Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin
Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren für die enzymatische Herstellung von Cyclodextrin aus Stärke.
Cyclodextrine, auch bekannt als Schardinger Dextrine, umfassen 6 oder mehr miteinander unter Bildung von Cycloverbindungen durch 1,4-Bindungen verbundene Anhydroalpha-D-Glucose-Reste. Cyclodextrine können spezieller klassifiziert werden durch die Anzahl von vorhandenen Glukoseeinheiten. Der 6-gliedrige Ring ist als alpha-Cyclodextrin oder Cyclohexamylose, der 7gliedrige Ring als beta-Cyclodextrin oder Cycloheptaamylose usw. bezeichnet.
Als Ergebnis der einzigartigen cyclischen Struktur, weisen Cyclodextrine ein beträchtliches Potential als Komplexbildner auf, weil sie Einschlussverbindungen mit Molekülen bilden, welche innerhalb des Hohlraums des cyclischen Moleküls verbleiben. Mögliche Anwendungen auf dem Gebiet der Nahrungsmittel, des Tabaks und der Medizin ebenso wie auf vielen anderen Gebieten sind zahlreich.
Cyclodextrine werden aus Stärke durch die Einwirkung eines Enzyms, gewöhnlich bekannt als Cyclodextrin-Transglycosylase (B. macerans amylase) hergestellt.
Die Quelle des Enzyms ist üblicherweise eine Kultur von Bacillus macerans. Die Kapazität zum Erzeugen des Enzyms, welches die Cyclodextrine synthetisiert, ist häufig ein Kriterion, welches dazu dient, Stämme vom Bacillus macerans von anderen nahe verwandten Mikroorganismen zu unterscheiden. Zum Erzeugen des Cyclodextrin synthetisierenden Enzyms wird Bacillus macerans unter geeigneten Bedingungen auf geeigneten Medien, welche geeignete Quellen an Stickstoff, Kohlenstoff, Wachstumsfaktoren und Mineralstoffen enthalten, gezüchtet. Verschiedene geeignete Mittel zum Erzeugen von Cyclodextrin-Transglycosylase sind in der Literatur (D. French in Methods in Enzymology , S.P. Colowick and N.O. Kaplan, Academic Press, New York, N.Y., Vol. V. 1962, S. 148-155) beschrieben.
Die Menge an Cyclodextrin-Transglycosylase-Aktivität, welche in Bacillus-macerans-Zubereitungen vorhanden ist, wird zweckmässigerweise durch das Tilden Hudson-Verfahren (E.B. Tilden und C.S. Hudson, J.
Bacteriol 43, 527-544, 1942) gemessen. Dieses Messverfahren ist auf alle Kulturflüssigkeiten oder auf Enzymzubereitungen anwendbar, welche durch Eindampfung, Adsorption an geeigneten Adsorbentien und anschliessender Auswaschung daraus, Lösungsmitteloder Salzfällungen oder Fraktionierung, oder andere für den Fachmann bekannte Mittel gereinigt oder konzentriert wurden.
Rohe Kulturflüssigkeiten enthalten im allgemeinen 3-6 Tilden-Hudson-Einheiten pro ml.
rGemäss üblichen bekannten Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin wird Cyclodextrin-Transglycosylase zu einer verdünnten Lösung einer geeigneten gelatinierten Stärke zugesetzt, und die Enzymolyse wird unter Bedingungen fortschreiten gelassen, welche zu einer fortgesetzten Enzymeinwirkung während ausreichender Zeit führen, um die Überführung der Stärke in Cyclodextrin zu ermöglichen.
Bisher wurde vorgezogen, Kartoffelstärke wegen ihrer geringeren Neigung zum Tetrogradieren bei der angewendeten Konversionstemperatur zu verwenden.
Ferner wurde es nicht als ausführbar betrachtet, Kartoffelstärke mit Konzentrationen über 5 O/o Feststoffe zu verwenden; es ist nämlich unmöglich, mit höheren Stärkekonzentrationen wegen der hohen Viskosität und der Stärkeretrogradation zu arbeiten. Wenn die Stärke während der Enzymolyse retrogradiert, führt dies zur Anwesenheit von viel unkonvertierter Stärke in den Konvertierungsflüssigkeiten, was die Schwierigkeit der Gewinnung des vorhandenen Cyclodextrins vergrössert.
Ebenfalls sind modifizierte Stärken im allgemeinen nicht als Substrat verwendet worden, weil die daraus an Cyclodextrin erhaltenen Ausbeuten wesentlich niedriger waren, als die aus unmodifizierter Stärke erhaltenen. (S.
dazu D. French . . . Die Stärke, 15, 280-284, 1963).
Obwohl Cyclodextrine bekannt waren, sind sie nicht in grossen Mengen verfügbar gewesen. Wirtschaftliche Mittel für ihre Gewinnung haben bisher nicht bestanden.
Viele Faktoren tragen zu den hohen Kosten der Gewinnung von Cyclodextrin durch die bisherigen Verfahren bei.
Ein grösserer Nachteil dieser bisherigen Verfahren für die Gewinnung von Cyclodextrin ist der Umstand, dass Konversion nur mit geringen Trockenstoffkonzentrationen ausführbar ist. Die Kosten des Umgehens mit grossen Flüssigkeits-Volumina einschliesslich des Erwärmens auf hohe Temperaturen und anschliessendes Erniedrigen der Temperatur ebenso wie das Konvertieren während langer Zeiten, um Cyclodextrin in wesentlichen Mengen zu erzeugen, machten die bisherigen Herstellungsverfahren in wirtschaftlicher Hinsicht nicht reizvoll.
Die wirtschaftliche Situation wird ferner durch den Umstand erschwert, dass, um das Cyclodextrin aus verdünnten Konvertierungsflüssigkeiten zu gewinnen, ein geeignetes Fällmittel, beispielsweise Trichloräthylen, zugesetzt wird, um das Cyclodextrin im wesentlichen unlöslich zu machen. Die Löslichkeiten der Cyclodextrin-Komplexe in diesen verdünnten Flüssigkeiten sind solche, dass es nicht möglich ist, das gesamte in den Flüssigkeiten vorhandene Cyclodextrin zu gewinnen.
Beispielsweise ist durch dieses Verfahren die Löslichkeit des Cyclodextrins in Anwesenheit von Trichloräthylen eine solche, dass 200/0 des gesamten vorhandenen Cyclodextrins in Lösung verbleibt, was ein wesentlicher Verlust ist.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren für die Konvertierung von Stärke zu Cyclodextrin zu schaffen, worin das Stärkesubstrat in Lösung bei einem höheren Feststoffgehalt vorhanden ist und Cyclodextrin in höheren Konzentrationen als bisher gewonnen wird.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Cyclodextrin aus Stärke zu schaffen, worin das Cyclodextrin oder seine Komplexe leicht kristallisierbar sind und während der Konvertierung kristallisieren können.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die wirtschaftliche Verwendung von Stärken für Cyclodextrin-Konvertierung zu ermöglichen, welche wegen der ihnen innewohnenden geringen Pastenbildungsvermögen oder ihren Neigungen zur Retrogradation bisher nicht dafür geeignet waren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein praktisches Verfahren zu schaffen, um hohe Ausbeuten an Cyclodextrin aus Stärke zu erhalten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent nicht über 20 der Konvertierung mit Cyclodextrin-Transglycosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird, um ein Konvertierungsprodukt mit einem Gehalt an Cyclodextrin zu erhalten.
Im Nachfolgenden wird für den Begriff Dextrose äquivalent die Kurzbezeichnung DE verwendet, wobei eine Ausführungsform des Verfahrens dadurch gekennzeichnet ist, dass Stärke auf ein DE von nicht über 20 teilhydrolysiert und anschliessend die teilhydrolysierte Stärke der Konvertierung mit Cyclodextrin Transglycosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird.
Es wurde gefunden, dass, wenn ein Stärkehydrolysat mit einem DE-Wert von nicht mehr als etwa 20 der Einwirkung von Cyclodextrin-Transglycosylase unterworfen wird, ausgezeichnete Ausbeuten an Cyclodextrin erhalten werden; die Konvertierung zu Cyclodextrin kann leicht bei hohen Stärkekonzentrationen ausgeführt werden. Schwierigkeiten mit Stärkeretrogracl ation und Stärkeverunreinigung des Produkts werden vermieden und Isolierung und Reinigung des Cyclodextrins vereinfacht. Um die Mängel der bisherigen Technik zu erläutern: Bisher empfohlene Verfahren für die Herstellung von Cyclodextrin aus 5 0/obiger Stärkesuspension würden ein Umgehen mit 2233 1 Wasser pro 45,4 kg erzeugtem Cyclodextrin erfordern.
Nach dem erfiiidungs- gemässen Verfahren, wobei eine 34 O/o (gewichtsmässig) Feststoff besitzende teilhydrolysierte Stärkelösung mit einer 50 zeigen Ausbeute an Cyclodextrin konvertiert werden kann, brauchen nur 220 1 Wasser pro 45,4 kg erzeugtes Cyclodextrin behandelt zu werden. Obwohl das erfindungsgemässe Verfahren mit niedrigeren Feststoffgehalten angewendet werden kann, besteht einer der wesentlichen praktischen Vorteile dieses Verfahrens darin, dass es möglich ist, Cyclodextrin in einem Medium zu gewinnen, welches eine geringste Menge an Wasser enthält. Der Feststoffgehalt des Ausgangsreaktionsgemisches wird üblicherweise 10 Gew.O/o überschreiten und kann vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 50 Gew.O/o liegen.
Die gemäss der Erfindung gewonnenen Cyclodextrine sind für die gleichen Zwecke wie die nach früheren Verfahren erhaltenen brauchbar. Beispielsweise sind nach dem erfindungsgemässen Verfahren gewonnene Produkte geeignet als aromafreimachende Stoffe für Tabakrauch und können auf einem Trägerfilter zur Herstellung von Tabakfiltern benutzt werden. Sie sind auch als an sich bekannte Einschliessungsstoffe brauchbar und finden aus diesem Grund Verwendung in der Chromatographie.
Herstellung eines Stärkehydrolysats
Jede Art von Stärke oder Stärkefraktion kann benutzt werden, um ein Stärkehydrolysat zu gewinnen, z. B. Getreide- und Knollenstärken, wachsartige oder amylasereiche Stärken und die Amylase- oder Amylopectinfraktionen daraus. Rohe Stärkequellen können auch benutzt werden, z. B. vermahlenes Getreide, macerierte Knollen oder teilgereinigte Stärke daraus. Wenn rohe Stärkequellen benutzt werden, kann das Cyclodextrin gewonnen werden: durch Erwärmen des Konvertierungsprodukts, um das Cyclodextrin löslich zu machen, Filtrieren, um Unlösliches zu entfernen und Gewinnen von Cyclodextrin aus dem Filtrat durch Kristallisation oder Ausfällung.
Teilhydrolyse von Stärke kann durch übliche Mittel bewerkstelligt werden. Geeignete Katalysatoren für die Teilhydrolyse schliessen ein Säuren, saure Salze, saure Ionen austauschende Harze und geeignete Enzyme. Das Stärkehydrolysat wird dadurch gewonnen, dass gelatinierte Stärke einer Behandlung mit Säure oder Enzymen oder mit beiden unterworfen wird.
Der Ausdruck Stärkehydrolysat umfasst das Produkt, welches aus der enzymatischen oder sauren Hy drolyse von Stärke stammt, wobei die Hydrolyse mit gelatinierter Stärke durchgeführt wird.
Falls Säurehydrolyse angewendet wird, kann die Acidität während der hydrolytischen Wirkung erniedrigt werden, wenn die Temperatur und Zeit der Hydrolyse gesteigert werden, u. z. bis zu einem Punkt, wo noch ausreichende Hydrolysewirkung sogar in neutraler Lösung erhalten werden kann, d. i. bei einer Temperatur von 204 "C.
Ein besonders geeignetes Verfahren für Teilhydrolyse von Stärke besteht in der Verwendung von alpha-Amylasebakterien. Das Enzym kann in Form von handelsüblichen wärmewiderstandsfähigen alpha-Amylasen, gewonnen durch gewisse Stämme von Bacillus subtilus oder Bacillus mesentericus, erhalten werden.
Während wärmebeständige bakterielle alpha-Amylase-Zubereitungen besonders zum Gewinnen des Stärkehydrolysats geeignet sind, können auch andere alpha Amylase-Zubereitungen verwendet werden, beispielsweise solche, welche aus Bakterien, Pilzen, Cerealen oder Tieren stammen. Wenn die Zubereitungen einen hohen Gehalt an saccharogener Enzymaktivität besitzen, sollten sie unter Bedingungen an pH, Temperatur und Zeit der Konvertierung benutzt werden, um die verflüssigende Enzymaktivität zu steigern und die saccharogene Enzymaktivität auf einem Mindestmass zu halten.
Wenn ein Enzym verwendet wird, um die Teilhydrolyse zu bewirken, sollte die Temperatur während der Hydrolyse unter der Inaktivierungstemperatur der Enzyme sein. Der Hydrolysekatalysator kann zu der Stärke vor, während oder nach der Gelatinierung der Stärke zugesetzt werden. Teilhydrolyse wird bewirkt, um die Stärkepasteviskosität auf einen solchen Grad zu verringern, dass die Stärke leicht bei hoher Feststoffkonzentration gehandhabt werden kann. Sie macht auch die Stärke löslich, sodass diese leicht für die Enzymolyse durch das zum Gewinnen des Cyclodextrins verwendete Enzym ist.
Zusätzlich verringert Teilhydrolyse erheblich Retrogradation der Stärke und ermöglicht wirksame Ausführung der Enzymolyse. Ferner ist das Cyclodextrin leichter gewinnbar. Vorzugsweise wird die Teilhydrolyse bei einem DE im Bereich zwischen etwa 0,5 und etwa 6 ausgeführt. DE ist die Abkürzung für Dextroseäquivalent, welches die Gesamtmenge an vorhandenen reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose und ausgedrückt als O/o Trockensubstanz, ist.
Obwohl das bevorzugte Verfahren für die Ausführung der Erfindung darin besteht, dass die Stärke auf etwa 0,5 bis etwa 6 DE vor der Enzymolyse hydrolysiert wird, um Cyclodextrin zu erhalten, kann die Stärke auf einen höheren oder niedrigeren Grad hydrolysiert werden. Wenn das Stärkehydrolysat ein DE wesentlich niedriger als 0,5 hat, treten die der Verwendung von unhydrolysierten Stärken innewohnenden erwähnten Probleme allmählich mit abnehmenden DE-Werten auf.
Diese Probleme schliessen eine unbehandelbare Viskosität und Retrogradation der Stärke ein. Wenn die Teilhydrolyse wesentlich über einem DE von 6 durchgeführt wird, nimmt die Ausbeute an Cyclodextrin ab.
Konvertierungsstufe - Gewinnung von Cyclodextrin
Nach der Teilhydrolyse ist das Stärkehydrolysat fertig zur Konvertierung zu Cyclodextrin durch die Einwirkung von Cyclodextrin-Transglycosylase. Dieses Enzym ist optimal aktiv bei Temperaturen zwischen etwa 40 und etwa 60 OC und bei pH-Werten vorzugsweise zwischen etwa 5,5 und etwa 7,5. Um höchste Ausbeuten an Cyclodextrin zu erhalten, ist es erwünscht, das Stärkesubstrat innerhalb dieser Grenzen zu halten, obwohl etwas höhere oder niedrigere pH- und Temperaturwerte benutzt werden können.
Die angewendete Menge an Cyclodextrin-Transglycosylase ist von der gewünschten Schnelligkeit, mit welcher die Enzymolyse durchgeführt werden soll und auch von anderen angewendeten Konvertierungsbedingungen abhängig. Beispielsweise, wenn die Temperatur und das pH konstant gehalten werden, ist die Menge an benutztem Enzym umgekehrt proportional der Dauer an erforderlicher Zeit, um die gewünschte Menge an Cyclodextrin zu erhalten. Zeit, Temperatur, Enzymmenge und pH können eingestellt werden, um die grössten Mengen an Konvertierungsprodukt während der kürzesten Zeit zu erhalten.
Im allgemeinen können höchste Ausbeuten an Cyclodextrin innerhalb etwa 2-7 Tagen bei 50 "C und bei einem pH von etwa 7 erhalten werden, wenn die Enzymmenge zwischen etwa 100 und etwa 1 000 Tilden Hudson-Einheiten pro 100 g Stärke liegt.
Gewinnung von Cyclodextrin
Das in der Konvertierungsflüssigkeit vorhandene Cyclodextrin kann leicht durch übliche Fällungs- und Kristallisationsverfahren gewonnen und gereinigt werden.
Die einzigartige Fähigkeit von Cyclodextrinen zur Bildung von Einschlussverbindungen mit vielen organischen Verbindungen kann benutzt werden, um das in der Konvertierungsflüssigkeit vorhandene Cyclodextrin im Anschluss an die Enzymolyse zu gewinnen. Somit führt der Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels, z. B.
Trichloräthylen, Tetrachloräthan, Brombenzol und dergl., zum Ausfällen des Cyclodextrins infolge der verringerten Löslichkeit des Cyclodextrinkomplexes.
Durch Ausnutzung verschiedener Fällungsmittel ist es möglich, das eine oder andere Cyclodextrin zu erhalten, beispielsweise alpha- oder beta-Cyclodextrin in gereinigter Form. Es ist auch möglich, die Anhäufung des entsprechenden Cyclodextrins während der Konvertierung in gewissen Grad zu steigern. Die unlöslichen Cyclodextrinkomplexe können gewünschtenfalls auch durch Umkristallisieren und dergl. gereinigt werden.
Stattdessen kann leicht festes Cyclodextrin durch direkte Kristallisation aus den Konvertierungsflüssigkeiten durch bekannte Kristallisationsmittel erhalten werden. Die Konvertierungsflüssigkeit mit dem darin enthaltenen gebildeten Cyclodextrin kann nach geeignetem Raffinieren eingedampft oder getrocknet werden, um einen ein festes Cyclodextrin enthaltenden Sirup zu ergeben.
Die Erfindung wird noch an den nachfolgenden Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Zu einer 30 Gew. /oigen Suspension von Kartoffel stärke mit pH 7,2 wurde die bakterielle alpha-Amylase Zubereitung HT 1.000 (unter diesem Handelsnahmen verkauft von der Miles Chemical Laboratories) mit einer Konzentration von 0,025 Gew.O/o der Enzymzubereitung, bezogen auf die Stärkefeststoffe zugesetzt.
Die Suspension wurde allmählich während 30 Minuten zu einem auf einer Temperatur von 90-92 OC gehaltenen Gefäss zugesetzt. Rühren wurde fortgesetzt und die
Temperatur während zusätzlicher 25 Minuten gehalten, bis die Stärke auf 2,6 DE teilhydrolysiert war. Die hydrolysierte Stärke wurde dann unverzüglich auf ein pH von 5,8 eingestellt, auf 121 0C erwärmt und 15 Minuten darauf gehalten, um restliche alpha-Amylase Aktivität zu vernichten.
Das so erhaltene Stärkehydrolysat wurde dann auf 45 OC gekühlt und das pH auf 6,0 eingestellt. Das Hydrolysat wurde dann in Anwesenheit von 5 ml Toluol pro 100 ml Konvertierungsflüssigkeit mit einer Menge von Cyclodextrin-Transglycosylase äquivalent 200 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärkehydrolysatfeststoffe konvertiert. Nach 5 Tagen Enzymolase bei 45 OC wurde die Konvertierungsflüssigkeit während 15 Minuten sieden gelassen, um das Enzym zu inaktivieren, das
Toluol abzutreiben und Cyclodextrin löslich zu machen.
Das Konvertierungsprodukt wurde noch heiss dann filtriert.
Die filtrierte Konvertierungsflüssigkeit wurde in drei
Anteile A, B und C geteilt und wie folgt behandelt:
Teil A wurde durch direkte Trichloräthylenfällung analysiert, um die Menge an anwesenden Cyclodextrinen zu bestimmen. Die folgende analytische Methode wurde für jede Caclodextrin-Analyse bei allen Beispielen angewendet:
:
Der Cyclodextringehalt wurde durch Zusetzen eines Überschusses von Trichloräthylen zu der Konvertierungsflüssigkeit (25 ml pro 100 ml Konvertierungsflüssigkeit) bestimmt, wobei die Mischung während 3-7 Tagen bei 25-30 OC geschüttelt wurde, im Vakuum durch Whatman No. 1 Filterpapier filtriert, der Filterkuchen mit einer Menge Wasser von 5 "C äquivalent 10 O/o des Volumens der Konvertierungsflüssigkeit gewaschen, der Filterkuchen quantitativ entnommen und bei 80 "C unter einem Vakuum von etwa 71 cm Quecksilber während etwa 24 Stunden getrocknet wurde.
Die Ausbeute an rohen Cyclodextrinen wurde aus dem Gewicht des Cyclodextrin-Filterkuchens durch folgende Formel berechnet: = Cyclodextrinausbeute = 100 x Trockengewicht des Filterkuchens pro Volumen Flüssigkeit Gewicht Cyclodextrinausb eute Gewicht der Stärkefeststoffe pro Flüssigkeitsvolumen.
Teil B wurde auf 80 OC bei einem pH von 6, 24 Stunden in Anwesenheit von 0,02 O/o einer bakteriellen alpha-Amylase-Zubereitung (HT 1000) gehalten und danach auf 121 OC während 15 Minuten erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren. Die Menge an vorhandenem Cyclodextrin wurde dann wie oben bestimmt.
Teil C wurde mit bakterieller alpha-Amylase wie oben beschrieben behandelt, auf eine Temperatur von 121 OC erwärmt und dann auf 75 "C gekühlt. Danach wurde die Flüssigkeitstemperatur allmählich auf etwa 30 0C während der nächsten 51 Stunden verringert, wobei die Flüssigkeit gerührt wurde, um Kristallisation des vorhandenen Cyclodextrins zu begünstigen. Die angesammelten Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gewonnen, gewaschen, getrocknet und gewogen.
Diese Kristalle werden als Teil C-1 bezeichnet. Die vereinigte Mutterlauge und Waschflüssigkeit wurden durch Behandlung mit Aktivkohle raffiniert und filtriert, um die Kohle zu entfernen. Die gereinigte Mutterlauge wurde dann eingedampft, um einen als Teil C-2 bezeichneten Siurp zu ergeben.
Die Ergebnisse dieser Behandlung folgen in der Tabelle.
Tabelle I Anteil Beschreibung DE Gesamttrocken- Cyclodex substanz (g/100 ml) trinausbeute
O/o A ursprüngliche
Konvertierungs- 4,3 41,1 39 flüssigkeit B alpha-amylase-be handelte 13,1 39,2 37
Flüssigkeit C-1 Kristallines
Cyclodextrin 27 (1-2 Konzentrierte
Mutterlauge 16,8 58,0 10
Dieses Beispiel zeigt die Gewinnung von Cyclodextrin in erheblicher Ausbeute durch das erfindungsgemässe Verfahren, weil die Cyclodextrinausbeuten aus den Teilen A und B im wesentlichen gleich sind, zeigen die Ergebnisse, dass der ausgefällte Cyclodextrinkomplex, erhalten durch dieses Verfahren, im wesentlichen frei von nicht umgesetzter Stärke ist. Überdies wird gezeigt, dass geeignete Enzyme, wie z.
B. bakterielle alpha Amylase, gebraucht werden können, um in der Konvertierungsflüssigkeit verbleibende nicht cyclische Glucane zu hydrolysieren, ohne eine merkliche gleichzeitige Hydrolyse des vorhandenen Cyclodextrins und ohne entsprechende Verringerung der Ausbeute. Die Ergebnisse erläutern auch die Möglichkeit des Gewinnens von Cyclodextrin in beträchtlicher Menge durch direkte Kristallisationsverfahren und zeigen die Herstellung eines Sirupprodukts mit einem Gehalt an Cyclodextrin.
Beispiel 2
Dieses Beispiel vergleicht die Behandlung eines Stärkehydrolysats mit einem Enzym zum Gewinnen von Cyclodextrin mit der Behandlung von unhydrolysierter Stärke zur Gewinnung von Cyclodextrin.
Eine 30 Gew. /oige Suspension von Kartoffelstärke wurde mit bakterieller alpha-Amylase wie in Beispiel 1 behandelt, um ein Stärkehydrolysat mit einem DE von 2,0 und einem Gehalt von 34 g Feststoffe pro 100 ml zu ergeben. Dieses Stärkehydrolysat wurde mit Wasser auf Trockenfeststoffgehalte, wie in der folgenden Tabelle II angegeben, verdünnt. Die Hydrolysate wurden dann bei 50 0C und bei einem pH von 7,2 in Anwesenheit von Toluol mit einer Cyclodextrin-Transglycosylase-Menge von 200 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärke Trockensubstanz konvertiert. Nach 7 Tagen der Konvertierung wurde das restliche Enzym durch Erwärmen auf 100 OC während 10 Minuten inaktiviert, und das vorhandene Cyclodextrin wurde durch Trichlor äthylenfällung bestimmt.
Die unhydrolysierten Stärkebreie wurden mit verschiedenen Trockensubstanzgehalten hergestellt, in gleicher Weise gelatiert und unmittelbar mit Cyclodextrin Transglycosylase behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse folgen in Tabelle II
Tabelle II
Substrat- erzeugtes Cyclodextrin Eigenschaften der Kon konzen- vertierungsflüssigkeit tration Substrat g/100 ml g/100 ml IGew.O/o Stärke Fluidität Filtration Gelati- 3,2 0,4 13 fliessend schlecht nierte 5,4 1,5 28 fliessend schlecht Stärke 8,1 2,5 31 fliessend schlecht
10,8 4,3 40 fliessend schlecht
16,1 - - nicht fliessend nicht fil trierbar
21,5 - - nicht fliessend nicht fil tierbar teilhydro- 3,4 0,9 26 fliessend gut lysierte 5,7 2,1 37 fliessend gut Stärke 8,5 3,4 40 fliessend gut (2,0 DE) 11,3 4,7 42 fliessend gut
17,0 7,9 46 fliessend gut
22,7 11,0 48 fliessend
gut
28,3 13,2 47 fliessend gut
34,0 17,6 52 fliessend gut
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des neuen Verfahrens, Cyclodextrin in hohen Ausbeuten mit hohen Trockensubstanzgehalten zu erzeugen. Bei den bisherigen Verfahren war dies nicht möglich.
Die Ergebnisse zeigen weiter, dass die frühere Ansicht zu Recht besteht, nämlich dass hohe Feststoffumwandlungen nicht praktisch sind, wenn das Substrat aus gelatinierter aber nicht hydrolysierter Stärke besteht.
Beispiel 3
Die Tatsache, dass das Ausmass der Hydrloyse sich auf die Ausbeute an aus Stärkehydrolysaten erhältlichem Cyclodextrin auswirkt, wird durch die Verwendung einer 30 Gew. /O-igen Dispersion von enzymverflüssigter wachsartiger Milostärke gezeigt.
Das Verflüssigungsverfahren bei diesem Beispiel war gleich dem in Beispiel 1 beschriebenen mit der Abänderung, dass eine geeignete Menge von bakterieller alpha Amylase verwendet wurde, sodass verschiedene DE Werte erhalten werden konnten. 30 Gew.o/oige Dispersionen von wachsartiger Milostärke wurden bei einer Temperatur von 90-92 0C während einer Zeit, die erforderlich war, um die verschiedenen DE-Werte zu erhalten, hydrolysiert.
Getrennte Muster der teilhydrolysierten Stärke von 34 g Trockensubstanz pro 100 ml wurden auf 121 "C erwärmt, um die restliche alpha-Amylase-Aktivität zu vernichten. Die Muster wurden danach bei 50 OC und einem pH von 7,2 in Gegenwart von Toluol mit einem Cyclodextrin-Transglycosylase-Zusatz von 400 Tilden Hudson-Einheiten pro 100 g Stärkefeststoffe konvertiert. Das vorhandene Cyclodextrin wurde nach 4 und 7 Tagen Konvertierung durch die vorbeschriebene Trichloräthylenfällung bestimmt. Tabelle III zeigt, dass Ausbeuten an Cyclodextrin über 40 /o erhalten wurden, wenn die Stärke von der Konvertierung zu einem DB im Bereich von 0,4-6 hydrolysiert wird und dass Cyclodextrinausbeuten über 3 g pro 100 ml bei einem DE bis 20 erhalten werden.
Tabelle III DE des Teil- Cyclodextrinausbeuten Cyclodextrinausbeuten hydrolysats g/100ml in /e
4 Tage 7 Tage 4 Tage 7 Tage
0,4 16,5 18,4 49 54
1,0 15,3 17,4 45 51
1,9 14,3 18,0 42 53
3,5 12,2 15,3 36 45
6,0 10,5 14,0 31 41
8,8 8,2 10,9 24 32 12,0 5,8 7,5 17 22 15,1 4,4 6,1 13 18 17,1 3,1 5,1 9 15 19,6 2,7 3,7 8 11 22,9 1,7 2,4 5 7 25,5 0,7 0,7 2 2
Beispiel 4
Dieses Beispiel erläutert, dass es für grösste Wirksamkeit wünschenswert ist, Cyclodextrinkonvertierungen in Anwesenheit einer angemessenen Menge eines geeigneten Fällungsmittels auszuführen.
Vermutlich besteht die Funktion des Fällungsmittels darin, unlösliche Komplexe mit den Cyclodextrinen zu bilden, wenn diese erzeugt werden, wodurch die Cyclodextrine aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden und hierdurch das Gleichgewicht der Reaktion zugunsten weiterer Cyclodextrinerzeugung verschoben wird. Beispiele geeigneter Fällungsmittel werden in Tabelle IV gezeigt.
In !diesem Beispiel wurde eine 30 Gew. /oige Suspension von Kartoffelstärke auf 1,9 DE verflüssigt und in Verfolgung des Verfahrens von Beispiel 1 erwärmt. Die verflüssigte Stärke wurde in mehrere Anteile aufgeteilt und bei 50 OC und einem pH von 7,0 und mit einer Cyclodextrin-Transglycosyiasemenge von 500 Tilden Hudson-Einheiten pro 100 g Substrat-Trockensubstanz konvertiert. 5 Stunden nach Beginn der Konvertierung wird das Cyclodextrinfällungsmittel in der Konvertierungsflüssigkeit in einer Menge äquivalent etwa 20 g pro 100 g festes Substrat dispergiert.
Nach 3 Tagen Konvertierung für eine Reihe von Anteilen und nach 4 Tagen Konvertierung für eine zweite Reihe von Anteilen wurde das Enzym durch Kochen inaktiviert. Um die Möglichkeit zu vermeiden, dass unreagierte Stärke die Cyclodextrin-Bestimmung stört, wurde jede Flüssigkeit dann mit 0,01 ovo der bakteriellen alpha-Amylase (HT 1000) während 24 Stunden bei 60 "C und einem pH von 7,0 umgesetzt.
Nachdem die bakterielle alpha-Amylase inaktiviert war durch Kochen, wurde die gebildete Cyclodextrinmenge durch Trichloräthylenfällung bestimmt. Die durch die Fällungsmittel bewirkte Ausbeutesteigerung findet sich auch in der folgenden Tabelle IV wieder.
Tabelle IV Fällungsmittel Stärke- erzeugtes konzen- Cyclodextrin tration (gllOO ml) (g/100 ml) 3 Tage 4 Tage 3 Tage 4 Tage p-Cymol 33,3 14,8 16,8 44 50 Tetrachloräthan 33,3 14,9 15,7 45 47 Benzol 33,3 13,2 15,7 40 Kohlenstoffdisulfid 33,3 13,1 15,4 39 46 Toluol 33,3 13,0 15,1 39 45 Naphthalin (in Äther) 33,9 13,3 15,3 39 45 Trichloräthylen 33,3 12,6 14,4 38 43 Cyclohexan 33,3 15,5 13,8 47 41 Hexan 33,3 10,2 11,7 31 35 Chloroform 33,5 10,4 11,6 31 35 Brombenzol 33,5 9,3 11,5 28 34 Kohlenstofftetrachlorid 33,5 10,4 10,8 31 32 Anthracen (in Äther) 33,9 10,9 10,3 32 30 Thymol 33,3 6,3 7,6 19 23 Kontrollversuch 33,3 3,7 3,2 11 10 nen.
Ein anderes wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, dass sie zu einer verbesserten Wirtschaftlichkeit führt, weil niedrigere Kapitalkosten erforderlich sind, um eine gegebene Menge an Cyclodextrin zu erzeugen, weil die Erfindung zu einem verbesserten Cyclodextrinprodukt führt und weil höhere Substratgehalte als 3 bis 50/0 Feststoffkonzentration benutzt werden können. Als Ergebnis der Erfindung ist es nicht nur möglich, die Konvertierung bei Substratkonzentrationen von 20 bis 30 O/o auszuführen, sondern es ist auch erwünscht dies zu tun, weil die oben aufgezählten Vorteile mit im wesentlichen keiner Verringerung der Konvertierungswirksamkeit verwirklicht werden.
PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stärkehydrolysat mit einem Dextroseäquivalent nicht über 20 der Konvertierung mit Cyclodextrin-Transglycosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird, um ein Konvertierungsprodukt mit einem Gehalt an Cyclodextrin zu erhalten.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Stärke bis zu einem Dextroseäquivalent von nicht über 20 teilhydrolysiert und anschliessend die teilhydrolysierte Stärke der Konvertierung mit Cyclodextrin-Transglycosylase unterworfen wird.
2. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkehydrolysat durch Behandeln gelatinierter Stärke mit einer Säure, einem Enzym oder einer Kombination beider erzeugt wird.
3. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konvertierung in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexbildners ausgeführt wird.
4. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke mit Säure hydrolysiert wird.
5. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke mit Enzym hydrolysiert wird.
6. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkehydrolysat ein Dextroseäquivalent nicht über 6 besitzt.
7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkehydrolysat einen Feststoffgehalt von mindestens 10 Gew.O/o besitzt.
8. Verfahren nach Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkehydrolysat einen Feststoffgehalt zwischen 10 und 40 Gew. lo besitzt.
9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Konvertierungstemperatur zwischen 40 und 60 0C liegt.
10. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konvertierungstemperatur zwischen 45 und 55 "C liegt.
11. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Konvertierungs-pH 5,5 bis 7,5 ist.
12. Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Konvertierungs-pH zwischen 6,0 und 7,5 ist.
13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Konvertierungszeit 2 bis 7 Tage beträgt.
14. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass ein wässriges Konvertierungsprodukt mit einem Gehalt von mindestens 3 g Cyclodextrin pro 100 ml Konvertierungsprodukt erhalten wird.
15. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene cyclodextrinhaltige Konvertierungsprodukt konzentriert wird, um einen Sirup mit einem grösseren Feststoffgehalt als 50 /0 zu ergeben.
16. Verfahren nach Unteranspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene cyclodextrinhaltige Konvertierungsprodukt ausreichend konzentriert wird, um ein im wesentlichen festes cyclodextrinhaltiges Produkt zu ergeben.
Beispiel 5
Dieses Beispiel erläutert die Gewinnung von Cyclodextrin in beträchtlichen Ausbeuten aus hohen Feststoffkonzentrationen von Maisstärke durch das erfindungsgemässe Verfahren.
Maisstärke ist typisch für solche Stärken, welche beim Gelieren hohen Pastenviskosität besitzen und eine ausgesprochene Neigung zur Retrogradation entfalten.
Diese Pastenbildung hat die Verwendung von Maisstärke und ähnlichen Stärken für eine technische Gewinnung von Cyclodextrin nach den bisherigen Verfahren ausgeschlossen.
Eine 30 Gew. /oige Suspension von Maisstärke wurde auf 2,1 DE teilhydrolysiert und dann in Befolgung des Verfahrens gemäss Beispiel 1 erwärmt. Dieses Stärkehydrolysat wurde in mehrere Anteile aufgeteilt, welche dann bei einem pH von 7,2 und 50 OC in Anwesenheit von Toluol mit Cyclodextrin-Transglycosylase während der Zeiten und unter den Bedingungen, wie sie in Tabelle V folgen, konvertiert wurden. Die Cyclodextrin-Transglycosylase-Aktivität wurde nach der Konvertierung durch Erhitzen auf 100 OC während 10 Minuten vernichtet. Um die Möglichkeit zu vermeiden, dass unreagierte Stärke die Cyclodextrin-Bestimmung stört, wurden die Konvertierungsflüssigkeiten der Einwirkung von bakterieller alpha-Amylase wie zuvor beschrieben ausgesetzt.
Nach dem Kochen, um die bakterielle alpha-Amylase zu in aktivieren, wurde das vorhandene Cyclodextrin durch Trichloräthylenfällung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse folgen in Tabelle V.
Tabelle V Konvertierungs- Enzym- Gesamt- Cyclo- Cyclodextrintemperatur menge trocken- Idextrin ausbeute in /0 "C ;(Einheiten substanz (g/100 ml) /g T.S.) (g/100 ml) 4 Tage 7 Tage 4 Tage 7 Tage 55 200 38,1 15,3 20,3 40 53
400 38,1 20,8 22,0 55 58 60 200 38,1 15,8 17,7 42 47
400 38,1 18,9 21,3 50 56
Beispiel 6
Dieses Beispiel erläutert die wirksame Gewinnung von Cyclodextrin bei hohen Feststoffkonzentrationen aus Stärke, welche durch übliche Säurehydrolyse teilhydrolysiert wurde.
Salzsäure wurde zu einer 18 Gew. /oigen Suspension von wachsartiger Milostärke zugesetzt, um eine Normalität von 0,032 zu erhalten. Die Temperatur dieser Mischung wurde auf 97-99 OC gesteigert, um Gelatinierung und Teilhydrolyse zu bewirken. Nachdem die Stärke auf 3,4 DE teilhydrolysiert war, wurde Natriumhydroxyd zugesetzt, um ein pH von 5,6 zu erreichen, wodurch die Säurehydrolyse beendet wurde. Das erhaltene Stärkehydrolysat wurde anschliessend filtriert, auf 30 O/o Trockensubstanz durch Eindampfen konzentriert und mit Cyclodextrin-Transglycosylase bei 55 OC und einem pH von 7,0 in Gegenwart von Toluol konvertiert.
Nachdem getrennte Anteile des Hydrolysats 4 und 7 Tage konvertiert waren, wurde das gebildete Cyclodextrin durch Trichloräthylenfällung bestimmt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle VI. Tabelle VI schliesst auch zwei Prüfungen ein, worin die Stärke durch Säurehydrolyse auf ein DE von 8,1 vor ihrer Verwendung als Substrat für Cyclodextrin-Konvertierung hydrolysiert wurde. Diese Konvertierungen sind ebenfalls gezeigt.
Tabelle VI DE der Trocken- Enzym- Cyclodextrinausbeute Teil- substanz- menge in o/o hydrolysate konzentration (g/100 mi) 4 Tage 7 Tage 3,4 18,5 200 29 38 3,4 18,5 400 39 48 3,4 32,5 200 28 35 3,4 32,5 400 37 47 8,1 34,5 200 15 19 8,1 34,5 400 19 23
Die Vorteile der Erfindung sind vielseitig. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass das Verfahren Cyclodextrin-Konvertierung in wirksamer Weise bei hohen Feststoffkonzentrationen durchzuführen ermöglicht. Ein anderer Vorteil besteht darin, dass Cyclodextrin-Konvertierungen mit einer grösseren Auswahl an Stärkesubstraten, z. B. Maisstärke, welche im wesentli- chen bisher unbrauchbar war, ausgeführt werden kön
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