreszierende, lumineszente oder chemilumineszente Reagenzien verwenden. Diese Reagenzien können verwendet werden, um Hapten- markierte-Antihapten-Nachweissysteme entsprechend bekannter Verfahren herzustellen, zum Beispiel kann ein Biotin-markiertes- Anti-Biotin-System zum Nachweis eines Antikörper-Antigen- Komplexes verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Assaykits mit Polypeptiden, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, die mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthalten, das an einen festen Träger gebunden ist, sowie notwendige Probenaufbereitungsreagenzien, Waschreagenzien, Nachweisreagenzien und signalerzeugende Reagenzien.
Weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein nach Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung, die Darstellungen der Erfindung in ihren derzeit bevorzugten Ausführungen liefert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1a und 1b illustrieren das HCV-Genom.
Fig. 2 zeigt die Verwendung antigener Polypeptide zum Erkennen des Vorhandenseins von Antikörpern in einem Schimpansen, der mit HCV geimpft wurde.
Die Fig. 3a und 3b zeigen die Sensitivitätszunahme bei Verwendung einer kombinierten Assayform.
Fig. 4 zeigt eine Testkassette für einen Immunodot-Assay.
Fig. 5 zeigt eine Serokonversionskurve, worin die Menge von Anti-NS5-S/N-Antikörper, dargestellt als durchgezogene Linie zwischen offenen Quadraten, und die Menge an Anti-HCV-2.0-S/CO- Antikörper, dargestellt als durchgezogene Linie zwischen geschlossenen Rauten, über der Zeit in Tagen nach dem Vorhandensein aufgezeichnet ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Assay zum Nachweis eines Antikörpers gegen ein HCV-Antigen in einer Testprobe. In einer bevorzugten Ausführung wird Humanserum oder Plasma in einem Probenverdünnungsmittel verdünnt und mit einem Polystyrolkügelchen inkubiert, das mit einem Polypeptid beschichtet ist, das ein antigenes HCV-Epitop enthält. Wenn Antikörper in der Probe vorhanden sind, bilden sie einen Komplex mit dem antigenen Polypeptid und bleiben an dem Polystyrolkügelchen haften. Nachdem sich der Komplex gebildet hat, werden nicht gebundene Materialien und Reagenzien durch Waschen des Kügelchens entfernt und der Kügelchen-Antigen- Antikörper-Komplex wird mit einer Lösung, die Meerrettichperoxidase-markierte Ziegen-Antikörper gegen Human- Antikörper enthält, umgesetzt. Dieses Peroxidaseenzym lagert sich dann an den Antigen-Antikörper-Komplex an, der bereits am Kügelchen gebunden ist. In einer letzten Reaktion wird die Meerrettichperoxidase mit o-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxidase in Kontakt gebracht, was zu einer gelborangen Farbe führt. Die Intensität der Farbe ist proportional zur Antikörpermenge, die sich anfänglich an das am Kügelchen haftende Antigen anlagert.
Polypeptide mit HCV-antigenen Epitopen wurden aus Abschnitten ausgewählt, die Aminosäuresequenzen enthalten, die denen anderer bekannter immunologisch reaktionsfähiger Agenzien ähnlich sind, und für die erkannt wurde, dass sie eine gewisse immunologische Reaktivität haben. Die immunologische Reaktivität eines Polypeptids wurde anfänglich durch Umsetzen des Zellextrakts von E. coli-Klonen, die mit cDNA-Fragmenten des HCV-Genoms transformiert wurden, mit HCV-infiziertem Serum bestimmt. Die Klone exprimierten vermutlich Polypeptide, die durch die eingelagerte cDNA codiert wurden, und die immunologisch reaktionsfähig waren mit Serum, von dem bekannt war, dass es Antikörper gegen HCV-Antigene enthielt. Eine Analyse einer gegebenen Aminosäuresequenz liefert jedoch nur grobe Richtlinien für die Vorhersage der immunologischen Reaktivität. Es gibt keine gleichbleibende Möglichkeit, die immunologische Aktivität ohne Herstellung einer gegebenen Aminosäuresequenz und Untersuchung der verdächtigen Sequenz in einem Test zu bestätigen. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, wurde für einige Peptide, von denen angenommen wurde, dass sie immunologische Reaktivität liefern, herausgefunden, dass sie bei Verwendung in einem praktischen Test nicht reaktionsfähig sind. TABELLE 1
Ein Probenwert wird als positiv angesehen, wenn die Extinktion bei 492 nm ≥ 4facher Extinktionswert der negativen Kontrollprobe ist (S/N ≥ 4,0).
A00642 Humane Plasmaprobe rekonvaleszent von NANB(HCV)- Hepatitis. Für den Patienten wurde klinisch NANB diagnostiziert und war negativ für HBV- und HAV- Marker.
Nr. 491 Humaner bezahlter Plasmaspender, positiv durch Screening-Assays auf der Basis von C-100. Klinische Geschichte nicht bekannt.
Nr. 423 Humaner bezahlter Plasmaspender, positiv durch Screening-Assays auf der Basis von C-100-3. Klinische Geschichte nicht bekannt.
Die Verwendung von Polypeptiden mit einem oder mehr als einem Epitop eines HCV-Antigens zum Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörpers gegen ein HCV-Antigen ist in Fig. 2 dargestellt. Der Verlauf der HCV-Infektion bei einem Schimpansen, Melilot, wurde mit einem Assay unter Verwendung des rekombinanten Polypeptids C100-3 und mit einem anderen Assay unter Verwendung des Polypeptids p1689 verfolgt. Beide Assays ergaben negative Ergebnisse vor der Impfung, und beide Assays wiesen das Vorhandensein von Antikörpern etwa 100 Tage, nachdem das Tier mit HCV infiziert wurde, nach.
Es gibt mehrere bekannte Verfahren, unter Verwendung synthetischer sowie rekombinanter Methodiken Polypeptide herzustellen, die in den Assayverfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können und für die herausgefunden wurde, dass sie immunologisch reaktionsfähig sind. Vorzugsweise können die Polypeptide mit Hilfe automatisierter Synthesizer hergestellt werden. Die Synthese von p1684 wird nachfolgend beschrieben.
Synthese von p1684:
H-
GRVVLSGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLLQTASRQAEVIA PAV-OH
Das vollkommen geschützte Peptid wurde auf einem Phenylacetamidomethyl(PAM)-Harz zusammengesetzt durch schrittweise Festphasensynthese (Beginn mit dem carboxyterminalen Ende) entsprechend der allgemeinen Prozedur, die von G. Barany und R. B. Merrifield in The Peptides (E. Gross und R. Meinhoeffer, eds.) 2, 1-284 (1980) Academic Press, New York, NY beschrieben wurde. Die C-terminale Aminosäure Valin (Cal) wurde an den festen Träger über eine Oxymethylphenylacetamidomethyl(OMPA)-Bindung gekoppelt und führte zu einem PAM-Harz, das eine verbesserte Stabilität gegenüber einer ausgedehnten Behandlung mit Trifluoressigsäure (TAE) sicherstellte. Ein BOC-Val-OCH&sub2;-PAM-Harz (0,78 mmol/g, 0,13 g) wurde in ein Reaktionsgefäß eines Applied Biosystems Peptid- Synthezisers, Modell 430A, überführt. Alle nachfolgenden Aminosäuren beginnend vom Carboxyl-Terminus bis zum N-Terminus, wurden schrittweise unter Verwendung des kleinstufigen Schnellzyklusprotokolls von Applied Biosystems gekoppelt. Geschützte Aminosäuren wurden unter Verwendung vorgebildeter symmetrischer Anhydridchemie gekoppelt, mit Ausnahme von Asparagin, Glutamin, Arginin und Histidin, die unter Verwendung von N-N'-Dicyclohexylcarbodiimid(DCC)/1- Hydroxybenzotriazol(HOBT)-Chemie doppelt gekoppelt wurden. In der ersten Kopplungsreaktion wurden geschützte Aminosäuren unter Verwendung von vorgebildeten symmetrischen Anhydriden, die in Dimethylformamid (DMF) gelöst waren, gekoppelt. Das symmetrische Anhydrid einer einzelnen Aminosäure wurde in Methylenchlorid gebildet, gefolgt von einem Lösungsmittelaustausch gegen DMF vor der Überführung in das Reaktionsgefäß des Peptidsynthesizers. Die zweite Kopplung von symmetrischem Anhydrid wurde ebenfalls in DMF durchgeführt. Die N-Aminogruppe aller verwendeten Aminosäuren wurde durch eine t-Butyloxycarbonyl(t-BOC)-Bindung geschützt. Die funktionellen Gruppen der Seitenketten verschiedener Aminosäuren wurden durch die folgenden Gruppen geschützt:
Arg-Tos (Tosyl)
Lys-2Clz (2-Chlorbenzyloxycarbonyl)
Thr,Ser-Bzl (Benzyl)
Tyr-2BrZ (2-Brombenzyloxycarbonyl)
Cys-4MeBzl (4-Methylbenzyl)
Asp,Glu-OBzl (O-Benzyl)
His-DNP Dinitrophenyl
Das voll geschützte Peptid-Harz (0,2 g) wurde in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) fünf Minuten quellen gelassen. Das Peptid-Harz wurde in ein manuelles Reaktionsgefäß überführt, zweimal jeweils 20 Minuten mit 5% Thiophenol in DMF behandelt, gefolgt von sechs Waschungen mit CH&sub2;Cl&sub2; von je einer Minute, und dann in das Reaktionsgefäß des Synthezisers überführt. Die t-BOC- Schutzgruppe wurde dann unter Verwendung von 60% TFA/CH&sub2;Cl&sub2; entsprechend des Protokolls des Herstellers entfernt, und das Peptid-Harz mit dem partiell aufgehobenen Schutz wurde dann über Nacht unter Hausvakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Das Peptid-Harz mit dem partiell aufgehobenen Schutz wurde dann mit Dimethylsulfid (DMS [1 ml], p-Cresol [1 ml], p-Thiocresol [0,2 g] und HF [10 ml] 1 Stunde bei 0ºC behandelt, um das Peptid vom Harzträger abzuspalten. Das HF/DMS und andere flüchtige Bestandteile wurden in vacuo bei 0ºC abdestilliert. Das abgespaltene Peptid und das Harz wurden drei Mal mit 15 ml Aliquoten Diethylether gewaschen, und das abgespaltene Peptid wurde durch dreimaliges Waschen mit je 10 ml Aliquoten 40% wässriger Essigsäure beziehungsweise 15% wässriger Essigsäure extrahiert. Die wässrigen Extrakte wurden zusammengefasst, drei Mal mit 15 ml Aliquoten Diethylether gewaschen und dann lyophilisiert, und ergaben ein Rohpeptid.
Das Rohpeptid wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit umgekehrten Phasen (Umkehrphasen-HPLC) auf einer C&sub4;-, 4,6 · 30- mm-Säule (Brownlee, Applied Biosystems, Inc., Forster City, Kalifornien), Durchflussgeschwindigkeit 1 ml/min. unter Verwendung von 0,1% wässrigem TFA (A) und 100% Acetonitril (B) als Lösungsmittelsystem auf Reinheit analysiert. Der bevorzugte Lösungsmittelgradient für diese Peptidanalyse begann bei 30% Lösungsmittel 8. Die Säule wurde bei 30% B eine Minute gehalten, dann folgte über einen Zeitraum von 20 Minuten eine lineare Zunahme auf 55% B, und die Säule wurde bei dieser Konzentration 1 Minute gehalten. Zuletzt wurde die Säule innerhalb von 2 Minuten auf 30% B zurückgebracht. Das Vorhandensein von Peptid im Ablauf wurde gleichzeitig bei 225 nm und 280 nm überwacht. Die Zusammensetzung des gereinigten Peptids wurde durch Säurehydrolyse bestimmt. Nach Entfernen der Säure wurde das Hydrolysat auf einem Beckmar 6300 Aminosäureanalyzer analysiert. Falls erhöhte Mengen an gereinigtem Polypeptid erwünscht waren, wurde eine semipräparative Umkehrphasen-HPLC auf ähnliche Weise unter Verwendung einer C&sub4;-, 10 · 100-mm Säule (Brownlee, Applied Biosystems, Inc., Forster City, Kalifornien) durchgeführt, unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems aus wässrigem 0,1% TFA (A) und 100% Acetonitril (B), das oben beschrieben wurde. Der bevorzugte Lösungsmittelgradient für den semipräparativen Lauf begann bei 27% B mit 3 ml/min für 2 Minuten, gefolgt von einer linearen Zunahme auf 50% 8 über einen Zeitraum von 20 Minuten. Die Konzentration wurde bei 50% B eine Minute gehalten und dann innerhalb einer Minute auf 27% B reduziert.
Andere hierin beschriebene Peptide wurden auf einem festen Träger, auf analoge Weise wie in der zuvor beschriebenen Synthese, zusammengebaut. Die Aminosäuren Tryptophan und Methionin, falls vorhanden, wurden ohne Seitenkettenschutz verwendet. Normalerweise wurde nach der Einlagerung von Methionin während des Kettenaufbaus Ethandithiol (0,1% V/V) zu TFA für alle nachfolgenden Entfernungen von t-BOC-Schutzgruppen hinzugesetzt. Wenn jedoch durch DNP geschütztes Histidin in der Sequenz vorhanden war, wurde kein Ethandithiol zu TFA hinzugesetzt; dagegen wurde Indol (1% V/V) verwendet. Auch nach der Einlagerung von Tryptophan wurde Indol (1% V/V) zu der TFA- Lösung hinzugesetzt.
HF-Abspaltung vom Harz und Reinigung der Peptide wurden im wesentlichen wie zuvor beschrieben erreicht.
Die wie oben beschrieben synthetisierten Peptide wurden auf ihre antigenen/immunogenen Eigenschaften untersucht. Eine Zusammenfassung der Aminosäurensequenzen immunologisch reaktionsfähiger Peptide, beginnend mit dem Aminoterminus und endend mit dem Carboxyterminus, befindet sich in den Tabellen 2 und 3. TABELLE 2 (Hinweis: H kennzeichnet den Aminoterminus, OH den Carboxyterminus.) TABELLE 3 (Hinweis: H kennzeichnet den Aminoterminus, OH den Carboxyterminus. Die beiden unterstrichenen Tyr-Reste sind nicht Teil der HCV-Sequenz, wurden jedoch konstruiert, um die Iodierung des Peptids zu einem späteren Zeitpunkt zu erleichtern.)
Die in Tabelle 2 dargestellten Polypeptide können auch schrittweise oder mit einem Fragmentkopplungsprotokoll unter Verwendung verschiedener Seitenkettenschutzmethodiken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Die Polypeptide können außerdem unter Verwendung von enzymatischer Methodik hergestellt werden.
Des weiteren können die in der Praxis dieser Erfindung nützlichen Polypeptide unter Verwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden. Kurz gesagt werden DNA-Sequenzen, die die gewünschten Polypeptide codieren, vorzugsweise aus Fragmenten der erwünschten Gesamtsequenz zusammengebaut. Die Fragmente werden im allgemeinen unter Verwendung wohlbekannter automatisierter Verfahren und Apparate hergestellt. Nachdem die vollständige Sequenz hergestellt wurde, wird die gewünschte Sequenz in einen Expressionsvektor eingelagert, der in eine Wirtszelle eingeschleust wird. Die DNA-Sequenz wird dann von der Wirtszelle exprimiert und ergibt das gewünschte Polypeptid, das von der Wirtszelle oder von dem Medium, in dem die Wirtszelle kultiviert wird, geerntet wird. In den meisten Fällen wird die hergestellte DNA-Sequenz unter Verwendung von Codons zusammengebaut, von denen bekannt ist, dass sie in der Wirtszelle bestens exprimiert werden. Wenn kleinere Peptide unter Verwendung rekombinanter Techniken herzustellen sind, ist es möglicherweise von Vorteil, eine einzelne DNA-Sequenz herzustellen, die mehrere Kopien des gewünschten Polypeptids in einer verbundenen Kette codiert. Die lange Kette wird dann isoliert und in die kleineren, erwünschten Sequenzen gespalten. Die Aminosäuresequenz für p1684 ist umgekehrt translatiert, um Codons zu ergeben, die optimiert sind (wo dies nicht unvereinbar mit dem Zusammenbau und der Synthese von Fragmenten ist), die Expression in E. coli auf hohem Level zu erleichtern. Einzelne Oligonucleotide werden auf Applied Biosystem 380A DNA- Syntheziser unter Verwendung von Verfahren und Reagenzien, die vom Hersteller empfohlen werden, synthetisiert. Diese gereinigten Oligonucleotide werden angeheftet und aneinander gebunden, um die ganze DNA-Sequenz aufzubauen für den Verdau mit BamHI Sall, was die Verknüpfung in pUC18 erlaubt. Das resultierende Plasmid wird geeignet in E. coli JM103-Zellen transformiert. Es wurden auch bevorzugte Codons für die Expression von p1 und p1223 identifiziert.
Um nachzuweisen, dass ein Klon die DNA-Sequenz exprimiert, wird er bei 37ºC in 50 ml Lria Broth in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben gezüchtet. Wenn die Kultur einen OD600 von 0,3-0,5 erreicht, wird IPGT bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, um die Expression zu induzieren. Proben (1,5 ml) werden in 1- Stunden-Intervallen entnommen und die Zellen pelletiert und bis zu einem OD600 von 10,0 in 2 · SDS/PAGE-Beschickungspuffer resuspendiert. Aliquote (15 ul) der hergestellten Proben werden auf ein 15% SDS/PAGE-Gel aufgebracht, die exprimierten Polypeptide getrennt, und dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose für Immunoblotting überführt. Das Nitrocellulosepapier, das die überführten Proteine enthält, wird mit einer blockierenden Lösung 1 Stunde inkubiert und über Nacht bei 4ºC mit HCV-Seren von Patienten, die in TBS verdünnt wurden, das 5% E. coli JM103-Lysat enthielt, inkubiert. Das Nitrocellulosepapier wird drei Mal in TBS gewaschen, dann mit HRPO-markiertem Ziegen-Anti-Human-IgG, das in TBS, welches 10% Fetalkälberseren enthielt, verdünnt wurde, inkubiert. Die Nitrocellulose wurde drei Mal mit TBS gewaschen und die Farbe in TBS, das 2 mg/ml 4-Chlor-1-napthol, 0,02% Wasserstoffperoxid und 17% Methanol enthielt, gebildet. Starke immunoreaktive Bandenbildung mit HCV-Seren von Patienten zeigten, dass das synthetische Polypeptid in E. coli in immunologisch reaktionsfähiger Form exprimiert wurde.
Bevorzugte Formen für Assays unter Verwendung der oben beschriebenen Polypeptide werden in den folgenden Beispielen geliefert. Es können jedoch andere dem Fachmann bekannte Assayformen verwendet werden. Zu diesen Assays gehören Ioneneinfangassays, Mikropartikelassays und die Verwendung von Rastertunnel-Mikroskopie (Scanning-tunneling-Mikroskopie), wobei mindestens ein Polypeptid an eine feste Phase gebunden ist, mit einem Testserum in Kontakt gebracht wird und die Oberfläche der festen Phase auf Antigen-Antikörper-Komplexe abgetastet wird.
Beispiel 1 beschreibt einen Referenz-Konfirmationsassay. Beispiel 2 beschreibt einen Referenz-Kombinationsassay. Beispiel 3 beschreibt einen synthetischen Polypeptid-basierten Referenzassay. Beispiel 4 beschreibt einen Referenz-Immunodot- Assay. Beispiel 5 beschreibt einen Referenz-Kompetitivassay. Beispiel 6 beschreibt einen Referenz-EIA-Assay, in dem die Peptide 380-436 und 447-483, 643-683 und 2302-2352 verwendet werden. Beispiel 7 beschreibt einen EIA unter Verwendung des Peptids p380.LG. Beispiel 8 beschreibt einen Referenz-EIA unter Verwendung des Peptids 2302 (NS-5) im Vergleich zu einem EIA unter Verwendung der Antigene NS3 (CKS-33C, NS4 (C-100) oder CORE (CKS-CORE). Referenzbeispiel 9 beschreibt das befolgte PEPSCAN-Protokoll. Beispiel 10 beschreibt die Herstellung synthetischer Peptide auf der Basis der Sequenzen von vier verschiedenen HCV-Isolaten. Beispiel 11 beschreibt die Daten, die Studien an chronischen Patienten und Plasmaspendern unter Verwendung der Peptide aus Beispiel 10 lieferten.
In den folgenden Beispielen wurden Peptidschichten auf einer festen Phase unter den Bedingungen aufgebracht, die in Tabelle 4 aufgeführt sind. TABELLE 4

BEISPIELE

Beispiel 1. KONFIRMATIONSASSAY (Referenz)

Der Konfirmationsassay verwendet mindestens zwei Polypeptide, die HCV-antigene Epitope enthalten, die vorzugsweise aus verschiedenen Quellen präpariert und isoliert sind. Ein Polypeptid wird zum Screenen von Serum- oder Plasmaproben verwendet. Das andere Polypeptid wird verwendet, um das Vorhandensein eines HCV-Antikörpers in einer Probe zu bestätigen, für die zunächst im Screenigprozess festgestellt wurde, daß sie HCV-Antikörper enthält.
Im Konfirmationsassay dieses Referenzbeispiels wird für Screeningverfahren ein rekombinantes Polypeptid C100-3 verwendet. Von dem rekombinanten Polypeptid C100-3 wird angenommen, dass es mehrere Epitope sowie eine immundominante Region enthält, die durch die Aminosäuresequenzen 1689-1806 definiert wird. Das Polypeptid C100-3 wird in rekombinanten Hefezellen exprimiert und von dem Zellextrakt isoliert, wie in EPA Publication Nummer 0 318 216 beschrieben wird. Andere rekombinante Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen Duplikate von C100-3 sind, können ebenfalls verwendet werden.
Das andere in diesem Referenz-Konfirmationsassay verwendete Peptid ist ein synthetisches Peptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p1, p35, p99, p1192, p1223, p1684, p1689, p1694, p1866 und p1899 besteht. Das Peptid ist vorzugsweise p1684 oder p1866. Diese Peptide wurden entsprechend der Verfahren, die oben beschrieben sind, hergestellt. Im Konfirmationsassay wurden C100-3 sowie die synthetischen Peptide, p1684, p1694 oder p1866 getrennt auf Polystyrolkügelchen aufgebracht. Eine Kombination synthetischer Peptide, die auf ein Polystyrolkügelchen aufgebracht ist, kann, falls erwünscht, ebenfalls verwendet werden.
Die Polystyrolkügelchen werden zunächst mit destilliertem Wasser und Propanol gewaschen, dann mit rohen oder gereinigten synthetischen HCV-Peptiden inkubiert, die in einer 0,1-M-Lösung eines geeigneten Puffers, der etwa 0,4-0,5 M NaCl, etwa 0,0022% Triton®X-100 enthält und auf etwa pH 6,5-10,0 eingestellt ist, auf 0,1-20,0 ug/ml verdünnt waren. Die folgenden Puffer, Tris, NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O, Borsäure- und Citratpuffer, werden bevorzugt und sind für alle Peptide optimiert; bevorzugte Puffer, pH-Werte und Beschichtungskonzentrationen für die synthetischen Peptide sind in Tabelle 4 aufgeführt. Erfolgreiche Beschichtungen wurden auch bei niedrigerem oder höherem pH erreicht. Die Kügelchen werden in der Antigenlösung etwa 2 Stunden bei 38-42ºC inkubiert, in Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und in 0,1% Triton X-100 in PBS 60 Minuten bei 38-42ºC eingeweicht. Die Kügelchen werden dann zwei Mal in PBS gewaschen, mit einer Lösung aus 5% (M/V) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS 60 Minuten beschichtet und drei Mal mit PBS gewaschen. Zuletzt werden die Kügelchen mit 5% (M/V) Saccharose in PBS beschichtet und unter Stickstoff oder Luft getrocknet.
Die Peptide werden jeweils einzeln auf Polystyrolkügelchen aufgebracht und in einer Antikörper-Einfangform verwendet. Zehn Mikroliter Probe werden zu den Vertiefungen einer Reaktionsschale zusammen mit 400 ul eines Probenverdünnungsmittels und einem Peptid-beschichteten Kügelchen hinzugesetzt. Das Probenverdünnungsmittel besteht aus etwa 10% (V/V) oder weniger Rinderserumalbumin und etwa 20% (V/V) oder weniger Ziegenserum in 20 mM Tris-Phosphatpuffer mit 0,20% (V/V) oder weniger Triton X-100, 3% (M/V) oder weniger BSA. Wenn das rekombinante Hefe C100-3 Polypeptid verwendet wird, werden Antikörper zu Hefeantigenen, die in einer Testprobe vorhanden sein können, mit Hefeextrakten umgesetzt, die zu dem Probenverdünnungsmittel (typischerweise etwa 200 ug/ml) hinzugesetzt werden. Die Zugabe der Hefeextrakte zum Probenverdünnungsmittel wird dazu benutzt, um fehlerhafte positive Ergebnisse zu verhindern. Das Endmaterial wird sterilfiltriert und in Plastikflaschen abgefüllt und mit 0,1% Natriumazid konserviert.
Nach einer Stunde Inkubation bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen und 200 ul Konjugat zu den Vertiefungen der Reaktionsschale hinzugegeben.
Das bevorzugte Konjugat ist Ziegen-Anti-Human-IgG- Meerrettichperoxidase-Konjugat. Konzentriertes Konjugat wird von Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland, käuflich erworben und titriert, um eine Arbeitskonzentration zu bestimmen. Ein 20-faches Konzentrat der arbeitenden Konjugatlösung wird dann durch Verdünnen des Konzentrats in Verdünnungsmittel hergestellt. Das Konjugatverdünnungsmittel enthält 10% (V/V) Rinderserum, 10% (V/V) Ziegenserum und 0,15% Triton X-100 in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5 mit 0,01% Gentamicinsulfat, lila Farbstoff und antimykotische Agenzien als Konservierungsstoffe. Das Konjugat wird sterilfiltiert und in Plastikflaschen abgefüllt.
Nach einer Stunde Inkubation mit dem Konjugat bei 40ºC werden die Kügelchen gewaschen, dem OPD-Substrat 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgesetzt, und die Reaktion durch Zugabe von 1 N H&sub2;SO&sub4; beendet. Die Extinktion wird bei 492 nm abgelesen.
Proben, für die in einem Screening-Assay unter Verwendung des Polypeptids C100-3 herausgefunden wurde, dass sie wiederholt reaktionsfähig sind, werden zweifach unter Verwendung von mit p1684 oder p1689 beschichteten Kügelchen untersucht. Reaktionsfähige Proben werden als bestätigte Proben angesehen. Proben, die nicht mit p1684 oder p1689 reagieren, werden zweifach mit p1694- und p1866-Kügelchen untersucht. Proben, die mit einem oder beiden dieser Peptide reagieren, gelten als bestätigt. Jene Proben, die mit keinem dieser Peptide reagieren, gelten als nicht bestätigt.
Um eine akzeptable Spezifität zu erhalten, sollte der Cutoff für den Assay bei mindestens 5-15% Standardabweichungen über dem Extinktionswert des Normalpopulationsmittelwerts liegen. In Übereinstimmung mit diesen Kriterien sollte ein Cutoff für den Assay gewählt werden, der die meisten der angenommenen "wahren negativen" von den "wahren positiven" Proben deutlich trennt. Ein allgemeiner Cutoff-Wert kann als etwa das 2,1- bis 8-fache des mittleren Extinktionswerts der negativen Kontrollprobe berechnet werden.

Durchführung des Konfirmationsassays

1. Proben von intravenösen Drogenanwendern

Proben wurden von einer Population intravenöser Drogenanwender gesammelt, die in eine NIH-finanzierte Studie aufgenommen wurden. Die Population bestand aus Individuen, die anerkannte Anwender von intravenösen Drogen waren und über einen Zeitraum von 2 Jahren aus den Patienten des Edward Hines Jr. Veterans Administration Hospital in Maywood, Illinois von Dr. Connie Pachucki und Mitarbeitern der Abteilung Infectious Diseases ausgewählt wurden.
Wie in Tabelle 5 dargestellt, wurden insgesamt 296 Proben, jeweils von einem einzelnen Spender, unter Verwendung des rekombinanten Hefepolypeptids C100-3 gescreent. 271 der 296 (91,6%) Proben wurden zunächst positiv getestet. Bei einem erneuten Test waren 269 von 271 (99,3%) Proben wiederholt positiv.
Der Konfirmationstest zeigte, dass 263 von 269 (97,8%) der wiederholt positiven mit p1689 reaktionsfähig waren, fünf Proben waren nicht reaktionsfähig mit p1689, und eine Probe wurde mit keinem der Konfirmations-Polypeptide getestet. Vier der fünf Proben, die nicht reaktionsfähig mit p1689 waren, reagierten nur mit p1866. Eine Probe, die nicht mit p1689 reagierte, reagierte nur mit p1694.
Alle Proben, die wiederholt reaktionsfähig waren, wurden in Assays unter Verwendung der HCV synthetischen Peptide als reaktionsfähig bestätigt. TABELLE 5 PROBEN VON ANWENDERN INTRAVENÖSER DROGEN

2. Proben von Schimpansen

Konfirmationsassays wurden zur Bewertung von 92 Proben von sechs Schimpansen verwendet. Alle Proben waren anfänglich reaktionsfähig mit rekombinantem C100-3. (Mit Schimpasenseren wurden wegen der Seltenheit dieser Proben und deren Nützlichkeit für serologische Studien mit anderen HCV-Antigenen keine Wiederholungsuntersuchungen durchgeführt.) 83 von 92 (90,2%) Proben wurden mit p1689 als reaktionsfähig bestätigt. Die Bestätigung der anfänglich reaktionsfähigen verbesserte sich auf 96,7% (89 von 92), wenn mit p1694 und p1866 wiederholt getestet wurde.

3. Ein Chiron Corporation Non-A-Non-B-Hepatitis-Virus- Leistungstestpanel #2

Ein Leistungstestpanel, bestehend aus reinem und verdünntem Humanplasma einschließlich Proben mit Antikörpern gegen HCV C100-3, wurde von Wissenschaftlern der Chiron Corporation geliefert (12 Proben). Dieses Panel enthält Testmaterialien, die in anderen Assays von niedriger bis hoher Reaktivität reichten, als nicht reaktionsfähig angenommene "wahre negative" Testmaterialien und reaktionsfähige Testmaterialien, die so verdünnt waren, dass sie geringe oder negative Ergebnisse lieferten.
Ergebnisse unter Verwendung des Konfirmationsassays auf dem Non- A-Non-B-Hepatitis-Virus-Leistungstestpanel Nr. 2 von Chiron Corporation, zeigten an, daß 9 von 9 (100%) der Proben, die durch den vorhergehenden Screening-Assay als reaktiv eingestuft wurden, mit p1689 bestätigt sind. Alle negativen Proben waren nicht reaktionsfähig.

4. Konfirmationstest an NANB-Panel II

Ein Panel mit besonders reinrassigen Human-Seren von Dr. H. Alter, NIH, Bethesda, MD, das infektiöse HCV-Seren, negative Seren und andere Krankheitskontrollproben enthielt, wurde getestet. Insgesamt 44 Proben befanden sich auf dem Panel. Alle Proben (16/16, 100%), die in dem Assay mit C100-3 reaktionsfähig waren, wurden durch p1689 bestätigt, wie in Tabelle 6 dargestellt ist. Wiederum gab es keine nichtspezifischen Reaktivitäten, da alle reinrassig negativen Kontrollproben oder "anderen Krankheits"-kontrollproben in dem Peptidassay nicht reaktionsfähig waren. TABELLE 6 Vergleich der p1689-Ergebnisse mit HCV-Screening-Assay-Ergebnissen auf NANB-Panel II (H. Alter, NIH)
Die dargestellten Daten zeigen die Wirksamkeit des Konfirmationsassays für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV- Antigene. Der aktuelle Assay ist sowohl sensitiv als auch spezifisch für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV-Antigene. Die Daten stützen auch die Nützlichkeit der Konfirmationsstrategie unter Verwendung synthetischer Peptide. Die synthetischen Peptide dienen als eine unabhängige Antigen- Quelle für die Verwendung in Immunoassays. Die Fähigkeit, im Mittel 99% der wiederholt reaktionsfähigen Proben in hochriskanten oder reinrassig positiven HCV-Paneln zu bestätigen, beweist die Nützlichkeit dieser Strategie.

Beispiel 2. KOMBINATIONSASSAY (Referenz)

Der Kombinationsassay verwendet mehr als ein Polypeptidantigen, die auf dem gleichen Kügelchen aufgebracht sind. Um Kügelchen mit mehreren Polypeptiden herzustellen, werden die in Beispiel 1 beschriebenen Polystyrolkügelchen gleichzeitig mit den Polypeptiden in geeigneten Pufferlösungen in Kontakt gebracht. Nachdem die Kügelchen mit den Polypeptiden in Kontakt gebracht wurden, werden die Kügelchen wie oben beschrieben weiterbehandelt.
Für ein Polystyrolkügelchen mit sowohl C100-3 als auch p1694 nimmt die Sensitivität des Tests zu. Wie in Fig. 3a dargestellt, führt die Zugabe von etwa 0,3, 0,95 bzw. 3 Mikrogramm p1694 zu der Beschichtungslösung zu einem signifikanten Anstieg des Signals, wenn die Nachweisverfahren aus Beispiel 1 angewendet werden. Fig. 3b veranschaulicht graphisch die Daten, die keinen entsprechenden Anstieg des Signals zeigen (wie sich möglicherweise aus nicht spezifischen Bindungen ergeben könnte) und von negativem Human-Plasma erzeugt wurden.

Beispiel 3. SYNTHETISCHER POLYPEPTID-BASIERTER ASSAY (Referenz)

Die Verwendung von synthetischen Polypeptiden, die Epitope von HCV-Antigenen enthalten, liefert immunologische Assays, die eine erhöhte Sensitivität aufweisen und spezifischer sein können als immunologische HCV-Assays unter Verwendung von SOD- Fusionspolypeptid C100-3. Die Verwendung kürzerer Aminosäuresequenzen auf Polystyrolkügelchen führt zu einem Anstieg der Sensitivität.
Die größere Sensitivität eines Tests mit synthetischen Polypeptiden im Vergleich zu einem Test mit rekombinantem Polypeptid C100-3 wurde in einer Verdünnungsreihenuntersuchung nachgewiesen. Die Verdünnungsreihenuntersuchung verwendete 15 Proben, für die unter Verwendung eines rekombinanten C100-3- Screening-Assays nachgewiesen wurde, dass sie Antikörper gegen HCV-Antigene enthalten. Jede positive Probe wurde unter Verwendung des rekombinanten Polypeptids C100-3 in einem Test und des Polypeptids p1689 in einem zweiten Test untersucht, und die Proben wurden dann zweifach verdünnt, bis der S/CO-Wert kleiner 1 war. Bei 12 Proben führte Polypeptid p1689 zu einer erhöhten Sensitivität (größere S/CO-Werte) bei allen Verdünnungsstufen. Bei zwei Proben waren das Polypeptid p1689 und das rekombinante Hefepolypeptid C100-3 im wesentlichen gleichwertig. Bei einer Probe reagierte das Polypeptid p1689 negativ auf eine positive Probe bei allen Verdünnungsstufen. Weitere Studien an Proben von seriellen Blutproben von drei Schimpansen, die an einem akuten gelösten Fall von HCV- Infektionen erkrankt waren, und drei Schimpansen, die an chronischen HCV-Infektionen erkrankt waren, zeigten unterschiedliche Immunantworten, von denen angenommen wird, dass sie sowohl auf die Infektionsart als auch auf das im Test verwendete Polypeptid zurückzuführen sind. Diese Untersuchung testete Serum von seriellen Blutproben von sechs Schimpansen, die mit HCV geimpft waren. Die Testprotokolle waren ähnlich denen, die in Beispiel 1 oben beschrieben wurden, mit den folgenden Unterschieden.
Die Antikörper, IgG, IgM und IgA, wurden nachgewiesen unter Verwendung von affinitätsgereinigten Ziegenantikörpern gegen Human-IgG, -IgM und -IgA, die an Meerrettichperoxidase (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaitherburg, Maryland) gekoppelt waren und bei Arbeitskonzentrationen von 0,2 ug/ml Anti-IgG, 0,5 ug/ml Anti-IgM und 0,2 ug/ml Anti-IgA verwendet wurden. Die Serumverdünnungen für jeden Test lagen bei 1 : 41 für IgG, 1 : 101 für IgM und 1 : 41 für IgA.
Zu den Polypeptiden, die in der Untersuchung verwendet wurden, gehörten C100-3, p1694, p1689 und p1866.
Kurz gesagt wurden Kügelchen, die die Polypeptide enthielten, mit verdünntem Serum 1 Stunde bei 40ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden dann gewaschen und mit dem entsprechenden Ziegenantikörper 1 Stunde bei 40ºC inkubiert. Die Kügelchen wurden erneut gewaschen und der Test wurde durch Inkubation der Kügelchen mit OPD 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt. Die Farbentwicklung wurde mit 1 N Schwefelsäure gelöscht und die Resultate bei 492 nm abgelesen.
Alle Schimpansen entwickelten Antikörper, die mit C100-3, p1684 und p1866 in 7 bis 17 Wochen nach der Beimpfung (WPI) nachgewiesen wurden. Bei jedem Schimpansen tauchten IgG- Antikörper, die mit C100-3, p1684 und p1866 reagierten, etwa zur gleichen Zeit auf. Die Antwort auf p1694 und p1866 war innerhalb dieses Zeitraums variabel mit Anzeichen dafür, dass Antikörper gegen diese beiden Peptide entweder nicht nachweisbar oder signifikant verzögert in Anschluss an die HCV-Injektion sein können. Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass von den fünf untersuchten Peptiden Antikörper gegen C100-3, p1684 oder p1689 der früheste und der beständigste serologische Indikator für eine HCV-Infektion sein könnten.
IgM-Antikörper wurde bei nur drei der sechs untersuchten Schimpansen nachgewiesen. Die Antwort jedes der drei Tiere auf C100-3, p1684, p1689 und p1694 wurde in 7 bis 10 WPI nachgewiesen, wobei IgM-Antikörper gegen p1866 bei zwei Schimpansen nicht nachweisbar war und bei dem dritten verzögert war. Alle IgM-Antworten waren kurzlebig mit Leveln, die innerhalb von 2 bis 22 Wochen unterhalb positiv (S/N kleiner als 3,0) fielen.
Die Erklärung und Signifikanz für das Auffinden von IgM- Antikörpern bei drei Schimpansen mit akut zurückgehender Erkrankung während keine IgM-Antikörper bei drei Schimpansen mit chronischer Infektion gefunden werden, ist unerwartet. Vorläufige experimentelle Ergebnisse zeigten, dass falsche negative IgM-Ergebnisse aufgrund von bevorzugter IgM-Bindung eine, unwahrscheinliche Erklärung ist. Wenn das beobachtete Muster bei diesen sechs Schimpansen mit den fünf Peptiden Gültigkeit hat, dann liefern Antikörper-Assays wichtige prognostische Informationen zu HCV.
Eine positive IgA-Antwort (S/N größer 3,0) wurde nur bei zwei der sechs Schimpansen festgestellt, und es wurde nachgewiesen, dass sie entweder zweiphasig oder signifikant später als die IgG- oder IgM-Antwort ist. Obwohl diese zwei Schimpansen chronisch erkrankt waren, können keine Schlussfolgerungen bezüglich der Signifikanz von IgA-Antikörpern gemacht werden, da Seren von den drei Schimpansen mit zurückgehender Erkrankung nur für 30 bis 40 WPI erhältlich sind.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Polypeptide, wenn sie für die Untersuchung für Antikörper gegen HCV-Antigene verwendet werden, geeignet sind, das Fortschreiten einer HCV-Infektion zu verfolgen, und dass die Polypeptide eine unerwartete Sensitivität auf verschiedene Antikörper aufweisen, die während des klinischen Fortschreitens der HCV-Infektion gebildet werden.

Beispiel 4. IMMUNODOT-ASSAY (Referenz)

Das Immunodot-Assaysystem verwendet ein Panel aus gereinigten synthetischen Polypeptiden, die in einer Aufreihung auf einem festen Nitrocelluloseträger platziert sind. Der vorbereitete feste Träger wird mit einer Probe in Kontakt gebracht und fängt spezifische Antikörper gegen HCV-Antigene ein. Die eingefangenen Antikörper werden durch eine Konjugat-spezifische Reaktion nachgewiesen. Vorzugsweise wird die Konjugat-spezifische Reaktion quantifiziert unter Verwendung einer Vorrichtung zur Messung der optischen Reflexion in einem Instrument, das in EP- A-0 353 591 beschrieben wurde. Die verwandten Patentanmeldungen EP-A-0 353 589, EP-A-0 353 590 und EP-A-0 353 592 beschreiben weiterhin spezifische Verfahren und nützliche Apparate für die Durchführung eines Immunodot-Assays. Kurz gesagt wird eine Nitrocellulose-basierte-Testkassette, die in einem automatisierten Verfahren für die Durchführung eines wie oben beschriebenen Immunodot-Assays verwendet werden kann, in Fig. 4 dargestellt. Nachdem alle antigenen Polypeptide auf der Nitrocellulose platziert sind, werden überschüssige Bindungsstellen auf der Nitrocellulose blockiert. Die Testkassette wird dann mit einer Testprobe so in Kontakt gebracht, dass jedes antigene Polypeptid in jeder Reaktionszone reagiert, falls die Probe den entsprechenden Antikörper enthält. Nach der Reaktion wird die Testpatrone gewaschen und alle Antigen-Antikörper-Reaktionen werden unter Verwendung geeigneter, wohlbekannter Reagenzien identifiziert.
Wie in den oben genannten Patentanmeldungen beschrieben wird, ist das gesamte Verfahren für die Automatisierung geeignet. In einem bevorzugten Immunodot-Assay wurden die synthetischen Polypeptide p1223, p1684, p1689 und p1866 in einer wässrigen gepufferten Lösung verdünnt (Polypeptidverdünnungsmittel: 0,03% Trixon X-100 und 0,1% Natriumazid in 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,6) und auf eine vormontierte Nitrocellulose-Testkassette mit etwa 40 ng in jeder Reaktionszone aufgebracht. Nach Trocknen der Kassette über Nacht bei Raumtemperatur wurde die nichtspezifische Bindekapazität der Nitrocellulosephase geblockt. Die Blockierungslösung enthielt 1% Schweinegelatine, 1% enzymatisches Caseinhydrolysat, 5% Tween-20, 0,1% Natriumazid, 0,5 M Natriumchlorid und 20 mM Tris, pH 7,5.
Testkassetten wurden mit Proben 00642 und 423 (siehe Tabelle 1) und ALT 27 inkubiert. Die Probe ALT 27 wurde von einem freiwilligen Spender erhalten, der erhöhte Alaninaminotransferasepegel aufwies. Nach Probeninkubation führten nachfolgende Inkubationen mit einem Biotin-konjugierten Ziegen-Anti-Human-Immunglobulin-spezifischen Antikörper, einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Hasen-Anti-Biotin- spezifischen Antikörper und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat zu einem farbigen Produkt an der Stelle der Reaktion.
Eine nachweisbare Reaktion wird durch die Bildung eines sichtbar wahrnehmbaren Produkts an der Antigenstelle in der Anordnung definiert; bei Quantifizierung mit dem Messgerät wird ein Reflexionsdichte(Dr)-Wert größer oder gleich etwa 0,0150 über dem Hintergrundsignal erhalten. Keines der getesteten Polypeptide löste eine nachweisbare Reaktion mit einem negativen Kontrollserum aus, für das zuvor unter Verwendung eines rekombinanten Polypeptids C100-3 gezeigt wurde, dass die Reaktion auf Antikörper gegen HCV-Antigene negativ ist.
Eine Reaktion mit jedem der synthetischen Polypeptide p1684, p1689, p1694 und p1866 trat auf, wenn die vorbereiteten Testzellen entweder mit Probe 00642 (Verdünnung 1 : 100 in negativem Serum) oder mit Probe 423 (Verdünnung 1 : 40 in negativem Serum) inkubiert wurden. Polypeptid p1223, zusätzlich zu den Polypeptiden p1684, p1689, p1694 und p1866, zeigte eine signifikante Reaktion mit dem erhöhten Testmaterial ALT 27. Bei allen Proben wurde die höchste Reaktivität mit p1689 erhalten. Eine verbesserte Reaktivität von Polypeptid p1684 mit Probe 00642 wurde durch leichte Modifikation der Antigenverdünnung erreicht (das modifizierte Polypeptidverdünnungsmittel war 0,5 M Natriumchlorid, 0,0022% Trixon X-100 und 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5).
Die Nettoreflexion (Dr) für eine Testkassette mit den Polypeptiden p1223, p1684, p1689, p1694 und p1866, die eine positive oder negative Antwort zeigen, ist in Tabelle 7 aufgeführt. TABELLE 7 NETTOREFLEXIONSDICHTE (INTERPRETATION*)
*+/ - Werte basierend auf S/N
- Reflexionsdichte/Hintergrund < 2,5
+ 2,5< Reflexionsdichte/Hintergrund < 100
++ 100< Reflexionsdichte/Hintergrund< 1000
+++ Reflexionsdiche/Hintergrund > 1000

Beispiel 5. KOMPETITIVASSAY (Referenz)

Die synthetischen Peptide mit antigenen HCV-Epitopen sind nützlich für Kompetitivassays. Zur Durchführung eines Neutralisationsassays werden Peptide, die Epitope innerhalb der C100-3-Region aufweisen, z. B. p1694, p1684 oder p1689, und 34 sind mit einem Probenverdünnungsmittel auf eine Endkonzentration von 0,5-50 ug/ml gemischt. Zehn Mikroliter (ul) Testmaterial oder verdünntes Testmaterial wird zu einer Reaktionsvertiefung hinzugesetzt, gefolgt von 400 ul des Probenverdünnungsmittels, das Peptid enthält, und falls erwünscht kann das Gemisch etwa 15 Minuten bis zwei Stunden vorinkubiert werden. Ein mit HCV- Antigen C100-3 überzogenes Kügelchen wird dann zu der Reaktionsvertiefung hinzugegeben und eine Stunde bei 40ºC inkubiert. Nach dem Waschen wird 200 ul Peroxidase-markiertes Ziegen-Anti-Human-IgG in Konjugatverdünnungsmittel hinzugegeben und eine Stunde bei 40ºC inkubiert. Nach dem Waschen wird OPD- Substrat hinzugegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 N Schwefelsäure beendet und die Extinktion bei 492 nm abgelesen.
Proben mit Antikörpern gegen das Antigen C100-3 erzeugen ein reduziertes Signal, was durch die kompetitive Bindung der Peptide an diese Antikörper in Lösung verursacht wird. Den prozentuale Anteil an kompetitiver Bindung kann durch Vergleich des Extinktionswerts der Probe bei Vorhandensein eines synthetischen Peptids mit dem Extinktionswert der untersuchten Probe bei Fehlen eines synthetischen Peptids in derselben Verdünnung berechnet werden.

Beispiel 6. EIA-ASSAY (Referenz)

Kügelchen wurden entweder mit den Peptiden 380-436 und 447-483, 643-686 oder 2302-2353 entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren beschichtet, mit der Ausnahme, dass die Peptide 380-436 und 447-483 gleichzeitig auf die gleiche feste Phase aufgebracht wurden und beide Sequenzen von der vermeintlichen Hüllregion von HCV sind. Jedes Peptid allein zeigte Aktivität in diesem Assaytyp. EIA wurde unter Verwendung aller hier beschriebenen Kügelchenkonfigurationen durchgeführt. Das durchgeführte EIA-Verfahren war so, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einem Cutoff bei dem 4fachen des negativen Kontrollwerts. Tabelle 8 zeigt Daten, die aus diesen Assays erhalten wurden, bei denen Serumproben von Patienten, denen chronische NANBH diagnostiziert wurde, untersucht wurden. TABELLE 8 ANTIGEN

Beispiel 7. EIA UNTER VERWENDUNG VON p380.LG (gemäß der Erfindung) und p380 (Referenz)

Kügelchen wurden entweder mit p380.LG oder mit p380 entsprechend Beispiel 1 beschichtet. Ein EIA entsprechend den Verfahren nach Beispiel 1 wurde für die Untersuchung von Proben verwendet. Wie aus den Daten in Tabelle 9 ersichtlich ist, wies das Peptid p380.LG Antikörper in Proben nach, die für p380 negativ waren. Die HCV-Sequenz ist stark variabel in der Region der Aminosäuren 380-436. Daher gibt es eine begründete Wahrscheinlichkeit, dass eine Unterscheidung zwischen HCV-"Serotypen", basierend auf der Reaktivität von Humanproben, auf die eine oder andere dieser Hüllregionpeptidsequenzen möglich ist. Die Daten aus Tabelle 9 lassen vermuten, dass p380.LG chronisch infizierte HCV-Patienten nachweisen kann, die auf p380 negativ reagieren. TABELLE 9

Beispiel 8. EIA UNTER VERWENDUNG VON p2302 (Referenz)

Kügelchen wurden entweder mit p2302 oder rekombinanten HCV- Antigenen entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 1 beschichtet. Die mit den rekombinanten Antigenen beschichteten Kügelchen enthielten Antigene der NS3(CKS-33C)-, NS4(C-100)- und Kern(CKS-CORE)-Regionen des HCV-Genoms. Eine Patientenprobe, die Serokonversion gegen p2302 aufwies, jedoch nicht gegenüber den Antigenen von HCV 2.0, ist in Fig. 5 dargestellt. Daher verbessert dieses Peptid die Fähigkeit, mit HCV infizierte Personen nachzuweisen.

Beispiel 9. PEPSCAN-PROTOKOLL (Referenz)

Die NS1-Region des HCV-Genoms von Aminosäure 600-720 wurde durch PEPSCAN-Analyse kartiert, wobei es sich um eine serologische Analyse einer Reihe sich überlappender Peptide handelt, die die Proteinsequenz überspannt, um die immunogenen Domänen zu identifizieren. Insgesamt 106 sich überlappende Hexamerpeptide wurden auf Polypropylennadeln nach den Anweisungen des Herstellers (Cambridge Research Bioscience, Valley Stream, NY) synthetisiert. Fab-Dimere von IgG, gereinigt von Seren von Personen, die seropositiv für HCV sind, wurden mit diesen Peptiden getestet. Auf der Basis der Reaktivität in EIA (durchgeführt wie vom Hersteller beschrieben) wurden vier Peptidsequenzen ausgewählt, wie in Tabelle 10 dargestellt.

TABELLE 10

AMINOSÄURESEQUENZ VON PEPTIDEN, AUSGEWÄHLT AUS DER NS1-REGION DES HCV-GENOMS (AMINOSÄUREN 600-720) AUF BASIS EINER PEPSCAN- ANALYSE

Aminosäure des HCV-Genoms Peptidsequenz

607-627 CLVDYPYRLWHYPCTINYTIF
643-663 ACNWTRGERCDLEDRDRSELSY
666-683 LLTTTQWQVLPCSFTTPLY
691-714 HLHQNIVDVQYLYGVGSSIASWAI
Jedes dieser Peptide wurde durch eine schrittweise Festphasensynthese, beginnend am Carboxy-Terminalrest, synthetisiert. Ein Panel von Seren, die positiv für Antikörper gegen das C-100-Protein von HCV waren, wurde auf ihre Reaktivität gegen das NS-Peptid durch Mikrotiter-EIA getestet, wie nachfolgend beschrieben.

EIA-PROTOKOLL

Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 100 ul des Peptids bei 10 ul/ml in 0,02 M Bicarbonatpuffer, pH 9,5, bei Raumtemperatur 12-16 Stunden beschichtet. Nach Waschen mit phoshatgepufferter Salzlösung (PBS), die außerdem 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,05% Tween-20® (erhältlich von BioRad Laboratories, Richmond, CA) enthielt, wurden freie Stellen mit 1% BSA in Bicarbonatpuffer, pH 9,5, überzogen. Die Platten wurden nach einem letzten Waschgang bei 4ºC gelagert. Seren von Personen, die seropositiv für Antikörper gegen HCV C- 100 sind, wurden seriell verdünnt in 100 ul eines Puffers, der 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 20% normales Ziegenserum, 10% Fetalkälberserum, 5 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 mM Tris, 0,2% Tween-20 mit Natriumazid als Konservierungsmittel, pH 6,8, enthielt. Die verdünnten Seren wurden mit Peptiden in Mikrotitervertiefungen 3 Stunden bei 37ºC oder über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Platten wurden gewaschen und 100 ul passend verdünnter Ziegen-Anti-Maus(HH)- Meerrettichperoxidase(HRPO)-konjugierter Antikörper (Jackson Immunochemicals, West Grove, PA) wurden hinzugegeben. Die Platten wurden bei 37ºC zwei Stunden inkubiert. Nach einer letzten Waschung wurde 100 ul O-Phenylendiamin-2HCl(OPD)- Farbreagenz hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur in der Dunkelheit 20-25 Minuten durchgeführt und durch Zugabe von 100 ul 1 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Extinktion des Reaktionsgemischs wurde bei 492 nm aufgezeichnet. Eine negative Kontrollprobe, für die zuvor bestätigt wurde, dass sie für HCV- Infektion negativ ist, war bei jeder Platte dreifach eingeschlossen. Die Probe wurde als reaktionsfähig angesehen, wenn die Extinktion der Probe bei einer Verdünnung von 1 : 2000 drei Mal so groß wie die Extinktion der negativen Kontrollprobe bei der gleichen Verdünnung war. Tabelle 11 zeigt die Reaktivität dieser Proben mit jedem einzelnen Peptid.
Die Legende für Tabelle 11 ist wie folgt:
+ = Probe mit 3facher Extinktion bei 492 nm der negativen Kontrollprobe
++ = Probentitration auf Verdünnung 1 : 5000
+++ = Starke Reaktivität mit Probentitration auf Verdünnung 1 : 10.000 TABELLE 11 REAKTIVITÄT EINES PANELS HCV-SEROPOSITIVER RPOBEN MIT NS1-PEPTIDEN DURCH MIKROTITER-EIA Peptide gewählt aus der NS1-Region (Nummern der Aminosäuren)
*Alle Proben zeigten das Vorhandensein von Antikörpern gegen Hepatitis C Virus durch EIA- sowie durch Western-Blot-Analyse.

Beispiel 10. SYNTHETISCHE PEPTIDE AM 5'-ENDE VON E2/NS1

Für das 5'-Ende der vermeintlichen E2/NS1 Strukturregion von HCV wurde gezeigt, dass sie hypervariabel ist bezüglich Nucleinsäure- und Aminosäuregehalt unter mehreren Virusisolaten, die weltweit untersucht wurden. Es wurde darüber spekuliert, jedoch nicht bewiesen, dass diese Region in einen Virusmechanismus zum Bekämpfen der Wirtsimmunüberwachung involviert ist. Wenn diese Region unter humoralen Immunselektionsdrücken zu mutieren wäre, dann sollten spezifische Antikörperantworten auf genotypische Varianten des Virus in HCV-infizierten Patienten nachweisbar sein. Wir zeigten das Vorhandensein mehrerer Epitope innerhalb dieser hypervariablen Region, wodurch die Hypothese unterstützt wurde, dass wie in Flaviviren und Pestiviren diese E2/NS1-Region dem Immunsystem des Wirts und den nachfolgenden Selektionsdrücken gegenüber antigenetisch verschiedenen Varianten ausgesetzt ist. Synthetische Peptide wurden auf der Basis der Sequenzen von vier verschiedenen HCV-Isolaten hergestellt. Die Peptide repräsentierten die Sequenz von Aminosäure 380 bis Aminosäure 436 des großen offenen Leserahmens von HCV. Ein kleineres Peptid, das durch die Aminosäuren 408-436 codiert wurde, wurde ebenfalls synthetisiert. Die Sequenzen wurden von HCV-1 (Chiron- Prototyp), HCV G83 (p380.LG), HCV-JH-1 und HCV-J erhalten. Peptid HCV-JH-1 war wie von K. Takeuchi et al., Nucleic Acids Research 18: 46226 (1989) beschrieben, während Peptid HCV-J wie von N. Kato et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 87: 9524-9528 (Dezember 1990) beschrieben war. Obwohl sie durch die gleiche Genregion codiert werden, unterscheidet sich jedes dieser Peptide von den anderen um mindestens 25% (im Bereich 25-35%) auf der Basis einer Aminosäuresequenz über eine Spanne von 57 Aminosäuren. Peptid 408-436 wurde auf der Basis der Sequenzen von HCV-JH-1 und HCV-J, die in dieser Region identisch sind, hergestellt. Jedes dieser Peptide wurde unter den Beschichtungsbedingungen, die in Tabelle 4 aufgelistet sind, auf eine feste Phase aufgetragen und als Antigenziele in getrennten Enzymimmunoassays (EIAs) verwendet, entsprechend der Verfahren, die weiter oben für EIA beschrieben sind. Die Spezifität der einzelnen EIAs wurde durch die Untersuchung von Populationen normaler Plasmaspender gezeigt. Ein Cutoff-Wert von 4 Mal der negativen Kontrollprobe wurde für alle Analysen verwendet. Populationen von chronischen HCV-Patienten aus den USA und Italien, Akutphasen-HCV-Patienten aus den USA und Italien und HCV-Antikörper positiver Plasmaspender aus den USA und Japan wurden untersucht.
Daten von Untersuchungen an chronischen Patienten und Plasmaspendern sind in Tabelle 12 dargestellt. Antikörper wurden zu jedem der vier verschiedenen synthetischen Peptide bei chronischen HCV-Patienten nachgewiesen. Der häufigste gemeinhin erkannte Serotyp bei den Patienten aus den USA war HCV-1 (43,5%), während der am wenigsten reaktionsfähige HCV-J (12,9%) war. Unter italienischen Patienten jedoch war HCV-G83 der häufigste Serotyp (52,0%), und HCV-1 (12,0%) war gemeinhin der am wenigsten in diesen Patienten gefundene. Die allgemein am häufigsten erkannte HCV-Variante bei für andere HCV-Antikörper positiven Plasmaspendern aus den USA war HCV-1. Umgekehrt war die HCV-1-Variante die am seltensten erkannte Variante bei japanischen Spendern. Die HCV-G83-Variante wurde am häufigsten bei japanischen Spendern erkannt und war auch nahezu genauso reaktionsfähig wie HCV-1 bei den Spendern aus den USA.
Serokonversion gegen mindestens einen dieser Serotypen wurde in der akuten Phase mehrerer HCV-infizierter Patienten beobachtet. Verlust des Antikörpersignals gegen einen Serotyp und die gleichzeitige Serokonversion gegen einem zweiten Serotyp wurde bei einem Patienten beobachtet.
Unter der Gruppe von Plasmaspendern aus den USA waren drei Proben, die nachweisbar Antikörper gegen alle vier verwendeten unterschiedlichen Peptide aufwiesen, woraus auf das Vorhandensein von mindestens einem erhaltenen Epitop innerhalb der Region 380-436 geschlossen werden konnte. Da die Sequenzen in der zweiten Hälfte (Aminosäure 408-436) dieser Region unter den vier Virusisolaten besser erhalten sind, wurde dieses Peptid auf der Basis der HCV-JH-1- und HCV-J-Sequenzen präpariert, die in dieser Region identisch sind. Alle drei Proben waren auch reaktionsfähig gegen diese kleinere, besser erhaltene Region, was die Existenz eines erhaltenen Epitops innerhalb dieser Grenzen demonstrierte. TABELLE 12 HCV-SEROTYP-ANALYSE
*Einige Proben verarmt.
Unsere Daten demonstrieren daher die Existenz von mindestens zwei Epitopen innerhalb der hypervariablen Region von HCV E2/NS1. Wir schließen daraus, dass die Genotypvariabilität in dieser Region aus antigenetisch verschiedenen HCV-Varianten resultierte. Eindeutige E2/NS1-Antikörperreaktionen können bei Patienten mit akuter oder chronischer HCV-Infektion sowie bei Plasmaspendern aus verschiedenen Teilen der Welt gefunden werden. Unsere vorläufigen Daten deuten daher auf die Möglichkeit geographischer Variabilität auch in Hinblick auf Antikörperantworten auf HCV. Es ist wahrscheinlich, dass ein großer Teil der Patienten mit chronischer HCV-Infektion Antikörper gegen die hypervariable Region von E2/NS1 hat, da für 58% bzw. 68% der chronischen Patienten aus den USA bzw. Italien unter Verwendung von Sequenzen von nur vier HCV-Isolaten von uns nachgewiesen wurde, dass sie reaktionsfähig auf diese Region sind. Die Auswirkungen für die HCV-Impfstoff-Entwicklung sind signifikant, falls virusneutralisierende Epitope innerhalb dieser hypervariablen Region existieren.
Die in den Assays verwendeten Polypeptide dieser Erfindung können zusammen mit den in EP-A-0 445 423 beschriebenen verwendet werden, um eindeutige Assays für den Nachweis verschiedener Epitope von HCV zu entwickeln. Diese Kombination von Polypeptiden kann zum Beispiel durch Beschichten einer festen Oberfläche mit mehr als einem Peptid erreicht werden oder durch Verwendung eines Gemischs fester Träger, worin das Gemisch aus einer einzigartigen Mischung aus zwei oder mehr Polypeptiden gegen HCV besteht. Diese Techniken sind dem Praktiker bekannt.

SEQUENZLISTE

1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANTRAGSTELLER: LESNIEWSKI, RICHARD R. LEUNG, TAT K.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR DETEKTION VON HEPATITIS C
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 27
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) EMPFÄNGER: ABBOTT LABORATORIES CHAD377/AP6D
(B) STRASSE: ONE ABBOTT PARK ROAD
(C) STADT: ABBOTT PARK
(D) STAAT: ILLINOIS
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60064-3500
(v) COMPUTERLESBARES FORMAT:
(A) MEDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1,25
(vi) AKTUELLE ANTRAGSDATEN:
(A) ANTRAGSNUMMER:
(B) AUSSTELLUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATIONEN ZU ANWALT/AGENT:
(A) NAME: POREMBSKIP, PRISCILLA E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33.207
(C) REFERENZ/LISTENNUMMER: 4767.P3.03
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSDATEN:
(A) TELEFON: 708-937-6365
(B) TELEFAX: 708-937-9556
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQUENZ-IDENTIFIKATIONS-NR. 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 75 Aminosäuren
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(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
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(A) LÄNGE: 57 Aminosäuren
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(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
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(B) TYP: Aminosäure
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(A) LÄNGE: 41 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
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(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
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(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
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(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 57 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANG: einfach
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(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-IDENTIFIKATIONS-NR. 26:
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQUENZ-IDENTIFIKATIONS-NR. 27:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANG: einfach
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(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZ-IDENTIFIKATIONS-NR. 27:

Claims

1. Ein Assay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem Hepatitis-C-Virus(HCV)-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, wobei der Assay folgende Schritte umfaßt: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind; und Nachweis des Antikörper-Polypeptid-Komplexes.

2. Der Assay nach Anspruch 1, worin das Polypeptid an einen festen Träger gebunden ist.

3. Ein Kombinationsassay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, wobei der Assay folgende Schritte umfaßt: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem festen Träger, an den mindestens ein Polypeptid gebunden ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind; und Nachweis des Antikörper-Polypeptid-Komplexes.

4. Der Assay nach Anspruch 3, worin der feste Träger ein Polystyrolkügelchen ist.

5. Ein Konfirmationsassay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers in einer flüssigen Probe, der mit einem HCV- Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, worin die Probe dazu verwendet wird, erste und zweite Aliquote zu erzeugen, und wobei das erste Aliquot in Kontakt gebracht wird mit einem ersten Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptid geeignet sind, und worin der erste Antikörper- Antigen-Komplex nachgewiesen wird;

In-Kontakt-Bringen des zweiten Aliquots mit einem zweiten Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, unter Bedingungen, die geeignet sind, einen zweiten Antikörper- Antigen-Komplex zu bilden, wobei das zweite Polypeptid sich von dem ersten Polypeptid unterscheidet; und

Nachweis des zweiten Antikörper-Antigen-Komplexes.

6. Der Assay nach Anspruch 5, worin die Antigene an einen festen Träger gebunden sind.

7. Der Assay nach Anspruch 6, worin der feste Träger ein Polystyrolkügelchen ist.

8. Ein Immunodot-Assay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, wobei der Assay folgende Schritte umfaßt:

gleichzeitiges In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens zwei Polypeptiden, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und die jeweils verschiedene Epitope eines HCV- Antigens enthalten und auf einen festen Träger aufgebracht sind, unter Bedingungen, die für die Komplexbildung zwischen Antikörper und Polypeptiden geeignet sind;

Nachweis des Antikörper-Polypeptid-Komplexes durch Umsetzung des Komplexes mit farbbildenden Reagenzien.

9. Ein Kompetitivassay zum Erkennen des Vorhandenseins eines Antikörpers, der mit einem HCV-Antigen immunologisch reaktionsfähig ist, in einer flüssigen Probe, worin die Probe dazu verwendet wird, erste und zweite immunologisch äquivalente Aliquote zu erzeugen, wobei der Assay folgende Schritte umfaßt:

In-Kontakt-Bringen des ersten Aliquots der Testprobe mit einem festen Träger, der mit mindestens einem Polypeptid beschichtet ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält, unter Bedingungen, die geeignet sind, mit dem Antikörper einen Komplex einzugehen, unter Ausbildung eines nachweisbaren Antikörper-Polypeptid-Komplexes;

In-Kontakt-Bringen des zweiten Aliquots mit dem Polypeptid, das ungebunden ist, und dann In-Kontakt-Bringen des zweiten Aliquots mit einem festen Träger, der mit dem Polypeptid überzogen ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, mit dem Antikörper einen Komplex einzugehen, unter Ausbildung eines nachweisbaren Antikörper-Polypeptid-Komplexes;

Nachweis des Vorhandenseins von gebundenem oder ungebundenem Antikörper.

10. Ein Kit für einen Immunoassay nach den Ansprüchen 1-9, folgendes umfassend:

ein Polypeptid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus p380JH1, p380J, p380.LG und p408J besteht, wie in Tabelle 3 beschrieben, und das mindestens ein Epitop eines HCV-Antigens enthält;

eines oder mehrere Probenherstellungsreagenzien; und

eines oder mehrere nachweis- und signalproduzierende Reagenzien.

11. Das Kit nach Anspruch 10, worin die Polypeptide auf einen festen Träger aufgetragen sind.