DE69228555T2

DE69228555T2 - Erhöhte cyclodextrin-produktion

Info

Publication number: DE69228555T2
Application number: DE69228555T
Authority: DE
Inventors: Allan Hedges; Wen Shieh
Original assignee: Cerestar USA Inc
Current assignee: Cerestar USA Inc
Priority date: 1991-10-07
Filing date: 1992-10-02
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2012-10-03
Also published as: CN1071435A; EP0607264A1; HU9400975D0; JPH07504804A; WO1993007285A1; EP0607264A4; US5326701A; JP2640875B2; DE69228555D1; EP0607264B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Cyclodextrine und dabei spezieller auf ein Verfahren zur Verbesserung der Herstellung von Alpha- und Beta-Cyclodextrin mit einer Amylase in Form von Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase, die aus dem Bacillus Macerans erhalten wird.
Amylase sind Enzyme, die die Hydrolyse der Alpha 1,4-Bindung in Amylase und Amylopectin fördern, in die beiden Glycosepolymere, die die Stärke bilden. Amylase werden durch eine große Anzahl von Pflanzen, Bakterien und Tieren erzeugt.
Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase (CGTase), die auch als Cycloamylose- Glucanotransferase bezeichnet wird, wurde zuerst aus Bakterien isoliert, nämlich aus dem Bacillus Macerans, und zwar im Jahre 1939 durch Tilden und Hudson. Seit dieser Zeit wurde CGTase auch von dem Bacillus Megaterium, Bacillus Circulans, Bacillus Stearothermophilus, Klebstella Pneumoniae und Bacillus Species (Alkalophilic, vergl. US-Patent Nr. 3 826 715, veröffentlicht juli 30, 1974) gewonnen. CGTase sind hinsichtlich ihrer Fähigkeiten, Cyclodextrine zu bilden, bekannt.
Cyclodextrine sind auch als Schardinger Dextrine bekannt und sind zusammengesetzt als Anhydroglucose-Gruppen, die miteinander durch Alpha 1,4 Bindungen in einem Ring oder Torus verbunden sind. Die Anzahl der Anhydroglucosegruppen im Ring bestimmen den Namen. Alpha-Cyclodextrin besitzt 6 Anhydroglucosegruppen, während Beta-Cyclodextrin 7 Anhydroglucosegruppen und Gamma-Cyclodextrin 8 Anhydroglucosegruppen aufweist. Wenn die Anhydroglucosegruppen zum Ring verbunden sind, und zwar über Bindungen, die keine Alpha 1,4 Bindungen sind und die den Ring nicht selbst bilden, wird das Cyclodextrin als verzweigtes Cyclodextrin bezeichnet. Cyclodextrine finden Anwendungen in vielen Bereichen, und zwar wegen ihrer Eigenschaft Komplexe mit anderen Verbindungen zu bilden. Cyclodextrine werden üblicherweise hergestellt durch Einwirken von CGTase auf ein Sträkesubstrat, beispielsweise Stärke oder ein Stärkehydrolysat welches einen DE-Wert zwischen 1 und 10 aufweist. Typischerweise wird die Hydrolyse-Reaktion bei einem für das Enzym optimalen PH-Wert und einer für das Enzym optimalen Temperatur ausgeführt. Für CGTase, welches von B. Macerans erhalten wurde, liegen der optimale PH-Wert zwischen 5 und 7 und die optimale Temperatur zwischen 50 und 60ºC.
Es ist auch bekannt, daß CGTase, welches von B. Macerans erhalten wird, unter Verwendung eines Katalysators die Produktion von Alpha-, Beta- und Gamma- Cyclodextrinen veranlaßt. Typischerweise beträgt der Anteil an Alpha-Cyclodextrinen ungefähr 63 Gewichtsprozent, an Beta-Cyclodextrin ungefähr 30 Gewichtsprozent und an Gamma-Cyclodextrin ungefähr 7 Gewichtsprozent, und zwar bezogen auf die Gesamtmenge des erzeugten Cyclodextrins.
Es ist auch bekannt, daß die Zugabe bestimmter Komplexbilder zum Reaktionsmedium bewirkt, daß das Reaktionsgleichgewicht so verschoben wird, daß bevorzugt Alpha- Cyclodextrin oder aber bevorzugt Beta-Cyclodextrin produziert wird. So lehrt beispielsweise das am 08. Februar 1972 veröffentlichte US-Patent 36 40 847, daß die Anwesenheit von 1-Decanol bei einer Temperatur von ungefähr 50 Cº und bei einem PH-Wert von ungefähr 7 bewirkt, daß bevorzugt Alpha-Cyclodextrin erzeugt wird, während die Anwesenheit von Toluol oder Toluene bewirkt, daß bevorzugt Beta- Cyclohexan produziert wird. Das US-Patent 3 640 847 lehrt, daß Cyclohexan bevorzugt Beta-Cyclodextrin erzeugt, wenn das Stärkesubstrat ein Stärkehydrolysat ist, und eine Mischung von Alpha- und Beta-Cyclodextrinen, wenn das Substrat eine gelatinierte Stärke ist, vergleiche Bespiele 1 bzw. V.
Ein Verfahren zur Isolierung einer im wesentlichen reinen Form von Alpha- Cyclodextrin aus einer Mischung von Alpha-Cyclodextrin und Beta-Cyclodextrin ist ebenfalls bekannt, und zwar aus dem US-Patent 3 541 077. Dieses bekannte Verfahren schließt hauptsächlich ein Konzept einer selektiven Komplexbildung der Alphaform bei Anwesenheit der Betaform ein, dann das Gewinnen der Alphaform als ein nichtlösbarer Alphakomplex und das anschließende Separieren des Alpha- Cyclodextrins vom Komplexbildner. Dieses bekannte Verfahren enthält auch die Lehre einer wässerigen Lösung der Mischung von Cyclodextrinen, wobei diese Lösung einen Anteil von wenigstens 5 Gewichtsprozent an festen Bestandteilen aus Alpha- Cyclodextrin und Beta-Cyclodextrin mit einem Alpha-Cyclodextrinkomplexbildner enthält. Der Komplexbildner wird der wässerigen Lösung der Mischung in einem Anteil zugegeben, der ausreicht, um eine Komplexbildung lediglich mit der Alphaform und um lediglich das Ausfällen der Alphaform in der Anwesenheit der gelösten Betaform zu erreichen.
Das US-Patent 36 52 398 lehrt ein Verfahren zum Herstellen eines Cyclodextrins unter Verwendung einer granularen modifizierten Stärke, die mit einer Cyclodextrin- Glycocyl-Transferase behandelt wird, welche von dem Bacillus Macerans erhalten wurde, und zwar bei einer Temperatur von 40-65 Cº.
Weiterhin ist auch bekannt, daß Cyclohexan während des Umwandlungsprozesses von Stärkehydrolysat bei der Herstellung von Alpha-Cyclodextrin verwendet werden kann, wobei bei diesem bekannten Umwandlungsprozeß eine Temperatur von ungefähr 55Cº verwendet wird (Proceedings of the fourth international symposium on cyclodextrins, April 1988, München, Seiten 33-39).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues und verbessertes Verfahren zum Herstellen von Alpha-Cyclodextrin mit einer erhöhten Produktausbeute aufzuzeigen.
Es wurde nun festgestellt, daß das Reaktionsgleichgewicht zwischen CGTase aus B- Macerans und einem Sträkesubstrat zur Erhöhung der Produktion von Cyclodextrin und dabei lediglich von Alpha- und Beta-Cyclodextrin im wesentlichen ohne Gamma- Cyclodextrin verschoben werden kann, und zwar durch Herabsetzung der Temperatur, bei der die Reaktion erfolgt und bei Durchführung der Reaktion in der Anwesenheit von Cyclohexan. Es wurde speziell erkannt, daß dann, wenn das Stärkesubstrat mit einer Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase auf der Basis von B. Macerans bei einer Temperatur von ungefähr 45 Cº und darunter bei der Anwesenheit von Cyclohexan behandelt wird, der Anteil an hergestelltem Cyclodextrin erhöht wird, und zwar im Vergleich zum Anteil an Cyclodextrin, welches bei der für das Enzym optimalen Temperatur von 50-60 Cº erhalten wird.
Dies ist sowohl überraschend, als auch unerwartet, da die herkömmliche Denkweise darin bestand, daß eine Reduzierung der Temperatur, bei der die Reaktion stattfindet, lediglich zu einer Abnahme in der Geschwindigkeit der Hydrolyse-Reaktion führt und dies eine Abnahme der Produktion des gesamten Cyclodextrin zufolge hat. Die Erkenntnis, daß der Anteil an produziertem Cyclodextrin tatsächlich aber ansteigt, ist unerwartet.
Weiterhin ist es ebenfalls überraschend, daß tatsächlich kein Gamma-Cyclodextrin produziert wird, da es bekannt ist, daß B. Macerans normalerweise zumindest einen gewissen Anteil an Gamma-Cyclodextrin erzeugt.
Es wurde auch festgestellt, daß Alpha-Cyclodextrin hergestellt wird, wenn das Stärkesubstrat eine hydrolysierte Stärke ist. Es ist überraschend, daß die Anwesenheit von Cyclohexan während der Umwandlung eines Sträkehydrolysats in Cyclodextrin dazu führt, daß ein Alpha-Cyclodextrin erzeugt wird, da bisher nicht bekannt war, daß Cyclohexan die Produktion von Alpha-Cyclodextrinen fördert.
Die vorliegende Erfindung schafft also ein Verfahren zur Herstellung von Alpha- Cyclodextrinen, welche gekennzeichnet ist durch Behandlung eines Stärkehydrolysats mit einer Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase, die mit dem Bacillus Macerans gewonnen wurde, und zwar bei einer Temperatur zwischen etwa 15ºC und ungefähr 40ºC in der Anwesenheit von Cyclohexan, sowie durch Rückgewinnung des Alpha- Cyclodextrins.
Es wurde festgestellt, daß es die Kombination der niedrigen Temperatur, der Anwesenheit von Cyclohexan und des B. Macerans-Enzyms sind, die die erhöhte Cyclodextrinproduktion oder -ausbeute verursachen. Weder die niedrige Temperatur, noch das Cyclohexan für sich allein bewirken eine Erhöhung der Produktion von Cyclodextrin. Auch die Kombination der niedrigen Temperatur und Cyclohexan bewirken mit einer anderen CGTase eine Erhöhung der Produktion von Cyclodextrin.
Es ist nicht exakt bekannt, weshalb die Kombination aus Temperatur und Cyclohexan den Anstieg in der Cyclodextrinausbeute bzw. Produktion bewirken. Die Hypothese hierzu ist, daß die Temperatur und das Cyclohexan in Kombination eine Auswirkung auf die Struktur des Enzyms in der Lösung haben könnten, so daß dieses zu einer Erhöhung der Produktion von Cyclodextrin veranlaßt wird. Weiterhin ist noch nicht verstanden, weshalb eine Verschiebung in der Menge des individuell produzierten Alpha- und Beta-Cyclodextrin stattfindet. Aus praktischer Sicht liegt aber eine Gesamterhöhung bei Alpha-Cyclodextrin vor.
Geeignete Sträkesubstrate schließen gelatinierte Stärke und Sträkehydrolysate ein. Die Basisstärke kann von jeder vegetativen Quelle stammen, und zwar einschließlich Mais, Weizen, Kartoffel, Reis, Tapioka und Zuckerkirsche usw.. Zusätzlich sind verschiedene Variationen der Stärkequellen denkbar, wie beispielsweise Waxy-Mais (mit einem hohen Anteil an Amylopektin) oder Hoch-Amylose-Mais (mit einem hohen Anteil an Amylose). Vorzugsweise ist die Stärke eine Waxy-Mais-Stärke. Das Sträkehydrolysat sollte ein Dextroseäquivalent (DE) zwischen 1 und 10 und dabei vorzugsweise ein Dextroseäquivalent von ungefähr 5 aufweisen. Das Hydrolysat wird durch die Reaktion einer Säure oder eines Enzym mit der granulare Stärke erhalten. Vorzugsweise ist das Stärkehydrolysat durch Einwirkung von Alpha-Amylase, beispielsweise bakterieller Alpha-Amylase auf gelatinierte granulare Stärke hergestellt. Das bevorzugte Stärkesubstrat ist ein Waxy-Sträke-Hydrolysat, welches aus einer Waxy-Mais-Stärke mit einem DE von ungefähr 5 erhalten ist. Ein Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase, welches für die vorliegende Erfindung geeignet ist, wird aus dem Bacillus Macerans erhalten. Das Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase aus dem Bacillus Macerans ist kommerziell erhältlich. Diese Enzyme arbeiten, wie berichtet wird, am besten bei einer Temperatur von ungefähr 60ºC. Es ist nun überraschend, daß ein Enzym bei der Herstellung von Alpha-Cyclodextrin noch besser arbeitet bei einer Temperatur unter 45ºC.
Bei einem bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung wird das Stärkehydrolysat in Wasser aufgelöst, um eine wässerige Lösung aus dem Stärkesubstrat mit einem Feststoffgehalt von ungefähr 5 bis 40 Gewichtsprozent zu bilden. Bevorzugt weist die Lösung einen Feststoffgehalt von ungefähr 35 Gewichtsprozent auf, und zwar bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung.
Der Anteil an CGTase, das zur Umwandlung des Stärkesubstrats verwendet wird variiert, und zwar in Abhängigkeit von der Aktivität des Enzyms, die in herkömmlicherweise durch das Tilden-Hudson-Verfahren bestimmt wird (E. B. Tilden and C. S. Hudson in J. Bacteriol, 43, 527-544, 1942). Bevorzugt weist das CGTase ungefähr 600 bis 700 Tilden-Hudson-Einheiten pro Millimeter auf.
Der PH-Wert der Lösung während der Umwandlung ist generell im Bereich zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 6,5. Herkömmliche Mittel werden dazu verwendet, um den PH-Wert einzustellen.
Die Temperatur während der Umwandlung wird auf Werte zwischen 15 und 40ºC gehalten. Gute Ergebnisse wurden bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20 und ungefähr 35ºC erreicht.
Das Cyclohexan ist vorzugsweise in einem Anteil von 5 bis 10% des Reaktionsvolumens vorhanden. Bevorzugter ist das Cyclohexan in einem Anteil von 5 Volumenprozent vorhanden, und zwar bezogen auf das Gesamt-Reaktionsvolumen vor der Zugabe von Cyclohexan. Jede Quelle von Cyclohexan kann verwendet werden. Die Zeitdauer für die Umwandlung beträgt ungefähr einen bis vier Tage.
Nach der Behandlung des Stärkesubstrats mit der Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase werden die Cyclodextrine zurückgewonnen. Vorzugsweise werden die Cyclodextrine durch Separierung des Cyclodextrinprezipitats aus den acyclischen Materialien in der Lösung zurückgewonnen. Die Trennung der cyclischen Materialien von den acyclischen Materialien wird im wesentlichen durch Zentrifugation und Filtration vorgenommen.
Nachdem das cyclische Material vom acyclischem Material getrennt ist, ist die Lösung des cyclischen Materials auf ungefähr 30% Festbestandteile eingestellt und wird einer Destillation unterworfen, um das gesamte Cyclohexan auszutreiben. Zurückbleibt eine Lösung aus Alpha- und Beta-Cyclodextrinen, die dann in herkömmlicherweise separiert wird.
Bevorzugt wird die Lösung aus Alpha- und Beta-Cyclodextrinen einer herkömmlichen Carbon-Behandlung unterworfen. Kristallisation wird verwendet, um den größten Anteil an Beta-Cyclodextrin zu gewinnen. Die Carbonbehandlung und Kristallisation werden in herkömmlicherweise ausgeführt.
Die verbleibende Lösung wird dann mit einem begrenzten Anteil an Cyclohexan behandelt, um eine differenzielle Komplexbildung des Alpha-Cyclodextrins zu erreichen. Der Komplex wird aus der Lösung separiert, und zwar in geeigneter Weise mit Hilfe von Zentrifugation und Filtration. Als nächster Schritt wird der Komplex aus Cyclohexan und Alpha-Cyclodextrin mit Hilfe von Destillation getrennt. Das Alpha- Cyclodextrin wird dann mit Kohlenstoff behandelt und kristallisiert, um so schließlich reines Alpha-Cyclodestrin zu erhalten.
Diese und andere Aspekte der Erfindung können nun noch vollständiger verstanden werden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele:

Beispiel I

Dieses Beispiel illustriert die Temperaturabhängigkeit der Cyclodextrin-Glucosyl- Transferase, erhalten vom B. Macerans, auf die Produktion von Alpha-Cyclodextrin aus einem Stärkehydrolysat. Die nachstehende Tabelle I gibt die Ergebnisse wieder. Tabelle I
Die Stärke war eine Waxy-Mais-Stärke-Hydrolysat mit einem DE von 5. Um die Cyclodextrine zu bilden, wurde zunächst eine 30%ige (Trockenbasis) Stärkehydrolysat- Lösung hergestellt. Der PH-Wert wurde auf 6.0 ± 0.2 eingestellt und Cyclohexan wurde der Lösung in einem Anteil von 5% des gesamten Reaktionsvolumens zugegeben. Die Lösung war mit Cyclodextrin-Glucosyl-Transferase einer Güte von 800 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 Gramm feste Stärke Bestandteile dosiert. Die Reaktionsmischung wurde verschiedenen, in der Tabelle 1 angegebenen Temperaturen ausgesetzt. Die Umwandlungen wurden bei Agitation bzw. Umrühren 3 Tage durchgeführt. Die produzierten Cyclodextrine wurden ermittelt und analysiert unter Verwendung der sogenannten High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Der in der Tabelle I angegebene Gesamtanteil ist das Gesamtgewicht der produzierten Cyclodextrine in Gramm. Die prozentualen Anteile von Alpha- und Beta-Cyclodextrin sind ebenfalls angegeben. Keine anderen meßbaren Cyclodextrine wurden produziert, so wurde beispielsweise kein Gamma-Cyclodextrin produziert. Dies trifft für alle Beispiele zu.

Beispiel II

Dieses Beispiel illustriert die Bedeutung von CGTase von B. Macerans im Vergleich zu einer anderen CGTase-Quelle, nämlich B. Subtilus.
Zwei getrennte Lösungen wurden vorbereitet, und zwar entsprechend dem Beispiel I und wurden bei Temperaturen, die in der nachstehenden Tabelle II angegeben sind behandelt. Der Anteil an Cyclodextrin und die prozentualen Anteile an Alpha-, Beta-, und Gamma-Cyclodextrine, die bei der Umwandlung hergestellt wurden, sind ebenfalls in der nachstehenden Tabelle II angegeben. Tabelle II
Wie aus der vorstehenden Tabelle II ersichtlich ist, ergibt sich bei Verwendung von CGTase, welches aus B. Subtilus gewonnen wurde, bei Reduzierung der Reaktionstemperatur kein Anstieg in dem Anteil des produzierten Cyclodextrins. Wie vorstehend festgestellt wurde, enthielten beide Lösungen Cyclohexan. Aus diesem Grunde führt die Reduzierung der Temperatur und die Verwendung von Cyclohexan allein nicht zu einem Anstieg bei der Cyclodextrinproduktion. In der Tat führt eine niedrige Temperatur bei Verwendung des B. Subtilus Enzyms zu einer niedrigen Produktion an Cyclodextrin.

Beispiel III

Dieses Beispiel illustriert die Bedeutung der Anwesenheit von Cyclohexan in der Lösung und weiterhin auch das man normalerweise erwartet, daß eine niedrige Temperatur eine Verlangsamung der Reaktion und eine Verringerung der Produktion erwarten läßt.
Die Lösungen aus Stärkehydrolysat wurden mit B. Macerans entsprechend dem Beispiel I bei den in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Temperaturen behandelt, und zwar ohne Cyclohexan. Tabelle III
Wie aus dem vorstehenden ersichtlich ist, führte eine Reduzierung der Temperatur exakt zu dem, was sich mit der herkömmlichen Denkweise deckt, nämlich zu einer Reduzierung des Anteils an den produzierten Produkten. Aus diesem Grunde führt die Reduzierung der Temperatur allein zu keiner Erhöhung der Cyclodextrinproduktion.

Beispiel IV

Dieses Beispiel illustriert weiterhin die Bedeutung der Kombination von Cyclohexan mit der niedrigen Temperatur.
Zwei Lösungen wurden hergestellt und entsprechend dem Beispiel I behandelt, und zwar bei den in der nachstehenden Tabelle IV angegebenen Temperaturen und unter Verwendung von Cyclohexan oder Toluol oder Tuloene. Der Anteil an Toluol war dabei jeweils gleich dem Anteil an Cyclohexan. Tabelle IV
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, führte eine niedrige Temperatur nicht zu einer Erhöhung des Anteils an produziertem Cyclodextrin, wenn Toluol als Komplexbildner verwendet wurde. Vielmehr führte in diesen Fällen eine niedrige Temperatur zu einem Abfall der Produktion an Cyclodextrin.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Alpha-Cyclodextrin, gekennzeichnet durch: Behandung eines Stärke-Hydrolysates mit einer Cyclodextrin-Glucoxyl-Transferase, die vom Bazillus macerans bei einer Temperatur zwischen 15º und 40ºC in Gegenwart von Cyclohexan gewonnen wurde, sowie Gewinnung des Alpha-Cyclodextrins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Cyclohexan 5-10% des Reaktionsvolumens beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärke-Hydrolysat einen DE-Wert(Dextrose äquivalent) zwischen 1 und 10 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärke-Hydrolysat ein solches einer wachsartigen Stärke (waxy starch) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung des Stärke-Hydrolysats über eine Zeitdauer von ungefähr 1 bis ungefähr 4 Tagen durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Cyclohexan 5% des Volumens des Breis beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Brei einen Anteil an festen Bestandteilen von 30-35 Gewichtsprozent aufweist.