DE69216621T2

DE69216621T2 - Makrozyklische Seltener-Erden-Komplexe und deren Verwendung für die Reduzierung von Interferenzen in Fluoreszenzbestimmungsverfahren

Info

Publication number: DE69216621T2
Application number: DE69216621T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Lehn; Gerard Mathis; Christine Roth
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: AU2568092A; WO1993005049A1; JP3345417B2; US5457184A; DE69216621D1; FR2680787B1; FR2680787A1; EP0601113A1; JPH06510296A; ATE147391T1; ES2099280T3; EP0601113B1

Description

Die Erfindung betrifft makrocyclische Komplexe von Seltenerdmetallen, ein Verfahren zur Verminderung von Störungen bei einer quantitativen Bestimmung durch Fluoreszenz unter Einsatz dieser Komplexe sowie ihre Verwendung zur Verminderung von Störungen im Bestimmungsmedium bei Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann.
Die Anwendung von immunologischen Bestimmungen zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen in biologischen Fluids ist derzeit weit verbreitet.
Unter den verfügbaren Methoden haben die Bestimmungen durch Fluorimetrie eine zunehmende Bedeutung gewonnen.
Tatsächlich weisen sie eine gewisse Anzahl von Vorteilen auf, wie Empfindlichkeit, Schnelligkeit der Bestimmung, Stabilität und Unschädlichkeit der durch fluoreszierende Verbindungen markierten Reaktanten und relativ niedrige Kosten.
Es ist bekannt, daß die qualitativen Bestimmungsverfahren, bei denen die Fluoreszenz angewendet wird, von Natur aus sehr empfindlich sind und Nachweisgrenzen unterhalb der Nachweisgrenzen ermöglichen könnten, die durch immunologische Bestimmungen, bei denen radioaktiv markierte Reaktanten eingesetzt werden, erreicht werden, insbesondere durch Verwendung von modulierbaren Laserlichtquellen (I. Wieder, Immunofluorescence and related staining techniques, 1978, Elsevier).
Es sind bereits zahlreiche, fluoreszierende, als Tracer bei diesem Typ von Bestimmungen verwendbare Moleküle beschrieben worden, von denen die Seltenerdmetallkomplexe interessante Eigenschaften besitzen.
Die Verwendung bestimmter Komplexe, der Seltenerdmetallkryptate, ist in den Anmeldungen EP 0 180 492, PCT/FR 86 00269, EP 0 321 353 und PCT/FR 89 00562 beschrieben.
Diese Seltenerdmetallkryptate besitzen den Vorteil, daß sie in einem protein- und salzhaltigen Medium sehr stabil sind, wobei diese Eigenschaft in dem Falle von in homogenem System durchgeführten Immunoassays besonders wichtig ist.
Die Empfindlichkeit der Bestimmung kann allerdings durch Störungen verschiedener Art, die sich aus dem Vorliegen verschiedener Moleküle in dem Bestimmungsmedium ergeben, stark beeinflußt werden.
Dieses Problem ist besonders ausgeprägt im Falle von quantitativen Bestimmungen in Serummedien, in denen zahlreiche Moleküle enthalten sind, die Störungen hervorrufen können.
Das gemessene Signal kann beispielsweise durch die Emission von Molekülen gestört werden, die angeregt werden können und bei den gleichen Wellenlängen wie das als Tracer verwendete Molekül emittieren können.
Die Methoden der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung erlauben eine teilweise Behebung dieses Nachteils. Das Prinzip dieser Methoden besteht darin, daß die Messung der Fluoreszenz, die von einem Tracermolekül emittiert wird, das eine relativ lange Emissionslebensdauer aufweist, durchgeführt wird, wobei die Messung über die Emissionslebensdauer der anderen vorhandenen Moleküle hinaus verzögert wird.
In diesem Fall ist es notwendig, fluoreszierende Tracermoleküle mit relativ langer Lebensdauer, wie die Seltenerdmetallchelate, zu verwenden.
So beschreibt der Artikel von Prodi et al. in Chem. Phys. Letters, 1991, 180, 45-50, die Lumineszenz-Eigenschaften bestimmter Kryptate oder makrocyclischer Komplexe des Europiums.
Die Empfindlichkeit der Messung kann auch durch Störung durch Moleküle des Mediums beeinflußt werden, das die Änderung der Fluoreszenz stören kann, die sich aus der Bindung zwischen der zu analysierenden Substanz und dem markierten biospezifischen Reagens ergibt. Die Patentanmeldung EP 0 324 323 beschreibt die Verwendung eines Modulators, der das Seltenerdmetallchelat, das an das biospezifische Reagens gebunden ist, so stabilisiert, daß die gemessene Fluoreszenz tatsächlich eine Funktion der Konzentration der zu analysierenden Substanz ist. Dieser Modulator dient dazu, die Störung der Fluoreszenz des Seltenerdmetallchelates durch die anderen im Medium vorhandenen Moleküle zu hindern. Die Änderung der gemessenen Fluoreszenz ist dann eine Funktion der Antigen- Antikörper-Reaktion allein. Die vorgeschlagenen Modulatoren sind Makromoleküle, wie Proteine und Tenside und müssen im Bereich von 0,1 bis 10 g/l im Überschuß verwendet werden.
Das Problem der Störungen aufgrund von im Bestimmungsmedium vorhandenen Molekülen wird allerdings durch keine dieser Methoden vollständig gelöst. Tatsächlich liegt eine wichtige Ursache für die Begrenzung der Empfindlichkeit der Bestimmung durch Fluoreszenz in der Existenz von Löschprozessen ("Quenching") durch im Medium vorhandene Moleküle, die in der Lage sind, die Fluoreszenz des als Marker bei der Messung verwendeten fluoreszierenden Moleküls zu inhibieren. Im Falle von Komplexen von Seltenerdmetallen können diese Prozesse von Elektronenübertragungsmechanismen in unmittelbarer Nachbarschaft herrühren, bei denen das inhibitorische Molekül die freigebliebenen Koordinationsstellen im Komplex besetzt. Insbesondere können die Redoxreaktionen genannt werden, die zwischen dem fluoreszierenden Molekül in seinem Grundzustand oder in seinem angeregten Zustand und den im Medium vorhandenen Molekülen ablaufen. Diese Mechanismen können zu einer nicht vernachlässigbaren Änderung der emittierten Fluoreszenz führen.
Der Artikel von Weber et al., Clin. Chem., 1983, 29/9, 1665-1672, beschreibt den Einfluß insbesondere von durch Harnsäure bedingten Störungen, durch Harnsäure bei der qualitativen amperometrischen Bestimmung eines Tris(2',2'-bipyridin)-ruthenium(III)-Komplexes. Dieser Komplex entstammt der Redoxreaktion des entsprechenden Ru(II)-Komplexes, der in der Lage ist, einen Co(III)-Löschkomplex zu oxidieren. Die Harnsäure wurde als Reduktionsmittel für Ru(III) identifiziert und kann daher bei der Messung stören.
Dieser Redoxmechanismus aufgrund einer Elektronenübertragung zwischen einer fluoreszierenden Verbindung und einer Fluoreszenzlöscher-Verbindung wurde auch von Sabbatini et al., J.A.C.S., 1984, 106, 4055-4056, nachgewiesen. Dieser Artikel beschreibt insbesondere die Oxidation eines M(CN)&sub6;&sup4;&supmin;&supmin;Komplexes, in dem M für Eisen, Ruthenium oder Osmium steht, durch ein Europiumkryptat.
Die Inhibierung der Fluoreszenz durch Mechanismen, an denen eine Übertragung von Elektronen stattfindet, und allgemein durch Löschmechanismen, ist in der Praxis ein äußerst störendes Phänomen, da die inhibierenden Stoffe entweder von Natur aus als Bestandteile in dem Bestimmungsmedium vorhanden sein können (beispielsweise Harnsäure im Serum) oder auch als Zusatzstoffe oder Stabilisatoren für die Bestimmung hinzugegeben werden können.
Diese Inhibitoren beeinträchtigen die Fluoreszenz des Markermoleküls stark. Insbesondere im Falle von störenden Redoxreaktionen führt der Übergang eines Seltenerdmetallions vom reduzierten Zustand in den oxidierten Zustand über einen Redoxmechanismus zu einer Verminderung der Lebensdauer und zu einer Änderung des Emissionsspektrums des Komplexes, in dem dieses Metallion enthalten ist, der Art, daß die Empfindlichkeit der Messung stark beeinträchtigt wird.
Die Verwendung von Liganden des makrocyclischen Typs zur Chelatisierung der Ionen von Seltenerdmetallen wurde bereits in der Literatur beschrieben, insbesondere in den folgenden Veröffentlichungen: J. Phys. Chem. 1987, 91, 4681-4685, Inorg. Chem. 1983, 22, 3866-3869, Inorg. Chem. Acta 1984, 95n 119-125, Nucl. Med. Biol. 1986, 13 311-318, Comprehensive Coordination Chemistry 1987 Bd. 3, Ed. Pergamon Press., sowie in der Veröffentlichung in Helvetica Chimica Acta, 1990, 73, 1149-1162.
Obschon gewisse der beschriebenen Verbindungen in Wasser eine geringe Dissoziationsgeschwindigkeit aufweisen, reicht das Kriterium einer Stabilität in reinem Wasser nicht aus, da das Serum in Wirklichkeit zahlreiche Ionen und Proteine enthält, gewisse davon in hoher Konzentration, die mit dem Liganden um die Komplexierung des Seltenerdmetallions konkurrieren können.
Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß die makrocyclischen Seltenerdmetallkomplexe, die aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz, das durch eine makrocyclischen Verbindung komplexiert ist, die mindestens eine molekulare Einheit umfaßt, die eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions besitzt, und aus mindestens einem Stickstoffheterocyclus, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, bestehen, die vorteilhafte Eigenschaft aufweisen, gegenüber der Löschung der Fluoreszenz ("quenching") durch Hemmer, die in dem Bestimmungsmedium vorhanden sind, wesentlich weniger empfindlich zu sein als die bekannten makropolycyclischen und makrocyclischen Chelate und Komplexe und in biologischen Medien stabiler sind als die anderen bekannten makrocyclischen Komplexe und Chelate.
Aufgrund dieser Tatsache sind sie besonders zur Verwendung als Tracer bei einer quantitativen fluorimetrischen Bestimmung geeignet.
Nach einem ersten Aspekt sind demnach makrocyclische Komplexe von Seltenerdmetallen Gegenstand der Erfindung, die dadurch gekennzeichnet, daß
sie aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz bestehen, das durch eine makrocyclische Verbindung der Formel (I)
- komplexiert ist, worin bedeuten:
- die zweiwertigen Gruppen , und , die identisch oder voneinander verschieden sind, Kohlenwasserstoffketten, die ggf. ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wobei mindestens eine der Gruppen mindestens eine molekulare Einheit enthält oder im wesentlichen aus einer molekularen Einheit besteht, die eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist, mindestens eine der Gruppen aus einem ggf. substituierten Stickstoffheterocyclus besteht, wobei mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, und wobei eine der Gruppen oder nicht vorhanden sein kann;
- X&sub1; und X&sub2;, die identisch oder voneinander verschieden sind, Wasserstoff oder eine Kohlenwasserstoffkette (CH&sub2;)n, die ggf. durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10 ist, mit der Maßgabe, daß die Gruppen und unter den Bichinolinen, Biisochinolinen, Bipyridinen, Terpyridinen, Cumarinen, Bipyrazinen, Bipyrimidinen und Pyridinen ausgewählt sind, wenn die Gruppen und/oder einen Stickstoffheterocyclus bedeuten, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt.
Nach einem bevorzugten Aspekt bestehen die erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplexe von Seltenerdmetallen aus mindestens einem Selterdmetallsalz, das mit einer makrocyclischen Verbindung der obigen Formel (I) komplexiert ist, in der mindestens eine der zweiwertigen Gruppen und mindestens eine molekulare Einheit trägt oder im wesentlichen aus einer molekularen Einheit besteht, die eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist, und mindestens eine der Gruppen C und D aus einem Stickstoffheterocyclus besteht, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt.
Weitere vorteilhafte makrocyclische Komplexe von Seltenerdmetallen sind diejenigen, in denen mindestens eine der folgenden Bedingungen realisiert ist:
- die zweiwertigen Gruppen und sind identisch;
- die zweiwertigen Gruppen und sind identisch;
- X&sub1; und X&sub2; sind identisch;
mit der Maßgabe, daß die Gruppen und/oder unter den Biquinolinen, Biisochinolinen, Bipyridinen, Terpyridinen, Coumarinen, Bipyrazinen, Bipyrimidinen und Pyridinen ausgewählt sind, wenn die Gruppen und/oder einen Stickstoffheterocyclus bedeuten, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt.
Die molekularen Triplett-Energie-Donoreinheiten, die erfindungsgemäß geeignet sind, müssen eine Triplett-Energie besitzen, die über der Triplett-Energie der Emissionsniveaus des Seltenerdmetallions liegt oder ihr entspricht. Nach einem bevorzugten Aspekt liegt das Triplettniveau der molekularen Einheit über 17300 cm&supmin;¹.
Die erfindungsgemäß besonders bevorzugten molekularen Einheiten sind Phenanthrolin, Anthracen, die Bipyridine, Biquinoline, insbesondere die Biisochinoline, beispielsweise 2,2'-Bipyridin, die Terpyridine, Coumarine, Bipyrazine, Bipyrimidine, Azobenzol, Azopyridin, die Pyridine oder 2,2'-Biisoquinolin oder die Einheiten
Nach einem vorteilhaften Aspekt ist der Stickstoffheterocyclus, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, unter den Einheiten N-Oxypyridin, N-Oxybipyridin, Di-N-Oxybipyridin, N-oxy-biisochinolin, Di-(N-Oxy)- biisochinolin, N-Oxybipyrazin, Di-N-Oxybipyrazin, N-Oxybipyrimidin und Di-(N-Oxy)-bipyrimidin ausgewählt.
Weitere bevorzugte makrocyclische Komplexe sind diejenigen, in denen die molekulare Einheit eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist und der Stickstoffheterocyclus, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, eine einzige und identische Einheit sind.
Als Seltenerdmetallion, das in den erfindungsgemäßen Komplexen verwendbar ist, konnen insbesondere die Ionen des Terbiums, Europiums, Samariums und Dysprosiums eingesetzt werden. Vorzugsweise wird das Terbium oder Europium verwendet.
Die makrocyclischen Komplexe sind insbesondere als Fluoreszenzmarker für biologische Substanzen geeignet.
In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Komplexe an mindestens einer der Gruppen , , und der makrocyclischen Verbindung mit einer -CO-NH-Y-Z-Gruppe substituiert sein, worin bedeuten:
-Y eine Gruppe oder eine Spacergruppe, dieaus einer zweiwertigen organischen Gruppe besteht, die unter den linearen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylengruppen, die ggf. eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten und/oder ggf. durch ein oder mehrere Heteroatome, wie wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, unterbrochen sind, unter den C&sub5;-C&sub8;-Cycloalkylengruppen oder den C&sub6;-C&sub1;&sub4;-Arylengruppen ausgewählt ist, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen ggf. mit Alkylen-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
- Z eine funktionelle Gruppe, die dazu befähigt ist, eine kovalente Bindung mit einer biologischen Substanz einzugehen.
Mit "funktionelle Gruppe die dazu befähigt ist, eine kovalente Bindung mit einer biologischen Substanz einzugehen" wird in der vorliegenden Beschreibung jede funktionelle Gruppe bezeichnet, die in der Lage ist, mit mindestens einer der von Natur aus vorhandenen oder künstlich eingebauten Funktionen an der biologischen Substanz direkt oder nach Aktivierung eine kovalente Bindung einzugehen. Diese Funktionen sind insbesondere die Funktionen NH&sub2;, COOH, SH oder OH. Diese Gruppen sowie die Aktivierungsverfahren sind bei P. TIJSSEN in "Practice and Theory of Enzyme immunoessays", Elsevier 1985, ausführlich beschrieben, wobei der Artikel in der vorliegenden Beschreibung als Referenz eingeschlossen ist.
Als Beispiel für die funktionellen Gruppen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, können insbesondere die Amino-, Thio-, Cyano-, Isocyano-, Isothiocyano-, Thiocyano-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Maleimido-, Succinimido-, Mercapto-, Phenol-, Imidazol-, Aldehyd-, Epoxy-, Halogen-, Thionyl-, Sulfonyl-, Nitrobenzoyl-, Carbonyl-, Triazo-, Anhydrid-, Halogenacetat-, Hydrazino-, Acridingruppe etc. zitiert werden.
Die besonders bevorzugten Gruppen sind die Amino-, Thio- und Carboxygruppe, die vor der kovalenten Kupplung mit der biologischen Substanz aktiviert werden müssen, sowie die Maleimido-, Succinimido- und Isothiocyanatgruppe, die direkt an die biologische Substanz binden können.
Die erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplexe werden durch bekannte Verfahren hergestellt.
Die makrocyclischen Verbindungen werden durch die Verfahren hergestellt, die bei R. Ziessel et al., Helvetica Chimica Acta, 1990, 73, 1149, für die Makrocyclen, die Bipyridineinheiten umfassen, beschrieben sind. Die anderen Makrocyclen können durch die Verfahren hergestellt werden, die in der Schriftenreihe Supramolecular Chemistry, Springer Verlag Chemie, F. Fötger Hrsg, beschrieben sind. Man läßt anschließend die makrocyclische Grundeinheit mit einem Halogenderivat des Stickstoffheterocyclus in einem polaren aprotischen Lösungsmittel reagieren, wobei dieser zuvor oxidiert worden ist, insbesondere durch die Wirkung einer Persäure wie Metachlorperbenzoesäure.
Wird die Herstellung eines Komplexes gewünscht, in dem die Gruppen und/oder aus einem Stickstoffheterocyclus bestehen, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, so wird der Grundmakrocyclus hergestellt, der vorzugsweise bei seiner Synthese, wenn er in Form eines Tosylderivates vorliegt, mit einer Persäure wie Metachlorperbenzoesäure oxidiert wird. Die makrocyclische Tosylverbindung wird anschließend von der Schutzgruppe befreit und mit dem Halogenderivat der Gruppen und/oder umgesetzt.
Die Herstellung des Bipyridin-Makrocyclus, welche über eine Tosyl-Zwischenstufe verläuft, wird insbesondere in J. Org. Chem. 1983, 48, 1848, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplexe von Seltenerdmetallen können durch die klassischen Herstellungsverfahren für Metallkomplexe dargestellt werden, die darin bestehen, daß die komplexierende Verbindung mit einer Donorverbindung des zu komplexierenden Kations umgesetzt wird.
Die makropolycyclischen Komplexe können beispielsweise dargestellt werden, indem eine Seltenerdmetallkation-Donorverbindung mit der makropolycyclischen Verbindung, die die vorstehend definierten Charakteristika aufweist, umgesetzt wird, wobei jede Verbindung zweckmäßigerweise in Lösung, vorzugsweise in dem gleichen Lösungsmittel oder in kompatiblen, gegenüber der Komplexierung inerten Lösungsmitteln vorliegt. Im allgemeinen werden als Lösungsmittel Acetonitril oder Methanol, die zum Rückfluß erhitzt werden, verwendet.
Nach einem anderen ihrer Aspekte betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung von Störungen bei einer quantitativen Bestimmung durch Fluoreszenz unter Einsatz der zuvor beschriebenen makrocyclischen komplexe als Tracer, insbesondere wenn das Bestimmungsmedium ein biologisches Medium und insbesondere ein Serummedium ist.
Nach einem letzten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der hier vorstehend beschriebenen makrocyclischen Komplexe zur Verminderung der Störungen in dem Bestimmungsmedium bei Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung durch Fluoreszenz einer zu analysierenden Substanz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann.
Die Komplexe finden eine wichtige Anwendung bei den quantitativen immunologischen Bestimmungen durch Fluoreszenz sowie bei den genannten quantitativen Bestimmungsverfahren, als kompetitives oder Überschußverfahren, in homogener oder heterogener Phase, die in der bisherigen Technik beschrieben worden sind (Landon, Ann. Clin. Biochem., 1981, 18, 253 und E. SOINO et al., Clin. Chem. 1979, 25, 353).
In der vorliegenden Beschreibung ist definiert:
- "zu analysierende Substanz" als jede qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende Substanz oder Gruppe von analogen Substanzen;
- "Rezeptor" als jede Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an eine Stelle der zu analysierenden Substanz zu binden.
Nach einem bevorzugten Aspekt ist das Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz, bei dem die erfindungsgemßen Makrocyclen verwendet werden, ein homogenes Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Makrocyclen werden insbesondere bei einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, verwendet, welches die folgenden Schritte umfaßt:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, zu diesem Medium,
2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der unter der zu analysierenden Substanz oder mindestens einem ihrer Rezeptoren ausgewählt ist, wobei einer der beiden Reaktanten mit einer fluoreszierenden Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplex besteht, und der andere Reaktant an eine fluoreszierenden Akzeptorverbindung gekuppelt ist, wobei die Reihenfolge der Zugabe vertauscht werden kann,
3) Inkubation des resultierenden Mediums entweder nach der Zugabe jedes Reaktanten oder nach der Zugabe der beiden Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der Donorverbindung,
5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals im Gleichgewichtszustand oder als kinetische Bestimmung.
Die Komplexe können auch bei einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung durch Fluoreszenz einer zu analysierenden Substanz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, durch ein Überschußverfahren mit den folgenden Schritten verwendet werden:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, die mit einer fluoreszierenden Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem makrocyclischen erfindungsgemäßen Komplex besteht, zu diesem Medium, das die gesuchte, zu analysierende Substanz enthält,
2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus einem oder mehreren anderen Rezeptoren der zu analysierenden Substanz besteht, wobei der zweite Reaktant mit einer fluoreszierenden Akzeptorverbindung gekuppelt ist,
3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe der Reaktanten oder nach der Zugabe der beiden Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorverbindung durch eine Lichtquelle,
5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Bei dem obigen Überschußverfahren wird insbesondere ein einziger Rezeptor der zu analysierenden Substanz verwendet, der entweder an die fluoreszierende Donorverbindung oder an die fluoreszierende Akzeptorverbindung gekuppelt sein kann.
Nach einem vorteilhaften Aspekt werden die erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplexe bei einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, mit einem kompetitiven Verfahren mit den folgenden Schritten verwendet:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht und der an eine fluoreszierende Donorverbindung gebunden ist, die aus einem erfindungsgemäßen makrocyclischen Komplex besteht, zu dem Medium, das die gesuchte zu analysierende Substanz enthält,
2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der zu analysierenden Substanz besteht, die an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist,
3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe der Reaktanten oder nach der Zugabe der beiden Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorverbindung,
5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Die zuvor beschriebenen makrocyclischen Komplexe werden insbesondere bei einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, mit einem kompetitiven Verfahren mit folgenden Schritten verwendet:
1) Zugabe zu dem Medium, daßs die gesuchte zu analysierende Substanz enthält, eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, wobei der Rezeptor mit einer fluoreszierenden Akzeptorverbindung gekuppelt ist,
2) Zugabe der zu analysierenden Substanz als zweiter Reaktant, die mit einer fluoreszierenden Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem makrocyclischen erfindungsgemäßen Komplex besteht,
3) Inkubation des Mediums entweder nach der Zugabe eines jeden Reaktanten oder nach der Zugabe der beiden Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorverbindung,
5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Nach einem vorteilhaften Aspekt werden die erste Reaktante und die zweite Reaktante, die bei den oben angegebenen Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz verwendet werden, dem Medium, das die gesuchte zu analysierende Substanz enthält, gleichzeitig zugesetzt.
Vorzugsweise wird als fluoreszierende Donorverbindung ein makrocyclischer Komplex, in dem das Seltenerdmetallion Europium ist, und als fluoreszierende Akzeptorverbindung eine Verbindung, die unter Allophycocyanin, Allophycocyanin B, Phycocyanin C oder Phycocyanin R ausgewählt ist, verwendet.
Als fluoreszierende Donorverbindung kann auch ein makrocyclischer Komplex des Terbiums und als fluoreszierende Akzeptorverbindung eine Verbindung, die unter den Rhodaminen, Thionin, Phycocyanin R, Phycoerythrocyanin, Phycoerythrin C, Phycoerythrin B oder Phycoerythrin R ausgewählt ist, verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die keinerlei einschränkendes Merkmal aufweisen, besser verstanden.

Beispiel 1

Herstellung der makrocyclischen Verbindung der Formel (3):

Diese Verbindung wird gemäß nachstehendem Schema hergestellt:

a) Herstellung der Verbindung (1)

Ein Gemisch von 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (2,76 g, 15 mmol) und N-Bromsuccinimid (5,10 g, 28,6 mmol) wird in 150 ml Chloroform 30 min lang unter Rückfluß erhitzt. Sodann werden 30 mg Benzoylperoxid zugesetzt. Nun wird das Gemisch 2 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, anschließend zur Abtrennung des Succinimids filtriert.
Die Lösung wird auf 0 ºC abgekühlt, und der Feststoff, der sich absetzt, wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Es werden 1,65 g 6,6'-Bis(brommethyl)-2,2'-bipyridin in Form eines kristallinen, weißen Feststoffes erhalten. Das zuvor ausgehend von der Lösung in Chloroform erhaltene Filtrat wird konzentriert und über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Elutionsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH 98:2).
Es werden 1,38 g 6,6'-Bis(brommethyl)-2,2'-bipyridin, 0,55 g 6-Methyl-6'-brommethyl-2,2'-bipyridin (Schmelzpunkt: 88 ºC) und 0,9 g 6,6'-Bis(dibrommethyl)-2,2'-bipyridin erhalten.
0,5 g (1,9 mmol) 6-Methyl-6'-brommethyl-2,2'-bipyridin werden in 100 ml Chloroform aufgelöst, welches zuvor über Aluminiumoxid (Basic-activity I, Merck, USA) gegeben worden ist. Tropfenweise werden 1,2 g Metachlorperbenzoesäure (55%ig in H&sub2;O), d.h. 2 Äquivalente Säure auf ein Äquivalent des Bromderivates, in Lösung in 50 ml Chloroform zugegeben. Nach 4 Stunden werden tropfenweise 2 weitere Äquivalente Metachlorperbenzoesäure zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur wird zur Trockene eingedampft und unter Drehschieberpumpenvakuum getrocknet. Es wird fünfmal mit Äther gewaschen. 400 mg des erwarteten Produkts werden in Form eines blaßgelben Pulvers erhalten (Ausbeute: 71 %). Schmelzpunkt 125 ºC.

b) Herstellung der Verbindung (3)

Einem Gemisch, das 0,45 g (1,14 mmol) von Verbindung (2) (Bipyridin-Makrocyclus, beschrieben in J. Org. Chem., 1983, 48, 4848) und 3 g (17, mmol) Na&sub2;CO&sub3; in 300 ml frisch destilliertem MeCN enthält, werden unter einer Stickstoffatmosphäre unter Rühren und Rückfluß tropfenweise 1,1 g (3,70 mmol) der Verbindung (1) in Lösung in 200 ml CH&sub3;CN zugesetzt.
Das Rühren und Erhitzen unter Rückfluß werden während 24 Stunden beibehalten. Das Gemisch wird heiß filtriert, und das Filtrat wird unter Vakuum bei Umgebungstemperatur konzentriert. Das Rohprodukt wird in CHCl&sub3; (200 ml) in Lösung gebracht und dreimal mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Nach der Chromatographie über Aluminiumoxid (Elutionsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH 9:1) werden 400 mg des erwarteten Produkts in Form eines weißen Pulvers erhalten (Ausbeute: 42 %). Schmelzpunkt 235 ºC (Zersetzung).
¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;):
2,59 (2CH&sub3;); 4,21 (4CH&sub2;); 4,55 (2CH&sub2;); 7,09 (d, J = 7,3, 4H); 7,31-7,47 (m, 14H); 7,74 (d, J = 7,5, 4H); 8,22-8,27 (m, 2H);
¹³C-NMR-Spektrum (CD&sub3;OD):
18,1 (2CH&sub3;); 58,2 (2CH&sub2;); 62,0 (4CH&sub2;);
121,2; 124,9; 125,5; 127,7; 128,1; 128,5; 130,8; 139,3: (24H)
145,3; 145,4; 148,8; 150,4; 156,0; 159,9: (16C)
Elementaranalyse:
- berechnet für C&sub4;&sub8;H&sub4;&sub4;O&sub5;N&sub1;&sub0;.H&sub2;O (840,91)
C:68,55 H:5,27 N:16,66
- gefunden C:68,34 H:5,09 N:16,38

Beispiel 2

Herstellung eines makrocyclischen Europiumkomplexes (Makrocyclus: Verbindung (3) von Beispiel 1)

17 mg EuCl&sub3;.6H&sub2;O (4,6x10&supmin;&sup5; mol) werden unter Rühren einer Lösung von 37 mg von Verbindung (3) (4,5x10&supmin;&sup5; mol) in 15 ml Methanol bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Das Rühren wird während 48 Stunden unter Stickstoffatmosphäre beibehalten. Sodann werden 30 ml Et&sub2;O zugesetzt, worauf sich ein weißer Niederschlag bildet, der durch Zentrifugieren isoliert wird. Es werden so 50 mg (99 %) des erwarteten Produkts in Form eines weißen Pulvers erhalten.
Schmelzpunkt: 190 ºC (Zersetzung).
Massenspektrum FAB-MS (NBA):
1045,0 ([M+Eu+2Cl]&spplus;); 1010,1([M+Eu+2Cl)&spplus;); 994,1 ([M-O+Eu+Cl]&spplus;)
Elementaranalyse:
- berechnet für C&sub4;&sub8;H&sub4;&sub2;O&sub4;N&sub1;&sub0;.EUCl&sub3;.6H&sub2;O (1189,30)
C:48,47; H:4,57; N:11,78
- gefunden C:48,71; H:4,94; N:10,89

Beispiel 3

Herstellung eines makrocyclischen Terbiumkomplexes (Makrocyclus: Verbindung (3) von Beispiel 1)

12 g TbCl&sub3;.6H&sub2;O (3,2x10&supmin;&sup5; mol) werden einer Lösung von 25 mg von Verbindung (3) (3,04x10&supmin;&sup5; mol) in 15 ml Methanol bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wird unter Stickstoffatmosphäre 48 Stunden lang beibehalten. Sodann werden 30 ml Et&sub2;O zugesetzt, worauf sich ein weißer Niederschlag bildet, der durch Zentrifugation isoliert wird. Es werden so 33 mg (94 %) des erwarteten Produkts in Form eines gelben Pulvers gewonnen.
Schmelzpunkt: 190 ºC (Zersetzung).
Massenspektrum FAB-MS (NRA):
1050,9 ([M+Tb+2Cl&supmin;]&spplus;); 1014,9 ([M+Tb+Cl]&spplus;)
Elementaranalyse:
- berechnet für C&sub4;&sub8;H&sub4;&sub2;O&sub4;N&sub1;&sub0;.TbCl&sub3;.H&sub2;O (1106,19):
C:52,11; H:4,01; N:12,66
- gefunden C:51,83; H:4,22; N:12,28

Beispiel 4

Herstellung der makrocyclischen Verbindungen der Formeln (5) und (6)

Diese Verbindungen werden ausgehend von Verbindung (2) von Beispiel 1 gemäß nachstehendem Schema hergestellt.

a. Herstellung der Verbindung (4)

Ein Gemisch von 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-4,4'-dimethyldicarboxylat (4,4 g) und N-Bromsuccinimid (9,76 g) wird in 240 ml Tetrachlorkohlenstoff 30 min lang unter Rückfluß erhitzt.
Sodann werden 0,54 g 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt.
Die Lösung wird anschließend heiß filtriert und 12 Stunden lang bei 4 ºC gekühlt.
Der erhaltene Niederschlag wird eingedampft und über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Elutionsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/Hexan 50/50).
Es werden 2,06 g 6-Methyl-6'-brommethyl-2,2'-bipyridin-4,4'- dimethyldicarboxylat erhalten.
2,06 g (5,4 mmol) Dimethyl-6-methyl-6'-brommethyl-2,2'-bipyridin-4,4'-dicarboxylat werden in 200 ml Chloroform gelöst. Tropfenweise werden 3,35 g (0,1 mM) Metachlorperbenzoesäure in Lösung in 40 ml Chloroform zugegeben. Nach 12 Stunden wird tropfenweise eine Chloroformlösung zugegeben, die 6,7 g Metachlorperbenzoesäure enthält.
Nach 24 Stunden wird zur Trockene eingedampft und unter Drehschieberpumpenvakuum getrocknet. Es wird viermal mit 50 ml Ethylether gewaschen und über Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: CHCl&sub3;/Cyclohexan 90/10). 1,05 g des erwarteten Produkts werden erhalten (Ausbeute 47 %).

b. Herstellung der Verbindungen (5) und (6)

Ein Gemisch, das 48 mg (0,12 mM) von Verbindung (2) und 0,13 g (1,2 mM) Na&sub2;CO&sub3; in 150 ml CH&sub3;CN enthält, wird 30 min lang unter Rückfluß erhitzt.
Anschließend wird tropfenweise ein Gemisch zugegeben, das 100 mg (0,24 mM) von Verbindung (1) in Lösung in 50 ml CH&sub3;CN enthält.
Das Rühren und Erhitzen unter Rückfluß werden 24 Stunden lang beibehalten. Das Gemisch wird heiß filtriert und das Filtrat unter Vakuum konzentriert.

Beispiel 5

Herstellung der makrocyclischen Europiumkomplexe, deren Makrocyclen die Verbindungen (5) und (6) von Beispiel 4 sind

Dem in Beispiel 4 erhaltenen Rohprodukt werden 302 mg EuCl&sub3;.6H&sub2;O (0,82 mM) in 60 ml wasserfreiem Methanol zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt.
Die Lösung wird anschließend gekühlt und eingedampft. Das Reaktionsrohprodukt wird anschließend über eine Umkehrphasensäule in CH&sub3;CN/H&sub2;O/Trifluoressigsäure gereinigt.
Es werden erhalten:
- 18 mg makrocyclischer Komplexes (6)
- Massenspektrum FAB-MS (NBA):
1101 [M+Eu+2CF&sub3;COO&supmin;]
988 [M+Eu+CF&sub3;COO&supmin;]
- 29 mg makrocyclischer Komplex (5)
- Massenspektrum FAB-MS (NBA):
1431 [M+Eu+2CF&sub3;COO&supmin;]

Beispiel 6

Herstellung einer makrocyclischen Verbindung der Formel (7)

Diese Verbindung wird ausgehend von den Verbindungen (1) und (2) von Beispiel 1 und von Verbindung (4) von Beispiel 4 gemäß nachstehendem Schema hergestellt.
Einem Gemisch von 0,45 g (1,14 mM) von Verbindung (2) und 3 g (17 mM) Na&sub2;CO&sub3; in 150 ml CH&sub3;CN und 125 ml CH&sub2;Cl&sub2; werden unter Rückfluß und tropfenweise 0,55 g (1,8 mM) von Verbindung (1) in Lösung in 100 ml CH&sub3;CN zugesetzt.
Man beläßt 12 Stunden lang unter Rühren und Stickstoff. Das Gemisch wird heiß filtriert und unter Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wird über eine Aluminiumoxidsäule gereinigt. Es werden 207 mg des monosubstituierten Produktes erhalten.
Einem Gemisch von 0,20 g des monosubstituierten Produktes (0,23 mM) und 0,6 g (3,4 mM) Na&sub2;CO&sub3; in 60 ml CH&sub3;CN werden unter Rückfluß und tropfenweise 0,1 g der Verbindung (4) (0,24 mM) in Lösung in 20 ml CH&sub3;CN zugesetzt.
Die Lösung wird 24 Stunden lang unter Rühren und Rückfluß gehalten. Das Gemisch wird heiß filtriert und unter Vakuum konzentriert. Das Produkt wird mit Wasser gewaschen.
Es werden 57 mg der Verbindung (7) (0,05 mM) erhalten.

Beispiel 7

Herstellung eines makrocyclischen Europiumkomplexes, dessen Makrocyclus die Verbindung (7) von Beispiel 6 ist

Dieser Komplex wird, wie weiter oben in Beispiel 5 beschrieben, hergestellt.
Massenspektrum FAB-MS (NBA):
1161 [M+Eu+2Cl]
1126 [M+Eu+Cl]

Beispiel 8

Herstellung eines makrocyclischen Europiumkomplexes, dessen Makrocyclus die Verbindung der Formel (8) ist

Diese Verbindung wird ausgehend von dem Makrocyclus von Beispiel 7 durch eine Aminolysereaktion, wie sie in der Patentanmeldung EP 0 321 353 (siehe insbesondere Beispiel 3, Abschnitt B) beschrieben ist, erhalten. Kurz gesagt, wird der Makrocyclus einer Aminolyse unterworfen, indem er portionsweise zu 4 ml Ethylendiamin gegeben wird, das über zuvor auf 90 ºC erhitztes KOH destilliert worden ist. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird noch eine Stunde lang gerührt, anschließend auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Das überschüssige Ethylendiamin wird anschließend unter Vakuum entfernt, und es wird ein Öl erhalten. Letzteres wird in 2 ml eines Gemisches von Toluol/CH&sub3;OH (2/1) aufgenommen, welches seinerseits unter Vakuum entfernt wird. Es wird so ein beigefarbenes Pulver erhalten. Kolorimetrisch werden 1,8 NH&sub2; pro Mol Chelat nachgewiesen.

Beispiel 9

Beweis der Stabilität und Nichtempfindlichkeit oder des "Quenching" (Löschen) der makrocyclischen Europiumkomplexe der Beispiele 2, 5, 7 und 8

Die nachstehenden Bestimmungen wurden mit einem Spektrometer LS 5 von PERKIN-ELMER durchgeführt.
Die Bestimmung der Lebensdauer der getesteten Komplexe wurde folgendermaßen durchgeführt: Das Emissionsspektrum des zwischen 600 und 650 nm gelegenen Peaks wurde aufgenommen, wobei die Lösung auf einem der Absorptionspeaks angeregt wurde. Es wurde im "Phosphoreszenz"-Modus gearbeitet. Der Wert des Fensters wird auf 1 ms = tg festgelegt. Die Aufnahmen werden für mehrere Werte von td (Verzögerung), d.h. 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 und 0,5 ms, durchgeführt. Die Intensität It des Peaks wurde gemessen und τ durch die folgende Formel bestimmt:
Die Verbindungen wurden in Wasser und in Phosphatpuffer, 100 mM, pH 7,2, bei einer Konzentration an Komplex von etwa 10&supmin;&sup6; M/l getestet.
Die Komplexe, die die obigen makrocyclischen Verbindungen enthielten, wurden im Vergleich mit den Europiumkomplexen der Beispiele 2, 5, 7 und 8 getestet. Verbindung A: Verbindung B: Verbindung C: Verbindung D: Verbindung E:
Die Herstellung der Verbindungen A und B wird bei J. M. Lehn et al., Helvetica Chimica Acta, 1991, 74, 572, beschrieben; diejenige der Verbindung C wird bei R. Ziessel et al., Helvetica Chimica Acta, 1990, 73, 1149 beschrieben; diejenige der Verbindung D bei J. M. Lehn et al., Helvetica Chimica Acta, 1990, 73, 106, und diejenige der Verbindung E wird in der Patentanmeldung EP 0 180 492 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 nachstehend angegeben.
Die Bestimmungen in dem Serum wurden in menschlichem Serum, das mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, auf 1/3 verdünnt worden war, durchgeführt.
Die Lebensdauer (τ) wird in ms ausgedrückt. Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, daß, obwohl der größte Teil der getesteten Verbindungen in Phosphatpuffer stabil ist (Stabilität bewertet durch die Dauerhaftigkeit der Peakhöhe), allein die erfindungsgemäßen Komplexe gegenüber dem Phänomen des Quenching deutlich weniger empfindlich sind oder sogar eine Steigerung der Fluoreszenz in dem Serum, bezogen auf die in Wasser emittierte Fluoreszenz, zeigen.

Claims

1. Makrocyclische Komplexe von Seltenerdmetallen, dadurch gekennzeichnet, daß

sie aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz bestehen, das durch eine makrocyclische Verbindung der Formel (I)

komplexiert ist, worin bedeuten:

- die zweiwertigen Gruppen , , und , die identisch oder voneinander verschieden sind, Kohlenwasserstoffketten, die ggf. ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wobei mindestens eine der Gruppen mindestens eine molekulare Einheit enthält oder im wesentlichen aus einer molekularen Einheit besteht, die eine Triplett-Energie über der Triplett- Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist, mindestens eine der Gruppen aus einem ggf. substituierten Stickstoffheterocyclus besteht, wobei mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, und wobei eine der Gruppen oder nicht vorhanden sein kann;

- X&sub1; und X&sub2;, die identisch oder voneinander verschieden sind, Wasserstoff oder eine Kohlenwasserstoffkette (CH&sub2;)n, die ggf. durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10 ist,

mit der Maßgabe,daß die Gruppen und/oder unter den Bichinolinen, Biisochinolinen, Bipyridinen, Terpyridinen, Cumarinen, Bipyrazinen, Bipyrimidinen und Pyridinen ausgewählt sind, wenn die Gruppen und/oder einen Stickstoffheterocyclus bedeuten, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt.

2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der zweiwertigen Gruppen und mindestens eine molekulare Einheit enthält oder im wesentlichen aus einer molekularen Einheit gebildet ist, die eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist, und mindestens eine der Gruppen und aus einem Stickstoffheterocyclus besteht, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt.

3. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen und identisch sind.

4. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen und identisch sind.

5. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß X&sub1; und X&sub2; identisch sind.

6. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Triplett-Energie der molekularen Einheit über 17300 cm&supmin;¹ liegt

7. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Einheit ausgewählt ist unter Phenanthrolin, Anthracen, Bipyridinen, Bichinolinen, Terpyridinen, Cumarinen, Bipyrazinen, Bipyrimidinen, Azobenzol, Azopyridin, Pyridinen oder 2,2'-Biisochinolin oder den Einheiten

8. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Stickstoffheterocyclus unter den Einheiten N-Oxypyridin, N-Oxybipyridin, Di-(N-Oxy)-bipyridin, N-Oxy-biisochinolin, Di-(N-Oxy)-biisochinolin ausgewählt ist.

9. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Einheit, die eine Triplett-Energie über der Triplett-Energie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions aufweist, und der Stickstoffheterocyclus, in dem mindestens eines der Stickstoffatome eine Oxygruppe trägt, eine einzige und identische Einheit sind.

10. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdmetallion unter Europium, Terbium, Samarium und Dysprosium ausgewählt ist.

11. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen , , und mit einer Gruppe -CO-NH-Y-Z substituiert ist, worin bedeuten

- Y eine Gruppe oder eine Spacergruppe, die aus einer zweiwertigen organischen Gruppe besteht, die unter den linearen oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylengruppen, die ggf. eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten und/oder ggf. ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, in ihrer Kette enthalten, und den C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkylengruppen oder den C&sub6;&submin;&sub1;&sub4;-Arylengruppen ausgewählt ist, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppe ggf. mit Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind und

- Z eine funktionelle Gruppe, die dazu befähigt ist, eine kovalente Bindung mit einer biologischen Substanz einzugehen.

12. Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die makrocyclische Verbindung die Verbindung der folgenden Formel ist:

13. Verfahren zur Verminderung der Störungen bei der quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz, dadurch gekennzeichnet, daß als Tracer ein makrocyclischer Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 12 verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmungsmedium ein biologisches Medium ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmungsmedium ein Serum ist.

16. Verwendung eines makrocyclischen Komplexes eines Seltenerdmetalls nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verminderung der Störungen in dem Bestimmungsmedium eines Verfahrens zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann.

17. Verwendung nach Anspruch 16 in einem homogenen Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 oder 17 in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, mit folgenden Schritten:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, zu diesem Medium,

2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der unter der zu analysierenden Substanz oder mindestens einem ihrer Rezeptoren ausgewählt ist, wobei einer der beiden Reaktanten mit einer fluoreszierenden Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 12 besteht, und der andere Reaktant an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist, wobei die Reihenfolge der Zugabe der Reaktanten vertauscht werden kann,

3) Inkubation des resultierenden Mediums entweder nach Zugabe jedes Reaktanten oder nach Zugabe der beiden Reaktanten,

4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der Donorverbindung, und

5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals im Gleichgewichtszustand oder als kinetische Bestimmung.

19. Verwendung nach Anspruch 18 in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantiativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, durch ein Überschußverfahren mit folgenden Schritten

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht und der an eine fluoreszierende Donorverbindung gebunden ist, die aus einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 12 besteht, zu dem die zu analysierende Substanz enthaltenden Medium,

2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus einem oder mehreren weiteren Rezeptoren der zu analysierenden Substanz besteht, wobei der zweite Reaktant an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist,

3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe der Reaktanten oder nach Zugabe der beiden Reaktanten,

4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorverbindung mit einer Lichtquelle, und

5) Bestimmung des von der fluoreszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.

20. Verwendung nach Anspruch 18 in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, mit einem kompetitiven Verfahren mit folgenden Schritten:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht und der an eine fluoreszierende Donorverbindung gebunden ist, die aus einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 9 besteht, zu dem die zu analysierende Substanz enthaltenden Medium,

2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der zu analysierenden Substanz besteht, die an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist,

4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Donorverbindung, und

21. Verwendung nach Anspruch 18 in einem Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Fluoreszenz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, mit einem kompetitiven Verfahren mit folgenden Schritten:

1) Zusatz eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, zu dem die zu analysierende Substanz enthaltenden Medium, wobei der Rezeptor an eine fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist,

2) Zugabe der zu analysierenden Substanz als zweiter Reaktant, die an eine fluoreszierende Donorverbindung gebunden ist, die aus einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 9 besteht,

3) Inkubation des Mediums nach Zugabe jedes Reaktanten oder nach Zugabe der beiden Reaktanten,

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Reaktant und der zweite Reaktant gleichzeitig dem Medium zugesetzt werden, das die zu analysierende Substanz enthält.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein einziger Rezeptor der zu analysierenden Substanz verwendet wird, der entweder an die fluoreszierende Donorverbindung oder an die fluoreszierende Akzeptorverbindung gebunden ist.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdmetallion des makrocyclischen Komplexes, der als fluoreszierende Donorverbindung verwendet wird, Europium ist, und dadurch, daß die fluoreszierende Akzeptorverbindung unter Allophycocyanin, Allophycocyanin B, Phycocyanin C oder Phycocyanin R ausgewählt ist.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdmetallion des makrocyclischen Komplexes, der als fluoreszierende Akzeptorverbindung verwendet wird, Terbium ist und dadurch, daß die fluoreszierende Akzeptorverbindung unter den Rhodaminen, Thionin, Phycocyanin R, Phycoerythrocyanin, Phycoerythrin C, Phycoerythrin B oder Phycoerytrin R ausgewählt ist.