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JPH06510296A - 巨環状希土類錯体，それを用いた螢光分析における干渉低減方法およびそれを用いて螢光分析における干渉を低減させる使用方法 - Google Patents

巨環状希土類錯体，それを用いた螢光分析における干渉低減方法およびそれを用いて螢光分析における干渉を低減させる使用方法

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JPH06510296A
JPH06510296A JP5504996A JP50499693A JPH06510296A JP H06510296 A JPH06510296 A JP H06510296A JP 5504996 A JP5504996 A JP 5504996A JP 50499693 A JP50499693 A JP 50499693A JP H06510296 A JPH06510296 A JP H06510296A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 互層状希土類錯体、それを用いた螢光分析における干渉低減方法およびそれを用 いて螢光分析における干渉を低減させる使用方法この発明は、互層状希土類錯体 、その互層状希土類錯体を用いて螢光分析における干渉を低減する方法、および 、測定媒質中に存在する可能性がある被検体（ａｎａｌｙｔｅ）を螢光を利用し て検出および／または定員するにあたって測定媒質中における干渉を低減すべく その互層状希土類錯体を使用する方法に関する。
現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析あるいは定量分析に広く用 いられている。現行の技術にあっては、螢光定量分析が益々重要になってきてい る。実際に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行えること、螢光 化合物により標識化された試薬が安定していて安全であること、比較的低コスト で行えること等の多くの利点がある。
螢光を利用する検出方法は、本質的に非常に高感度であり、特に、変調可能なレ ーザ光源を使用する場合には、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出 下限をより低くすることができるもノテあることが知られている（１．　Ｗｉｅ ｄｅｒ、　”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅ−ｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅ ｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″、　１９７８．　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ）。
斯かる方式の分析においてトレーサとして用いることができる多数の螢光分子が 既に書物に記述されており、それらの中で、希土類錯体が極めて有用な特性を有 している。そして、希土類錯体のうちの特定のものとして希土類クリプテートを 用いる分析が、ヨーロッパ特許出願：　ＨＰ　０１８０４９２．国際特許比＠　 ：　ＰＣＴノＦＲ８６１００２６９、ヨーロッパ特許出願：　ＥＰ　０３２１３ ５３．国際特許出願：　ＰＣＴ／ＦＲ８９１００５６’２等に記載されている。
希土類クリブテートは、含塩蛋白質媒質中において非常に安定であるという利点 を有しており、斯かる特性は、均質免疫分析の場合において格別に重要である。
このようなもとにあっても、測定感度は、測定媒質中における様々な分子の存在 に起因する各種の摂動によって左右されるところが大なるものとされる。この問 題は、干渉を生じ得るものとされる多数の分子が存在する血清媒質中における分 析の場合にとりわけ深刻である。例えば、測定対象信号は、励起され得る状態に おかれ、しかも、トレーサとして用いられている分子と同じ波長の光を発し得る ものとされた分子からの発光による干渉を受けるものとされる。
これに対し、螢光測定にあたって時分割法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｍｅ −ｔｈｏｄ）をとることにより、上述の不都合を部分的に解消することができる 。この方法の原理は、比較的長い発光寿命を有したトレーサ分子が発する螢光を 他の存在分子の発光寿命が尽きた後に測定することにある。そして、斯かる場合 には、希土類キレートの如くの比較的長い寿命を有した螢光トレーサ分子を用い ることが必要とされる。
プロディ／他（Ｐｒｏｄｉ　ｅｔ　ａｌ、）による論文：　Ｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓ 。
（、ｅ（ｔｅｒｓ、１９９１．１８０．４５−５０には、ある種のユーロピウム ・クリブテートもしくは互層状ユーロピウム錯体の螢光特性について記述されて いる。
また、測定感度は、検出されるべき被検体と標識生体特異試薬との間の結合に起 因して発せられる螢光の変化に摂動を生じさせ得るものとされた、媒質中の分子 からの干渉の影響も受けるものとされる。それに対して、ヨーロッパ特許出願： 　ＨＰ　Ｏ３２４３２３には、生体特異試薬と結合した希土類キレートを安定化 させる変調因子を用い、測定対象とされる螢光の変化が実質的に被検体の濃度の 関数となるようになすことが記載されている。この変調因子の効果により、希土 類キレートが発する螢光が媒質中に存在する他の分子によって摂動を生しるもの とされることが禁止され、その結果、測定対象とされる螢光の変化が、抗原抗体 反応のみの関数とされる。変調因子として提案されているものとしては、蛋白質 、清浄剤等の巨大分子があり、それらは、０．１〜１０ｇ／ｌの範囲を越えるも のとされて用いられる。
斯かる状況にもかかわらず、測定媒質中に各種の分子が存在することに起因する 摂動の問題は、上述の如くの方法のいかなるもによっても、十分に解消すること はできない。実際、螢光測定の感度を制限する元となっているものは、分析マー カーとして用いられる螢光分子の発光を抑制することになる、媒質中に存在する 分子による消光作用である。希土類錯体の場合にあっては、斯かる消光作用は、 螢光抑制分子が錯体中において自由な状態におかれた配位部位を占めるものとさ れる電子伝達メカニズムに起因するものとなる。特に、基底状態もしくは励起状 態にある螢光分子と媒質中に存在する分子との間で行われる酸化還元反応が指摘 され、これらのメカニズムは、発せられた螢光に無視できない変化を与える。
ウェーバ−／他（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）による論文：Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ ｕ＋、。
１９８３、２９／９．１６６５〜１６７２には、トリス（２°、２゛　−ジピリ ジン）ルテニウム−（ＩＩＩ）錯体についての電流滴定検出における、特に、尿 酸による摂動の影響について記載されている。ここで述べられている錯体は、Ｃ ｏ　（Ｉｌｌ）消光錯体を酸化することができることになる、対応するＲｕ（Ｉ Ｉ）錯体の酸化還元反応によって生成される。そして、尿酸は、ＲＵ　（ＩＩＩ ）に対する還元剤として扱われており、それゆえ、測定に干渉するものとなる。
斯かる螢光化合物と消光化合物との間の電子伝達による酸化還元メカニズムは、 サバテイー二／他（５ａｂｂａｔｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）　による論文　Ｊ、　 Ａ、　Ｃ，Ｓ、、　１９８４．１０６．４０５５〜４０５６　において論証され ている。この論文にあっては、Ｍ　（ＣＮ）＠’−錯体のユーロピウム・クリブ テートによる酸化について、特に、詳細に記述されており、そのなかで、Ｍは、 鉄、ルテニウムあるいはオスミウムである。
電子伝達を含んだメカニズムおよび通常の消光メカニズムによる螢光の抑制は、 実際に際しては極端に面倒な現象である。なぜなら、抑制要因は、例えば、血清 中における尿酸の如くに、測定媒質中にその成分として本来存在するもの、ある いは、分析１こあたっての添加剤あるいは安定剤として加えられるものとされる 力１らである。
このような抑制剤は、マーカー分子が発する螢光に大なる影響を与える。特に、 寄生酸化還元反応にあっては、酸化還元メカニズムによる希土類イオンの還元状 態から酸化状態の転換力く、希土類イオンを含む錯体の寿命を短縮するとともに 希土類イオンを含む錯体の発光スペクトラムを変化させ、それにより、測定感度 （こ大なる影響を及ぼす。
希土類イオンをキレート化すべく互層型の配位子を用いることについては、文献 に記載されているところであり、斯かる文献としては、特に、以下の刊行物が挙 げられる。
Ｊ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、、　１９８７．９１．４６８１〜４６８５．　ｌ ｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｎ、、１９８３゜２２、３８６６〜３８６９．　Ｉｎｏｒｇ 、　Ｃｈｅｍ、　Ａｃｔａ、　１９８４．９５ｎ、　１１９〜１２５゜Ｎｕｃｌ 、　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ、、　１９Ｂ６．１３．３１１〜３１Ｂ、バーガモン　 プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）による発行の　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ ｉｖｅ　Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８７．　ｖｏｌ 、　３　、および、）ＩｅｌｖｅＬｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ。
１９９０、７３．１１４９〜１１６２゜これらの文献に記載された化合物のうち の幾つかは、水中において低解離度を呈するが、血清は実際には多数のイオンお よび蛋白質を含んでおり、それらのうちの幾つかは、高濃度であって、希土類イ オンを錯化する配位体に匹敵するものであるので、純水中における安定度の尺度 は当てはまらない。
従来にあっては予期されていなかったことであるが、この発明によって、錯化さ れた希土類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有する少な くとも一つの分子単位と、窒素原子のうちの少なくとも一つが酸素を担うものと された少なくとも一つの窒素含有複素環系とを含む巨環状化合物により錯化され た少なくとも一つの希土類塩から成る互層状希土類錯体は、従来知られているキ レート類および巨大多環状および互層状錯体に比して、測定媒質中に存在する抑 制因子よる消光作用がほとんど見られないという優れた特性を有しており、生体 媒質中において他の従来知られている互層状錯体およびキレート類より一段と安 定であることが見出された。それゆえ、斯かる互層状希土類錯体は、螢光定量分 析におけるトレーサとしての使用に格別に適している。
この発明は、先ず、式（１）によってあられされる巨環状化合物によって錯化さ れた少なくとも一つの希土類塩から成る互層状希土類錯体に関する。
ここで、二価の基■、■、■および■は、同一であっても相違してもよく、一つ もしくは複数のへテロ原子を任意に含有した炭化水素鎖てあり、これらの基■、 ■、■および■のうちの少なくとも一つが、錯化された希土類イオンの発光準位 のエネルギより大なる三重項エネルギを有する少なくとも一つの分子単位を含有 するか、あるいは、本来、錯化された希土類イオンの発光準位のエネルギより大 なる三重項エネルギを■のうちの少なくとも一つが、窒素原子のうちの少なくと も一つがオキシ基（ＯＸＹ　ＧＲＯＵＰ）を担うものとされた窒素含有複素理系 から成り、さらには、基○および■のうちの一つは無くてもよいものとされ、　 また、ＸｌおよびＸ２は、同一であっても相違してもよく、水素、または、一つ もしくは複数のへテロ原子が介在せしめられた炭化水素鎖（ＣＨ、）ｎてあって ｎが１かおよび／または■が、ビキハン、ビイソキノリン、ビピリジン、チルピ リジン、クマリン、ビビラジン、ビビリミジンおよびピリジンのなかから選ばれ るものとされる。
この発明に係る互層状希土類錯体の好ましい例は、上記の式（Ｉ）によりあられ され、二価の基■および■のうちの少なくとも一方が、錯化された希土類イオン の発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有する少なくとも一つの分子 単位を含有するか、あるいは、本来、錯化された希土類イオンの発光準位のエネ ルギより大なる三重項エネルギを有する分子単位から成るものとされ、また、二 価の基■および■のうちの少なくとも一方が、窒素原子のうちの少なくとも一つ がオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系から成るものとされた巨環状化 合物により錯化された少なくと一つの希土類塩から成るものとされる。
この発明に係る互層状希土類錯体の他の好ましい例は、上記の式（Ｉ）によりあ られされ、基■および／または■が、窒素原子のうちの少なくとも一つがオキシ 基を担うものとされた窒素含有複素環系である場合には、基■および／または■ が、ビキノリン、ビイソキノリン、ビピリジン、チルピリジン。
クマリン、ヒピラジン、ビビリミジンおよびピリジンのなかから選ばれるものと されたもとで、以下の条件のうちの少なくとも一つを満たすものとされる。
・　二価の基■および■が同じもの； ・　ＸｌおよびＸ２が同しもの。
この発明に係る互層状希土類錯体に適した三重項エネルギドナー分子単位は、希 土類イオンの発光準位のエネルギ以上の三重項エネルギを有していなければなら ない。好ましくは、三重項エネルギドナー分子単位の三重項準位は１７，３００ 　ｃＩ−’より大とされるのがよい。
特に好ましい分子単位は、フェナントロリン、アントラセン。
ビピリジン、および、特に、ビスイソキリン等のビキノリン、例えば、ビキノリ ンなどのビキノリン、例えば、２，２゛　−ビピリジン、チルピリジン、クマリ ン、ビピラジン、ビビリミジン、アゾベンゼン、アゾピリジン、ピリジンまたは ２．２゛　−ビスイソキノリン、もしくは、下記の単位である。
この発明に係る互層状希土類錯体における、窒素原子のうちの少なくとも一つが オキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系は、次の単位のなかから選ばれる 。
ピリジン　Ｎ−オキサイド、ビピリジン　Ｎ−オキサイド。
ビピリジン　ジ−Ｎ−オキサイド、ビスイソキノリン　Ｎ−オキサイド、ビスイ ソキノリン　ジ−Ｎ−オキサイド、ビピリジン　Ｎ−オキサイド、ビピリジン　 ジ−Ｎ−オキサイド、ビビリミジン　Ｎ−オキサイド、および、ビビリミジン　 ジ−Ｎ−オキサイド。
この発明に係る巨環状化合物のさらに他の好ましい例は、上記れた希土類イオン の発光準位のエネルギより大なる三重項エネルうちの少なくとも一つがオキシ基 を担うものとされた窒素含有複素環系とを、同一の単位とする。
斯かる互層状希土類錯体に用いられ得る希土類イオンとしては；テルビウム・イ オン、ユーロピウム・イオン、サマリウム・イオンおよびジスプロシウム・イオ ンが挙げられる。とりわけ、テルビウム・イオンもしくはユーロピウム・イオン が好ましい。
この発明に係る互層状希土類錯体は、生物学的物質用の螢光マーカーとするに特 に好適である。そして、この発明に係る互層状希土類錯体にあっては、生物学的 物質用の螢光マーカーとすべく、によって置換することができる。斯かる基にお いて、・Ｙは、一つもしくは複数の二重結合を含むもの、および／または、一つ もしくは複数の、酸素、窒素、硫黄または燐の如くのへテロ原子を介在させた線 状のまたは枝分かれしたｃｌがらＣ２゜まてのアルキレン基、Ｃ６からＣ８まで のシクロアルキレン基、および、Ｃ６からＣｌ　１まてのアリレン基のうちから 選択された二価の有機基から成るスペーサ基もしくはスペーサアームであって、 上述のアルキレン基、シクロアルキレン基もしくはアリレン基は、アルキル基、 アリル基またはスルホネート基によって置換されるものとされ、 ・Ｚは、生物学的物質との共有結合が可能である官能基である。
この発明の説明において、“生物学的物質との共有結合が可能である官能基”と いう表現は、直接に、または、活性化後、天然に存在する、もしくは、人工的に 生物学的物質に導入された官能基の少なくとも−っと共有結合できるあらゆる官 能基を意味する。
このような官能基として代表的なものは、ＮＨ２基、Ｃ０ＯＨ基。
ＳＨ基あるいはＯＨ基である。このような基は、ピー、ティーセン（Ｐ、　Ｔｉ ｊｓｓｅｎ）によって、′酵素免疫測定法の実際と理論（Ｐｒａ−ｃｔｉｃｅ　 ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　）” 、エルセヴイール、　＋９８５．に詳細に記されており、この文献における記載 事項の一部が、この発明の説明のためここに引例されている。
上述のＺとして用いるに適した官能基の例として、特に挙げられるのは、アミノ 基、ヂオ基、シアノ基、イソノアノ基、イソチオノアノ基、チオノアノ基、カル ボキシル基、ヒドロキシル基。
マレイミド基、スフノンイミド基、メルカプト基、フェノール基、イミダゾール 基、アルデヒド基７エポキサイド基、ハライド基、チオニル基、スルホニル基、 ニトロベンゾイル基、カルボニル基、トリアゾ基、アンヒドライド基、ハロゲノ アセテート基。
ヒドラジノ基、アクリジン基、その他の基である。
とりわけ好ましい基は、アミノ基、チオ基およびカルボキシル基（これらは生物 学的物質に共有結合する前に活性化することが必要である）、さらには、マレイ ミド基、スクシンイミド基およびイソチオンアナート基（これらは直接的に生物 学的物質と結合できる）である。
そして、この発明に係る互層状希土類錯体は、従来知られた手順を経て調製され る。また、この発明に係る巨環状化合物は、アール・チーセル／他（Ｒ，Ｚｉｅ ｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ）によるビピリジン単位を含んで成る互層状体に関する文 献：　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ。
＋９９０．７３．　１１４９　に記載されている技術によって得られる。また、 エフ・フェクテル（Ｆ、　Ｆ６ｇｔｅｒ）による超分子化学（Ｓｕｐｒａｌｎｏ ｌｅｃｕ−Ｉａｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）と題された一連の文献：　Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅ−ｍｉｅに記載された技術によっても得られる 。
そして、得られた凹環状単位基体が、有極性非プロトン性溶媒中において、メタ クロロ過安息香酸の如くの過酸との反応により予め酸化された、窒素含有複素環 系のハロゲン化誘導体と反応せものとされた窒素含有複素環系から成るものとさ れるのであれば、得られた凹環状単位基体は、好ましくはトシル化誘導体とされ るものとなされてその合成中に、メタクロロ過安息香酸の如くの過酸によって酸 化される。そして、トンル化された巨環状化合物が、ロゲン化誘導体と反応せし められる。
トシル化された中間生成物を経てビピリジン巨環状体を得ることについては、文 献：　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ＋ｏ、、　１９８３．４８．１８４８　に記載さ れている。
この発明に係る計理状希土類錯体は、錯化する化合物と錯化されるべき陽イオン を提供するドナー化合物とを反応させることにより成る、金属錯体を得るための 従来知られた手順によって調製される。例えば、希土類陽イオンを提供するドナ ー化合物を上述された特性を有する計理状化合物と、両者が夫々錯体生成に対し て不活性なものとされた同じもしくは同等の溶媒中に在る状態で反応させること により、この発明に係る計理状希土類錯体を得ることができる。斯かる際におけ る溶媒としては、一般的に、アセトニトリルあるいはメタノールが用いられ、還 流点まで加熱される。
また、この発明は、上述の計理状希土類錯体をトレーサとして用いることにより 、螢光分析、特に、測定媒質が生体媒質、具体的には、血清媒質とされる螢光分 析における干渉を低減させる方法に関する。
さらに、この発明は、測定媒質中に存在する可能性がある被検体を螢光を利用し て検出および／または定量するにあたって測定媒質中における干渉を低減すべく 、上述の計理状希土類錯体を使用する方法にも関する。
この発明に係る計理状希土類錯体、文献（Ｌａｎｄｏｎ、　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８１．１８．２５３およびＥ、　５ＯＩＮＩ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、。
１９７９、２５．３５３）に記載されている如くの、均質相あるいは不均質相中 における螢光免疫分析、所謂、競争分析あるいは過剰分析に適用されることに大 なる意味がある。
本願の記載においては、“被検体（ａｎａｌｙｔｅ）″は、検出および／または 測定の対象とされる物質あるいは類似する物質群を意味し、また、“レセプタ（ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）″は、特に被検体の一部に結合することができる物質を意味 する。
望ましくは、この発明に係る計理状希土類錯体が用いられたもとで被検体の検出 および／または定量を行なう方法は均質方法とされる。
この発明に係る計理状希土類錯体は、測定媒質中に存在する可能性がある被検体 を螢光を利用して検出および／または定量する方法の実施にあたって用いられ、 その被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う方法は、 ■）媒質に、被検体に対する少なくとも一つのレセプタを含んで成る第１の試薬 を添加するステップ；２）媒質に、被検体および少なくとも一つのレセプタのう ちから選択された第２の試薬を添加するステップ；３）第１および第２の試薬の 夫々が添加された後、あるいは、第１および第２の試薬の両者が添加された後、 得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ；　および、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状 態のもとで測定するステップ；を含み、第１および第２の試薬のうちの一方がこ の発明に係る計理状希土類錯体から成る螢光ドナー化合物と結合しているものと されるとともに、第１および第２の試薬のうちの他方が螢光アクセプタ化合物と 結合しているものとされ、また、第１の試薬を添加するステップと第２の試薬を 添加するステップとは順序が可逆とされるものとなされる。
また、この発明に係る計理状希土類錯体は、測定媒質中に存在する可能性がある 被検体の検出および／または定量を、以下の１）〜５）の各ステップを含むもの とされる過剰分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行う方法の実施にあ たって用いられる。
ｌ）被検体を含む媒質に、被検体に対する少なくとも一つのレセプタから成り、 この発明に係る計理状希土類錯体から成る螢光ドナー化合物と結合した第１の試 薬を添加するステップ：２）媒質に、被検体に対する一つもしくは複数の他のレ セプタから成り、螢光アクセプタ化合物と結合している第２の試薬を添加するス テップ。
３）第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１および第２の 試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベーよされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光源からの光によって励起するステップ、　および、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
上述の過剰分析方法は、螢光ドナー化合物もしくは螢光アクセプタ化合物のいず れかと結合する、被検体に対する単一のレセプタを用いるものともされる。
この発明に係る計理状希土類錯体は、測定媒質中に存在する可能性がある被検体 の検出および／または定量を、以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされ る競争分析方法の助けを得たちとて、螢光を利用して行う方法の実施にあたって 用いられる。
ｌ）被検体を含む媒質に、被検体に対するレセプタであって、この発明に係る計 理状希土類錯体から成る螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステ ップ；２）媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した被検体から成る第２の試薬 を添加するステップ； ３）第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１および第２の 試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ： ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ；　および、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
さらに、この発明に係る計理状希土類錯体は、測定媒質中に存在する可能性があ る被検体の検出および／または定量を、以下の１）〜５）の各ステップを含むも のとされる競争分析方法の助けを得たちとて、螢光を利用して行う方法の実施に あたって用いられる。
■）被検体を含む媒質に、被検体に対するレセプタであって、螢光アクセプタ化 合物と結合している第・１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、この発明に係る互層状希土類錯体がら成る螢光ドナー化合物と結合 している被検体を、第２の試薬として添加するステップ： ３）第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１および第２の 試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ；　および、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
この発明において、好ましくは、上述の被検体の検出および／または定量を螢光 を利用して行う方法において用いられる第１の試薬および第２の試薬が、被検体 を含む媒質に同時に添加される。
また、この発明に係る好ましい例にあっては、用いられる螢光ドナー化合物が希 土類イオンをユーロピウムとする互層状錯体とされるとともに、用いられる螢光 アクセプタ化合物が、アロフィコシアニン、アロフィコンアニンＢ、フィコシア ニンＣおよびフィコシアニンＲの中から選択されたものとされる。
さらに、他の好ましい例にあっては、用いられる螢光ドナー化合物が互層状テル ビウム錯体とされるとともに、用いられる螢光アクセプタ化合物が、ローダミン 、チオニン、フィコシアニンＲ。
フィコエリトロンアニン、フィコエリトリンＣ，フィコエリトリンＢおよびフィ コエリトリンＲの中から選択された化合物とされる。
この発明は、下記に述べられる、発明を制限するものではない実施例が参照され ることにより、一層明瞭に理解される。
式（ＩＩ＋）によりあられされる互層状化合物は、下記に従って調製される。
ａ）化合物（１）の調製 ６．６゛−ジメチル−２，２′−ビピリジン（２，７６ｇ、　１５ａｕｎｏｌ） とＮ−プロモスクシンイミド（５，１０ｇ、　２８．６＋＋ｏ＋＋ｏｌ　）との 混合溶液が、　１５００１１のクロロフォルム中において３０分間還流され、そ れに、３０ｍｇのベンゾイル過酸化物が加えられる。そして、混合溶液はさらに ２時間還流され、その後、濾過されてスクシンイミドが分離される。
続いて、溶液は、０℃まで冷却され、析出した固形物が濾過分離されてメタノー ルによって洗浄される。　１．６５ｇの６．６°−ビス（ブロモメチル）−２， ２°−ビピリジンが、白色固形結晶の形で回収される。クロロフォルム溶液から 上述の如くにして得られる濾過生成物は、イオン交換樹脂柱（ｅｌｕｅｎｔ：　 ＣＨｚＣＩｉ／ＭｅＯ１ｌ　９８：２）を用いたイオン交換クロマトグラフィに よって濃縮分離される。
これにより、　！、　３８ｇの６．６゛−ビス（ブロモメチル）−２，２’−ビ ピリジン、０．５５ｇの６−メチル−６゛−ブロモメチル−２，２゛−ビピリジ ン（融点＝８８℃）、および、０．９ｇの６，６′−ビス（ジブロモメチル）− ２゜２°−ビピリジンが得られる。
０．５ｇ　（１，９ｍｍｏｌ）の６−メチル−６′−ブロモメチル−２，２゛− ビビリノンが、アルミナ（塩基性活量１．　Ｍｅｒｃｋ、　ＵＳＡ）を通じた１ ００Ｉ１１１ノクロロフオルム中で可溶化される。それに５０ｍ１のクロロフォ ルムに１．２ｇのメタクロロ過安息香酸（水５５％）が溶解されている溶液、即 ち、臭素化誘導体の１当量あたり２当量とされた酸が、滴下されて加えられる。
それから４時間後、さらに２当量のメタクロロ過安息香酸が滴下されて加えられ る。そして、室温のもとて一晩攪拌された後、混合溶液は、蒸発せしめられると ともに、真空ポンプによる真空状態のもとて乾燥せしめられる。それにより得ら れた残留物に対するエーテルによる洗浄が５回行なわれ、４００ｍｇの目的物が 淡黄色の粉末（収率ニア１％、融点：１２５℃）の形で得られる。
ｂ）化合物（３）の調製 ０．４５ｇ　（１，１４ｍｍｏｌ）の化合物（２）（文献：　Ｊ、Ｏｒｇ、　Ｃ ｈｅｍ、、１９８３゜４８、４８４８に記載されたビピリジン巨環状体）と新た に蒸留されて得られた３００ｍ１のＭ　ｅ　ＣＮ中に３ｇ　（１７１１１０１０ １）のＮａ２ＣＯｔが溶解されている溶液とを含んだ混合溶液に、窒素雰囲気中 における還流下において、２００ｍ１のＣＨ，ＣＮにｌ、　Ｉｇ　（３，７０ｍ ｍｏｌ）の化合物（１）が溶解されている溶液が、攪拌されつつ滴下されて加え られる。還流状態は、攪拌を伴って、２４時間に亙って維持される。その後、混 合溶液が濾過され、それにより得られる濾過生成物が、室温下の真空状態のもと で濃縮される。その結果得られる粗生成物が、ＣＨＣＩ　ｚ　（２００ｍｌ）に 溶解され、水による洗浄が３回行なわれ、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＋が用いられて乾燥さ れ、蒸発せしめられる。そして、アルミナイオン交換柱（ｅｌｕｅｎＬ：　Ｃ） ＩｔＣ１ｔ／ＭｅＯＨ９：ｌ）を用いたイオン交換クロマトグラフィによって分 離されて、４００ｍｇの目的物が白色の粉末（収率：４２％、融点：２３５℃（ 分解））の形で得られる。
’ＨＮＭＲスペクトラム（ＣＤＣＩ＋　）　：２．５９　（２Ｃ）１．）；　４ ．２１　（４Ｃ）１．）；　４．５５　（２ＣＨ２）；　７，０９　（ｄ、　Ｊ 　＝　７．３゜４Ｈ）；　７．３１−７．４７　（ｍ、　１４８）；　７．７４ 　（ｄ、　Ｊ　＝　７．５．４ｔ（）；　８．２２−８．２７　（ｍ、　２Ｈ） 。
”ＣＮＭＲスペクトラム（ＣＤ、ＯＤ）：１８．Ｉ　（２Ｃ）Ｉ、）；　５８． ２　（２ＣＨ２）；　６２．０　（４ＣＨＩ）；　１２１．２；　１２４．９： １２５．５＋　１２７．７；　１２８．１；　１２８．５；　１３０．８．　１ ３９．３：Ｃ２４Ｈ）：１４５．３；　１４５．４．　１４８．８；　１５０． ４；　１５６．０；　１５９．９：　（１６Ｃ）成分分析ニ ー　Ｃ，、Ｈ，，０，Ｎ、、−８２０（８４０，９１）に関する計算値Ｃ：６８ ．５５．　Ｈ：　５．２７；　Ｎ：１６．６６・実験値： Ｃ：６８．３４；　Ｈ：　５．０９；　Ｎ：１６．３８１５ａ＋Ｉのメタノール に３７ｎ＋ｇの化合物（３）　（４，５ｘｉｏ−Ｓｍｏｌ）が溶解されている溶 液に、室温のもとで、１７＋ｎｇのＥｕＣＩｓ　・６Ｈ２０（４，６ｘ　１０− ’　ｍｏｌ）が、攪拌されつつ加えられる。攪拌状態は、窒素雰囲気中において ４８時間に亙って維持される。その後、３０の１のＥｔ２０が加えられ、それに より、白色の沈殿物が生成されるが、この沈殿物は、遠心分離機によって分離さ れる。そして、５０ｍｇ　（９９％）の目的物が白色の粉末（融点＝１９０℃（ 分解））の形で回収される。
ＦＡＢ實量入量スペクトラムＢＡ）： １０４５．０　（［Ｍ　＋　Ｅｕ　＋　２ＣＩ］　’　）；　１０１０．１　（ ［Ｍ　＋　ｌ！ｕ　＋　ＣＩ］　”　）；９９４．１　（［Ｍ　−０＋　Ｅｕ　 ＋　ＣＩ］　”　）。
成分分析： ”　Ｃ＋＋Ｈｔ＋Ｏ＋　Ｎ１ｏ’　ＥｕＣＩ　ｓ　’　６Ｈ２０（１１８９，３ ０）に関する計算値 Ｃ：４８．４７；　Ｈ：　４．５７．　Ｎ：１１．７８・実験値 Ｃ・４８．７１．　）（：　４．９４．　Ｎ：ｌＯ，８９実施例　３゜ 互層状テルビウム錯体（互層状体：実施例　ｌ　における化合物（３））の調製 １５ｍ１のメタノールに２５ｍｇの化合物（３）　（３，０４Ｘ１０−’ｍｏｌ ）が溶解されている溶液に、室温のもとで、１２ｇのＴｂＣ］３　・６Ｈ８０（ ３，２ｘｌＯ−５０１０１）が、攪拌されつつ加えられる。攪拌状態は、窒素雰 囲気中において４８時間に亙って維持される。その後、３０ｍ１のＥｔ＋　Ｏが 加えられ、それにより、白色の沈殿物が生成されるが、この沈殿物は、遠心分離 機によって分離される。そして、３３ｍｇ　（９４％）の目的物が黄色の粉末（ 融点：１９０℃（分解））の形で回収される。
ＦＡＢ質量スペクトラム（ＮＲＡ）・ １０５０．９　（［Ｍ　＋　Ｔｂ　＋　２ＣＩ　−］　＋）；　１０１４．９　 （［Ｍ　＋　Ｔｂ　＋　ＣＩ］　”　）；成分分析ニ ー　Ｃ１１Ｈ１２０，Ｎｌ０−　Ｔｂ　Ｃ］　ｌ　・Ｈｔ　Ｏ（１１０６，１９ ）に関する計算値 Ｃ：５２□１１＋　Ｈ：　４．０１．　Ｎ：１２．６６・実験値： Ｃ二５１．．８３．Ｈ：４．２２．Ｎ：１２．２８実施例　４： 式（５）および（６）によりあられされる互層状化合物の調製これらの化合物は 、実施例　１　における化合物（２）から、下記に従って調製される。
Ｎ１□Ｃｏ、、　Ｃ）ｌ、ＣＮ ６．６゛−ジメチル−２，２゛−ビピリジン−４，４°−ジカルボキレート（４ ，４ｇ）とＮ−ブロモスクシンイミド（９，７６ｇ　）との混合溶液力（，２４ ０ｍ１のカーボンテトラクロライド中にお０て３０分間還流され、それに、０． ５４ｇの２．２′　−アゾビス（２−メチルプロビオニド１ノル）が加えられる 。そして、混合溶液はさらに４時間還流され、その後、濾過され、４℃のもとて １２時間に亙って冷却される。そして、得られた沈殿物が蒸発せしめられ、イオ ン交換樹月旨柱（ｅｌｕ−ｅｎｔ：　ＣＬＣＬ／ｈｅｘａｎｅ　５０１５０）を 用いたイオン交換クロマトグラフィによって分離される。それにより、２．０６ ｇのジメチル−６−メチル−６゛−ブロモメチル−２，２′−ビピリジン−４， ４′−ジカルボキシレートが得られる。
２、０６ｇ（５，４ｎ＋ｍｏｌ）のジメチル−６−メチル−６゛−ブロモメチル −２，２’−ビピリジン−４，４°−ジカルボキシレートは、２００ｍ１のクロ ロフォルム中で可溶化される。それに、４０ｍ１のクロロフォルムに３．３５ｇ 　（０，１ｍＭ）のメタクロロ過安息香酸力（溶解されてＩ、Ｘる溶液が、滴下 されて加えられる。それから１２時間後、６．７ｇのメタクロロ過安息香酸が含 まれたクロロフォルム溶液が、さらニ滴下されて加えられる。そして、２４時間 後、混合溶液は、蒸発せしめられるとともに、残留物が真空ポンプによる真空状 態のもとて乾燥せしめられる。その後、残留物に対する５０Ｉｌｌｌのエチルエ ーテルによる洗浄が４回行なわれ、さらに、イオン交換樹脂柱（ｅｌｕ−ｅｎｆ ：　ＣＨＣｌ＋／ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ　９０／１０）を用いた精製が行なわ れて、１、．０５ｇの目的物（収率：４７％）が得られる。
ｂ、化合物（５）および（６）の調製 ４８ｍｇ　（０，１２ｍＭ）の化合物（２）と０．１３ｇ　（１，２ｍＭ）のＮ ａ２ＣＯ＋とを含んだ混合溶液が、＋５０＋ｎｌのＣＨ，ＣＮ中において３０分 間還流サレル。ソノ後、５０ｍ１　ｔ７）ＣＨｒ　ＣＮニ］、ＯＯｍｇ（０，２ ４ｍＭ）ノ化合物（１）が溶解している混合溶液が、滴下されて加えられる。そ して、混合溶液は、攪拌を伴った還流状態が２４時間に亙って維持されるものと なされ、その後、濾過されて、それにより得られる濾過生成物が、真空状態のも とで濃縮される。
実施例　５： 巨環状ユーロピウム錯体（互層状体：実施例　４　における化合物（５）および （６））の調製 実施例４において得られる粗生成物（化合物（５）もしくは（６））に、　６０ ｍ１の無水メタノール中における３０２ｍｇ（７）Ｅ　ｕ　ＣＩ　ｓ　・６ｆ（ ２０（０，８２ｍＭ）が加えられ、その混合溶液が、２時間に亙って還流状態に おかれる。その後、溶液は、冷却されるとともに蒸発せしめられる。その後、得 られた粗反応生成物に対する、ＣＨ。
ＣＮ／Ｈ，Ｏ／ＴＦＡ中におかれたイオン交換樹脂柱を用いた逆相クロマトグラ フィによる精製が行なわれ、その結果、１８＋ｎｇの互層状錯体（６）もしくは ２９＋ｎｇの互層状錯体（５）が得られる。
・　１８＋ｎｇの互層状錯体（６）に関するＦＡＢ質量スペクトラム（ＮＢＡ） 　：１１０１　［Ｍ　＋　Ｅｕ　＋　２ＣＦ３ＣＯＯ］９８８　［Ｍ　＋　Ｅｕ 　＋　ＣＦｓＣＯＯ］・　２９Ｈの互層状錯体（５）に関するＦＡＢ質量、スペ クトラム（ＮＢＡ）　＋１４３１　［Ｍ　＋　Ｅｕ　＋　２ＣＦ＋ＣＯＯ］これ らの化合物は、実施例　ｌ　における化合物（１）および（２）、および、実施 例　４　における化合物（４）から、下記に従って調製される。
０、４５ｇ　（１，１４ｍＭ）の化合物（２）と１５０ｍ１のＣＨ２ＣＮ中にお ける３ｇ　（１７ｍＭ）のＮａ２ＣＯ＋と１２５ｍ１のＣＨ２Ｃ１，とから成る 混合溶液に、還流状態がとられたもとで、１００＋＋＋ＩのＣＨ，ＣＮに０．５ ５ｇ　（１，８ｍＭ）の化合物（１）が溶解している溶液が滴下されて加えられ る。そして、混合溶液は、還流状態のもとで、１２時間に亙って攪拌される。そ の後、混合溶液が濾過され、それにより得られる濾過生成物が、真空状態のもと で濃縮される。その結果得られる粗生成物が、アルミナイオン交換柱を用いたイ オン交換クロマトグラフィによって精製され、２０７＋ｎｇの単置換生成物が得 られる。
続いて、０．２０ｇ　（０，２３ｍＭ）の単置換生成物と６０ｍ１のＣＨｓＣＮ 中における０、６ｇ　（３，４ｍＭ）のＮ　ａ　２　ＣＯｚとから成る混合溶液 に、還流状態がとられたもとて、２０ｍ１のＣＨ，ＣＮにＯ，Ｉｇ　（０，２４ ｍＭ）の化合物（４）が溶解している溶液が滴下されて加えられる。そして、混 合溶液は、還流状態のもとで、２４時間に亙って攪拌される。その後、混合溶液 が濾過され、それにより得られる濾過生成物が、真空状態のもとで濃縮される。
その結果得られる生成物に対して水による洗浄が行なわれ、５７ｍｇ　（０，０ ５ｍＭ）の化合物（７）が得られる。
実施例　７ 巨環状ユーロピウム錯体（互層状体：実施例　６　における化合物（７））の調 製 この錯体（互層状錯体（７））は、実施例　５　において得られる互層状錯体（ ５）もしくは互層状錯体（６）の場合と同様にして調製される。
・互層状錯体（７）に関するＦＡＢ質量スペクトラム（ＮＢＡ）　：１１６１　 ［Ｍ　＋　Ｅｕ　＋　２ＣＩ］１１．２６　［Ｍ　＋　Ｅｕ　＋　ＣＩ］この化 合物は、実施例　７　における巨環状化合物から、ヨーロッパ特許第０３２１． ３５３号（特に、実施例３のステップＢ参照）に記載されている如くの、アミツ リシス反応の助けを得て調製される。概略を述べるに、実施例　７　における巨 環状化合物は、蒸留されて９０°Ｃに予加熱された４ｍｌのエチレンジアミンに 加えられてアミツリシス反応を生じるものとされる。次に、それにより得られる 反応混合溶液が、さらに１時間に亙って攪拌された後、室温にまで冷却される。
その後、過剰なエチレンジアミンが真空状態のもとで除去され、オイル状を呈す るものとされる。このオイル状溶液には、２ｍｌのトルエン／　ＣＨ３０Ｈ混合 物（２／　１）が混在しており、次に、それが真空状態のもとで除去されて、ベ ージュ・パウダー状のものが得られる。そして、これに対する比色分析により、 モルあたり１．５ＮＨｔのキレートが定量される。
実施例　９・ 実施例　２，５．７および８　における互層状ユーロピウム錯体の安定性および 消光作用についての実証下記の定量分析は、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲＬＳ　５ ”分光計が用いられてなされた。
試験に供された錯体の寿命（τ）が、次のようにして測定された。
先ず、溶液が吸収ピークの一つに対応する光によって励起されるもとで、波長が ６００ｎｍと６５０ｎｍとの間におけるピークについての発光スペクトラムが記 録された。“燐光”モードが使用され、タイムウィンドウの値はＩｍｓ＝ｔｇに 設定された。発光スペクトラムの記録は、　ｂ　（遅れ時間）の幾つかの値、即 ち、０．１＋ｎｓ、　０．２ｍ５０．３ｍｓ、　０．４ｔｎｓおよび０．５＋ｎ ｓの夫々に対応してなされた。発光ピーク強度１．が測定され、その結果に基づ いて、寿命τが次の式（ｔは時間）により算出された。
１、＝１゜・　ｅ１′τ τ＝　０．４３４　ｔ／（ｌｏｇ　１１０−１ｏ　１．　）各化合物は、約１０ −’　Ｍ／ｌの複合濃縮状態のもとで、水中およびｐＨ７，２の１００ｍＭ燐酸 緩衝液中において試験された。
下記の計理状化合物（化合物　Ａ、　Ｂ、　Ｃ，ＤおよびＥ）を含んだ錯体が、 実施例２．　５．　７および８における互層状ユーロピウム錯体との比較のため 試験された。
・化合物　Ａ・ ・化合物　Ｂ： ・化合物　Ｃ ・化合物　Ｄ： ・化合物　Ｅ。
化合物　Ａ　および　Ｂ　の調製については、ジェイ・エム・レーン／他（Ｊ、 　Ｍ、　Ｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ）による文献：　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍ ｉｃａ＾ｅｔａ、　１９９１．７４．５７２に、　化合物　Ｃの調製については 、アール・チーセル／他（Ｒ，Ｚｉｅｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ）による文献：　） ＩｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｌｎｉｃａ　Ａｃｔａ、　１９９０．７３．１１４９ 　に、　化合物　Ｄ　の調製については、ジエイ・エム・レーン／他（Ｊ、　Ｍ 、　Ｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ）による文献：　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃ ａ　Ａｃｔａ、　１９９０．７３．１０６に、そして、化合物　Ｅ　の調製につ “いては、ヨーロッパ特許第０１８０４９２号に、夫々記載されている。
試験の結果は、下記の表１および表２に示されるとうりである。
なお、測定に供された血清は、ｐＨ７，２の１００ｍＭ燐酸緩衝液によって１／ ３の濃度に希釈された人間の血清が用いられた。
寿命（τ）の単位は、ｍｓ　（ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ）である。
表１ 表２ 表１および表２に示される測定結果は、燐酸緩衝液中においては試験に供された 化合物のほとんどのものが安定であるが（安定性は発光ピークレベルの持続時間 によって評価される）、血清中においては、この発明に係る錯体のみが、水中で 発せられる螢光に比して、消光現象がほとんど見られないもの、あるいは、螢光 高揚現象さえ見られるものであることを示している。
□　１ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＪ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、　 ＵＳ （７２）発明者　マチ　ジエラール フランス　３０２００　バニュール　シー　セーズ　アンパス　ドウ　ラ　カブ レ　デラドウレ　１７

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. １．下記の式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）によってあらわされる巨環状化合物に よって錯化された少なくとも一つの希土類塩から成り、 上記式（Ｉ）における２価の基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）は、同一で あっても相違してもよく、一つもしくは複数のヘテロ原子を任意に含有した炭化 水素鎖であり、上記基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも 一つが、錯化された希土類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネル ギを有した少なくとも一つの分子単位を含有するか、あるいは、本来、錯化され た希土類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有した分子単 位から成るものとされ、また、上記基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のう ちの少なくとも一つが、窒素原子のうちの少なくとも一つがオキシ基を担うもの とされた窒素含有複素環系から成るものとされ、さらには、上記基（Ｃ）および （Ｄ）のうちの一つは無くてもよいものであり、また、上記式（Ｉ）におけるＸ １およびＸ２は、同一であっても相違してもよく、水素、または、一つもしくは 複数のヘテロ原子が介在せしめられた炭化水素鎖（ＣＨ２）ｎであってｎが１か ら１０までの整数のものであり、 さらに、上記基（Ａ）および／または（Ｂ）が、窒素原子のうちの少なくとも一 つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系である場合には、上記基（Ｃ ）および／または（Ｄ）が、ビキノリン，ビイソキノリン，ビピリジン，テルピ リジン，クマリン，ビピラジン，ビピリミジンおよびピリジンのなかから選ばれ るものとされる巨環状希土類錯体。
  2. ２．二価の基（Ａ）および（Ｂ）のうちの少なくとも一方が、錯化された希土類 イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有する少なくとも一つ の分子単位を含有するか、あるいは、本来、錯化された希土類イオンの発光準位 のエネルギより大なる三重項エネルギを有する分子単位から成るものとされ、ま た、二価の基（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一方が、窒素原子のうちの 少なくとも一つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系から成るものと された巨環状化合物により錯化された少なくとも一つの希土類塩から成るものと される請求項１記載の巨環状希土類錯体。
  3. ３．二価の基（Ａ）および（Ｂ）が同じものであることを特徴とする請求項１ま たは２記載の巨環状希土類錯体。
  4. ４．二価の基（Ｃ）および（Ｄ）が同じものであることを特徴とする請求項１ま たは２記載の巨環状希土類錯体。
  5. ５．Ｘ１およびＸ２が同じものであることを特徴とする請求項１，２，３または ４記載の巨環状希土類錯体。
  6. ６．三重項エネルギを有した分子単位の三重項エネルギ準位が、１７，３００ｃ ｍ−１より大とされることを特徴とする請求項１，２，３，４または５記載の巨 環状希土類錯体。
  7. ７．三重項エネルギを有した分子単位が、フェナントロリン，アントラセン，ビ ピリジン，ビキノリン、テルピリジン，クマリンビピラジン，ビピリミジン，ア ゾベンゼン，アゾピリジン，ピリジン、２，２′−ビスイソキノリン、および、 単位：▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼ 、および、▲数式、化学式、表等があります▼ のうちから選ばれることを特徴とする請求項１から６のうちのいずれかに記載の 巨環状希土類錯体。
  8. ８．窒素含有複素環系が、ピリジンＮ−オキサイド，ビピリジンＮ−オキサイド ，ビピリジンジ−Ｎ−オキサイド，ビスイソキノリンＮ−オキサイド，ビスイソ キノリンジ−Ｎ−オキサイドのうちから選ばれることを特徴とする請求項１から ７のうちのいずれかに記載の巨環状希土類錯体。
  9. ９．錯化された希土類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを 有する分子単位と、窒素原子のうちの少なくとも一つがオキシ基を担うものとさ れた窒素含有複素環系とが、同一の単位とされることを特徴とする請求項１から ８のうちのいずれかに記載の巨環状希土類錯体。
  10. １０．希土類イオンが、ユーロピウム・イオン，テルビウム・イオン，サマリウ ム・イオンおよびジスプロシウム・イオンのうちから選ばれることを特徴とする 請求項１から９のうちのいずれかに記載の巨環状希土類錯体。
  11. １１．二価の基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一つが 、基：−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ｚによって置換され、該基において、 Ｙが、一つもしくは複数の二重結合を含むもの、および／または、一つもしくは 複数の、酸素，窒素，硫黄または燐の如くのヘテロ原子を介在させた線状のまた は枝分かれしたＣ１からＣ２０までのアルキレン基，Ｃ５からＣ８までのシクロ アルキレン基、および、Ｃ６からＣ１４までのアリレン基のうちから選択された 二価の有機基から成るスペーサアームもしくは基であって、上記アルキレン基， シクロアルキレン基もしくはアリレン基は、アルキル基，アリル基またはスルホ ネート基によって置換されるものであり、また、 Ｚが、生物学的物質との共有結合が可能である官能基であることを特徴とする請 求項１から１０のうちのいずれかに記載の巨環状希土類錯体。
  12. １２．巨環状化合物が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ によってあらわされる化合物とされることを特徴とする請求項１から１０のうち のいずれかに記載の巨環状希土類錯体。
  13. １３．下記の式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）によってあらわされる巨環状化合物に よって錯化された少なくとも一つの希土類塩から成り、上記式（Ｉ）における２ 価の基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）は、同一であっても相違してもよく 、一つもしくは複数のヘテロ原子を任意に含有した炭化水素鎖であり；上記基（ Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一つが、錯化された希土 類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有した少なくとも一 つの分子単位を含有するか、あるいは、本来、錯化された希土類イオンの発光準 位のエネルギより大なる三重項エネルギを有した分子単位から成るものとされ； また、上記基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一つが、 窒素原子のうちの少なくとも一つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環 系から成るものとされ；さらには、上記基（Ｃ）および（Ｄ）のうちの一つは無 くてもよいものであり、また、上記式（Ｉ）におけるＸ１およびＸ２は、同一で あっても相違してもよく、水素、または、一つもしくは複数のヘテロ原子が介在 せしめられた炭化水素鎖（ＣＨ２）ｎであってｎが１から１０までの整数のもの であり、さらに、上記基（Ａ）および／または（Ｂ）が、窒素原子のうちの少な くとも一つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系である場合には、上 記基（Ｃ）および／または（Ｄ）が、ビキノリン，ビイソキノリン，ビピリジン ，テルピリジン，クマリン，ビピラジン，ビピリミジンおよびピリジンのなかか ら選ばれるものとされる巨環状希土類錯体を螢光トレーサとして用いることによ り、測定媒質中に存在する可能性がある被検体を螢光を利用して検出および／ま たは定量する螢光分析における干渉を低減させる干渉低減方法。
  14. １４．測定媒質が生体媒質とされることを特徴とする請求項１３記載の干渉低減 方法。
  15. １５．生体媒質が血清媒質とされることを特徴とする請求項１４記載の干渉低減 方法。
  16. １６．下記の式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）によってあらわされる巨環状化合物に よって錯化された少なくとも一つの希土類塩から成り、上記式（Ｉ）における２ 価の基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）は、同一であっても相違してもよく 、一つもしくは複数のヘテロ原子を任意に含有した炭化水素鎖であり；上記基（ Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一つが、錯化された希土 類イオンの発光準位のエネルギより大なる三重項エネルギを有した少なくとも一 つの分子単位を含有するか、あるいは、本来、錯化された希土類イオンの発光準 位のエネルギより大なる三重項エネルギを有した分子単位から成るものとされ； また、上記基（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）のうちの少なくとも一つが、 窒素原子のうちの少なくとも一つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環 系から成るものとされ；さらには、上記基（Ｃ）および（Ｄ）のうちの一つは無 くてもよいものであり、また、上記式（Ｉ）におけるＸ１およびＸ２は、同一で あっても相違してもよく、水素、または、一つもしくは複数のヘテロ原子が介在 せしめられた炭化水素鎖（ＣＨ２）ｎであってｎが１から１０までの整数のもの であり、さらに、上記基（Ａ）および／または（Ｂ）が、窒素原子のうちの少な くとも一つがオキシ基を担うものとされた窒素含有複素環系である場合には、上 記基（Ｃ）および／または（Ｄ）が、ビキノリン，ビイソキノリン，ビピリジン ，テルピリジン，クマリン，ビピラジン，ビピリミジンおよびピリジンのなかか ら選ばれるものとされる巨環状希土類錯体を、測定媒質中に存在する可能性があ る被検体を螢光を利用して検出および／または定量する螢光分析における螢光ト レーサとして用いて、該螢光分析における干渉を低減させる巨環状希土類錯体の 使用方法。
  17. １７．螢光分析における被検体の検出および／または定量を行なう方法が均質方 法とされることを特徴とする請求項１６記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  18. １８．螢光分析における被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う 方法が、 １）媒質に、被検体に対する少なくとも一つのレセプタを含んで成る第１の試薬 を添加するステップ；２）上記媒質に、上記被検体および少なくとも一つのレセ プタのうちから選択された第２の試薬を添加するステップ；３）上記第１および 第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１および第２の試薬の両者 が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベ ートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した 光によって励起するステップ；および、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状 態のもとで測定するステップ；を含み、上記蛍光ドナー化合物が巨環状希土類錯 体から成り、上記第１および第２の試薬のうちの一方が上記蛍光ドナー化合物と 結合しているものとされるとともに、上記第１および第２の試薬のうちの他方が 上記螢光アクセプタ化合物と結合しているものとされ、また、上記第１の試薬を 添加するステップと上記第２の試薬を添加するステップとは順序が可逆とされる ことを特徴とする請求項１６または１７記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  19. １９．螢光分析における被検体の検出および／または定量が、１）被検体を含む 媒質に、該被検体に対する少なくとも一つのレセプタから成り、巨環状希土類錯 体から成る螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ；２）上 記媒質に、上記被検体に対する一つもしくは複数の他のレセプタから成り、螢光 アクセプタ化合物と結合している第２の試薬を添加するステップ； ３）上記第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１およ び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステッ プ；４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長 に相当する波長を有した光源からの光によって励起するステップ；および、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ を含むものとされる過剰分析方法の助けを得たもとで、螢光が利用されて行なわ れることを特徴とする請求項１８記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  20. ２０．螢光分析における被検体の検出および／または定量が、１）被検体を含む 媒質に、該被検体に対するレセプタであって、巨環状希土類錯体から成る螢光ド ナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した被検体から成る第２の試薬を 添加するステップ； ３）上記第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１およ び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステッ プ；４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長 に相当する波長を有した光によって励起するステップ；および、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ、 を含むものとされる競争分析方法の助けを得たもとで、螢光が利用されて行なわ れることを特徴とする請求項１８記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  21. ２１．螢光分析における被検体の検出および／または定量が、１）彼検体を含む 媒質に、該被検体に対するレセプタであって、螢光アクセプタ化合物と結合して いる第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、巨環状希土類錯体から成る螢光ドナー化合物と結合している被 検体を、第２の試薬として添加するステップ； ３）上記第１および第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１およ び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステッ プ；４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長 に相当する波長を有した光によって励起するステップ；および、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ、 を含むものとされる競争分析方法の助けを得たもとで、螢光が利用されて行なわ れることを特徴とする請求項１８記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  22. ２２．螢光分析における被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う 方法において用いられる第１の試薬および第２の試薬が、被検体を含む媒質に同 時に添加されることを特徴とする請求項１８，１９，２０または２１記載の巨環 状希土類錯体の使用方法。
  23. ２３．螢光分析における被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う 方法において、螢光ドナー化合物もしくは螢光アクセプタ化合物のいずれかと結 合する、被検体に対する単一のレセプタが用いられることを特徴とする請求項１ ８または１９記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
  24. ２４．螢光分析における被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う 方法において、螢光ドナー化合物が希土類イオンをユーロピウムとする巨環状錯 体とされるとともに、螢光アクセプタ化合物が、アロフィコシアニン，アロフィ コシアニンＢ，フィコシアニンＣおよびフィコシアニンＲの中から選択されたも のとされることを特徴とする請求項１８から２３のうちのいずれかに記載の巨環 状希土類錯体の使用方法。
  25. ２５．螢光分析における被検体の検出および／または定量を螢光を利用して行う 方法において、螢光ドナー化合物が巨環状テルビウム錯体とされるとともに、螢 光アクセプタ化合物が、ローダミン，チオニン，フィコシアニンＲ，フィコエリ トロシアニン，フィコエリトリンＣ，フィコエリトリンＢおよびフィコエリトリ ンＲのうちから選択されたものとされることを特徴とする請求項１８から２３の うちのいずれかに記載の巨環状希土類錯体の使用方法。
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