DE1643815A1 - Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin - Google Patents

Description

r :,.-·.*v* a* _ \ - 588.755. Case D 1936

G0H2T PRODUOüä 0 OMPAFI,

717 ^ifth Avenue, Few York, Ν*Υ_β USA

.Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin

Priorität: USA Patentanmeldung

ITr. 580.755 vom 24.. Oktober 1-966.

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren für die enzymatisch^ Herstellung von Cyclodextrin aus Stärke^

Cyclodextrine, auch bekannt als Schardinger Dextrine, umfassen 6 oder mehr miteinander unter Bildung von Cycloverbindungen durch 1,4-Bindungen verbundene Anhydroalpha-D-Glueose-Reste. Cyclodextrine können spezieller klassifiziert werden durch die Anzahl von vorhandenen G-lukoeeeinheiten. Der 6-gliedrige Ring ist als älpha-Cyclodextrin oder Cyclohexaamylose, der 7-gliedrige Ring als beta-Cyclodextrin oder Cycloheptaamylose usw. bezeichnet«

Ils Ergebnis der einzigartigen cyclischen Struktur,' weisen Cyclodextrine ein beträchtliches Potential als Komplexbildner auf, "Yiieil sie Einschlußverbindungen mit Molekülen bilden, welche innerhalb des Hohlraums des cyclischen Mole*

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ICüls verbleiben. Mögliche Anwendungen auf dem Gebiet der Nahrungsmittel, des Tabaks und der Medizin ebenso wie auf vielen anderen Gebieten sind zahlreich« ·

Cyclodextrine werden aus Stärke durch die Einwirkung eines Enzyms, gewöhnlich bekannt als Cyclodextrin-Transglycosylase (B. macerans amylase) hergestellte Die Quelle des Enzyms ist üblicherweise eine Kultur von Bacillus macerans_o Die Kapazität zum Erzeugen des Enzyms, welches die Cyclodextrine synthetisiert, ist häufig ein !Criterion, welches, dazu dient, Stämme vom Bacillus macerans von anderen nahe verwandten Mikroorganismen zu unterscheiden. Zum Erzeugen des Cyclodextrin synthetisierenden Enzyms wird Bacillus macerans unter geeigneten Bedingungen auf geeigneten Medien, welche geeignete Quellen an Stickstoff, Kohlenstoff, Wachstumsfaktoren und Mineralstoffen enthalten, gezüchtet. Verschiedene geeignete Mittel zum Erzeugen von Ojcclodextrin-Transglycosylase sind in der Literatur (D. French in "Methods in Enzymology", SoP. Colowick and U.Oο Kaplan, Academic Press, New York, I.Y«, Vol. Y, 1962, S. 148-155) beschrieben. ' ■■" *'

Die Menge an Oyolodextrin-Transglycosylase-Aktivität, welche in Bacillus-macerans-Zubereitungeh vorhanden ist, wird zweckmäßigerweise durch das Tilden-Hudson-Verfahren (E.B. Tilden und CSo Hudson, J. Bacteriol 43, 527-544» 1942) gemessen. Dieses Meßverfahren ist'auf alle Kultur- ' flüssigkeiten oder auf Enzymzubereitungen anwendbar, welche durch Eindampfung, Adsorption an geeigneten Adsorbentien und anschließender Auswaschung daraus, !lösungsmittel- oder SaIzfällungen oder Fraktionierung, oder andere für den Fachmann bekannte Mittel gereinigt -oder konzentriert wurden. 2098.13/Λ272

Hohe ICulturflüssigke it en enthalten im allgemeinen 3-- 6 i'iläen-Hudson-ilinheiteii pro- ml« _t G-tiüäiS üblichen, bekannten Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin wird Cyclodextrin-üransglycosyläse zu einer verdünn: te η Lösung einer geeigneten gelatinierten Stärke zugesetzt, und die 3nzymolyse: wird unter- Bedingungen fortschreiten gelassen, v.eiche zu einer fortgesetzten Emzymeinv/irkung während ausreichender Zelt führen, um die Überführung der Stärke in Cyclodextrin zu ermögliche*?.*

Bisher wurde vorgezogen, Kartoffelstärke "wegen ihrer geringeren 27eigung zum Ee trogradier en bei der angewendeten Eonversionstemperatur zu verwenden. Ferner wurde es nicht als ausführbar betrachtet, Eartoffeistärke mit Konzentrationen über 5yo Feststoffe zu verwenden! es ist nämlich unmöglich, mit höheren Stärkekonzentrat ionen wegen der hohen Viskosität und der Stärkeretrogradation zu arbeiten_e wenn die Stärke während der¹ SEg^SZM^Ü 'Enzymolyse retro— graäiert, führt dies zur Anwesenheit von viel unkonver— tierter Starke in den lionvertierungsflüssigkeiten, was die-Schwierigkeit der Gewinnung des vorhandenen Cyclödextrins vergrößert. Ebenfalls sind modifizierte Stärken im allgemeinen nicht als Substrat verwendet worden, weil die daraus an Cyclodextrin erhaltenen Ausbeuten wesentlich niedriger waren, als'die aus unmodifizierter Stärke erhaltenen, (S* dazu 33. French ... Pie Stärke, V§, 280-284» 1963). V ;.'. ^::" Λ

Obwohl Cyclodextrine bekannt waren, sind sie nicht in großen Mengen verfügbar gewesen, Wirtschaftliche Mittel für ihre Gewinnung haben bisher nicht bestandene Viele Faktoren tragen zu den hohen Kosten der Geviinnung von

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Cyclodextrin durch die bisherigen Verfahren bei»

Ein größerer Nachteil dieser bisherigen Verfahren für die _; G-ewinnüng-von Cyclodextrin ist der Umstand, daß Eonversion nur mit geringen Trockenstoffkonzentrationen ausführbar ist. Die Kosten des Umgehens mit großen Flüssigkeits— Volumina einschließlich des Erwärmens auf hohe Temperaturen und anschließendes Erniedrigen der Temperatur ebenso wie das Konvertieren während langer Zeiten, um Cyclodex—

in wesentlichen Mengen

t^zu"erzeugen, machten die bisherigen Herstellungsverfahren in wirtschaftlicher Hinsicht nicht reizvoll»

Die wirtschaftliche Situation wird ferner durch den Umstand erschwert, daß, um d,as Cyclodextrin aus verdünnten Konvertierungsflüssigkeiten zu gewinnen, ein geeignetes Fällmittel, beispielsweise Trichloräthylen, zugesetzt wird, um das Cyclodextrin im wesentlichen unlöslich zu machen. Die Löslichkeiten der Cyclodextrin-Komplexe in diesen verdünnten Flüssigkeiten sind solche, daß es nicht möglich ist, das gesamte in den Flüssigkeiten vorhandene Cyclodextrin zu gewinnen. Beispielsweise ist durch di&ses Ver— P fahren die Löslichkeit des Cyclodextrins in Anwesenheit von Trichlorethylen, eine solche, daß 2Q^ des gesamten vorhandenen Cyclodextrins in Lösung verbleibt, was ein wesentlicher Verlust ist. · .

Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren für die Konvertierung von Stärke zu Cyclodextrin su schaffen, worindas Stärkesubstrat in Lösung bei einem höheren Feststoff·* gehalt vorhanden ist und Cyclodextrin in höheren Konzentrationen als bisher gewonnen wird« . .. / "

Es i. ü ein linderes Ziel der Erfindung, ein Verfahren sur Gfewin/une; von Cjclodexiriii mvj otärke i:u schaffen, worin

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das Cyclodextrin oder seine Komplexe leicht kristallisierbar sind und während der Konvertierung kristallisieren können& . -

Ein anderes Ziel der Erfindung ist die wirtschaftliche Verwendung von Stärken für Gyclodextrin-Konvertierung zu ermöglichen, welche wegen der ihnen innewohnenden geringen Pästenbildungsvermögen oder ihren Ifeigungen zur Retrogra— dation bisher nicht dafür geegg.net waren·

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein praktisches Terfahren zu schaffen, um hohe Ausbeuten an Cyclodextrin aus Stärke zu erhalten· '

Andere Ziele der Erfindung werden noch aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbar«

Die Erfindung schafft ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin aus einem Stärkehydrolysat mit einem DB nicht über etwa 20 und ist dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkehydrolysat einer Konvertierung mit CyQlodextrin-OJraiisglycosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird_f um ein Konvertierungsprodukt mit einem Gehalt an Cyclodextrin zu erhalten·

Die Erfindung schafft auoh ein Verfahren zum Herstellen von,Cyclodextrin aus Stärke, welches dadurch gekennzeichnet 1st, daß Stärke auf ein DE nicht über etwa 20 teilhydrolysiert und anschließend die teilhydrolysierte Stärke der Konvertierung mit Cyclodextrin-Transglyoosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird, um ein Konver*· tierungsprodukt mit einem, Q-ehalt an Cyclodextrin--zu; erhaltend ■

Es wurde gefunden, daß, wenn ein Stärkehydrolysat mit einem

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DÜ-Wert von nicht mehr als etwa 20 der Einwirkung von Gyclodextrin-Transglycosylase unterworfen wird, ausgezeichnete Ausbeuten an Cyclodextrin erhalten werden; die : Konvertierung zu Cyclodextrin kan#ieicht bei hohen Stärke— konzentrationen ausgeführt werden, Schwierigkeiten mit Stärkeretrogradation und Stärkeverunreinigung des Produkts werden vermieden und Isolierung und Reinigung des Cyclodextrins vereinfacht. Um die Mangel der bisherigen Technik zu erläuternj Bisher empfohlene Verfahren für die Herstellung von Cyclodextrin aus feiger Stärkesuspension würden ein Untgehen mit 2233 1 Wasser pro 45,4 kg erzeugtem Cyclodextrin erfordern» Fach dem erfindungsgemäßeη Verfahren, wobei eine 34$ (gewichtsmäßig) Feststoff besitzende teilhydrolysierte Stärkelösung mit einer 50$igen Aus— . beute an Cyclodextrin konvertiert werden kann, brauchen nur 220 1 Wasser pro 45»4 kg erzeugtes Cyclodextrin behandelt zu werden. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren mit niedrigeren Feststoffgehalten angewendet werden kann, besteht einer der wesentlichen praktischen Vorteile, dieses Verfahren darin, daß es möglich ist, Cyclodextrin in einem Medium gu gewinnen, welches eine geringste Menge an Wasser enthält. Der Feststoff gehalt des Ausgangsreaktionsge·· misches wird üblicherweise 10 Gew·^ überschreiten und kann vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 50 Gew.?! liegen·

Die gemäß der Erfindung gewonnenen Cyclodextrine sind für die gleichen Zwecke wie die naoh-früheren Verfahren erhaltenen brauchbar. Beispielsweise sind nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Produkte geeignet als aroma- ^! freimachende Stoffe für Tabakrauch und können auf einem ' Trägerfilter zur Herstellung von Tabakfiltern benutzt wer— 2(198 t3/1272

~⁷~ ΊΒ43815

den»-Sie sind auch als an sich bekannte Einschließungs— stoffe.brauchbar und finden aus diesem Grund Verwendung in der Chromatographieο * ' .

Herstellung eines Stärkehydrolysate

Jede Art von Stärke oder fftärkefraktion kann benutzt "werden, um ein Stärkehydrolysat zu gewinnen, z.Bo ..Getreide*· und Knollenstarken, wachsartige oder amylasereiche Stärken und d-ie Amylase- oder Amylopectinfraktionen daraus _o Rohe Stärkequellen können auch benutzt werden, z.B. vermahlenes .Getreide, macerierte Knollen oder freilgereinigte Stärke daraus· Wenn rohe Stärkequellen benutzt werden, kann das Cyclodextrin gewonnen werdenr durch Erwärmen des Eonvertierungsprodukts, um das Cyclodextrin löslich zu machen, filtrieren, um Unlösliches zu entfernen und Gewinnen von Cyclodextrin aus dem Piltrat durch Kristallisation oder Ausfällung·

•Teilhydrolyse von Stärke kann durch übliche Mittel bewerkstelligt werden. Geeignete Katalysatoren für die Teilhydrolyse schließen ein Säuren, saure Salze, saure Ionen austauschende Harze und geeignete Enzyme. Das Stärkehydrolysat wird dadurch gewonnen, daß gelatinierte Stärke einer Behandlung mit Säure oder Enzymen oder mit beiden unterworfen wird»

Der Ausdruck Stärkehydrolysat umfaßt das irodukt, welches aus der enzymatisohen oder sauren HydroIyse von. Stärke stamst, wobei die Hydrolyse mit gelatinierter Stärke durchgeführt wird*

ialls Säurehydrolyse angewendet wird, lcarin die Ac id i tat während der hydrolytischen Wirkung ,erniedrigtiwerden, wenn oie Ü!e:^-e:'a'bur und Zeit der Hydrolyse ^esteigert werden,

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u.Za bis zu einem Punkt, wo noch ausreichende Hydrolysewirkung sogar in neutraler Lösung erhalten werden kann, ■ do ι« bei einer Temperatur von 204 G.

Ein besonders geeignetes Verfahren für Teilhydrolyse von Stärke besteht in der Verwendung von alpha—Amy lasebak-terien. Das. Enzym kann in Porm von handelsüblichen wärmewiderstandsfähigen alpha-Amgrlasen, gewonnen durch gewisse Stämme von Bacillus subtilus oder Bacillus mesentericus, ■erhalten werden«

Während wärmebeständige bakterielle alpha-Amylase-Zube-™ .reitungen besonders zum Gewinnen des Stärkehydrolysats geeignet sind, können auch andere alpha-Amyläse—Zubereitungen verwendet werden^ beispielsweise; solche, welche aus Bakterien, Pilzen, Gerealen oder Tieren -stammen* Wenn die Zubereitungen einen hohen Gehalt an saccharogener Enzymaktivität besitzen, sollten sie unter Bedingungen an pH, Temperatur und Zeit der. Konvertierung benutzt werden, "um die verflüssigende Enzymaktivität zu steigern und die saocharogene Enzymaktivität auf einem W Mindestmaß jau halten« "

Wenn ein Enzym verwendet wird, um die Teilhydrolyse zu bewirken, sollte die Temperatur während der Hydrolyse unter der Inaktivierungstemperatur der Enzyme sein. Der Hydrolysekatalyaator kann zu der Stärke vor, während oder nach der Gelatinieruhg der Stärke zugesetzt werden. Teil-• hydrolyse wird bewirkt, um die Stärkepasteviskosität auf einen solchen G-rad zu verringern, daß die Stärke leicht bei hoher Feststof!konzentration gehandhabt werden kann· Sie macht auch die. Stärke löslich, sodaß diese -leicht für

die Enzymolyse durch das zum Gewinnen des Cyclodextrins 209813/1272

verwendete Enzym Ist. Zusätzlich verringert Teilhydrolyse erheblich Retrogradation der' Stärke und ermöglicht 'wirk- -same Ausführung der Enzymolyseo lerner Ist das Cyclodextrin leichter gewinnbarv Vorzugsweise wird die Teilhydrolyse bei einem DE im Bereich zwischen etwa O_t5 und etwa 6 ausgeführt. DE Ist die Abkürzung für Dextroseäquivalent, welches die Gesamtmenge an vorhandenen reduzier enden Zuckern, berechnet als Dextrose undausgedrückt als$ Trockensubstanz, "Ist» ; ;·. .

das bevorzugte Verfahren für die .Ausführung der Erfindung darin besteht, daß die Stärke auf etwa 0$5 bis etwa 6 DE vor der Enzymolyse hydrolysiert wird, um Cyclodextrin zu erhalten, kann die Stärke auf einen höheren oder niedrigeren Grad hydrolysiert werden· Wenn das Stärkehydrolysat ein DE wesentlich niedriger als 0,5 hat, treten die der Verwendung von unhydrolysierten Stärken innewohnenden erwähnten Probleme allmählich mit abnehmenden DE-Werten auf· Diese Probleme schließen eine unbehandelbare Viskosität und Retrogradation dei Stärke ein. Wenn die Teilhydrolyse wesentlich über einem "DE von 6 durchgeführt wird, nimmt die Ausbeut© an Cyclodextrin ab»

Konvertierungsstufe - Gewinaung von OyoiodeXtrin Fach der jeilhydrolyse ist das Stärkehyärolysat fertig zur Eonv0rtierung zu Cyclodextrin; duroh die Einwirkung von Gyclodextrin-Tranaglyoosylase» Dieses inzymiat optimal aktiv bei Temperaturen zwischen etwa 40 und; etwa 60⁰C und bei pH-Werten vorzugsweiae zwischen etwa 5>5 un4 etwa 7>5· Um höchste Ausbeuten an Cyclodextrin zu trhsitfn-i, ist as erwünscht, das Stärkesubstrat innerhalb.dieser Örenzen zu ' halten, obwohl 3±wji|höhe^fi-oder niedrigere pH* unt Tempe-

raturwerte benutzt werden können. '.'■=■"»'..

• Die angewendete Menge an Cyolodextrin-Iransglycosylase •;. - ist von der gewünschten Schnelligkeit, mit welcher die > Enzymolyse durchgeführt werden soll und auch von anderen angewendeten Konvertierungsbedingungen abhängig. Beispiels-' weise, wenn die l'emperatur und das pE konstant gehalten werden, ist die Menge an benutztem Enzym umgekehrt proportional der Dauer an erforderlicher Zeit, um die gewünschte Menge an Cyclodextrin zu erhalten. Zeitj Temperatur, En- ^ zymmenge und pH können eingestellt werden, um die größten Mengen an Konvertierungsprodukt während der kürzesten Zeit zu erhalten·

Im allgemeinen können höchste Ausbeuten anCyclodextrin innerhalb etwa 2-7 lagen bei 5G⁰C und bei einem pH von etwa 7 erhalten werden, wenn die Enzymmenge zwischen etwa 100 und etwa 1.000 Tilden-Hudson-Einheiten pro tOO g Stärke liegt«

Gewinnung von Cyclodextrin .

P Daa in der Konvertierungsflüssigkeit vorhandene Cyclodextrin kann leicht durch übliche Fällungs- und Kristallisationsverfahren gewonnen und gereinigt werden·

■ *

'■■■■-■ ' j

Die einzigartige Fähigkeit von Cyolo^extrinen zur Bildung von Eihsohlußverbindungeii mit vielen organischen Verbindungen kann benutzt werden, um das in der Konvertierungs- | flüssigkeit vorhandene Cyclodextrin im Anschluß an die .

Enzymolys© zu gewinnen. Somit führt der Zusaija einei ge- ..j eigneten Fällungsmittels, z.B. Trichloräthylen, ietrachlor-- · äthan, Brombenzol und dergl., zum Ausfällen des Öyölo· ■ • dextrins infolge der verringerten Löslichkeit döa Cyolo- ■;

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dextrinkomplexe a. Durch Ausnutzung verschiedener 3?ällungsmittel-iot es möglich, das eine oder andere Cyclodextrin" ' zu erhalten, beispielsweise alpha— oder beta—Cyclodextrin^ in gereinigter !Form« Es ist auch möglich, die Anhäufung des entsprechenden Cyclodextrins fahrend der Konvertierung in gewissem Grad zu steigern« Die unlöslichen Cyclodextrin«- komplexe können gewünschtenf alls auch durch⁷ Umkristallisieren und dergl. gereinigt werden» ■

Stattdessen kann leicht festes Cyclodextrin durch direkte Kristallisation aus den Konvertierungsflüssigkeiten durch bekannte Kristallisationsmittel erhalten werden«. Die Kon»- vertierungsflüssigkeit mit dem darin enthaltenen gebürdeten Cyclodextrin kann nach geeignetem Raffinieren eingedampft oder getrocknet werden^ um einen ein festes Cyclodextrin· enthaltenden Sirup zu ergeben»

Die Erfindung wird noch an den nachfolgenden Beispielen erläutert.

Beispiel^ _;

Zu einer 30 Gew«$igen Suspension von KartoffelsBrke mil; pH 7>2 wurde/l die bakterielle alpha-Amylase-Zuberei-bung HD 1.000 (unter diesem Händelsnaiaen verkauft von der Miles Chemical Laboratories) mit einer Konzentration von 0,025 Gew.# der Enzymzubereitung, bezogen auf die Stärkefeststoffe zugesetzt· Die Suspension wurde allmahlieli während 30 Minuten zu einem auf einer iemperattii' von gg.* 92⁰G gehaltenen Gefäß, zugesetzt* Rühren wurde fortge« • setzt und die Temperatur während zusätzlicher 25. Minuten gehalten, bis die Stärke auf 2,6 DE teilhydrölysiert war»

Die hydrolysierte Stärke wurde dann unverzüglichmuf ein' pH von 5,8 eingestellt, auf 121⁰C erwärmt und 15 Minuten 209813/1272 BADORlGiHAL

• - - - I2.f- - ■■.■■■

darauf gehalten, um restliche alpha-Amylase-Aktivität zu vernichten» , ■

Das so erhaltene Stärkehydrolysat wurde dann auf45°0 gekühlt und das pH auf 6,0 eingestellt» Das Hydrolysat wurde dann in Anwesenheit von 5 ml Toluol pro 100 ml Konver— tierungsflüssigkeit mit einer Menge von Gyclodextrin-Trans» glycogylase äquivalent 200 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärkehydrolysatfeststoffe konvertiert. Nach 5 Tagen Enzymolase bei 45 0 wurde die Konvertierungsflüssigkeit während 15 Minuten sieden gelassen, um das. Enzym zu in-A aktivieren, das Toluol abzutreiben und Cyclodextrin löslich zu machen. Das Konvertierungsprodukt wurde noch heiß dann filtriert* »

Die filtrierte Konvertierungsflüssigkeit- wurde in drei Anteile A, B und G geteilt und wie folgt behandelt:

Teil A wurde durch direkte Trichloräthyleiifällung analysiert, um die Menge an anwesenden Cyclodextrine^ zu beistimmen. Die folgende analytische Methode wurde für jede 0acIodextrin-Analyse bei allen Beispielen angewendet:

^w ₌ . Der Oyclodextringehalt -.,urde durch Zusetzen eines Überschusses von Trichloräthyleii zu der !Convert ie rungs flüssigkeit (25 ml pro 100 ml Eoiivertierungsflüssigkeit) bestimmt,, wobei; die Mischung während 3—7 Tagen bei- ~ '.. 25 - 30 G geschüttelt wurde, im Vakuum durch V/hatman ITo. 1 Filterpapier filtriert, der Filterkuchen mit einer Menge Wasser von 5⁰G äquivalent 10?j des Volumens der Koiivei-tieimiigsflüssigkeit gewaschen, der Filterkuchen quantitativ enthomrüen und bei 80°G unter einem Vakuum von etwa 71 cm Queoksilbe'::¹' während etwa 24 itunden getrocKrt«·⁴ wvrcU^ BAD ORIGINAL

.c .209813/1272

Die Ausbeute an rohen Oyclodextrinen wurde aus dem Gewicht des Cyclodextrin-lilterkuchens durch f-olgende lormel berechnet:

io Ggcclodextrinausbeute = ■- ■ " ν -.. "

-■■■■■:." ... keit 100 x Trockengewicht des gilterkuohens pro "Volumen fflüssig-

G-ewicht der Stärkefest stoffe pro IPiüsaigkeitsvolumen·'

Teil B wurde auf 80⁰O bei einem pH von 6, 24 Stunden in Anwesenheit von 0*02$ einer bakteriellen alpha-Amylase·- Zubereitung (HD 1000) gehalten und danach auf 121°Ö während 15 Minuten erwärmt, um ias Enzym zu inaktivieren« Die Menge an vorhandenem Cyclodextrin wurde dann wie oben be 'Teil 0 wurde mit bakterieller alpha-Amylase wie oben beschrieben behandelt, auf eine Temperatur von 121 0 erv?ärmt- und dann auf 75⁰O gekühlt. Danach wurde die I¹IUsaigkeitstemperatur allmählich-auf etwa 3O⁰O während der nächsten 51 Stunden verringert, wobei die Flüssigkeit gerührt wurd, um Kristallisation des vorhandenen Cyclodextrins zu begünstigen» Die angesammelten Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gewonnen, gewaschen, getrocknet und gewogen. Diese Kristalle werden als Teil 0-1 bezeichnet· Die vereinigte Mutterlauge und Waschflüssigkeit wurden durch Behandlung mit Aktivkohle raffiniert und filtriert_§ um die Kohle zu entfernen. Dia gereinigte Mutterlauge wurde dann eingedampft, um einen als Teil 0-2 bezeichneten Sirup zu ergebene

Ir ie jürgebniaa«? dieser Behandlung f ο 1-gen in der Tabelle»

aft Q'il 1 ^ / *ί *5 *ϊ Ί
υ & Θ ι 4 ι ι 4L I I

a b e 1 1 e I

Anteil	Be Schreibung	de:	Gesamttrocken—	Cyclodex-
	: - - -		substanz (g/100ml\	trinausbeute
A	ursprüngliche Konvertierungs- flüasigkeit	4,3	41,1	39
B	alpha-amylase-"be handelt e Flüssigkeit	13,1	39,2	37
0-1	Kristallines Cyclodextrin			27
0-2	Eonzentrierte Mutterlauge	16,8	58,0.	.— 10

Dieses Beispiel zeigt die Gewinnung von Cyclodextrin in erheblicher Ausbeute durch das erfindungsgemäße Verfahren, Weil die Cyclödextrinausbeuten aus den Teilen A und B im ■wesentlichen gleich sind, zeigen die XX£g Ergebnisse, daß der ausgefällte Cyolodextrinkomplex, erhalten durch dieses Verfahren, im -wesentlichen frei von nicht umgesetzter Stärke ist. Überdies wird gezeigt, daß geeignete Enzyme, wie z.B. bakterielle alpha-Amyläse, galnpaftis-fg» gebraucht werden können, um in der Konvertierungsflüssigkeit verbleibende nicht cyclische"Glucane zu hydrolysieren, ohne eine merkliche gleichzeitige Hydrolyse des vorhandenen Cyclodextrins und ohne entsprechende-Verringerung der Ausbeute» Die Ergebnisse erläutern auch die Möglichkeit des Gewinnens von Cyclodextrin in beträchtlicher Menge durch . direkte Kristallisationsverfahren und zeigen die Herstellung eines Sirupprodukts mit einem Gehalt an Cyclodextrin·/

Beispiel 2 ■'', _ --.-'.

ύ 83β3 EerLöfiel vergleicht die Behandlung, eines Stärke-

2 Q 9 8 1 3 7 1 2 7 2 SAD

hydrolysate mit einem Enzym zum Gewinnen von Cyclodextrin mit der Behandlung von unhydrolysi-erter .Stärke zur Gewinnung von Cyclodextrin«»

Eine 30 Gew<,$ige Suspension von Kartoffelstärke wurde mit bakterieller alpha-Amylase wie in Beispiel 1 behandelt, um ein Stärkehydrolysat mit einem DE von 2,0 und einem Gehalt von 34 g Feststoffe pro" 100 ml zu ergeben· Dieses Stärkehydrolysat wurde mit Wasser auf Erookenfeststoff*- gehalte, wie in der folgenden Tabelle II angegeben, verdünnt. Die Hydrolysate" wurden dann bei 50⁰G und bei einem pH von 7»2 in Anwesenheit von Toluol mit einer Oyolodextrin-Transglyoosylase-Menge von 200 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100 g Stärke-Trockensubstanz konvertierte lach 7 Tagen der Konvertierung wurde das restliche Enzym durch Erwärmen auf 100⁰G während 10 Minuten inaktiviert, und das vor*~ handene Cyclodextrin wurde durch Trichloräthylenfällung bestimmte ..""_■

Die unhydrolysierten Stärkebreie wurden mit verschiedenen i'rockensubstaiizgehalten hergestellt, in gleicher Weise gelatiniert und unmittelbar mit Gyclodextrln-Transglycosylase behandelt* Die erhaltenen Ergebnisse folgen in Tabelle II

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a b e 1 1 -e . II

	Substrat-	11,3	erzeugtes	Cyclodextrin	26 _ 37 40	Eigenschaften der Kon	Filtration
	konzen-	17,0			42	vertier ungs flüssigkeit	schlecht
Substrat	ox abxuix -g/100 ml	22,7	g/100 ml	G-ew.^ Stärke	46	Fluidität	schlecht
Gelati	3,2	28,3	0,4	13	48	fließend	schlecht
nierte Stärke	5,4	34» O	1,5	• 28	47	fließend	schlecht
	8,1	2,5	31	52	fließend	nicht fil trierbar
	10,8	4,3	40	fließend	nicht fil trier bar
	16,1	—	..- nicht	fließend	gut gut gut
	21,5	—	nicht	fließend	gut
teilhydro- 3,4 lysi&rte R η stärke p?' (2,0 DS) 8,5	0,9 2,1 3,4	fließend fließend fließend	gut
	4,7	fließend	gut
	7,9	fließend	gut
	11,0	fließend	gut
	13,2	fließend
-	17*6	fließend

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des neuen Verfahrens, Cyclodextrin in hohen Ausbeuten mit hohen TrOckensubstansgehalten.zu erzeugen. Bei den bisherigen Verfahren war dies nicht möglich. ■ ■" .

Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die frühere Ansicht zu Secht besteht, nämlich daß hohe Feststof!Umwandlungen nicht praktisch sind, wenn das Substrat .aus gelatinierter aber nicht hydrolysierter Stärke. bestellte

Beispiel 3 -■ . .

Die Tatsache, daß das Ausmaß der Hydrolyse sich auf die Ausbeute an aus Stärkehydrolysateii. erhältlichem Cyclodextrin auswirkt, .wird "durch die Verwendung einer 30

20981371272 BADOBIQINAL

igen Dispersion von enzym-verflüssigter wachsartiger Milosfcärke gezeigt. ■

-Das Verflüssigungsverfahren bei diesem Beispiel war gleich dem in Beispiel 1 beschriebenen mit der Abänderung! daß eine geeignete Menge von bakterieller. alpha-Amylase ver- ■ vjendet wurd, sodaß verschiedene DE-Werte erhalten werden köniiteno 30 Gew.^ige Dispersionen von wachsestiger stärke wurden bei einer Temperatur von 90 - 92⁰G während einer ¹AeHi₁ die e'rforderlioh war, um die verschiedenen DE-:

Werte zu erhalten, hydrolysiert» ' '~ g

Getrennte Mus-ter der teilhydrolysierten Stärke von 34 g. !Trockensubstanz pro 100 ml wurden auf 121 G erwärmt, um die restliche alpha-Amylase-Aktivität zu vernichten« Die Muster wurden; danach bei 5O⁰C und einem pH von 7»2 in Gegenwart von Toluol mit einem Gyolodextrin-Transglycosylase-Zuaatz von 400 Tilden-Hudson«-Einheiten pro 100 g Stärkefeststoffe konvertiert. Das vorhandene oyclodextrin v/urde nach 4 und 7 Tagen Konvertierung durch die vörbe— schriebene Trichloräthylenfällung bestimmte Tabelle III zeigt, daß Ausbeuten an Cyclodextrin über 40$ erhalten wurden, wenn die Stärke vor der Konvertierung zu einem DB im Bereich von 0,4 - 6 hydrolysiert wird und daß GyQlO-dextr'inausbeuten über 3 g pro 100 ml bei einem DE Ms 2Ö erhalten ,werden»

20 ^81 3/ Uli

	- "	7 Tage	' 1643815	4 Tage	=-	7.Tage
	Tab β lie	18,4		49	54
DB dea Teil-		17,4		45	51
hydrolysata	i 111	18,0	Cyclodextrinauabeuten	42	53
	Oyblodextrinauabauten	15,3	in ft	36	45
0,4	g/100 ml	14,0	31	4f
1,0	4 Tage	10,9	24	32
' 1,9 - .	16,5	7,5	17	22;
3,5 .	15,3	6,1	13	18
6,0	14^	5,1	9	15
8,8	12,2	3,7	8	11
12,0	10,5	2,4	5	7
I5,f	8,2	0,7	2	2
1-7,1	5,8
19,6	4,4
22,9	3,1
25,5	2,7
Beispiel 4	1,7
0,7

Dieses Beispiel erläutert» daß es für größte Wirksamkeit wünschenswert ist, Oyclodextrinkonvertierungen in Anwesenheit einer angemessenen Menge eines geeigneten Eällungs— mittels auszuführen. Vermutlich besteht die Funktion des* iällungsiiiittels darin, unlösliche Komplexe mit den Oyölodextrinen zu bilden, wenn diese erzeugt werden, woduroh die Cyclodextrine aus dem Reaktionsgemisoh. entfernt werden und hierdurch das Gleichgewicht der Reaktion zugunsten weiterer Gyelodextrinerzeugurig veraci|oben wird. Beispiele geeigneter Pällungsmittel werden in Tabelle UT gezeigt* In diesem Beispiel wurde eine 30 Gew^Ige Suspension von Kartoffelatärke auf 1,9 BB verflüssigt und in Verfolgung dea Verfahrens von Beispiel" 1 erwärmt. Die verflüaaigte Stärke wurde in mehrere Anteile aufgeteilt und bei 5Ö°0 ■"'

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und einem pH von 770 und mit einer.Cyclodextrin-Transglycosy-lasemenge von 500 Tilden-Hudson-Einheiten pro 100g Substrat-Trockensubstanz konvertierte 5 Stunden nach Beginn der Konvertierung wird das. GyelOdextrinfällungsmittel in der IConvertierungsflüssigkeit in einer Menge" äquivalent etwa 20 g pro 100 g festes 8/faibstrat dispergierte

Fach 3 Tagen Konvertierung für eine Eeine von Anteilen und nach 4 Tagen Konvertierung-für eine zweite Seihe von Anteilen wurde das Enzym durch Kochen inaktiviert. TJm die Ilöjlichkeit zu vermeiden, daß unreagierte Stärke die ■

Gyclodextrin-BeStimmung stört, wurde jede I ]?lüssigkeit dann mit 0,01$ der bakteriellen alpha-Amylase (HT 1000) -während 24 Stunden bei §0⁰G und einem pH von .7»0 umgesetzt6 STachdem. die bakterielle alpha-Amylase inaktiviert war durch Kochen, wurde die gebildete Gyelodextrinmenge durch Trichloräthyleiifällung bestimmt. Die durch die Pällungsmittel bewirkte Ausbeutesteigerung findet sich auch in der folgenden Tabelle Ι1Γ wieder_o

- 20 V

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	_ 2Q -	■',-■-33,9.	le IV	16,8	1643815	•	50
	T a b el	33,3		'15,7			47
Fällungsmittel·	Starke- konzen- tration (g/100 ml)	33,3		15,7	Cyclodextrin Ausbeute info 3 Tage 4 Tage	47
p-Gymol	33,3		erzeugtes Cyclodextrin (g/1ÖO ml) ■ 3 Tage '4 Tage	15,4	44	46
Tetrachlorathan	33,3		t$,e	15,1	45	•45
Benzol	.33,3	• 14,9	15,3	40	45
Kohlenstoff disulf id	33,3	13,2	14,4	39 '	43
Toluol	33,3	13,1	13,-8	39	4t
Naphthalin (in Ither)	33*9	13,0	11,7	39	35
Trichloräthylen	33,3	• 13,3	11,6	38	35 ^
Gyclohexan	33,3	12,6	11,5	47.	34
Hexan	33,3	15,5	10,8	31	32
Chloroform	33,5	10,2	10,3	31	30
Brombenzol	33,5	10,4	7,6	28	23
Kohlenstofftetrachlorid 33,5	9,3	3,2	31	10
Anthracen (in Äther)	10,4		32.
Thymol	10,9	'19
Kontrollversuch	6,3	11
Beispiel 5	3,7

Dieses Beispiel erläutert die Gewinnung von Cyclodextrin in beträchtlichen Ausbeuten aus hohen Feststoffkonzentrationen von Maisstärke durch das erfindungsgemäße Verfahren·

Maisstärke ist typisch für solche Stärken, welche beim Grelleren höhe Pastenviskosität besitzen und eine ausgesprochene: Ii^ gung zur Retrogradation entfalten. Diese Jaatenbildung hat die Verwendung von Maisstärke und ähnlichen Stärken für eine technische Gewinnung von 'Cy-Q-Io** , dextrin nach den bisherigen Verfahren ausgeschlossen·

Eine 30 GeWeJöige Suspension von Maisstärke wurde auf _f . 2,1 DE teilhydrolysiert und dann in Befolgung des Verfahrens gemäß Beispiel 1 erwärmt.- Dieses Stärkehydrolysat.

20 9 8 1 3/1272 ^BAD ORIGINAL

wurde in mehrere Anteile aufgeteilt, welche, dann bei einem pH von 7,2 und 50⁵G in.Anwesenheit von (Toluol mit Oyclodextrin-Transglycosyläse während der Zeiten und unter den Bedingungen, wie sie'in Tabelle Y folgen, konvertiert wurden. Die Gyclodextrin-Transglycosylase-Aktivität wurde nach der Konvertierung durch Erhitzen auf 10O⁰O während 10 Minuten vernichtet. Um die Möglichkeit zu vermeiden, daß unreagierte Stärke die Qyclodextrin-Be Stimmung stört* wurden die Eönvertierungsflüssigkeiten der Einwirkung von bakterieller alpha-Amylase wie zuvor beschrieben ausge-? setzt. Nach dem Kochen, um die bakterielle älpha-Amylaae zu inaktivieren, wurde das vorhandene Oyclodextrin durch Trichloräthylenfällung bestimmt„ Die erhaltenen Ergebnisse folgen in Tabelle V* '■■:■·

	T	a be 1 le	Y	7 Tage	Gyolodextrin·* ausbeute in ^	7 Tage
Zo nve rtierungs— temperatur σ	Enzym menge (Einheiten	Gesamt- trocken- substanz		20,3	4 Tage	53
	/g T«S.)	(g/100 ml)	Cyclo dextrin (g/100 ml)	22 10	40	58
55	200	38,1	4 Tage	17,7	55	47
	400	38,1 ;	15,3		42	56 8
60	. 200	38,1	20,8		50
	400	38,1 l	15,8
Beispiel-6...		18,9

Dieses Beispiel erläutert die wirksame Qewinnung von Cyclodextrin bei hoheii Peststoffkonzentratioiien aus Stärke, welche durch übliche SäurehydrOlyse teilhydrolysiert wurde«

Salzsäure v^urde su einer 18 Gew^iigen Suspension von waehe«- artigsr lilostärke.augesetzt _$ um eine Normalität von 0,032

' 1843815-.

zu erhalten,, Die Temperatur dieser Mischung wurde auf 97 - ^9⁰O gesteigert, um G-elatinierung und Teilhydrolyse zu bewirken. JTachdem die Stärke auf 3,4 DE teilhydroly- "". siert war, wurde ITatriumhydroxyd zugesetzt, um ein pH von 5,6 zu erreichen, wodurch die Säurehydrolyse beendet wurde ο Das erhaltene Stärkehydrolysat wurde anschließend filtriert, auf 30$ Trockensubstanz durch Eindampfen konzentriert und mit Cyclodextrin-Transglycosylase bei 55 und einem pH von 7',0 in Gegenwart von Toluol konvertiert·

Nachdem getrennte Anteile des Hydrolysats 4 und ? Tage konvertiert waren, wurde das gebildete Cyclodextrin durch Trichloräthylenfällung bestimmte Die Ergebnisse folgen in Tabelle VI«· Tabelle VI schlieft auch zwei Prüfungen ein, worin die Stärke durch Säurehydrolyse auf ein DE von 8,1 vor ihrer Verwendung als Substrat für Cyclodextrin-Konvertierung hydrolysiert wurde· Diese Konvertierungen sind ebenfalls gezeigt* =

Tabelle

DE der Trocken- Enzym- Oyclodextrinausbeute ^ · Teil— substanz— menge in ^c/o

W hydrolysate konzentration

(g/100 ml) _ 4 Tage V Tage

3,4 18,5 200 29 38

3,4 18,5 400 39 48

3,4 32,5 200 . 28 ." 35

3,4 32,5 400 37 47

8,1 34,5 200 15 19

8,1 ..." 34,5 400 19 23

Die Vorteile der Erfindung sind vielseitig» Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, daß daa Verfahren Gyolo« dextrin-Konvertierung in wirksamer T,7eise bei hohen ?öst«« stoffkonzentrationeri dürohsufUhren ermögliob.1Si» Ein anderer

Vorteil besteht darin, daß Gyolodextrin-Konvertierungen mit einer größeren Auswahl' an StärJcesubstraten, z.B. Maisstärke ι welche im wesentlichen bisher unbrauchbar warf ausgeführt werden können» Ein anderes wichtiges Merkmal . der Erfindung besteht darin, daß sie zu einer verbesserten V7irtschaftlichkeit führt, v;,eil niedrigere Kapital— kosten erforderlich sind, um eine gegebene Menge an Cyclodextrin zu erzeugen, weil die-Erfindung zu einem verbesserten Cyclodextrinprodukt führt und weil höhere Substratgehalte als 3 bis 5j£ Peststoff konzentrat ion benutzt werden können. Als Ergebnis der Erfindung ist es nicht nur möglich, die Konvertierung'bei Substratkonzentrationen von 20 bis 30$ auszuführen, sondern es ist auch erwünscht dies zu tun, weil die oben aufgezählten Torteile mit im wesentlichen keiner Verringerung der Konvertierungswirksamkeit verwirklicht werden« ■

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stärkehydrolysat mit· einem DB nicht über etwa 20 der Konvertierung mit Cyolodextrin-Iransglycosylase in einem wässrigen Medium unterworfen wird, um ein Konvertierungsprodukt mit einem Gehalt an Cyclodextrin zu erhalten»

   2o Verfahren nach Anspruch 1 ,da durch ge k e η η ν zeichnet, daß Stärke zu einem DE nicht über etwa 20 teilhydrolysiert und anschließend die teilhydrolysierte Stärke der Konvertierung mit Cyclodextrin-Transglycosylas.e unterworfen wird»

   3β Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d'a durch gekennzeichnet, daß das Stärkehydrolysat durch gelatinierter Stärke mit einer Säure, einem Enzym oder einer Kombination beider erzeugt _ wird.

   4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d a durch ge k e η η ζ e ic h η e t , daß die Konvertierung in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexbildners ausgeführt wird·

   5· Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d a — durch.-gek.-e η η ze iehnet , daß die Stärke mit Säure hydrolysiert wird©

   6a Verfahren nach Anspruch 1 -4, dadurch geke nnze ic hnet , daß die Stärke mit Enzym hydro-

   , · ₊ -, _Λ 209813/1272

   lysiert v^ird·

   7* Verfahren nach den- vorhergehenden Ansprüchen, - d a

   durch g e k e η η ζ e Ic h η e t > daß das Stärkehydrolysat ein DE nicht über etwa 6 besitzt*

   8· Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, da d u r c-h g" e k e η η ζ e ic h η e t , daß das Stärke* hydrolysat einen Peststoffgehalt von mindestens etwa K) G-ew.fo besitzt·

   9. Verfahren nach'den vorher gehend eh Ansprüchen, d a durch g e k e η η ζ e I e h η e t , daß das Stärkehydrolysat einen Feststoffgehalt zwischen etwa iO und etwa 40 Gew.$& besitzt· . ..-■■■

   10. Yerfaliren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d a durch, g e k e η η ζ e i c h η e t , daß die Eonvertierungstemperatur zwischen etwa 40 und etwa 60°Cliegt·

   11· -Verfahren nach Anspruch' 10> d a d u r c h gekennzeichnet, daß die Konvertierungstemperatur zwischen etwa 45 und etwa 55°C liegt· -

   12· Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, da- -

   durch -g e k e η η ζ e i c h η e t , daß das Eonvertierungs-pH etwa 5,5 bis etwa 7t5 ist·

   13. "Verfahren nach Anspruch 12 , da durch g e k θ η η-zeichnet, daß das !Convert ierungs-pH zwischen etwa 6,0 und etwa 7,5 ist·

   14· Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d a — " d u r c h g e k, θ a n.z e ic h η © t _t daß die Konvertier ungs ze It etwa 2 bia etwa 7 3!ag© beträgt® 20@©f 9/127.2 ■■■■-■■ .

   . - 26 - - .■'■■".

   18438t5

   15· Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, d a -d u r c hg. e k en η ze i c h η e t ₉ daß ein wtssriges Eonvertiörungaprodukt mit einem Gehalt von mindestens etwa 3 g Cyclodextrin pro 100 ml Eonvertierungsprodukt erhalten wird» ■ .

   16. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, da d u r ch gekennze ic h η e t , daß das erhaltene oyelodextrinhaltige Konvertierungsprpdukt konzen- ±txm triert Tiird, um einen· Sirup mit einem größeren ]?eststoffgehalt als 50$ zu ergeben·

   17· Verfahren nach Anspruch 16 , d a d u r c h g e -kennzeichn et , daß das erhaltene cyclodextrinhaltige Eonvertierungsprodukt ausreichend konzentriert wird, um ein im wesentliches festes oyclodextrinhaltiges Produkt zu ergeben.

   18. Cyclodextrin, wenn hergestellt nach den Verfahren eines der vorhergehenden Ansprüche.

   19· Cyclodextrinkomplexe erhalten nach den Verfahren eines der Ansprüche 1 - 14·