DE69521450T2

DE69521450T2 - Glukane mit cyclischer Struktur und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69521450T2
Application number: DE69521450T
Authority: DE
Inventors: Kazutoshi Fujii; Hiroyasu Nakamura; Shigetaka Okada; Takeshi Takaha; Hiroki Takata; Michiyo Yanase
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-04-03
Publication date: 2002-05-16
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: DE69521450D1; US5686132A; EP0675137A3; DK0675137T3; EP0675137A2; EP0675137B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft Glucane und deren Derivate, die als Rohstoffe für die Stärke-verarbeitende Industrie, für Nahrungsmittel- und Getränk-Zusammensetzungen, als Zusatz für Nahrungsmittel-Zusammensetzungen, Infusionslösungen, Haftmittel- Zusammensetzungen, Einschlussmaterialien und Adsorptionsmaterialien verwendet werden können. Die Glucane und deren Derivate können ferner als Anti-Retrogradationsmittel für Stärke und als Stärkesubstitute für biologisch abbaubare Kunststoffe verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich insbesondere mit Glucanen, die eine cyclische Struktur umfassen, welche mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, deren Derivate und Verfahren zu deren Herstellung.

2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik.

Stärken sind polymere Materialien, welche zuvor als Rohstoffe für die Herstellung von Maltose, Stärkesirup, Cyclodextrinen und ähnlichen, Nahrungsmittel- und Getränke-Zusammensetzungen, Zusatzstoffen für Nahrungsmittel-Zusammensetzungen und als Rohstoffe für biologisch abbaubare Kunststoffe verwendet wurden.
Übliche Stärken weisen jedoch Probleme, wie geringere Löslichkeit in Wasser, Instabilität in Wasser und hohe Viskosität in Lösung auf, wenn sie für die oben genannten Verwendungen eingesetzt werden. Grundsätzlich weisen Stärken eine geringe Löslichkeit in Wasser auf. Es ist daher notwendig, eine Hitzebehandlung oder eine chemische Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, Säuren, alkalischen Verbindungen, etc. vorzunehmen, welche die Stärke auflösen und ihre Löslichkeit in Wasser dadurch verbessern.
Gelöste oder gelatinierte Stärke wird schnell retrogradiert, wobei sich ein unlösliches Präzipitat bildet. Die Retrogradation der Stärke verändert deren Eigenschaften, wie die Viskoelastizität der Stärke-Lösung, die adhäsiven Eigenschaften der Stärke und ähnliche. Nahrungsmittel, die Stärke enthalten, können ferner Probleme, wie Reduktion der Wasser-Halte-Eigenschaften, Formerhaltungseigenschaften, Resistenz gegen gefrieren, Verdau- Eigenschaften und ähnliche erhalten.
Gelatinierte Stärke weist ferner eine hohe Viskosität auf, welche in der Tatsache begründet ist, dass das Amylopektin in Stärke ein extrem langes Molekül ist, indem eine Anzahl an Cluster- Strukturen angeordnet ist. Da gelatinierte Stärke eine hohe Viskosität hat, besteht das Problem darin, dass die Stärke schwierig in der Handhabung ist, für den Fall, dass die Stärke als Rohstoff für die Herstellung von Maltose, Cyclodextrin, etc. verwendet wird. Sofern gelatinierte Stärke einer bestimmten, hohen Konzentration durch eine Röhre transportiert wird, kann die Röhre beispielsweise verstopfen.
Aufgrund der oben genannten Eigenschaften üblicher Stärken (geringe Löslichkeit, Lösungsinstabilität und hohe Viskosität in Lösung) ist der Nutzen der Stärken für Nahrungsmittel und andere Applikationen beschränkt gewesen.
Kürzlich wurde Forschung durchgeführt, um die Löslichkeit und die retrogradierenden Eigenschaften der Stärken durch Reduktion des Molekulargewichts mittels enzymatischer Behandlung, chemischer Behandlung oder physikalischer Behandlung zu verbessern. Diese Behandlungen konnten die oben genannten Probleme teilweise erfolgreich lösen. Es ist jedoch schwierig, eine übermäßige Reduktion des Molekulargewichts der Stärken zu verhindern, und die Stärken verlieren ihre inhärenten Eigenschaften. Als Ergebnis dieser Behandlungen wurden ferner Stärken mit gesteigerter Reduktionskapazität erhalten. Wenn Stärken daher mit einem Protein, einer Aminosäure, etc. erhitzt werden, sind sie Gegenstand einer Färbung aufgrund der Reaktion mit diesen Verbindungen. Dies reduziert ebenfalls deren nützliche Verwendung.
Eine enzymatische Behandlung umfasst beispielsweise ein Verfahren, bei dem ein sogenanntes D-Enzym (disproportionierendes Enzym (EC 2.4 1.25)) oder Amylomaltase (EC 2.4 1.25) verwendet wurde. Das D-Enzym wurde ursprünglich in der Kartoffel entdeckt und ist dafür bekannt, dass es in verschiedenen Pflanzen und Mikroorganismen, wie beispielsweise E. coli, vorliegt. Das Enzym wird als D-Enzym bezeichnet, wenn es aus Pflanzen abstammt und als Amylomaltase, wenn es von Bakterien abstammt.
Man ging davon aus, dass D-Enzym die Transglykosilierungsreaktion (Disproportionierungsreaktion) der Maltooligosaccharide katalysiert. Es katalysiert den Transfer einer Glucosyl- oder Maltooligosyl-Einheit vom nicht-reduzierenden Ende eines Donormoleküls auf das nicht-reduzierende Ende eines Akzeptormoleküls (Palmer et al., Eur. J. Biochem., Vol. 69, 105-115 (1976)). Die enzymatische Reaktion resultiert daher in einer Disproportionierung der ursprünglich bestehenden Maltooligosaccharide. Es wurde berichtet, dass diese Disproportionierungsreaktion auftritt, wenn Stärke mit hohem Molekulargewicht, wie feste Stärke oder Amylopektin als Donor und Glucose oder Maltooligosaccharide als Akzeptoren verwendet werden. D-Enzym wurde jedoch nicht zur Lösung der oben genannten Probleme verwendet.
Auf der anderen Seite wurde jedoch die Verwendung eines cyclischen Polysaccharids, bestehend aus D-Glucose, z.B. eines cyclischen Glucans, als Substitut für die oben genannten Stärken in Erwägung gezogen.
Cyclodextrine, die Glucane mit nur einer cyclischen Struktur darstellen, welche eine alpha-1,4-glykosidische Bindung umfasst, sind als übliche cyclische Glucane bekannt. Diese Cyclodextrine, welche durch Cyclodextringlucantransferase (CGTase) aus Stärke synthetisiert werden, weisen typischerweise einen Polymerisationsgrad (DP) von 6 bis 8 auf. Obwohl Kobayashi (Denpun Kagaku, Vol. 40, 103-116 (1993)) berichtet, dass Glucane welche nur eine cyclische Struktur aufweisen, nur eine alpha-1,4-glykosidische Bindung mit einem DP von mehr als 9 umfassen, von CGTase synthetisiert werden, beträgt der DP des größten bekannten Glucans 13.
Glucane, die nur eine cyclische Struktur aufweisen, welche eine alpha-1,4-glykosidische Bindung mit einem DP bon 9 bis 13 umfasst, werden ferner in extrem geringer Ausbeute erhalten und sind nicht sehr praktisch nutzbar. Es wird ferner davon ausgegangen, dass ein Glucan mit einem DP von mehreren zehn oder mehreren hundert und lediglich einer cyclischen Struktur, die alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, durch die Reaktion von CGTase und Stärke nicht synthetisiert werden kann.
Obwohl ein Saccharid an die 6-Position eines oder mehrerer der Glucosereste in Cyclodextrin gebunden werden kann, beträgt die maximale Größe der gebundenen Saccharide üblicherweise bis zu der Größe einer Maltotetraose unter dem Aspekt der Ausbeute. Diese Glucane weisen ein Problem auf, da sie aufgrund ihrer besonderen Strukturen nicht unmittelbar durch Amylasen, welche in den Verdauungssekreten, wie beispielsweise Speichel, Pankreassaft, und ähnlichen vorliegen, verdaut werden können.
Andere Enzyme, wie beispielsweise D-Enzym werden nicht für die Synthese von Glucanen mit einer cyclischen Struktur verwendet, welche alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
In anderen Verfahren, als solchen die Enzyme verwenden, wurde die Herstellung von Glucanen, welche eine cyclische Struktur aufweisen, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, nicht berichtet. Das heißt, Glucane mit einem DP von 17 oder mehr oder sogar mehreren zehn oder mehreren hunderten und einer cyclischen Struktur, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, sind im Stand der Technik nicht bekannt.
Daher sind auch die Eigenschaften der Glucane, die einen DP von 17 oder mehr oder sogar mehreren zehn oder mehreren hundert und eine cyclische Struktur aufweisen, welche mindestens 17 alpha- 1,4-glykosidische Bindungen umfasst, nicht bekannt und konnten nicht als mögliche Substitute für Stärken in Erwägung gezogen werden.
Stärkesubstitute, welche solche exzellenten Eigenschaften aufweisen, wie eine höhere Löslichkeit in Wasser als übliche Stärken, deren gelatinierte Lösungen eine geringere Viskosität aufweisen und die nicht einer Retrogradation unterworfen werden, welche bei üblichen Stärken beobachtet wird, sind demgemäß Gegenstand eines lange bestehenden Bedarfs.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung räumt die oben genannten Probleme aus und stellt neue Verbindungen mit ausgezeichneten Eigenschaften zur Verfügung, wie einer höheren Löslichkeit in Wasser als übliche Stärken, Lösungen mit einer geringeren Viskosität, die nicht einer Retrogradation unterliegen, welche bei üblichen Stärken beobachtet wird, und die in der Lage sind, die Retrogradation der Stärken zu verhindern, und schließlich als Stärkesubstitute nützlich sind.
Die gegenwärtigen Erfinder haben festgestellt, dass die Enzyme, die zur Katalyse der Transglykosilierungsreaktion geeignet sind, insbesondere D-Enzym, eine neue Reaktion katalysieren können, d.h. die Ringschlussreaktion eines alpha-1,4-Glucans zusätzlich zu der bekannten Disproportionierungsreaktion. Die vorliegenden Erfinder haben ferner festgestellt, dass das vorgenannte D-Enzym die Ringschlussreaktion eines alpha-1,4-Glucans katalysieren kann, welches mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung aufweist. Es ist ein unbekannter, unerwarteter und überraschender Effekt, dass das D-Enzym eine synthetische Reaktion eines Glucans katalysieren kann, der einen DP von mindestens 14 und sogar mehrere zehn oder mehrere hundert aufweist und in dessen Molekül eine cyclische Struktur, alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfassend, (d.h. ein Glucan, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst). Die vorliegenden Erfinder haben bestätigt, dass die Glucane dieser Erfindung, welche neue Verbindungen sind, eine extrem hohe Löslichkeit in Wasser aufweisen, dass deren Lösungen eine geringe Viskosität aufweisen und dass diese nicht Gegenstand einer Retrogradation sind. Die Erfinder haben ferner festgestellt, dass sie als Nahrungsmittel- oder Getränk-Zusammensetzungen, Zusatzstoff für Nahrungsmittel-Zusammensetzungen oder Stärkesubstitute für biologisch abbaubare Kunststoffe sind.
In dem Molekül des erfindungsgemäßen Glucans liegt eine cyclische Struktur vor, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Glucan nur eine cyclische Struktur auf, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt im Molekül des erfindungsgemäßen Glucans eine cyclische Struktur vor, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Glucan lediglich eine cyclische Struktur auf, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Derivate dieser Glucane zur Verfügung, in denen mindestens eine der alkoholischen Hydroxylgruppen der Glucane derivatisiert wurde.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Derivatisierung aus der Gruppe bestehend aus Veretherung, Veresterung, Vernetzung und Anpolymerisierung ausgewählt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung eines Glucans oder dessen Derivate zur Verfügung, in deren Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, die einen Schritt aufweisen, indem ein lineares alpha-1,4-Glucan oder ein dies enthaltendes Saccharid mit einem Enzym umgesetzt wird, das in der Lage ist, ein Glucan zu erzeugen, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart einer Phosphorylase und Glukose-1- phosphat durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße in Gegenwart eines Enzyms durchgeführt, das in der Lage ist, eine alpha-1,4-glykosidische Bindung zu spalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das lineare alpha- 1,4-Glucan oder das dies enthaltende Saccharid, welches für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird aus der Gruppe bestehend aus Maltooligosaccharide, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Stärken, wachsartige Stärken, Stärke mit hohem Amylosegehalt, löslichen Stärken, Dextrine, verzweigte Stärken, teilweise hydrolysierte Stärken, enzymatisch mit Phosphorylase synthetisierte Stärken und deren Derivate ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das für die Herstellung des Glucans geeignete und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym D-Enzym.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das für die Erzeugung des Glucans geeignete und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym ein immobilisiertes Enzym.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Nahrungsmittel- und Getränk-Zusammensetzung oder einen Nahrungsmittelzusatzstoff zur Verfügung, der mindestens ein Glucan oder dessen Derivat umfasst, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Infusionslösung zur Verfügung, die mindestens ein Glucan oder dessen Derivat aufweist, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, welche mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Adhäsionsmittel zur Verfügung, das mindestens ein Glucan oder dessen Derivat aufweist, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Einschlussmaterial oder ein Adsorptionsmaterial zur Verfügung, das (a) mindestens ein Glucan oder dessen Derivat aufweist, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, und (b) eine Verbindung, die darin eingeschlossen oder adsorbiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Stärke zur Verfügung, die mindestens ein Glucan oder dessen Derivat aufweist, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Anti-Retrogradationsmittel für Stärke zur Verfügung, das mindestens ein Glucan oder dessen Derivat aufweist, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.
Die erfindungsgemäßen Glucane und deren Derivate, welche neue Verbindungen sind, weisen ausgezeichnete Eigenschaften auf, weil sie im Vergleich zu üblichen Stärken, wie Amylose und Amylopektin, eine deutlich verbesserte Löslichkeit in Wasser haben und Lösungen derselben nicht Gegenstand einer Retrogradation sind, welche in üblichen Stärken, wie Amylose und Amylopektin, beobachtet wurde. Die erfindungsgemäßen Glucane können ferner als Anti-Retrogradationsmittel für Stärke wirken. Wässrige Lösungen derselben weisen zudem ausgezeichnete Eigenschaften, wie eine geringere Viskosität als wässrige Lösungen üblicher Stärken auf. Sie weisen ferner ausgezeichnete Eigenschaften auf, da sie bei Erhitzen in Gegenwart von Proteinen oder Aminosäuren nicht unmittelbar gefärbt werden, was durch ihre geringeren Reaktivität im Vergleich zu üblichen Stärkesirupen und Dextrinen begründet ist. Die erfindungsgemäßen Glucane und deren Derivate haben ferner ausgezeichnete Eigenschaften, wie verschiedene Materialien einschließende oder adsorbierende Eigenschaften. Da die erfindungsgemäßen Glucane und deren Derivate dieselbe Grundstruktur wie übliche Stärken aufweisen, in denen die Glucose nur über eine alpha-1,4-glykosidische Bindung und eine alpha- 1,6-glykosidische Bindung verknüpft ist, werden sie unmittelbar durch die Enzyme für Glucose abgebaut, die in Organismen vorliegen, wodurch ausgezeichnete Verdauungseigenschaften und eine höhere Effizienz des Energieaustauschs ermöglicht wird.
Da das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Glucane und deren Derivate Schritte umfasst, bei denen eine Stärke, eine teilweise verdaute Stärke, ein Derivat derselben oder eine Mischung davon als Ausgangsstoff mit einem Enzym umgesetzt wird, das in der Lage ist einen Glucan zu erzeugen, der eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, können die erfindungsgemäßen Glucane und deren Derivate ohne weiteres hergestellt werden.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann durch Lesen und Verständnis der nachfolgenden detaillierten Beschreibung mit Bezugnahmen auf die beigefügten Figuren deutlich.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist ein Schema, das die erfindungsgemäßen Glucane zeigt.
Fig. 2 ist ein Schema, das eine Serie von Schritten zur Herstellung eines cyclischen Glucans aus Amylose oder Amylopektin darstellt, der nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.
Fig. 3 ist ein Schema, das eine Serie von Schritten zur Herstellung eines Glucans aus Amylopektin zeigt, das nur eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfasst.
Fig. 4 zeigt das Elutionsmuster des erfindungsgemäßen, cyclischen Glucans, der nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen nach Behandlung mit oder ohne Stärke Hydrolasen aufweist.
Fig. 5 zeigt das Elutionsmuster der Glucane, wobei 5-1 das Elutionsmuster des in Beispiel 2 erhaltenen cyclischen Glucans darstellt, welcher nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, und 5-2 ein Elutionsmuster des linearen alpha-1,4-Glucans darstellt. Die Zahlen an jedem Peak zeigen den DP an.
Fig. 6 zeigt das Elutionsmuster des intakten und von teilweise hydrolysierten, cyclischen Glucan-Molekülen, welches dem Peak G-L in Fig. 5 entspricht. Die Zahlen an jedem Peak verweisen auf den DP.
Fig. 7 zeigt das Elutionsmuster des in Beispiel 4 erhaltenen cyclischen Glucans nach Gelfiltrationschromatographie, welcher nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.
Fig. 8 zeigt das Elutionsmuster nach Gelfiltrationschromatographie von wachsartigen Mais-Stärken vor und nach Behandlung mit D-Enzym.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung, welche die Schritte zur Bestimmung der acyclischen Struktur, der cyclischen Struktur mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidische Bindung und der cyclischen Struktur mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen des in Beispiel 8 erhaltenen Glucans darstellt.
Fig. 10 zeigt das Elutionsmuster der cyclischen Struktur des Glucans mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung, welcher in Beispiel 8 erhalten wurde, des linearen alpha1,4-Glucans und des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, welcher in Beispiel 2 erhalten wurde. Die Nummern an jedem Peak verweisen auf den DP.
Fig. 11 zeigt die anti-retrogradierenden Wirkungen des in Beispiel 8 erhaltenen Glucans auf Stärke.
Fig. 12 zeigt das Fluoreszenzspektrum der ANS in Gegenwart des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, welcher in Beispiel 2 erhalten wurde (durchgezogene Linie), alpha-Cyclodextrin (unterbrochene Linie), Pullulan (Linie aus alternierenden, langen und kurzen Punkten), Dextran (Linie aus alternierenden langen und zwei kurzen Punkten) oder einer Kontrolle (gepunktete Linie). Die horizontalen und vertikalen Achsen stellen Wellenlänge (nm) und Spektrumstärke, respektive, dar.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die erfindungsgemäßen Glucane sind solche, in deren Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfaßt, und umfassen insbesondere verschiedene Glucane, die schematisch in Fig. 1 dargestellt sind. Die horizontalen geraden und gebogenen Linien in Fig. 1 zeigen die mittels alpha-1,4-glykosidische Bindungen verbundenen Glucan-Ketten und die vertikalen Pfeile zeigen eine alpha-1,6-glykosidische Bindung (die horizontalen und geraden Linien und die vertikalen Pfeile der folgenden Schemata haben dieselbe Bedeutung).
Wie oben dargestellt, umfassen die erfindungsgemäßen Glucane, ein Glucan mit nur einer cyclischen Struktur (nachfolgend das das cyclische Glucan der vorliegenden Erfindung bezeichnet), und Glucane mit einer acyclischen Struktur zusätzlich zu einer cyclischen Struktur. Die cyclischen Strukturen umfassen solche, die nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfassen, und solche, die alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha- 1,6-glykosidische Bindung umfassen. Das Glucan, welches mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung in der cyclischen oder acyclischen Struktur aufweist, wird erhalten, wenn ein Glucan mit Verzweigungspunkten, wie Amylopektin, als Substrat verwendet wird.
Das Glucan, das nur eine cyclische Struktur aufweist, kann durch Behandlung eines Glucans mit einer acyclischen Struktur zusätzlich zu einer cyclischen Struktur mit Glucoamylase, welche in der Lage ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung und der alpha- 1,6-glykosidischen Bindung des nicht-reduzierenden Endes zu spalten, erhalten werden. Es kann ferner unmittelbar durch Verwendung eines linearen alpha-1,4-Glucans oder eines Glucans mit Verzweigungspunkten als Substrat erhalten werden.
Die Glucane der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Eigenschaften.
(1) Wenn eine Glucoamylase (Toyobo, Inc.), die als Exo-Typ- Amylase in der Lage ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung und die alpha-1,6-glykosidische Bindung am nichtreduzierenden Ende zu hydrolysieren, mit dem Glucan umgesetzt wird, bleibt ein Glucoamylase-resistenter Bestandteil, welcher als Bestandteil nicht weiter abgebaut wird. Dieser Bestandteil wird selbst dann nicht abgebaut, wenn eine Phosphatase (Sigma, Inc.) zugegeben wird und die Glucoamylase anschließend darauf einwirken kann.
(2) Der oben beschriebene Glucoamylase-resistente Bestandteil kann durch eine Isoamylase (Hayashibara Biochemical Research, Inc.), welche in der Lage ist, die alpha-1,6- glykosidische Bindung der Stärke zu hydrolysieren, abgebaut werden und gegenüber der Wirkung der Glucoamylase sensitiv werden.
(3) Der oben beschriebene Glucoamylase-resistente Bestandteil kann durch eine alpha-Amylase abgebaut werden, welche eine Endo-Typ-Amylase ist.
Unter den erfindungsgemäßen cyclischen Glucanen weist ein Glucan mit nur einer cyclischen Struktur, welche mindestens 17 alpha- 1,4-glykosidische Bindungen und keine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfaßt (nachfolgend als das erfindungsgemäße cyclische Glucan mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen bezeichnet), die folgenden Eigenschaften auf.
(1) Weder ein reduzierendes Ende noch ein nicht-reduzierendes Ende sind in dem Glucan nachweisbar.
(2) Das Glucan wird nicht durch eine beta-Amylase verdaut (Nagase Biochemical Industries, Inc.), die ein Exo-Typ- Amylase ist, welche in der Läge ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung eines nicht-reduzierenden Endes zu hydrolysieren, noch durch eine Glucoamylase (Toyobo, Inc.).
(3) Das Glucan wird nicht durch die kombinierte Verwendung einer Isoamylase (Hayashibara Biochemical Research, Inc.), welche in der Lage ist, die alpha-1,6-glykosidische Bindung in Stärke zu hydrolysieren und einer Pullulanase (Hayashibara Biochemical Research, Inc.), noch durch kombinierte Verwendung der Isoamylase, Pullulanase und einer beta-Amylase abgebaut.
(4) Das Glucan wird vollständig durch eine alpha-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) abgebaut, welches ein Endo-Typ-Amylase ist, die in der Lage ist, die alpha-1,4- glykosidische Bindung innerhalb eines Stärkemoleküls zu hydrolysieren.
(5) Wenn das Glucan durch eine bakterielle Saccharifikations- Typ-alpha-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) hydrolysiert und anschließend mittels HPLC analysiert wird, werden ausschließlich Glucose, Maltose und eine geringe Menge an Maltotriose erhalten. D.h., keine anderen als alpha-1,4-glykosidische Bindungen liegen in dem Glucan vor.
Unter den erfindungsgemäßen cyclischen Glucanen weist ein Glucan, das aus nur einer cyclischen Struktur besteht, welche mindestens 17 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung (nachfolgend als das erfindungsgemäße cyclische Glucan mit einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung bezeichnet) umfaßt, die folgenden Eigenschaften auf.
(1) Weder ein reduzierendes noch ein nicht-reduzierendes Ende kann in dem Glucan nachgewiesen werden.
(2) Das Glucan wird nicht durch beta-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) abgebaut, wobei es sich um eine Exo- Typ-Amylase handelt, die in der Lage ist, die alpha-1,4- glykosidische Bindung vom nicht-reduzierenden Ende zu hydrolysieren, noch durch eine Glucoamylase (Toyobo, Inc.).
(3) Das Glucan wird durch Isoamylase abgebaut (Hayashibara Biochemical Research, Inc.), welche in der Lage ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung der Stärke zu hydrolysieren und wird anschließend gegenüber der Wirkung einer Glucoamylase sensitiv.
(4) Das Glucan wird durch einen Endo-Typ-alpha-Amylase abgebaut (Nagase Biochemical Industries, Inc.), welche in der Lage ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung in Stärke zu hydrolyiseren, und wird anschließend gegenüber der Glucoamylase sensitiv. Ferner ist bekannt, dass das Dextrin mit dem kleinsten Größe Isomaltosyl-Maltose (IMM) ist, wobei der Endo-Typ-alpha-Amylase auf das Glucan mit alpha-1,6- glykosidischer Bindung wirkt (Yamamoto T., Handbook of Amylase and Related Enzymes, Pergamon Press, 5.40-45 (1988)). Das IMM wird nachgewiesen, wenn das oben beschriebene Dextran mit einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung mit einer Endo-Typ alpha-Amylase umgesetzt wird.
Die Anzahl der Glykosyl-Reste, welche die cyclische Struktur des erfindungsgemäßen Glucans bilden, beträgt mindestens 17, vorzugsweise 17 bis etwa 5000, und besonders bevorzugt etwa 17 bis 1000. Soweit das Glucan alpha-1,6-glykosidische Bindungen aufweist, beträgt die Anzahl der alpha-1,6-glykosidischen Bindungen mindestens 1, üblicherweise 1-500 und vorzugsweise 1-100.
Die Bestimmung der oben genannten reduzierenden Enden kann mittels des modifizierten Park-Johnson-Verfahrens (Hizukuri et al., 1981) Carbohydr. Res.: 94; 205-213), und die Bestimmung der nicht reduzierenden Enden kann mittels des schnellen Smith-Abbau-Verfahrens durchgeführt werden (Hizukuri und Osaki (1978) Carbohydr. Res.: 63; 261-264).
Der Abbau des Glucans mit den oben genannten beta-Amylasen und Glucoamylasen, welches Exo-Typ-Amylasen sind, oder Isoamylasen, Pullulanasen oder alpha-Amylasen, welches Endo-Typ-Amylasen sind, kann analysiert werden, indem beispielsweise das Glucan der Erfindung mit nur einer cyclischen Struktur und mindetens 14 alpha-1,4-glykosidischen Bindungen in destilliertem Wasser gelöst wird, so dass die Konzentration 0,1% (w/v) beträgt, 100 ul der Lösung mit einer geeigneten Menge des oben genannten Enzyms bei 30-45ºC mehrere Stunden umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt dem Kohlenhydratanalysesystem der DIONEX, Inc. (Pumpensystem: DX300, Detektor: PAD-2, Säule: CarboPacPA100) unterworfen wird. Das Elutionsverfahren kann beispielsweise unter den Bedingungen Flußrate: 1 ml/min., NaOH Konzentration: 150 mM, Natriumacetatkonzentration: 50 mM bei 0 Min., 50 mM bei 2 Min., 350 mM bei 37 Minuten, 850 mM bei 45 Min. und 850 mM bei 47 Minuten zur Analyse des DP und des erzeugten Saccharides durchgeführt werden.
Der Nachweis des oben genannten Glucoamylase-resistenten Bestandteils des erfindungsgemäßen Glucans oder dessen Derivate kann wie nachfolgend beschrieben durchgeführt werden. Beispielsweise werden 100 mg des erfindungsgemäßen Glucans in 5 ml destilliertem Wasser gelöst, wozu Glucoamylase in einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml gegeben wird und die Reaktion wird über Nacht bei 40ºC stehengelassen. Nachdem das Reaktionsprodkt für 10 Min auf 100ºC erhitzt wurde und unlösliche Stoffe mittels Zentrifugation entfernt wurden, wird ein 10faches Volumen an Ethanol zu dem Reaktionsprodukt gegeben und zentrifugiert, um die verbleibenden Polysaccharide als Präzipitat zu gewinnen. Das Präzipitat wird in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst, eine Glucoamylase wird zugesetzt, so dass die Endkonzentration 50 Einheiten/ml beträgt, 1 Stunde bei 40ºC umgesetzt, für 10 Min. bei 100ºC erhitzt und zentrifugiert, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Zu dem Reaktionsprodukt wird ein 10faches Volumen an Ethanol gegeben, um ein Präzipitat zu erhalten. Soweit eine Stärke als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Glucan verwendet wird, welche teilweise durch eine Phosphat-Gruppe modifiziert wurde, wird das erhaltene Präzipitat in einem 10 mM Carbonat-Puffer auf gelöst (pH 9,4, enthaltend 10 mM MgCl&sub2; und 0,3 mM ZnCl&sub2;), 20 Einheiten einer Phosphatase (vom Rind abstammend, Sigma, Inc.) werden zugesetzt und 24 Stunden bei 40ºC umgesetzt. Anschließend wird ein 10faches Volumen an Ethanol zugegeben, um das Reaktionsprodukt als Präzipitat wiederzugewinnen. Das Präzipitat wird wieder in destilliertem Wasser aufgelöst, eine Glucoamylase wird zugestzt, so dass die Endkonzentration 50 Einheiten/ml beträgt, und eine Stunde bei 40ºC umgesetzt. Anschließend wird ein 10faches Volumen an Ethanol zu dem Reaktionsprodukt gegeben, um den Glucoamylase-resistenten Bestandteil als Präzipitat zu erhalten.
Die Bestimmung der acyclischen Struktur, der cyclischen Struktur mit alpha-1,6-glykosidischen Bindungen, und der cyclischen Struktur, welche nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, kann wie folgt durchgeführt werden. Nach Auflösen von 10 mg der Glucan-Proben in 1 ml DMSO, wird die Lösung unmittelbar unter Verwendung von 8 ml eines 100 mM Natriumacetatpuffers verdünnt. Vier 900 M1 Proben werden aus der verdünnten Lösung ausgewählt und zu jeder Probe werden je 100 ml destilliertes Wassser, einer Glycoamylaselösung, einer Lösung, welche Debranching-Enzym und Glucoamylase enthält, und einer Lösung, welche einen Endo-Typ alpha-Amylase und eine Glucoamylase enthält, zugesetzt und 4 Stunden bei 40ºC umgesetzt. Die Reaktion wird durch Kochen beendet, die resultierende Glucose wird unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Glucosebestimmungs-Kits gemessen, um die Anzahl der acyclischen Strukturen, der cyclischen Strukturen mit alphal-1,6-glykosidischen Bindungen und der cyclischen Strukturen mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen in der Glucan-Probe zu bestimmen. Weitere Details der Bestimmung werden in den Beispielen dargestellt.
Der DP der cyclischen Struktur der erfindungsgemäßen Glucane kann mittels Chromatographie bestimmt werden. Es ist allgemein bekannt, dass ein cyclisches Polysaccharid sich im Vergleich zu einem linearen Polysaccharid mit demselben DP unterschiedlich in der Chromatographie verhält. Die Identifizierung der cyclischen Struktur und die Bestimmung des DP des cyclischen Polysaccharides kann unter Ausnutzung dieser Eigenschaft durchgeführt werden. Beispielsweise wird das cyclische Glucan mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen der vorliegenden Erfindung, welches durch Umsetzung mit einem D-Enzym erhalten wurde, durch das oben beschriebene Kohlenhydratanalysesystem der DIONEX, Inc. aufgetrennt, wobei nur eine einzige Peak-Fraktion erhalten wird. Nach Behandlung der resultierenden Fraktion mit beispielsweise, einer 0,1 N HCl für 30 Min. bei 100ºC, um die cyclische Struktur teilweise zu hydrolysieren, werden die resultierenden linearen Glucane mit verschiedenen DPs durch das Kohlenhydratanalysesystem der DIONEX, Inc. analysiert, um deren DPs zu bestimmen. Die detaillierte Analyse mittels dieses Verfahrens ist in den Beispielen beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Glucane werden erhalten, indem ein lineares alpha-1,4-Glucan oder ein Saccharid, welches dieses enthält, mit einem Enzym umgesetzt wird, das in der Lage ist, ein Glucan zu erzeugen, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfaßt. Irgendein Enzym kann verwendet werden, solange es diese Aktivität aufweist. Es ist jedoch bevorzugt, im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein D-Enzym zu verwenden.
Das D-Enzym, welches ursprünglich in der Kartoffel entdeckt wurde, liegt in verschiedenen Pflanzen und Mikroorganismen, wie beispielsweise E.coli vor. Ein D-Enzym, wie solche, die durch Expression eines Gens, das für das Enzym aus einer Pflanze kodiert, in einem Wirt, wie beispielsweise E.coli, kann somit verwendet werden, unabhängig von dessen Ursprung. Die nachfolgenden Beispiele beschreiben ein Verfahren zur Reinigung von D- Enzymen aus Kartoffel und E.coli, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Ein Verfahren zur Reinigung des D-Enzyms aus Kartoffel wird in Takaha et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, 1391-1396 (1993) beschrieben. Zuerst wird eine Kartoffelknolle in geeignetem Puffer, welcher 5 mM Meraptoethanol enthält, homogenisiert, zentrifugiert, durch eine 0,45 um Membran passiert und anschließend auf eine Q-Sepharose-Säule geladen, und mit, beispielsweise einem Puffer aus (1) 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 5 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer A) und (2) 150 mM NaCl, gewaschen. Das D- Enzym wird in Puffer A eluiert, welcher 450 mM NaCl enthält. Das Eluat wird dialysiert, Ammoniumsulfat wird zugesetzt, so dass dessen Endkonzentration 500 mM beträgt, auf eine Phenyl Toyopearl 650 M Säule (Toso, Inc.) geladen und durch Veränderung der Konzentration des Ammoniumsulfats in Puffer A von 500 mM auf 0 mM eluiert. Die Fraktionen mit aktivem D-Enzym werden gesammelt und gegen Puffer A dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine PL-SAX Säule (Polymer Laboratory, U.K.) geladen, welche mit Puffer A equilibriert wurde, und durch Variieren der zu Puffer A gegebenen NaCl Konzentration zwischen 150 mM und 400 mM eluiert, um die Fraktionen mit aktivem D-Enzym zu sammeln. Das D- Enzym kann ferner nach dem oben beschriebenen Verfahren aus Kartoffeln isoliert werden. Die Bestimmung der Enzym-Aktivität wird in den Beispielen im Detail dargestellt.
Die bereits genannte Veröffentlichung Takaha et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, 1391-1396 (1993) offenbart die cDNS-Sequenz des D-Enzyms der Kartoffel (Seite 1394, Fig. 3), die Herstellung eines rekombinanten Plasmids für das D-Enzym (Seite 1392), die Expression des rekombinanten Plasmids in E.coli und die Reinigung des D-Enzyms aus rekombinantem E.coli. Die mittels rekombinanter Verfahren erzeugten D-Enzyme können auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Gemäß des Verfahrens zur Reinigung des D-Enzyms aus E.coli wird beispielsweise Maltose zu dem Medium gegeben, nachdem E.coli TG-1 Stamm bei 37ºC bis zur logarithmischen Wachstumsphase unter Verwendung von LB Flüssigmedium in Kultur gezogen wurde, so dass die Endkonzentration 1% (w/v) beträgt, und weiter bei 37ºC 2 Stunden in Kultur gezogen. Das Medium wird zentrifugiert, um die Bakterien zu sammeln. Die Bakterien werden in dem oben beschriebenen Puffer A suspendiert, einer Ultraschall-Behandlung unterworfen und zentrifugiert, um einen bakteriellen Extrakt zu erhalten. Der bakterielle Extrakt wird anschließend beispielsweise auf eine Q- Sepharose Fast Flow Säule (Pharmacia, Inc.) geladen, welche mit Puffer A equilibriert wurde, und durch Variation der NaCl Konzentration, die zu Puffer A in einer Menge von 0 mM bis 500 mM gegeben wird, elutiert, um die Fraktionen mit aktivem D-Enzym zu sammeln. Zu den gesammelten aktiven Fraktionen wird Ammoniumsulfat gegeben, so dass die Endkonzentration 1 M beträgt, der Ansatz wird stehengelassen und zentrifugiert, um unlösliche Präzipitate zu entfernen. Der überstand wird auf eine Phenyl Toyopearl 650 M Säule (Toso, Inc.) geladen, welche mit Puffer A, der 1 M Ammoniumsulfat enthielt, equilibriert wurde. Das D-Enzym wird durch Variation der Ammoniumsulfatkonzentration eluiert, welcher Puffer A in einer Menge von 1 M bis 0 mM zugesetzt wurde, anschließend wird die Fraktion mit aktivem D-Enzym gesammelt. Nach Dialyse der Fraktion gegen Puffer A wird die dialysierte Fraktion auf eine Resource Q Säule (Pharmacia, Inc.) geladen, welche mit Puffer A eguilibriert wurde, und das D-Enzym wird durch Variation der NaCl Konzentration eluiert, welches zu Puffer A in einer Menge von 0 mM bis 500 mM gegeben wurde, um das D-Enzym zu reinigen.
Das D-Enzym kann wie oben beschrieben gereinigt werden. Sofern ein Endo-Typ-Amylase, welcher auf die alpha-1,4-glykosidische Bindung in einem Stärkemolekül wirkt, in dem D-Enzym-Ansatz nachgewiesen wird, kann jede rohe D-Enzym-Zusammensetzung jeder Reinigungsstufe für die Synthese der erfindungsgemäßen Glucane verwendet werden.
Das für die Synthesereaktion der erfindungsgemäßen Glucane genutzte Enzym kann ferner ein immobilisiertes Enzym sein, unabhängig davon, ob es ein gereinigtes oder rohes Enzym ist, und die Reaktionsverfahren können von einem Batch-Typ oder einem kontinuierlichen System sein. Verfahren zur Immobilisierung der Enzyme, die dafür verwendet werden können, umfassen Trägerbindungsverfahren (beisielsweise kovalente Bindungsverfahren, ionische Bindungsverfahren und physikalische Adsorptionsverfahren), Vernetzungs- und Einschlußverfahren (darunter solche der Matrixtypen und Mikrokapseltypen) und ähnliche.
Um ausschließlich das cyclische Glucan der vorliegenden Erfindung mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen zu erhalten, kann es durch die Wirkung der oben genannten Enzyme hergestellt werden, welche für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, beispielsweise D-Enzym, auf ein lineares alpha- 1,4-Glucan, bestehend aus nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, beispielsweise Amylose, eine nicht-verzweigte Stärke, eine enzymatisch mit Phosphorylase synthetisierte Amylose, ein Maltooligosaccharid und ähnliche.
Das cyclische Glucan der vorliegenden Erfindung mit nur alpha- 1,4-glykosidischen Bindungen kann ferner hergestellt werden, indem ein Saccharid mit einer alpha-1,6-verzweigten Struktur, wie beispielsweise Amylopektin, Glycogen, Stärken, wachsartige Stärken, Stärken mit hohem Amylosegehalt, lösliche Stärken, Dextrine, hydrolysierte Stärken, enzymatisch mit Phosphorylase synthetisierte Amylopektine und ähnliche als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei das oben genannte Enzym, das für das erfindungsgemäße Glucan verwendet werden kann, beispielsweise D- Enzym, unmittelbar mit dem Saccharid umgesetzt wird. Das Glucan kann ferner hergestellt werden, indem das oben genannte Saccharid mit dem oben genannten Enzym, das für das erfindungsgemäße Glucan verwendet werden kann, beispielsweise einem D-Enzym, in Gegenwart eines Enzyms umgesetzt wird, das in der Lage ist, die alpha-1,6-glykosidischen Bindungen zu spalten, jedoch nicht in der Lage ist, alpha-1,4-glykosidische Bindungen zu spalten, beispielsweise Isoamylase, Pullulanase und ähnliche.
Wie in Fig. 2 beschrieben, wird Amylose (12), welche das reduzierende Ende (11) aufweist, beispielsweise mit dem D-Enzym umgesetzt, um das oben beschriebene cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen zu erzeugen, und anschließend sukzessive vom nicht-reduzierenden Ende durch Zugabe der Glucoamylase hydrolysiert. Anschließend wird Ethanol zu dem hydrolysierten Produkt gegeben, um ein cyclisches Glucan als Präzipitat zu gewinnen, welches Gefrier-getrocknet wird, wobei das cyclische Glucan mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen (13) erhalten wird.
Ferner können das Amylopektin (14), welches das reduziernde Ende (11) aufweist, Isoamylase, die nicht in der Lage ist, eine alpha-1,6-glykosidische Bindung zu spalten, und das D-Enzym gleichzeitig umgesetzt werden, um das cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen zu erzeugen, und anschließend vom nicht-reduzierenden Ende aus durch Zugabe einer Glucoamylase sukzessive zu hydrolysieren. Anschließend wird Ethanol zu dem hydrolysierten Produkt gegeben, um ein cyclisches Glucan als Präzipitat zu gewinnen, welches danach Gefriergetrocknet wird, um das cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4- glykosidischen Bindungen zu erhalten.
Das Amylopektin (14), welches das reduzierende Ende (11) aufweist, wird ferner mit dem D-Enzym umgesetzt, um das cyclische Glucan (13) zu erzeugen, welches nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, wobei das Glucan (18) eine cyclische Struktur, mit nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen, und eine acyclische Struktur aufweist, und das Glucan (15), in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha- 1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfaßt, und anschließend mit Glucoamylase und Isoamylase umsetzt und gegebenenfalls ferner mit Pullulanase umsetzt. Zu dem Reaktionsprodukt wird anschließend Ethanol gegeben, um ein cyclisches Glucan zu präzipitieren, welches gewonnen und Gefrier-getrocknet wird, um das cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen zu erhalten.
Ein Glucan, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glycosidische Bindung umfaßt (nachfolgend als das erfindungsgemäße Glucan mit alpha-1,6-glycosidischen Bindungen bezeichnet), kann ferner durch Einwirkung des oben beschriebenen Enzyms hergestellt werden, das für die erfindungsgemäßen Glucane verwendet werden kann, beispielsweise D-Enzym, auf ein Ausgangsmaterial, das eine alpha-1,6-verzweigte Struktur aufweist, wie beispielsweise Amylopektin, Glycogen, Stärken, wachsartige Stärken, Stärken mit hohem Amylosegehalt, lösliche Stärken, Dextrine, hydrolysierte Stärken enzymatisch mit Phosphorylase synthetisierte Amylopektine und ähnliche.
Wie beispielsweise in Fig. 3 beschrieben, wird Amylopektin (14) mit dem reduzierenden Ende (11) mit D-Enzym umgesetzt, um das Glucan (15) zu erhalten, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfaßt, das cyclische Glucan (13), welches nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, und das Glucan (18) mit einer cyclischen Struktur, die nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfaßt, und einer acyclischen Struktur zu erhalten. Anschließend wird das oben beschriebene Glucan (15), in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfaßt, mittels Gelfiltrationschromatographie aufgetrennt. Zu dem Glucan (15) wird Glucoamylase gegeben, um die acyclische Struktur vom nicht-reduzierenden Ende aus sukzessive zu hydrolysieren. Nach der Hydrolyse wird Ethanol zu dem hydrolysierten Produkt gegeben, um ein cyclisches Glucan als Präzipitat zu gewinnen, welches anschließend Gefrier-getrocknet wird, um das Glucan (16) zu erhalten, das nur eine cyclische Struktur aufweist, welche mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung umfaßt.
Die linearen alpha-1,4-Glucane und Saccharide, welche diese enthalten, die gemäß der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, umfassen Malto-Oligosaccharide, wie beispielsweise Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und ähnliche, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Stärken, wachsartige Stärken, Stärken mit hohem Amylosegehalt, lösliche Stärken, Dextrine, entzweigte Stärken, teilweise hydrolysierte Stärken, enzymatisch mit Phosphorylase synthetisierte Stärken und deren Derivate. Diese können alleine oder in Kombination verwendet werden. Als entzweigte Stärke wird ein Material bezeichnet, das durch vollständigen oder teilweisen enzymatischen Verdau der alpha-1,6- glykosidischen Bindungen, die in Stärken vorliegen, erhalten wird. Die teilweise hydrolysierte Stärke bezeichnet ferner ein Material, das durch enzymatischen oder chemischen Verdau eines Teils der alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, welche in Stärken vorliegen, erhalten wird. Die Ausgangsmaterialien, die für teilweise hydrolysierte Stärken verwendet werden können, umfassen beispielsweise Amylopektine mit einem DP von etwa 100 oder mehr, Amylosen mit einem DP von etwa 20 oder mehr und ähnliche.
Das lineare alpha-1,4-Glucan oder das Saccharid, welches dieses enthält, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, können ferner mit einem Enzym, das in der Lage ist, ein Glucan zu erzeugen, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 14 alpha-1,4-glykosidische Bindungen umfaßt, in Gegenwart einer Phosphorylase und Glucose 1-Phosphat umgesetzt werden. Die Phosphorylase kann die Verlängerungsreaktion der alpha-1,4-Glucan-Kette katalysieren, wenn ein Überschuß an Glucose-1-Phosphat-Menge vorliegt. Sofern die alpha-1,4-Glucan- Kette des oben beschriebenen Ausgangsmaterials daher keine ausreichende Länge aufweist, um eine Ringschlußreaktion mit dem oben beschriebenen Enzym zu durchlaufen, kann die Ausbeute des erfindungsgemäßen Glucans durch Zugabe der Phosphorylase und des Glucose-1-Phosphats gesteigert werden.
Die Derivate der oben genannten Stärken und teilweise hydrolysierten Stärken, beispielsweise die Derivate der oben genannten Stärken, bei denen mindestens eine alkoholische Hydroxylgruppe verethert (carboxymethyliert, hydroxyalkyliert etc.) verestert (phosphoriliert, acetyliert, sulfurisiert etc.) vernetzt oder anpolymerisiert wurde, können ebenfalls als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen können auch als Ausgangsmaterialien verwendet werden.
Die Reaktion der oben genannten Ausgangsmaterialien mit dem Enzym, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann unter beliebigen Bedingungen wie pH, Temperatur, etc. durchgeführt werden, soweit die erfindungsgemäßen Glucane unter diesen Bedingungen erzeugt werden.
Wenn D-Enzym verwendet wird, wird der pH-Wert der Reaktionsmischung normalerweise etwa 3 bis etwa 10 betragen und vorzugsweise etwa 4 bis etwa 9, und besonders bevorzugt 6 bis 8 im Hinblick auf die Reaktionsrate und Effizienz, die Stabilität des Enzyms und ähnliche. Die Temperatur liegt im Bereich von etwa 10 bis etwa 90ºC, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 60ºC und besonders bevorzugt von 30 bis 40ºC im Hinblick auf die Reaktionsrate und Effizienz, die Stabilität des Enzyms und ähnliche. Sofern ein Enzym verwendet wird, das von Hitze-resistenten Mikroorganismen gewonnen wurde, kann es bei erhöhten Temperaturen von etwa 50 bis etwa 90ºC verwendet werden. Die Konzentration der oben beschriebenen Ausgangsmaterialien (Substratkonzentration) kann im Hinblick auf den DP des verwendeten Substrats bestimmt werden und beträgt normalerweise etwa 0,1 bis etwa 30%, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 10% im Hinblick auf die Reaktionsrate und Effizienz, die Verfügbarkeit der Handhabung der Substratlösung und ähnliche, und besonders bevorzugt von etwa 0,5 bis 5% im Hinblick auf die Löslichkeit des Substrates. Die Menge des verwendeten Enzyms kann im Zusammenhang mit der Reaktionszeit und der Konzentration des Substrates bestimmt werden und wird vorzugsweise so ausgewählt, dass die Reaktion in etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden beendet werden kann und beträgt üblicherweise etwa 50 bis etwa 10000 Einheiten pro 1 g des Substrates, vorzugsweise etwa 70 bis etwa 2500 Einheiten pro 1g des Substrates, besonders bevorzugt etwa 400 bis etwa 2000 Einheiten pro 1g des Substrates.
Die erfindungsgemäßen Glucane können nach beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Nachdem die oben beschriebene Reaktion abgeschlossen ist, können die erfindungsgemäßen Glucane beispielsweise durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel oder Trennung mittels einer Membran, Chromatographie oder ähnlichem abgetrennt und gereinigt werden. Vorzugsweise werden sie als solche gereinigt, oder durch Erhitzen der Reaktionslösung. Das erfindungsgemäße Glucan mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen kann Auftrennungs- oder Reinigungsverfahren unterworfen werden, wie beispielsweise Fällung mit einem Lösungsmittel, Membran-Abtrennung, Chromatographie-Trennung und ähnliche, nachdem eine Exo-Typ beta-Amylase oder Glucoamylase zu der Reaktionslösung zugegeben wurde, um das verbleibende lineare alpha-1,4-Glucan zu verdauen, oder soweit ein verzweigtes Polysaccharid, beispielsweise Stärke, verwendet wird, mit einem Enzym umgesetzt wurde, welches in der Lage ist, die alpha-1,6-glykosidische Bindung zu spalten, wodurch das cyclische alpha-1,4-Glucan übrig bleibt.
Die erfindungsgemäßen Glucane können ferner unmittelbar verethert, verestert, vernetzt oder anpolymerisiert werden, um deren Derivate zu erhalten, welche für die oben genannten Zwecke und Verwendungen genutzt werden können. Die Verfahren zur Derivatisierung, welche verwendet werden können, umfassen solche, die üblicherweise für die Modifizierung von Stärken eingesetzt werden (s. Seibutsu Kagaku Jikkenho 19, "Experimental Methods for Starches and Related Saccharides", Nakamura et al., Gakkai Shuppan Center, 1986, Seiten 273-303). Phosphoryliertes Glucan der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise durch Umsetzung des Glucans der Erfindung mit Phosphoroxychlorid in Dimethylformamid erhalten.
Die wie oben beschrieben erhaltenen erfindungsgemäßen Glucane, welche neue Verbindungen sind, weisen eine deutlich verbesserte Löslichkeit in Wasser im Vergleich zu üblichen Stärken wie beispielsweise Amylose und Amylopektin, auf; und deren wässrige Lösungen weisen ausgezeichnete Eigenschaften auf, da diese nicht Gegenstand einer Retrogradation sind, welche bei wässrigen Lösungen üblicher Stärken, wie beispielsweise Amylose und Amylopektin, beobachtet wird. Die erfindungsgemäßen Glucane haben ferner die Wirkung, die Retrogradation üblicher Stärken zu kontrollieren oder zu verhindern. Deren wässrige Lösungen weisen ferner ausgezeichnete Eigenschaften auf, wie beispielsweise eine geringere Viskosität als wässrige Lösungen üblicher Stärken. Wenn die erfindungsgemäßen Glucane erhitzt werden, sowie wenn sie mit einem Protein oder einer Aminosäure vermischt werden, werden sie nicht unmittelbar gefärbt, da sie eine geringere Reaktivität im Vergleich zu üblichen Stärkesirupen und Dextrinen aufweisen. Die erfindungsgemäßen Glucane weisen ausgezeichnete Eigenschaften auf, darunter den Einschluß oder die Adsorption verschiedener Materialien. Da die erfindungsgemäßen Glucane dieselbe Grundstruktur wie übliche Stärken aufweisen, in denen Glucose nur über alpha-1,4-glykosidische Bindungen und alpha- 1,6-glykosidische Bindungen verknüpft ist, werden sie durch in den Organismen vorliegende Enzyme ohne weiteres zu Glucose abgebaut, wodurch ausgezeichnete Abbau-Eigenschaften und eine höhere Effizienz des Energieaustauschs ermöglicht wird.
Aufgrund der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Glucane können diese für beliebige Nahrungsmittel verwendet werden, in denen übliche Stärken, Dextrine genutzt werden, darunter die meisten Nahrungs- und Getränkezusammensetzungen und Nahrungsmittelzusatzstoffe. "Nahrungsmittel- und Getränkezusammensetzung" ist ein allgemeiner Begriff, der menschliche Nahrungsmittel, tierische Futtermittel und Haustier-Futter umfaßt. Die Glucane können wirksam für flüssige oder pulverige Getränke, wie beispielsweise Kaffee, Tee, japanischen Tee, Oolong-Tee, Säfte, Sportgetränke und ähnliche verwendet werden; Weizenprodukte, wie Brote, Cookies, Cräckers, Biscuits, Kuchen, Pizzas, Aufläufe und ähnliches; Pasta, wie Spagetti, Makkaroni und ähnliche; Nudeln, wie japanische Nudeln, chinesische Nudeln und ähnliche; Süßstoffe, wie Karamel, Kaugummi, Schokoladen und ähnliche, Snacks, wie Reiscracker, Kartoffelchips, andere Snacks und ähnliche; Eis wie Eiscreme, Sorbet und ähnliche, Milchprodukte wie Creme, Margarine, Käse, Milchpulver, Milchkondensat, Milchgetränke und ähnliche, westliche Desserts, wie Jellies, Puddings, Mousse, Joghurts und ähnliche; japanische Desserts, wie Bohnenkuchen, Reisjellies, Reiskuchen, Reisbohnenkuchen, und ähnliche; Gewürze wie Sojasaucen, Sojasaucen-Dips, Nudelsaucen, Worcestersaucen, Grundlagen für Brühe, Grundlagen für Stew, Grundlagen für Suppen, kombinierte Gewürze, Grundlagen für Curry, Mayonnaise, Dressings, Ketchup und ähnliche; Retortennahrung und Dosennahrung für Curry, Stew, Suppen, Grundlagen für Reisschüssel und ähnliche; gekühlte Nahrungsmittel und gefrorene Nahrungsmittel wie Schinken, Hamburger, Fleischbällchen, Kroketten, Pilavs, Reisbällchen und ähnliches; verarbeitete Nahrungsmittel aus dem Meer, wie Fischstäbchen und Fischpaste und ähnliches; Reisprodukte wie Reisbällchen, Mittagsreis, Sushi Reis und ähnliches; Gyoza Skins, Shumai Skins und ähnliche. Da die Glucane ferner verbesserte Eigenschaften für den Verdau aufweisen, können sie für die Herstellung von Baby-Nahrungsmitteln, Haustier-Futter, Tierfutter, Sportgetränken, Sportnahrungsmitteln, supplementierende Nährstoff-Nahrungsmittel und ähnliche verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Glucane können auch als Infusionslösung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Glucane können als adhäsive Zusammensetzungen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Glucane weisen adhäsive Eigenschaften und Zugfestigkeit auf und sind daher für Bereiche, in denen übliche Stärken, Dextrine und deren Derivate verwendet werden, verfügbar. Die adhäsiven Zusammensetzungen umfassen beispielsweise Oberflächen-Schlichtemittel, Beschichtungsmittel, Schicht-Haftmittel und ähnliche für Papierherstellende und -verarbeitende Industrien; Bindemittel und ähnliche für die Nahrungsmittelindustrien; Pasten, Dichtungen und ähnliche für die Textil- und Werkstoffindustrien.
Die erfindungsgemäßen Glucane schließen verschiedene Materialien ein oder adsorbieren diese. Obwohl Cyclodextrine und übliche Amylosen Einschluß- und Adsorptionseigenschaften aufweisen, können die erfindungsgemäßen Glucane voraussichtlich in einem breiteren Bereich dieser Anwendungen eingesetzt werden, da sie eine signifikant größere Löslichkeit in Wasser als übliche Stärken und Cyclodextrine haben. Da sie ferner einen höheren DP als die Cyclodextrine aufweisen, ist davon auszugehen, dass sie eine von Cyclodextrin verschiedene Gastspezifität aufweisen. Der Einschluß oder die Adsorption eines Materials in Amylosen oder Cyclodextrine kann in einer Änderung der Eigenschaften und in der Aufnahme neuer Eigenschaften resultieren. Diese allgemein bekannten Eigenschaften umfassen beispielsweise verbesserte Löslichkeit, Nicht-Verflüchtigung flüchtiger Materialien, Stabilisierung instabiler Materialien, Maskierung aggressiver Gerüchte und ähnliches. Die in den erfindungsgemäßen Glucanen adsorbierten oder eingeschlossenen Materialien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf beispielsweise Nahrungsmittel wie japanischer Rettich, Sojasauce, japanischen Tee, japanischen Pfeffer, Zitrone, Gewürze, Farbmittel und ähnliches; Arzneimittel, wie Menthol, Linolsäure und ähnliches. Die so hergestellten Einschluß- und Adsorptionsmaterialien können als Nahrungsmittel und Medizin verwendet werden. Sie können beispielsweise für die oben beschriebenen Nahrungsmittel, als Badekristalle und Arzneimittel, wie interne Medizin, Pulver-Medizin und ähnliches verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Glucane können als Ausgangsmaterialien für biologisch abbaubare Kunststoffe und als Ausgangsmaterialien für die Stärkeindustrie sowie als Zwischenmaterialien für die Herstellung von Cyclodextrinen aus Stärken und ähnliches verwendet werden, wobei auf die geringere Viskosität der Lösungen fokussiert wird.
Verschiedene weitere Änderungen werden dem Fachmann geläufig sein und können von diesem unmittelbar ausgeführt werden, ohne vom Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist es nicht beabsichtigt, dass der Umfang der nachfolgenden Ansprüche auf die hierin offenbarte Beschreibung beschränkt ist, sondern die Ansprüche sollten breit ausgelegt werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele illustrieren die erfindungsgemäßen Glucane spezifisch, jedoch wird der Umfang der Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.

(Beispiel 1: Herstellung des D-Enzym)

D-Enzym wird entsprechend dem in Takaha et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, 1391-1396 (1993) beschriebenen Verfahren gereinigt. Eine Kartoffelknolle wurde zunächst in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) Puffer, der 5 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer A) enthält, homogenisiert, zentrifugiert, durch eine 0,45 um Membran passiert, auf eine Q- Sepharose-Säule geladen (16 · 100 mm; Pharmacia, Inc.) und mit Puffer A, enthaltend 150 mM NaCl, gewaschen. Das D-Enzym wurde in Puffer A eluiert, der 450 mM NaCl enthielt. Das Eluat gegen Puffer A dialysiert, zu dem Ammoniumsulfat gegeben wurde, so dass die Endkonzentration 500 mM betrug. Diese Lösung wurde auf eine Phenyl Toyopearl 650 M Säule geladen (10 · 100 mm; Toso, Inc.) und durch Variation der Ammoniumsulfatkonzentration in Puffer A von 500 mM bis 0 mM eluiert. Die Fraktion mit aktivem D-Enzym wurde gesammelt und gegen Puffer A dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde unter Verwendung eines Amicon Centricon 30 Mikrokonzentrator konzentriert, auf eine PL-SAX HPLC Säule (Polymer Laboratory, U.K.) geladen, und mittels eines linearen Gradienten einer zu Puffer A gegebenen NaCl Konzentration von 150-400 mM eluiert, um die Fraktion mit aktivem D-Enzym zu sammeln, welche anschließend mittels des oben beschriebenen Amicon Centricon 30 Mikrokonzentrators konzentriert wurde.
Die D-Enzymaktivität wurde in einer 100 ul Reaktionsmischung analysiert, die 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,0), 5 mM 2-Mercaptoethanol, 1% (w/v) Maltotriose und das Enzym enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 10 Min. bei 37ºC inkubiert und durch Eintauchen der Reaktionsröhrchen in kochendes Wasser für 3 Min. beendet. Die freigesetzte Glucose wurde mittels des Glucose- Oxidase-Verfahrens (Barham und Trinder, (1972) Analyst 97; 142) bestimmt. Eine Einheit der Aktivität des D-Enzyms wird als die Menge an Enzym definiert, die ein umol Glucose pro Minute unter den genannten Nachweisbedingungen erzeugt.

(Beispiel 2: Herstellung des erfindungsgemäßen cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen)

Nachdem 500 mg der kommerziell erhältlichen Amylose (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 30000) vollständig in 10 ml einer 1 N NaOH gelöst wurde, wurden sukzessive 10 ml 1 M Tris Salzsäurepuffer (pH 7,5), 20 ml destilliertes Wasser und 10 ml 1 N Salzsäure zu der Lösung gegeben, um eine Amylose-Lösung herzustellen. 200 Einheiten des D-Enzyms aus Kartoffel wurden zu der Amyloselösung gegeben und bei 30ºC für 24 Stunden umgesetzt.
Nach Zentrifugieren der Reaktionslösung wurde der Überstand für 5 Min. bei 100ºC behandelt und nochmals zentrifugiert, um das denaturierte Enzymprotein zu entfernen. Zu dem Überstand wurden etwa 100 Einheiten beta-Amylase und 100 Einheiten Glucoamylase gegeben und 3 Std. bei 50ºC umgesetzt und anschließend durch Zugabe einer 10fachen Menge an Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde Gefrier-getrocknet, um 400 mg Pulver zu erhalten.

(Beispiel 3: Herstellung des erfindungsgemäßen cyclischen Glucans mit nur einer alpha-1,4-glykosidischen Bindung)

Nachdem 500 mg der kommerziell erhältlichen Stärke in 10 ml 1 N NaOH vollständig aufgelöst wurden, wurden sukzessive 10 ml 1 M Tris Salzsäurepuffer (pH 7,5), 20 ml destilliertes Wasser und 10 ml 1 N Salzsäure zu der Lösung gegeben, um eine Stärke-Lösung herzustellen. 10 Einheiten der kommerziell erhältlichen Isoamylase und 200 Einheiten des D-Enzyms aus Kartoffel wurden zu der Stärke-Lösung gegeben und für 24 Stunden bei 30ºC umgesetzt.
Nach Zentrifugieren der Reaktionslösung wurde der Überstand 5 Min. bei 100ºC behandelt und nochmals zentrifugiert, um das denaturierte Enzymprotein zu entfernen. Zu dem Überstand wurden etwa 100 Einheiten beta-Amylase und 100 Einheiten Glucoamylase gegeben und für 3 Std. bei 50ºC umgesetzt, und anschließend wurde ein cyclisches Glucan durch Zugabe einer 10fachen Menge an Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde Gefrier-getrocknet, um etwa 150 mg des Pulvers des cyclischen Glucans zu erhalten, welches nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.

(Beispiel 4: Herstellung des erfindungsgemäßen cyclischen Glucans, das nur alpha-1,4-glycosidische Bindungen aufweist)

Nachdem 20 mg der kommerziell erhältlichen Amylose (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 320000) in 1 ml DMSO vollständig aufgelöst wurden, wurden 9 ml 20 mM Zitronensäurepuffer (pH 7,0), der 68 Einheiten des in Beispiel 1 gereinigten D-Enzyms enthielt, zugegeben und bei 30ºC für 10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten, 2 Stunden, 6 Stunden und 18 Stunden umgesetzt. Die Reaktionslösungen wurden für 10 Min. auf 100ºC erhitzt und anschließend zentrifugiert, um das denaturierte Enzymprotein zu entfernen. 5 Einheiten Glucoamylase wurden pro 1 ml Überstand zugegeben und für 4 Std. bei 40ºC umgesetzt, um die lineare Amylose zu entfernen. Die Reaktionslösungen wurden anschließend nochmals für 10 Min. auf 100ºC erhitzt, und danach zentrifugiert, um das modifizierte Enzymprotein zu entfernen. Zu 250 ul des Überstands wurde eine 10fache Menge an Ethanol gegeben, um die cyclischen Glucane auszufällen.

(Beispiel 5: Identifizierung des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen)

(1) Quantifizierung der reduzierenden Enden und nichtreduzierenden Enden
Die Quantifizierung der reduzierenden Enden des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers wird entsprechend des Park-Johnson Verfahrens durchgeführt, das in Hizukuri et al. (1981) Carbohydr. Res: 93; 205-213, beschrieben wurde. Die Quantifizierung der nichtreduzierenden Enden des Pulvers wurde entsprechend des schnellen Smith-Abbauverfahrens durchgeführt, das in Hizukuri und Osaki (1978) Carbohydr. Res: 63; 261-264, beschrieben wurde. Als Ergebnis wurden weder reduzierende Enden noch nicht-reduzierende Enden in dem Pulver gefunden.
(2) Verdauung der Glucane mit dem Exo-Typ-Enzym und dem Debranching-Enzym.
Nachdem das in Beispiel 2 erhaltene Pulver in destilliertem Wasser aufgelöst wurde, so dass die Konzentration 0,1% (w/v) betrug, wurde eine Einheit jeder der folgenden Amylasen zu 100 M1 der wässrigen Lösung gegeben und für 2 Std. bei 40ºC umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels des Kohlenhydratanalysesystems von DIONEX, Inc. (Pumpensystem: DX300, Detektor: PAD-2, Säule: CarboPacPA100) analysiert. Das Elutionsverfahren wurde unter den Bedingungen Flußrate: 1 ml/Min., NaOH Konzentration: 150 mM, Natriumazetatkonzentration: 50 mM bei 0 Minuten, 50 mM, bei 2 Minuten, 350 mM, bei 37 Min. (Gradientenkurve Nr. 3), 850 mM bei 45 Minuten (Gradientenkurve Nr. 7), und 850 mM bei 47 Minuten. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse.
Wie in Fig. 4 gezeigt, wurde das in Beispiel 2 erhaltene Pulver nicht durch beta-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) und Glucoamylase (Toyobo Co. Ltd.), die Exo-Typ-Amylasen sind, welche in der Lage sind, die alpha-1,4-glykosidische Verbindung des nicht-reduzierenden Endes eines Stärke-Moleküls zu hydrolysieren, abgebaut. Ferner wurde es nicht durch eine kombinierte Verwnedung der Isoamylase (Hayashibara Biochemical Research, Inc.) und der Pullulanase (Hayashibara Biochemical Research, Inc.), welche in der Lage sind, die alpha-1,6-glykosidische Bindung in Stärke zu hydrolysieren, oder einer kombinierten Verwendung der Isoamylase, Pullulanase und beta-Amylase abgebaut. Das Pulver wurde jedoch vollständig durch die alpha-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) abgebaut, welche eine Endo-Typ-Amylase ist, die in der Lage ist, die alpha-1,4-glykosidische Bindung innerhalb des Stärkemoleküls zu hydrolysieren.
(3) Verdau es Glucans mit Endo-Typ-Emzym
Nachdem das in Beispiel 2 erhaltene Pulver in destilliertem Wasser aufgelöst wurde, so dass die Konzentration 0,1% (w/v) betrug, wurde eine Einheit an bakterieller Saccharifizierungstyp-Amylase (Nagase Biochemical Industries, Inc.) zu 100 ul der wässrigen Lösung gegeben und für 2 Std. bei 40ºC umgesetzt. Als das Reaktionsprodukt mit HPLC analysiert wurde, wurden Glucose, Maltose und ein geringer Anteil als Maltotriose erhalten. Dies zeigt, dass das in Beispiel 2 erhaltene Pulver nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen enthält und dass das resultierende Pulver ein cyclisches Glucan ist, welches nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.
Dieselbe Analyse zeigt, dass die in den Beispielen 3 und 4 erhaltenen Pulver cyclische Glucane sind, welche nur alpha-1,4- glykosidische Bindungen aufweisen.

(Beispiel 6: Messung des DP des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen)

Es ist allgemein bekannt, dass ein cyclisches Glucan anders als ein lineares Glucan mit demselben DP bei Chromatographie unterschiedlich eluiert. Die Identifzierung der cyclischen Struktur und die Bestimmung des DP des cyclischen Glucans wurden durch Ausnutzung dieser Eigenschaften erzielt.
(1) Herstellung des cyclischen Glucans mit spezifischem DP und nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen
Weil davon auszugehen ist, dass das in Beispiel 2 erhaltene Material eine Mischung aus cyclischen Glucanen mit verschiedenen DPs darstellt und nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, wurde das Material gereinigt, um ein cyclisches Glucan mit einem spezifischen DP zu erhalten.
Fig. 5-1 zeigt das Elutionsmuster, wenn 100 ug des in Beispiel 2 erhaltenen Materials mittels des Kohlenhydratanalysesystems von DIONEX, Inc. analysiert werden (das System und die Elutionsbedingungen sind dieselben, wie oben beschrieben). Fig. 5-2 zeigt das Elutionsmuster des linearen alpha-1,4-Glucans unter denselben Elutionsbedingungen.
Der zuerst eluierte, nachweisbare Peak, der in Figure 5-1 gezeigt wird, wurde als A bezeichnet, und die nachfolgenden Peaks wurden als B, C, D----L bezeichnet. Die Peaks von G-L wurden fraktioniert und gereinigt.
(2) Analyse des mit Säure hydrolysierten Materials
Die fraktionsweise gewonnenen Peaks G-L wurden mit 0,1 N HCl für 30 Min. bei 100ºC hydrolysiert. Diese Bedingung ist eine Bedingung, die in einer Teil-Hydrolyse resultiert. Das hydrolysierte Material wurde mittels des Kohlenhydratanalysesystems von DIO- NEX, Inc. analysiert, (das System und die Elutionsbedingungen waren dieselben, wie in Beispiel 4). Fig. 6 zeigt die Ergebnisse.
Die Fraktion des oben genannten Peak G wurde mit Säure teilweise hydrolysiert und zu Glucose sowie zu einem linearen alpha-1,4- Glucan mit einem DP von 2-23 abgebaut.
Der intakte Peak G wird um die Position des linearen alpha-1,4- Glucans mit einem DP von 20 herum eluiert. Als interessantes Phänomen wurde gefunden, dass das abgebaute Material bei einer Position für einen höheren DP als das intakte Material eluiert wurde. Diese Phänomen wurde auch in den anderen Peaks, H-L, bestätigt, was darauf hinweist, dass die Peaks G-L einem cyclischen Glucan entsprechen, das nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.
Es wird davon ausgegangen, dass der DP des größten linearen alpha-1,4-Glucans, welches erzeugt wurde, in dem zuvor beschriebenen Teil-Hydrolyse-Versuch dem DP des cyclischen Glucans entspricht, das nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen in jedem Peak aufweist. Es wurde somit festgestellt, dass der DP der Peaks G, H, I, J, K und L 23, 24, 25, 26, 27 und 28, respektive, beträgt. Es wurde ferner aufgrund dieser Ergebnisse geschätzt, dass der DP des Peaks A, welcher dem cyclischen Glucan mit dem geringsten DP und nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen entspricht, 17 beträgt.
Der DP der cyclischen Glucane mit einem weit höheren DP und nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen kann auf der anderen Seite mittels Gelfiltrationschromatographie analyisert werden. Däs Pulver des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, das zu jeder Reaktionszeit in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde in 250 ul destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine verbundene Säule aus Superose 6 (( ) 1 cm · 30 cm, Pharmacia, Inc.) und Superdex 30 (( ) 1 cm · 30 cm, Pharmacia, Inc.) geladen und mit 150 mM Natriumacetatlösung eluiert.
Wie in Fig. 7 gezeigt, wies das cyclische Glucan, das nur alpha-1,4-glycosidische Bindungen aufweist, und in der Probe hergestellt wurde, deren Reaktionszeit mit dem D-Enzym 10 Min. betrugt, einen durchschnittliches Molekulargewicht von 70000 auf. Mit Zunahme der Reaktionszeit mit dem D-Enzym nahm das Molekulargewicht des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen ab. Das durchschnittliche Molekulargewicht des cyclischen Glucans blieb jedoch unverändert ab einer Größe von etwa 15000 und nach einer Reaktionszeit von 6 Std., und es erfolgte keine weitere Reduktion des Molekulargewichts. Das Molekulargewicht des cyclischen Glucans wurde unter Verwendung der synthetischen Amylose als Standard geschätzt.
Es wurde somit festgestellt, dass der DP des cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, das mit D-Enzym hergestellt wurde, willkürlich in dem Bereich von 17 bis etwa mehrere Hundert durch Veränderung des DP der Amylose, die als Substrat verwendet wird, der Menge des D-Enzyms der Reaktionszeit und ähnlichen Parametern kontrolliert werden kann.

(Beispiel 7: Herstellung des erfindungsemäßen Glucans)

Nachdem 40 mg kommerziell erhältlicher wachsartiger Maisstärke in 2 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) dispergiert wurden, wurden 18 ml eines 20 mM Zitronensäurepuffers (pH 7,0), der 680 Einheiten des in Beispiel 1 gereinigten D-Enzyms enthielt, zu der Stärke-Lösung gegeben und für 40 Min. bei 30ºC umgesetzt.
Die Reaktionsmischung wurde bei 100ºC für 10 Std. erhitzt und zentrifugiert, um das denaturierte Enzymprotein zu entfernen. Zu dem Überstand wurde eine 10fache Menge an Ethanol gegeben, um das Glucan zu präzipitieren. Das resultierende Präzipitat wurde anschließend Gefrier-getrocknet, um 40 mg des Pulvers des erfindungsgemäßen Glucans zu erhalten. Das Pulver bestand aus einer Mischung des erfindungsgemäßen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, des erfindungsgemäßen Glucans mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung und des erfindungsgemäßen Glucans mit einer cyclischen Struktur, die nur alpha- 1,4-glykosidische Bindungen und einer acyclischen Struktur umfaßt.

(Beispiel 8: Herstellung des erfindungsgemäßen Glucans mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung in einer cyclischen Struktur und einer acyclischen Struktur)

Das in Beispiel 7 erhaltene Präzipitat wurde mittels Gelfiltrationschromatographie fraktioniert. Das Präzipitat wurde in 250 ul destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine verbundene Säule aus Superose 6 (( ) 1 cm · 30 cm, Pharmacia, Inc.) und Superdex 30 (( ) 1 cm · 30 cm, Pharmacia, Inc.) geladen und mit 150 mM Natriumacetatlösung eluiert. Wie in Fig. 8 gezeigt, wurde das Molekulargeicht des Amylopektin, welches mit dem Leervolumen eluiert wurde, durch die Reaktion mit dem D-Enzym verringert, um zwei Arten von Bestandteilen zu erzeugen, die aus Peak I mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 30000 und Peak 11 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 3000 bestehen. Peak 11, der ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 3000 aufwies, bestand im wesentlichen aus cyclischen Glucanen mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen. Auf der anderen Seite bestand Peak I, der ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 3000 aufwies, aus einem Glucan mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung. Peak I wurde fraktioniert und ein Glucan mit mindestens einer alpha- 1,6-glykosidischen Bindung wurde durch Zugabe einer 10fachen Menge an Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde zentrifugiert, gewonnen und anschließend Gefrier-getrocknet, um 20 mg des Glucans mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung zu erhalten. Das Molekulargewicht des cyclischen Glucans wurde unter Verwendung von synthetischer Amylose als Standard geschätzt.

(Beispiel 9: Herstellung des cyclischen Glucans mit nur alpha- 1,4-glykosidischen Bindungen)

Nachdem 20 mg Maltohexaose und 200 mg Glucose 1-Phosphat in 10 ml eines 100 mM Zitronensäurepuffer (pH 7,0), der 5 mM Adenosinmonophosphat enthielt, aufgelöst wurden, wurden 20 Einheiten des in Beispiel 1 hergestellten Enzyms und 1 mg der Phosphorylase (Sigma, Inc.) zu der Lösung gegeben und für 2 Std. bei 30ºC umgesetzt.
Nach Zentrifugieren der Reaktionslösung wurde der Überstand für 5 Min. bei 100ºC behandelt und nochmals zentrifugiert, um das denaturierte Enzymprotein zu entfernen. Zu dem Überstand wurden 50 Einheiten Glucoamylase gegeben, um linearen alpha-1,4-Glucan zu entfernen und anschließend wurde ein 10faches Volumen an Ethanol zu der Lösung gegeben, um einen cyclischen Glucan auszufällen. Das Präzipitat enthielt 30 mg eines cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen. Das Gluose-Phosphat, das ferner in dem Präzipitat vorlag, wurde mittels Gelfiltrationschromatographie entfernt.

(Beispiel 10: Bestätigung, dass das Material des Beispiels 8 eine cyclische Struktur enthält, die mindestens eine alpha-1,6- glykosidische Bindung aufweist)

Glucoamylase ist ein Enzym, das in der Lage ist, nacheinander die alpha-1,4-glykosidischen Bindungen von dem nichtreduzierenden Ende eines Glucans, wie beispielsweise Stärke, zu hydrolyiseren. Es ist bekannt, dass dieses Enzym auch die alpha-1,6- glykosidische Bindung des nicht-reduzierenden Endes hydrolysiert, obwohl die Geschwindigkeit der Hydrolyse gering ist. Wie in Fig. 9 gezeigt, werden Amylose und Amylopektin, die keine cyclische Struktur aufweisen, durch die Glucoamylase vollständig zu der Glucose (17) abgebaut. Im Fall des Glucans, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt (13 und 15), werden jedoch Teil der acyclischen Struktur des Glucans durch Glucoamylase abgebaut und dessen cyclische Strukturen (16) verbleiben als ein Material, welches nicht Gegenstand des Glucoamylase-Abbaus ist (nachfolgend als Glucoamylase-resistenter Bestandteil bezeichnet). Der Glucoamylase-resistente Bestandteil wurde ferner entsprechend der Sensitivität gegenüber Särke-Debranching-Enzym in Gruppen klassifiziert, in denen das cyclische Glucan (16) mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung aufweist und in denen das cyclische Glucan (13) nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist. D.h., es ist davon auszugehen, dass der Glucoamylase-resistente Bestandteil, der nicht durch den kombinierten Einsatz des Debranching-Enzyms und der Glucoamylase abgebaut wird, das cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen ist. Auf der anderen Seite ist davon auszugehen, dass der Glucoamylase-resistente Bestandteil, der durch die kombinierte Verwendung des Debranching-Enzyms und der Glucoamylase abgebaut wird, das cyclische Glucan (16) mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung ist. Das cyclische Glucan (13) mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, welches nicht durch kombinierten Einsatz des Debranching-Enzyms und der Glucoamylase abgebaut wird, wird durch kombinierten Einsatz eines Endo-Typ alpha-Amylase und Glucoamylase vollständig zu Glucose abgebaut. Die Nutzung dieser Eigenschaften ermöglicht es, die Menge der acyclischen Struktur, der cyclischen Struktur, die mindestens eine alpha-1,6-glykosidische Bindung aufweist, und der cyclischen Struktur, die nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist, in den Glucanproben quantitativ zu bestimmen.
Die cyclischen Strukturen des in Beispiels 8 erhaltenen Glucans und des Amylopektin wurden quantitativ unter Verwendung dieses Verfahrens bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung der cyclischen Strukturendes in Beispiel 8 erhaltenen Glucans und des Amylopektins. Tabelle 1
Nachdem 10 mg des in Beispiel 8 erhaltenen Materials oder 10 mg des Amylopektins in 1 ml DMSO aufgelöst wurden, wurde die Lösung umittelbar mit 8 ml eines 100 mM Natriumacetatpuffers verdünnt. Aliquote Teilmengen (900 ul) der verdünnten Lösung wurden bei 40ºC für 4 Std. mit 100 ul an (1) destilliertem Wassser, (2) Glucoamylase-Lösung (3) einer Lösung, die Debranching-Enzym und Glucoamylase enthielt, oder (4) einer Lösung, die Endo-Typ alpha-Amylase und Glucoamylase enthielt, inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die erzeugte Glucose mittels eines kommerziell erhältlichen Glucosebestimmungs-Kits bestimmt. Der Prozentsatz der acyclischen Struktur, der cyclischen Struktur mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung und der cyclischen Struktur mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen in den Glucanproben wurde gemäß der folgenden Berechnungsformeln bestimmt: Formel 1 Formel 2 Formel 3
worin c, x, y und z die Glucose-Menge darstellt, die in der Reaktionslösung aus (1), (2), (3), und (4), respektive, erzeugt wurde. Aufgrund der Ergebnisse kann festgestellt werden, dass das in Beispiel 8 erhaltene Material ein Glucan darstellt, der eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens eine alpha-1, 6- glykosidische Bindung umfaßt.

(Beispiel 11: Messung des DP der cyclischen Struktur des Materials des Beispiel 8).

Nachdem 10 mg des in Beispiel 8 erhaltenen Materials in 1 ml DMSO aufgelöst wurden, wurde 1 ml 1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,5), 8 ml destilliertes Wasser, und 200 Einheiten Glucoamylase zu der Lösung gegeben und für 1 Stunde bei 40ºC umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt und anschließend zentrifugiert, um das denaturierte Enzym zu entfernen. Zudem Überstand wurde ein 10faches Volumen an Ethanol gegeben, um ein Polysaccharid auszufällen, welches anschließend getrocknet wurde. Das resultierende Polysaccharid wurde in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden 50 Einheiten Glucoamylase gegeben und für 1 Stunde bei 40ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde für 10 Min. bei 100ºC erhitzt und anschließend zentrifugiert, um das denaturierte Enzym zu entfernen. Zu dem Oberstand wurde ein 10faches Volumen an Ethanol gegeben und das so erhaltene Präzipitat wurde getrocknet, um 1,1 mg des Pulvers des Glucoamylase-resistenten Bestandteils zu erhalten (cyclische Struktur).
Der wie oben beschrieben erhaltene Glucoamylase-resistente Bestandteil wurde in destilliertem Wasser aufgelöst, so dass die Konzentration 0,4 (w/v) betrug und anschließend unter Verwendung des Kohlenhydrat-Analysesystems von DIONEX, Inc. analysiert (Pumpensystem: DX 300, Detektor: PAD-2, Säule: CarboPacPA100). Das Elutionsverfahren wurde beispielsweise unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, Flußrate: 1 ml/min., NaOH Konzentration: 150 mM, Natriumacetatkonzentration: 50 mM bei 0 Min., 50 mM bei 2 Min., 350 mM bei 37 Min. (Gradientenkurve Nr. 3), 850 mM bei 45 Min. (Gradientenkurve Nr. 7) und 850 mM bei 47 Min.
Als Marker zum Vergleich des DP wurden das lineare alpha-1,4- Glucan und das in Beispiel 2 hergestellte Glucan mit nur alpha- 1,4-glykosidischen Bindungen unter denselben Bedingungen analysiert.
Wie in Fig. 10 gezeigt, erlaubte der resultierende Glucoamylase-resistente Bestandteil kein klares Auftrennungsmuster, welches für das lineare alpha-1,4-Glucan und das Glucan mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen erhalten wurde. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass der Glucoamylase-resistente Bestandteil eine unterschiedliche Anzahl an alpha-1,6-glykosidischen Bindungen enthält. Im Hinblick auf die Tatsache, dass der kleinste Peak (Pfeil) einer Position mit einem DP von 15 entspricht und dass das Glucan mit einer cyclischen Struktur früher als lineare Glucan mit demselben DP, wie in Beispiel 6 beschrieben, eluiert wurde, ist jedoch zu schließen, dass der DP der kleinsten cyclischen Struktur mit mindestens einer alpha-1,6- Bindung mindestens 15 beträgt.

(Beispiel 12: Löslichkeit der erfindungsgemäßen Glucane)

Jeder der in den Beispielen 6 und 8 erhaltenen Glucane und Amylose, wachsartige Maisstärke und lösliche Stärke (WAKO Pure Chemicals, Inc.) als Kontrollen wurden einzeln in destilliertem Wasser suspendiert, so dass die Konzentration 10% (w/v) betrug, kräftig mit dem Vortex-Mischer vermischt und anschließend zentrifugiert. Die Konzentration des bei 0ºC, 30ºC, 60ºC und 100ºC in jedem der Überstände gelösten Saccharides wurde bestimmt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, dass die Glucane der Beispiele eine signifikant höhere Löslichkeit als übliche Stärken aufweisen.
(Beispiel 13: Retrogradationstest des erfindungsgemäßen Glucans)
200 mg jedes der in Beispiel 2 und 8 erhaltenen Glucane, und Amylose, wachsartige Maisstärke und lösliche Stärke (WAKO Pure Chemicals, Inc.) als Kontrollen wurden einzeln in Röhrchen mit Schraubverschluß eingeführt, in die 10 ml Wasser gegeben wurde, und anschließend gekocht und aufgelöst. Nachdem diese 4 Proben bei 0ºC für 0 Stunden, 3 Stunden, 6 Stunden und 20 Stunden stehen gelassen wurden, wurde 1 ml jeder Probe in ein Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert, um die Konzentration des im Überstand gelösten Saccharids zu bestimmen. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt, dass die Glucane der Beispiele eine signifikant geringere Retrogradation als übliche Stärken aufweisen.
(Beispiel 14: Anti-Retrogradations-Wirkung des erfindungsgemäßen Glucans auf Stärke)
Wenn eine 4% (w/v) lösliche Stärke-Lösung, die durch Erhitzen vollständig gelatinisiert wurde, bei 4ºC gelagert wird, wird die lösliche Stärke schnell retrogradiert und wird zu einer Lösung aus einer wolkigen Paste. Unter Ausnutzung dieses Phänomens wurden die erfindungsgemäßen Glucane auf ihre Anti-Retrogradationseigenschaften hin untersucht. Das in Beispiel 8 erhaltene Glucan wurde zu einer 4% (w/v) löslichen Stärke-Lösung gegeben, so dass eine Endkonzentration von 0% (w/v), 2% (w/v), oder 4% (w/v) erhalten und bei 4ºC gelagert wurde. Proben wurden nach verschiedenen Zeitpunkten genommen und die Trübung wurde bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt. Fig. 11 zeigt die Ergebnisse.
Fig. 11 zeigt, dass das Glucan des Beispiels 14 eine Anti- Retrogradationswirkung auf Stärke aufweist.
(Beispiel 15: Viskosität der erfindungsgemäßen Glucane) Nach dem 1,6 g jedes der in Beispiel 8 erhaltenen Glucane und der üblichen wachsartigen Maisstärke, löslichen Stärke (WAKO Chemicals, Inc.) und Pinedex Nr. 1 (Matsutani Chemical, Inc.) als Kontrollen einzeln in Röhrchen plaziert wurden und mit 8 ml destilliertem Wasser dispergiert wurden, wurden 72 ml Dimethylsulfoxid zu der Dispersion gegeben und die Glucane wurden vollständig durch Rühren bei Raumtemperatur aufgelöst. Die Viskosität jeder Lösung wurde mittels des digitalen Viskometers, DVL-B (Tokyo Keiki, Inc. Rotor; Nr. 1, Rotationsfrequenz; 60 UpM, Meßzeit; 10 Sek.) bestimmt. Die Viskosität einer Lösung aus 72 ml Dimethylsulfoxid, welche zu 8 ml an destilliertem Wasser (90% DMSO Lösung) gegeben wurde, wurde ebenfalls als Kontrolle bestimmt. Das dabei verwendete Pinedex Nr. 1, ist eine Stärke, die weitergehend mit alpha-Amylase hydroylsiert wurde, als die oben beschriebene lösliche Stärke. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 4

Viskosität (mP · s)
90% DMSO Lösung 5,3
In Beispiel 8 erhaltenes Glucan 6,4
Pinedex Nr. 1 5,8
Lösliche Stärke 5, 6
Wachsartige Maisstärke 100,3
Tabelle 4 zeigt, dass die pastenförmige Lösung des Beispiels eine signifikant geringere Viskosität als übliche wachsartige Mais-Stärken aufweist.
(Beispiel 16: Reaktivität des erfindungsgemäßen Glucans)
Nachdem 20 mg jedes der in Beispiel 2 und 8 erhaltenen Glucane und lösliche Stärke (WAKO Junyaku, Inc.) und Pinedex Nr. 1 (Matsutani Chemical, Inc.) als Kontrollen einzeln in 1 ml destilliertem Wasser gelöst wurde, wurde die Reduktionskraft jeder Lösung gemäß des Dinitrosalicylsäureverfahrens (von Sakuzo Fukul, Seibutsu Kagagku Jikkenho Nr. 1, Determination of Reduction and the like, Gakkai Shuppan Center) bestimmt. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 5

Menge des reduzierten Zuckers (mg/ml)
In Beispiel 2 und 8 erhaltene Glucane nicht nachgewiesen (< 0,01)
Pinedex Nr. 1 5,10
Lösliche Stärke 2,84
Tabelle 5 zeigt, dass die Glucane der Beispiele eine signifikant geringere Reaktivität als übliche Stärken aufweisen.

(Beispiel 17: Phosphorylierung der erfindungsgemäßen Glucane)

8 mg jedes der in Beispiel 2 und 8 erhaltenen Glucane wurden in 1 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 46 mg Phosphoroxychlorid umgesetzt. Zu der Reaktionslösung wurden 9 ml Aceton gegeben, um 8 mg jedes der phosporisierten Glucane zu erhalten.

(Beispiel 18: Einschlußeigenschaften (1) des erfindungsgemäßen Glucans)

Es ist bekannt, dass 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) eine extreme schwache Fluoreszenz in wässriger Lösung aufweist, jedoch eine starke Fluoreszenz nach Einschluß in den Hohlraum des Cyclodextrins aufweist. Um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäßen Glucane ANS einschließen, um dessen Fluoreszenz zu vergrößern oder nicht, wurden 20 mg von jedem der cyclischen Glucane mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, die in Beispiel 2 erhalten wurden, alpha-Cyclodextrin, Pullulan und Dextran einzeln in 1 ml eines 100 mM Phosphatpuffers aufgelöst. Nach Zugabe von 400 uM wässriger Lösung des ANS zu der Glucan- Lösung wurde gut gemischt und das Fluoreszenzspektrum der Lösung unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrophotometers bestimmt.
Wie in Fig. 12 gezeigt, wurde die Fluoreszenzstärke des ANS in Gegenwart des Pullulan oder Dextran, welche keine Einschlußeigenschaften aufweisen, nicht verstärkt, während die Fluoreszenzstärke des ANS in Gegenwart des alpha-Cyclodextrins, welches Einschlußeigenschaft aufweist, gesteigert wurde. Die Fluoreszenzstärke des ANS in Gegenwart des in Beispiel 2 erhaltenen Glucans wurde stärker gesteigert als in Gegenwart des alpha-Cyclodextrins, was darauf hinweist, dass die erfindungsgemäßen Glucane Einschluß-Eigenschaften gegenüber ANS aufweisen.

(Beispiel 19; Einschlußeigenschaften (2) des erfindungsgemäßen Glucans)

Jedes der in Beispiel 2 erhaltenen cyclischen Glucane mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen, kommerziell erhältliche Amylose und lösliche Stärke wurden einzeln in destilliertem Wasser aufgelöst, so dass die Konzentration 2% (w/v) betrug. Anschließend wurde 1/10 Volumen eines höheren Alkohols (1-Octanol etc.) oder einer höheren Fettsäure (Ölsäure etc.) zu der Lösung gegeben und kräftig vermischt. Die Erscheinung der Lösung wurde visuell wie folgt bewertet. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse. In Tabelle 6 weist (O) auf eine große Menge an gebildeten Präzipitat hin, ( ) weist auf eine kleine Menge an gebildeten Präzipitat hin und (X) weist darauf hin, dass kein Präzipitat gebildet wurde. Tabelle 6
Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde eine große Menge des weißen Präzipitats des in Beispiel 2 erhaltenen cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen erzeugt, was darauf hinweist, dass das erfindungsgemäße Glucan Einschlußeigenschaften aufweist.
(Beispiel 20: Sportgetränke, die die erfindungsgemäßen Glucane enthalten)
Ein Sportgetränk wurde unter Verwendung des erfindungsgemäßen Glucans durch Vermischen der folgenden Bestandteile in den in Tabelle 7 beschriebenen Anteilen hergestellt.

Tabelle 7

Natriumchlorid 0,3
Vitamin C 0,02
Natrium Vitamin B1 0,02
Magnesiumchlorid 0,2
Calciumlactat 0, 2
Zitronensäure 2,0
Natriumzitrat 1,5
Glucose 50
Wasser 1000
Cyclisches Glucan des Beispiels 2 100
Das resultierende Sportgetränk wies ausgezeichnete Verdau-Eigenschaften und hohe Effizienz beim Energieaustausch auf.

(Beispiel 21: Einschlußkomplex des erfindungsgemäßen Glucans und Linolsäure)

Zu 100 Teilen des in Beispiel 2 erhaltenen cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen wurden 900 Teile Wasser gegeben, es wurde gerührt und gelöst. Zu der Lösung wurden 100 Teile Linolsäure gegeben und gründlich gerührt. Nach dem Rühren wurde die so erzeugte Fraktion des weißen Präzipitates Gefrier-getrocknet, um das Pulver als Einschlußkomplex zu erhalten, weicher das erfindungsgemäße Glucan und Linolsäure aufweist.

(Beispiel 22: Einschlußkomplex aus dem erfindungsgemäßen Glucan und Menthol)

Zu 100 Teilen des in Beispiel 2 erhaltenen cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen wurden 900 Teile Wasser gegeben, es wurde gerührt und gelöst. Die Lösung wurde erhitzt. Ferner wurden 100 Teile des zuvor gelösten Menthols zugegeben und gut verrührt. Nach dem Rühren wurde die Fraktion des so erzeugten weißen Präzipitats Gefrier-getrocknet, um das Pulver des Einschlußkomplexes zu erhalten, welches das erfindungsgemäße Glucan und Methanol aufwies.

(Beispiel 23: Adhäsive Zusammensetzung, das erfindungsgemäße Glucan enthaltend)

Zu 40 Teilen des erfindungsgemäßen Glucans mit mindestens einer alpha-1,6-glykosidischen Bindung des Beispiels 8, wurden 60 Teile Wasser gegeben, es wurde erhitzt und gelöst. Die Lösung wies ausgezeichnete adhäsive Eigenschaften auf.

(Beispiel 24: Herstellung des erfindungsmäßgen cyclischen Glucans mit nur alpha-1,4-glykosidischen Bindungen)

1 g des Enzym-immobilisierenden Trägers Kitopearl BCW-3503 (Fuji Boseki, Inc.) wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und 130 Einheiten (5 ml) der gereinigten D-Enzymlösung, enthaltend einen 20 mM Tris-Puffer (pH 7) wurden bei langsamem Rühren und Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert, um das D-Enzym an den Träger zu adsorbieren. Die Reaktionslösung wurde filtriert. Als die D- Enzym-Aktivität des Filtrats gemessen wurde, konnte eine geringe D-Enzym-Aktivität nachgewiesen werden. Es ist daher davon auszugehen, dass der überwiegende Teil des D-Enzyms auf dem Träger immobilisiert wurde. Zu dem auf dem Träger immobilisierten D- Enzym wurden 10 ml einer 0,5% synthetisch synthetisierten Amylose (AS-30) Lösung gegeben und bei pH 7 und 30ºC für 24 Stunden umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde bei 100ºC für 5 Min. behandelt und nochmals zentrifugiert. Nach Zugabe von 10 Einheiten Glucoamylase zu dem Überstand und Umsetzen bei 50ºC für 3 Stunden wurde ein zehnfaches Volumen an Ethanol zu der Reaktionslösung gegeben, um ein cyclisches Glucan auszufällen. Das Präzipitat wurde Gefriergetrocknet, um 30 mg eines Glucan-Pulvers zu erhalten. Entsprechend dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde festgestellt, dass das so erhaltene cyclische Glucan nur alpha-1,4-glykosidische Bindungen aufweist.
Verschiedene weitere Änderungen werden dem Fachmann geläufig sein und können unmittelbar durchgeführt werden, ohne vom Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Es ist demgemäß nicht vorgesehen, dass der Umfang der nachfolgenden Ansprüche durch die hierin gegebene Beschreibung beschränkt wird, sondern dass die Ansprüche breit interpretiert werden.

Claims

1. Glucan, in dessen Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 α-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.

2. Glucan nach Anspruch 1, wobei das Glucan nur eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens 17 α-1,4-glykosidische Bindungen umfasst.

3. Glucan nach Anspruch 1, wobei in dem Glucan-Molekül eine cyclische Struktur vorliegt, die mindestens 17 α-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine α-1,6-glykosidische Bindung umfasst.

4. Glucan nach Anspruch 1, wobei das Glucan nur eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens 17 α-1,4-glykosidische Bindungen und mindestens eine α-1,6-glykosidische Bindung umfasst.

5. Glucan nach Anspruch 1, wobei das Glucan eine oder mehrere alkoholische Hydroxylgruppen aufweist, und wobei mindestens eine der alkoholischen Hydroxylgruppen derivatisiert wurde.

6. Glucan nach Anspruch 5, bei dem die Derivatisierung aus der Gruppe bestehend aus Veretherung, Veresterung, Vernetzung und auf Polymerisierung ausgewählt wurde.

7. Verfahren zur Herstellung eines Glucans oder dessen Derivates, das in seinem Molekül eine cyclische Struktur aufweist, die mindestens 17 α-1,4-glykosidische Bindungen umfasst, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man ein lineares α-1,4-Glucan oder ein Saccharid, welches das lineare α-1,4-Gucan umfasst, mit einem D-Enzym umsetzt und das Glucan oder dessen Derivat, welches in seinem Molekül eine in dem Reaktionsschritt gebildete cyclische Struktur aufweist, reinigt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem man den Reaktionsschritt in Gegenwart von Phosphorylase und Glukose-1-Phosphat durchführt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem man den Reaktionsschritt in Gegenwart eines Enzyms durchführt, das in der Lage ist, eine α-1,6-glykosidische Bindung zu spalten.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das lineare α-1,4-Glucan oder Saccharid mindestens eines aus der Gruppe bestehend aus Malto-Oligosaccharide, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Stärken, wachsartige Stärken, Stärken mit hohem Amylose-Gehalt, lösliche Stärken, Dextrine, unverzweigte Stärken, teilweise hydrolysierte Stärken, enzymatisch synthetisierte Stärken mit Phosphorylase und deren Derivate ausgewählt wurde.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das D-Enzym ein immobilisiertes Enzym ist.

12. Zusammensetzung zur Verwendung als mindestens einem aus Nahrungsmittel, Getränk oder Nahrungsmittelzusatzstoffen, die mindestens eine Verbindung umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus dem Glucan gemäß Anspruch 1 und dem Glucan gemäß Anspruch 5 ausgewählt wurde.

13. Infusionslösung, die mindestens eine Verbindung umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus dem Glucan gemäß Anspruch 1 und dem Glucan gemäß Anspruch 5 ausgewählt wurde.

14. Haftmittel, das mindestens eine Verbindung umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus dem Glucan gemäß Anspruch 1 und dem Glucan gemäß Anspruch 5 ausgewählt wurde.

15. Einschlussmaterial oder Adsorptionsmaterial, umfassend (a) mindestens eine Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus dem Glucan gemäß Anspruch 1 und dem Glucan gemäß Anspruch 5 ausgewählt wurde, und (b) eine Verbindung, die darin eingeschlossen oder daran adsorbiert wird.

16. Anti-Retrogradationsmittel, umfassend mindestens eine aus der Gruppe bestehend aus dem Glucan gemäß Anspruch 1 und dem Glucan gemäß Anspruch 5 ausgewählten Verbindung.

17. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem der Reaktionsschritt unter ausgewählten Bedingungen, darunter ein pH-Wert von etwa 3 bis etwa 10, eine Temperatur von etwa 10ºC bis etwa 90ºC und eine Substratkonzentration von etwa 0,1% bis etwa 30% durchgeführt wird und die Menge des D-Enzyms so gewählt wird, dass die Reaktion nach etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden beendet ist.