DE60131276T2

DE60131276T2 - Kryptate der seltenen erden mit verringerter fluoreszenz-löschung

Info

Publication number: DE60131276T2
Application number: DE60131276T
Authority: DE
Inventors: Herve Autiero; Herve Bazin; Gerard Mathis
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2021-06-13
Also published as: ATE377755T1; WO2001096877A2; DE60131276D1; FR2810406B1; WO2001096877A3; US7087384B2; EP1290448A2; JP2004509075A; US20040092726A1; EP1290448B1; AU7246801A; FR2810406A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren der durch das Meßmedium bei einem Fluoreszenztest hervorgerufenen Fluoreszenzlöschung, indem man in das Medium Seltenerdmetallcryptate gibt, die gegenüber dieser Fluoreszenzlöschung nicht sehr empfindlich sind.
Die Erfindung betrifft ebenso neue Seltenerdmetallcryptate, die gegenüber der durch das Meßmedium hervorgerufenen Fluoreszenzlöschung nicht sehr empfindlich sind.
Die Erweiterung des biologischen Wissensstandes benötigt in zunehmendem Maße diagnostische Verfahren, mit denen Biomoleküle verfolgt oder quantifiziert werden können.
Gleichzeitig wird von den radioaktiven Markierungen, die im allgemeinen bei Referenztestverfahren eingesetzt werden, Abstand gehalten. Allgemein richten sich zur Zeit die Bemühungen darauf, radioaktive Indikatoren (Tracer) durch andere Markierungen und vorwiegend durch Fluoreszenzmarkierungen zu ersetzen. Durch die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen lassen sich unter idealen Bedingungen hohe Empfindlichkeiten erzielen, die theoretisch zu den mit radioaktiven Indikatoren erzielten Empfindlichkeiten gleichwertig sind.
Viele Fluoreszenzmoleküle, die als Indikatoren in derartigen Tests verwendet werden können, sind bereits beschrieben worden, wobei unter diesen Seltenerdmetallkomplexe vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.
Die Verwendung bestimmter Komplexe, nämlich Seltenerdmetallcryptate, ist beispielsweise aus den Patentanmeldungen WO 9918114 , EP 0 180 492 und EP 0 321 353 bekannt.
In der Praxis sind die Leistungseigenschaften von Fluoreszenzindikatoren einerseits durch das Vorhandensein eines Hintergrundrauschens, das häufig hoch ist, und andererseits durch die Tatsache, daß sie im allgemeinen sehr empfindlich gegenüber Änderungen in ihrer Umgebung sind, eingeschränkt. Kleine Änderungen des pH-Werts, der Polarität, des Vorhandenseins von gelöstem Sauerstoff oder der Nähe von Schweratomen (beispielsweise Iod) oder absorbierender Gruppen können ihre Quantenausbeute (im Sinne einer Anregung oder einer Löschung) modifizieren oder die Emissionswellenlänge verschieben.
Die den Analyseverfahren mittels Fluoreszenzmessung innewohnenden Probleme sind in einem Übersichtsartikel (I. Hemmilä, Clin. Chem. 31/3, 359–370 (1985)) aufgeführt.
Die dem aus der intrinsischen Fluoreszenz von Proteinen und auch von anderen, in biologischen Proben vorliegenden Biomolekülen entstehenden Hintergrundrauschen innewohnenden Probleme können teilweise durch die Verwendung von aus Seltenerdmetallkomplexen (hauptsächlich Europium) gebildeten Fluoreszenzmarkierungen, durch die eine zeitliche Selektion des spezifischen Signals gestattet wird, gelöst werden. Die besonders langen Lebensdauern (ungefähr 0,1 ms bis 1 ms), durch die Europiumkomplexe gekennzeichnet sind, ermöglichen es, mittels einer zeitaufgelösten Messung das beispielsweise von den Serumproteinen gebildete Hintergrundrauschen, das durch eine relativ kurze Lebensdauer gekennzeichnet ist (etwa 4 ns), loszuwerden.
Ein Format homogener Art weist den erheblichen Vorteil auf, daß die Kinetik der Ausbildung eines immunologischen Komplexes in Echtzeit verfolgt werden kann, doch lassen sich damit eventuelle ungünstige Wechselwirkungen zwischen der Markierung und den in einem biologischen Medium vorliegenden Molekülen (Löschen der Fluoreszenz) nicht ausschließen.
Eine Wiederherstellung der fotophysikalischen Eigenschaften, und dabei insbesondere der Lebenszeit, kann in einem Serummedium dadurch erreicht werden, daß man das Medium mit Fluoridionen versetzt, wie aus der Patentanmeldung EP 0 539 435 bekannt ist.
Trotzdem werden von keinem dieser Verfahren die durch die im Meßmedium vorhandenen Moleküle verursachten Interferenzprobleme vollständig gelöst. Der Grund hierfür liegt darin, daß eine Hauptursache für die eingeschränkte Empfindlichkeit der Messung mittels Fluoreszenz in der Existenz von durch im Medium vorhandene Moleküle verursachten Löschvorgängen besteht, die die Fluoreszenz des als Markierung im Test verwendeten Fluoreszenzmoleküls hemmen können. Im Falle von Seltenerdmetallkomplexen kann die Löschung das Ergebnis von Mechanismen einer Elektronenübertragung durch Nähe sein, wobei das Inhibitormolekül die freien Koordinationsstellen im Komplex besetzt. Zu nennen sind hier insbesondere die Redoxreaktionen, die zwischen dem Fluoreszenzmolekül in seinem Grundzustand oder in seinem angeregten Zustand und im Medium vorhandenen Molekülen stattfinden. Diese Mechanismen sind in der Lage, die emittierte Fluoreszenz merklich zu modifizieren.
Die Hemmung der Fluoreszenz durch Mechanismen unter Beteiligung von Elektronenübertragung und allgemein durch Löschmechanismen stellt in der Praxis eine starke Indisposition dar, da die Hemmfaktoren entweder als Bestandteile im Meßmedium natürlicherweise vorhanden sein können (beispielsweise Harnsäure in Serum) oder auch als Zusätze oder Stabilisatoren für den Test hinzugegeben werden können.
Diese Inhibitoren beeinträchtigen die Fluoreszenz des Markierungsmoleküls stark. Insbesondere bringt im Falle von störenden Redoxreaktionen der Übergang vom oxidierten Zustand zum reduzierten Zustand eines Seltenerdmetallions mittels eines Redoxmechanismus eine Verringerung der Lebensdauer sowie eine Änderung des Emissionsspektrums des das Ion enthaltenden Komplexes mit sich, so daß die Empfindlichkeit der Messung stark beeinträchtigt wird.
Es wurden nun neue Seltenerdmetallcryptate gefunden, die aus einem mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die wenigstens eine molekulare Einheit, bestehend aus einem Pyridin, umfaßt, komplexierten Seltenerdmetallsalz bestehen und neue und unerwartete fotophysikalische Eigenschaften zeigen.
Ebenso erwies sich, daß diese vorteilhaften Eigenschaften dann beobachtet werden, wenn diese makropolyzyklische Verbindung auch eine molekulare Einheit mit einer Triplettenergie umfaßt, die höher ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions, das mit einer Elektronendonorgruppe substituiert ist.
Eine mechanistische Hypothese diesbezüglich besteht darin, daß der Austausch einer molekularen Einheit mit größerem sterischem Volumen gegen ein Pyridin die Kavität des Makrozyklus reduziert und einen Einfluß auf das Redoxgleichgewicht des Seltenerdmetallions ausübt, indem dadurch dessen oxidierter Zustand gefördert wird.
Durch das Vorhandensein einer Elektronendonorgruppe kann das Redoxpotential des Seltenerdmetallions ebenfalls beeinflußt werden.
Die erfindungsgemäßen Seltenerdmetallcryptate weisen somit die vorteilhafte Eigenschaft auf, daß sie im Vergleich mit entsprechenden Cryptaten, die keine Pyridineinheit und/oder Substitution mit einer Elektronendonorgruppe umfassen, weniger empfindlich gegenüber dem Phänomen einer Fluoreszenzlöschung, die von einer Wechselwirkung mit im Medium vorhandenen Molekülen herrührt, sind.
Diese Beobachtung ist von größtem Interesse, da damit Fluoreszenzmessungen in biologischen Medien ohne Verwendung eines Adjuvants, wie beispielsweise Fluoridionen, durchgeführt werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bestehen somit aus neuartigen Markierungen, die an ein biologisches Molekül mit einer Erkennungsrolle gekoppelt werden können und die an einen Partner binden können, während sie gleichzeitig ihre löschungsresistenten Eigenschaften beibehalten.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zum Reduzieren der Fluoreszenzlöschung, die durch das Meßmedium bei einem Fluoreszenztest eines Analyten unter Verwendung von wenigstens einer Fluoreszenzmarkierung hervorgerufen wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein makropolyzyklischer Seltenerdkomplex in das Meßmedium eingeführt wird, wobei dieser Komplex aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die der nachfolgenden Formel II entspricht:
in welcher:

– der Ring der Formel
der Bis-Bipyridinmakrozyklus ist, mit der Formel:
– n = 0, 1 oder 2 ist,
– A eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent mit einer biologischen Substanz zu binden,
– R₁ eine -COOR₃-Gruppe ist, in welcher R₃ Wasserstoff oder eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist und vorzugsweise für eine Methyl-, Ethyl- oder tert.- Butylgruppe steht, oder R₁ eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist;
– R₂ Wasserstoff, eine Elektronendonorgruppe, insbesondere Carboxylat, -NH₂, -NHAlk, -N(Alk)₂, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)₂, -C(Alk)₃, -NHCOAlk, gegebenenfalls substituiert mit Phenyl, wobei Alk eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A ist, mit der Vorgabe, daß nicht mehr als einer der Substituenten R₁ und R₂ eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt und R₁ und R₂ nicht gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-YA oder -Y-A darstellen;
– Y eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, die wahlweise eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidogruppe(n), oder auch gewählt unter C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder unter C₆- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen wahlweise mit Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.

In der folgenden Beschreibung bedeutet der Begriff "Analyt" eine beliebige Substanz oder Gruppe von Substanzen, ebenso wie Analoge davon, die wünschenswerterweise nachgewiesen und/oder bestimmt werden soll.
In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Ausdruck "funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, kovalent mit einer biologischen Substanz zu binden" eine beliebige funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, über eine kovalente Bindung direkt oder nach Aktivierung mit wenigstens einer der natürlich vorhandenen oder künstlich in die biologische Substanz eingeführten Funktionen zu binden. Derartige Funktionen sind insbesondere NH₂-, COOH-, SH- und OH-Funktionen. Solche Gruppen und die Aktivierungsvorgänge werden ausführlich von P. Tijssen in "Practice and Theory of Enzyme immunoassays" Elsevier 1985, beschrieben.
Als Beispiele für funktionelle Gruppen, die sich für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen, sind zu nennen insbesondere Amino-, Thio-, Cyano-, Isocyano-, Isothiocyano-, Thiocyano-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Maleimido-, Succinimido-, Mercapto-, Phenol-, Imidazol-, Aldehyd-, Epoxid-, Halogen-, Thionyl-, Sulfonyl-, Nitrobenzyl-, Carbonyl-, Triazo-, Anhydrid-, Halogenacetat-, Hydrazinn-, Acridin- usw. Gruppen.
Besonders bevorzugte Gruppen sind Amino-, Thiol- und Carboxylgruppen, die vor der kovalenten Kopplung mit der biologischen Substanz aktiviert werden müssen, und ebenso Maleimido-, Succinimido- und Isothiocyanatgruppen, die direkt mit der biologischen Substanz binden können.
Bei dem komplexierten Seltenerdmetallion handelt es sich vorzugsweise um ein Europiumion.
In der vorliegenden Beschreibung sind die "Cryptat"-Theorie und die Nomenklatur der Makrozyklen und Polyzyklen wie bei J.M. Lehn in Struct. Bonding (Berlin), 16, 1, 1973 und in Acc. Chem. Res. 11, 49, (1978) definiert.
Zur Bezeichnung der die Makro(Poly)zyklen aufbauenden molekularen Einheiten wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

2,2'-Bipyridin: = bpy
Pyridin: = Py
4-Methylisonicotinat: = Py(CO₂Me)
2,2'-Bipyridin-4,4'-diethylcarboxylat: = bpy(CO₂Et)₂
2,2'-Bipyridin-4,4'-di-tert.-butylcarboxylat: = bpy (CO₂tbu)₂
2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarbonsäure: = bpy(CO₂H)₂
Pyridin-3,5-diethylcarboxylat: = Py(CO₂Et)₂
3,5-Bis[N-(2-aminoethyl)carboxamidyl]pyridin): = Py(NH₂)₂
3,5-Bis[N-(4-maleimidomethylcyclohexylcarboxamido-2-ethyl)carboxamidyl]pyridin): = Py[CONH(CH₂)₂NHR₄]₂,

₄

Für die erfindungsgemäßen Zwecke besonders bevorzugte makropolyzyklische Seltenerdmetallkomplexe sind die Europiumcryptate [Eu³⁺ ⊂ py·Bpy(CO₂H)₂·Bpy(CO₂H)₂] (Beispiel 4, b), [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy (CO₂H)₂·py(NH₂)₂] (Beispiel 6) und [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·py(CONH(CH₂)₂NHR₄]₂, mit
R₄ =
(Beispiel 7).
Gemäß einem bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der makrozyklische Seltenerdmetallkomplex als alleinige Markierung oder als eine der Markierungen in dem Test verwendet.
Vorteilhafterweise ist das Meßmedium ein biologisches Medium, insbesondere ein Serummedium.
Die makro(poly)zyklischen Verbindungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, werden nach bekannten Verfahrensweisen hergestellt. Die Herstellung des Bipyridinmakrozyklus, die über eine Tosylzwischenstufe erfolgt, ist insbesondere in J. Org. Chem. 1983, 48, 4848 beschrieben; die funktionalisierten makrozyklischen Analoge des Typs bpy·bpy·(R₂)₂ wurden über den gleichen Ansatz erhalten.
Im allgemeinen werden die makrobizyklischen Liganden gemäß den im Patent EP 0 321 353 bzw. in Helv. Chim. Acta, 1988, 71, 1042 offenbarten Techniken hergestellt. Insbesondere wurden diese Moleküle durch Alkylierung eines in einem polaren aprotischen Lösungsmittel vorgeformten makrozyklischen Diamins in Gegenwart eines als Base und Matrizenion fungierenden Alkalicarbonats hergestellt.
Die makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexe, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können mit den herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Metallkomplexen, bei denen die komplexierende Verbindung mit einer Verbindung, die das zu komplexierende Kation zur Verfügung stellt, umgesetzt wird, erhalten werden.
Beispielsweise können die makropolyzyklischen Komplexe dadurch erhalten werden, indem man eine Verbindung, die ein Seltenerdmetallkation zur Verfügung stellt, mit der die oben definierten Eigenschaften aufweisenden makropolyzyklischen Verbindung umsetzt, wobei jede Verbindung vorteilhafterweise in Lösung, vorzugsweise im gleichen Lösungsmittel oder in vergleichbaren Lösungsmitteln, die hinsichtlich der Komplexierung inert sind, vorliegt. Im allgemeinen wird als Lösungsmittel Acetonitril oder Methanol verwendet, wobei bis zum Rückfluß erhitzt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenso makropolyzyklische Seltenerdmetallkomplexe, die aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz bestehen, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die der Formel II entspricht:
in welcher:

– der Ring der Formel
der Bis-Bipyridinmakrozyklus ist, mit der Formel:
– n = 0, 1 oder 2 ist,
– Y eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, die wahlweise eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidogruppe(n), oder auch gewählt unter C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder unter C₆- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen wahlweise mit Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
– A eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent mit einer biologischen Substanz zu binden,
– R₁ eine -COOR₃-Gruppe ist, in welcher R₃ Wasserstoff oder eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist und vorzugsweise für eine Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppe steht, oder R₁ eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist;
– R₂ Wasserstoff, eine Elektronendonorgruppe, insbesondere Carboxylat, -NH₂, -NHAlk, N(Alk)₂, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)₂, -C(Alk)₃, -NHCOAlk, gegebenenfalls substituiert mit Phenyl, wobei Alk eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A ist, mit der Vorgabe, daß nicht mehr als einer der Substituenten R₁ und R₂ eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt und R₁ und R₂ nicht gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellen; und mit der Vorgabe daß, wenn n = 0, R₂ verschieden von Wasserstoff ist.

Bevorzugte Komplexe sind solche, in denen die makropolyzyklische Verbindung der Formel II entspricht, in welcher:

– n = 0,
– Y, A und R₁ wie oben definiert sind und
– R₂ wie oben definiert ist und einer der Substituenten R₂ eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist.

Besonders vorteilhafte Komplexe sind die Europiumcryptate [Eu³⁺ ⊂ Py·Bpy(CO₂H)₂·Bpy(CO₂H)₂], [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(NH₂)₂] und [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(CONH(CH₂)₂NHR₄]₂, mit
Die makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexe gemäß der vorliegenden Erfindung werden mit den oben erwähnten Verfahren hergestellt.
Die Erfindung betrifft ebenso Fluoreszenzkonjugate, bestehend aus den wie oben definierten makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexen, die kovalent an einen Teil eines Paars von Molekülen, die in der Lage sind, spezifisch aneinander zu binden, gebunden sind, insbesondere ein Polypeptid, ein Protein, einen Zellrezeptor, ein Antigen, einen Antikörper oder eine Nukleinsäure.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenso die Verwendung eines makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexes wie oben definiert zur Reduzierung der Fluoreszenzlöschung, die durch das Meßmedium bei einem Fluoreszenztest eines Analyten hervorgerufen wird.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, bei denen die zur Kennzeichnung und Identifizierung der Verbindungen verwendeten Techniken wie folgt sind:
Die Schmelzpunkte wurden unter Verwendung einer Schmelzpunktkapillarapparatur: electrothermal IA8103 bestimmt und sind nicht korrigiert.
Die Dünnschichtchromatographien (DC) wurden auf Macherey-Nagel-Platten: Al₂O₃(Polygram Alox N/UV254) und SiO₂(Polygram SIL 6/UV254) mit Fluoreszenzindikator durchgeführt.
Die Flüssigkeitschromatographien (HPLC) wurden unter Verwendung eines aus den folgenden Bestandteilen zusammengesetzten chromatographischen LKB-Systems durchgeführt: 2152 Mikroprozessor, 2150 Pumpe, Uvicord 21.58 Detektor; Merck 50734 Lichrosphes 100RP18 Säule; aufgetragener Gradient [Zeit(min)-Flußgeschwindigkeit/ml) Anteil des Lösungsmittels B (%): 0–1–15; 5–1–15; 35–1–100]; Lösungsmittel A = H₂O mit 1% TFA, Lösungsmittel B = CH₃CN.
Die Retentionszeiten TR sind in Minuten ausgedrückt.
Die NMR-Spektren wurden unter Verwendung des Bruker-Geräts AC 250 [250 (¹H); 62,9 (¹³C)] aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zum entsprechenden inneren Standard angegeben.
Für die Messungen bezüglich (¹H) gilt: CHCl₃ = 7,26; CH₃OH = 3,34; tBuOH = 1,36. Die folgenden Symbole wurden verwendet:

s: = Singulett
d: = Dublett
t: = Triplett
m: = Multiplett
AB: = Kopplungssystem
J: = Kopplungskonstante

Für die Messungen bezüglich Kohlenstoff (¹³C) gilt: CHCl = 77,0, wobei die folgenden Symbole verwendet wurden:
Ct = tertiärer Kohlenstoff; Cq = quarternärer Kohlenstoff.
Bei den für die Massenspektren verwendeten Ionisierungsverfahren handelt es sich um FAB⁺ = Fast Atom Bombardment (Beschuß mit schnellen Atomen) im positiven Modus (MNBA-Matrix: Meta-Nitrobenzylalkohol oder Thioglyzerin) und EI (Electron Impact).
Die Absorptionsspektren (UV-sichtbar) wurden unter Verwendung des Spektrofotometers lambda 15 von Perkin Elmer mit 10^–5 M Lösungen aufgezeichnet.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, in denen die folgenden Abkürzungen verwendet werden:

AIBN:: Azobisisobutyronitril
HPLC:: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
M.A.:: Mikroanalyse
Fp.:: Schmelzpunkt
M.S.:: Massenspektrum
NBS:: N-Bromsuccinimid
¹H NMR:: Protonenkernmagnetresonanz
¹³C NMR:: Kohlenstoff-13-Kernmagnetresonanz
SPDP:: N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat Sulfo-SMCC = 3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidester von 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure
TFA:: Trifluoressigsäure
DC:: Dünnschichtchromatographie
TMS:: Tetramethylsilan

Beispiel 1: Herstellung des Makrobizyklus der Formel (6) bpy·bpy·py(CO₂Me)
Die Alkylierung des makrozyklischen Diamins (5) mit dem Dibrommethylderivat (4) ergibt die nachfolgend dargestellte Verbindung (6).
a) Darstellung von 4-Methyl-2, 6-dibrommethylisonicotinat (4)
Die nachfolgend dargestellte Reaktionsabfolge gestattet die Isolierung der Verbindung (4).
– 4-Cyano-2,6-dimethylpyridin (1)
Die in J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 4004 beschriebenen Untersuchungen von W.E. Feely und E.M. Beavers bezüglich der Cyanierung von Aminoxidsalzen ermöglichen die Gewinnung der Verbindung (1).
– 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2)
Ein Gemisch aus 1 g (7,56 mmol) von (1) und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure wird 5 Stunden bei 100°C erhitzt. Die erhaltene Lösung wird anschließend im Eisbad abgekühlt, mit 10 N Natriumhydroxid auf pH 3,5 gebracht und dann zur Trockne eingeengt. Durch 48stündige Etherextraktion (Soxhlet) eines Teils des erhaltenen Rückstands erhält man 50 mg 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2) zur Analyse. Das restliche rohe Reaktionsprodukt, das nicht mit Ether behandelt wurde, wird in seiner bestehenden Form in der Veresterungsreaktion ohne weitere Aufreinigung eingesetzt.
NMR: 1H (D₂O); innerer Standard tBuOH 1,29 ppm. 2,82 (s, 6H, CH₃); 8,05 (s, 2H, Py).
MS (EI): 151 (M+, 100); 134 (M+ -OH, 7,2); 106 (M+ -CO₂H, 16,4)
MA: C₈H₉NO₂ + 0,1 NaHSO₄ (163,16)

Berechnet: C 58,89 H 5,62 N 8,58 O 23,53

Gefunden: C 58,73 H 5,90 N 8,37 O 23,7
– 4-Methyl-2,6-dimethylisonikotinat (3)
Ein Gemisch aus 2 g 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2) (ungereinigt), 100 ml Methanol und 1 ml 98%ige Schwefelsäure wird am Rückfluß 24 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsmedium mit gesättigter NaHCO₃-Lösung neutralisiert und anschließend fünfmal mit 60 ml CHCl₃ extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen werden dann über Na₂SO₄ getrocknet und anschließend eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird danach viermal mit 50 ml Ether extrahiert und die Etherphase anschließend eingeengt. Die Chromatographie des erhaltenen weißen Rückstands an Aluminiumoxid [Gradient: Cyclohexan/CH₂Cl₂ (50/50) zu reinem CH₂Cl₂] ergibt 1 g 4-Methyl-2,6-dimethylisonikotinat (3).
Fp.: 45–47°C
DC: Rf: 0,3 [SiO₂/CH₂Cl₂-MeOH (97/3)]
HPLC: Tr: 2,4
UV: CHCl₃: 290,6 nm (3650)
NMR: ¹H CDCl₃; innerer Standard TMS
2,59 (s, 6H, CH₃); 3,93 (s, 3H, CO₂CH₃); 7,51 (s, 2H, Py)
¹³C CDCl₃; innerer Standard 77,0 ppm
24,5 (CH₃); 52,5 (OCH₃); 119,5 (Ct); 137,9, 158,9 (Cq); 166,1 (C=O).
MS (EI): 165 (M⁺, 24); 134 (M⁺-OCH₃, 13); 106 (M⁺-CO₂Me)
– 4-Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat (4)
Ein Gemisch aus 1,372 g (8,3 mmol) von (3), 60 mg AlBN und 2,866 g (16,1 mmol) NBS in 120 ml CCl₄ wird unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt und dabei 8 Stunden mit einer 100 W-Lampe bestrahlt. Das Reaktionsmedium wird dann auf Raumtemperatur zurückgebracht und dann mit 200 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Nach Abtrennen der unteren Phase (CCl₄) wird die wäßrige Phase 4 mal mit 50 ml CHCl₃ extrahiert; die vereinigten organischen Extrakte werden dann mit 100 ml H₂O gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und danach zur Trockne eingeengt. Die Reinigung des erhaltenen Rückstands mittels Chromatographie an Siliziumdioxid [Gradient: Cyclohexan-CH₂Cl₂ (80/20) zu reinem CH₂Cl₂] ermöglicht die Abtrennung einer ersten Fraktion des Bromderivats (4) von den Polybromspezies, von einem Gemisch von Isomeren symmetrischer und asymmetrischer Dibromderivate sowie von den ebenso gebildeten Monobromspezies.
Um eine größere Menge an Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat zur Verfügung zu haben, wird die oben isolierte Monobromverbindung [0,543 g (2,2 mmol)] mit 0,4 g (2,2 mmol) NBS, 23 mg AlBN und 50 ml CCl₄ gemischt und danach unter den obigen Bromierungsbedingungen unter Erhalt einer zweiten Fraktion von (4) umgesetzt.
Schließlich erhält man durch Aufreinigung der in den obigen beiden Reaktionen isolierten Gemische von Dibromisomeren über Chromatographie an Siliziumdioxid [Gradient: reines Cyclohexan zu Cyclohexan/EtOAc (85/15)] eine Endfraktion von (4), d. h. insgesamt 596 mg (22%)
Fp. 90–92°C:
DC: Rf: 0,6 (SiO₂/CH₂Cl₂)
HPLC: Tr: 20 min 5 sek
UV: CHCl₃: 290,8 nm (4270); 240,3 nm (3010)
NMR: ¹H CDCl₃; innerer Standard TMS 3,98 (s, 3H, CH₃); 4,58 (s, 4H, CH₂); 7,92 (s, 2H, Py) ¹³C CDCl₃; innerer Standard 77,0 ppm 32,8 (CH₂); 52,9 (OCH₃); 122,2 (Ct); 139,8, 157,9 (Cq); 164,7 (C=O)
MS (EI): 322,9 (M⁺, 15); 243,9 (M⁺-Br, 100); 163 (M⁺-2Br, 15,7).
MA: C₉H₉NO₂Br₂ (322, 98)

berechnet: C H N O 9,90

33,47 2,80 4,33

gefunden: C H N O

33,69 2,81 4,29 10,17
b) Herstellung des Alkalicryptats [Na⁺ ⊂ bpy·bpy·pyCO₂Me]Br^– der Formel (6).
Ein Gemisch aus 0,2 g (0,508 mmol) makrocyclischem Bipyridindiamin (5) (beschrieben in J. Org. Chem., 1983, 48, 4848) und 0,376 g (5,08 mmol) Li₂CO₃ in 400 ml CH₃CN wird 40 min unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt. Eine Lösung von 0,165 g (0,508 mmol) 4-Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat (4) in 100 ml CH₃CN wird zu der erhaltenen Suspension zugetropft (2 Stunden). Nach erfolgter Zugabe wird weitere 22 Stunden unter den gleichen Bedingungen gerührt und das Reaktionsmedium danach im Eisbad abgekühlt. Anschließend wird das Carbonat abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Chromatographie des erhaltenen Rückstands an Siliziumdioxid [Gradient: CH₂Cl₂ mit 10% MeOH] ergibt 117,5 mg der Verbindung (6) (35%).
DC: Rf: 0,4 (Al₂O₃/CHCl₃-MeOH (90/10)]
HPLC: Tr: 4 min 1 sek
UV: CHCl₃: 246 nm (27950); 291 nm (27410).
NMR: ¹H (CDCl₃); innerer Standard TMS. 3,94 (s, 3H, CH₃); 4,00 (d, J = 15 Hz, AB, 4H, CH₂); 4,08 (d, J = 14,7 Hz, AB, 4H, CH₂); 4,09 (s, 4H, CH₂); 7,39-7,42 (m, 4H, BPy); 7,77 (s, 2H, Py); 7,85-7,89 (m, 8H, BPy). ¹³C (CDCl₃); innerer Standard 77 ppm. 52,9 (CH₃, CO₂ Me; 59,4 (CH₂); 59,5 (CH₂); C_t (119,9; 122,1; 123,4; 138,8) Cq (139,2; 154,6; 158,5; 159,6); 165,3 (CO ₂Me).
MS(FAB⁺): Thioglyzerinmatrix.
578,2 (Ligand-Li⁺+Na⁺, 100%); 556,2 (Ligand-Li⁺+H, 10%).
Thioglyzerinmatrix + 1% TFA
578 (Ligand-Li⁺+Na⁺, 20%); 556,1 (Ligand-Li⁺+H, 100%).
MA: C₃₃H₂₉N₇O₂NaBr, 3H₂O (712,53).

berechnet: C H N

55,62 4,95 13,76

gefunden: C H N

55,93 4,73 13,61
Beispiel 2: Herstellung des Europiumcryptats [Eu³ ⁺ ⊂ bpy·bpy·pyCO₂Me]Cl^– ₃ von Ligand (6) aus Beispiel (1)
11,8 mg EuCl₃·6H₂O (3,22 × 10^–5 mol) werden zu 20,2 mg (2,84 × 10^–5 mol) des in 5 ml wasserfreiem Methanol vorliegenden Makrobizyklus (6) gegeben.
Das entstandene homogene Gemisch wird 23 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt. Danach führt die Zugabe von 4 ml Ether zu dieser auf Raumtemperatur abgekühlten Lösung zur Kristallisierung von 14,2 mg (52%) des Europiumcryptats.
HPLC: Tr: 14,1
UV: H₂O: 250 nm (18270); 309 nm (24400).
MS (FAB⁺): Nitrobenzylalkoholmatrix 778: [(Eu³ ⁺ ⊂ L + 2Cl^–)⁺, 40%]; 743 [(Eu² ⁺ ⊂ L+Cl^–)⁺, 90%]; 707 [(Eu³⁺ ⊂ L –2H)⁺, 100%]
MA: C₃₃H₂₉N₇O₂EuCl₃, 0,13 EuCl₃, NaBr, 2 CH₃OH (1014,51)

berechnet: C H N

41,43 3,67 9,66

gefunden: C H N

41,23 3,95 9,63
Beispiel 3: Herstellung des Makrobizyklus der Formel (12) Py·Bpy(CO₂Et)₂·Bpy(CO₂Et)₂
Diese Verbindung wird gemäß dem nachfolgend dargestellten Schema hergestellt.
a) Herstellung des Makrozyklus der Formel (11)
Die folgende Reaktionsabfolge ergibt den bpy·bpy-Diamintetraester-makrozyklus (11).
– Tosyl-bpy·bpy-tetraester-makrozyklus (9)
Ein Gemisch aus 5,5 g (12 mmol) 6,6'-Dimethyl-2,2'-dibrommethyl-4,4'-bipyridindicarboxylat (8) (beschrieben in Helv. Chim. Acta, 1988, 71, 1042), 4,64 g frisch hergestelltem Tosylamid-Natriumsalz (24 mmol), und 900 ml absolutem Ethanol wird 26 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt. Diese Suspension wird danach im Eisbad 1 Stunde abgekühlt und anschließend filtriert. Der isolierte Niederschlag wird dann mit 700 ml Wasser, 500 ml Ethanol und 20 ml Chloroform gewaschen, so daß man 1,88 g (31,6%) von (9) erhält.
DC: Rf: 0,7 [SiO₂/CHCl₃-MeOH (99/1)]
HPLC: Tr: 36,1
MS (FAB)+: MNBA-Matrix 991 (M⁺, 45%); 835 (L-Tos, 12%).
MA: C₅₀H₅₀O₁₂N₆S₂NaBr. (1094)

berechnet: C H 4,6 N S Na 2,1

54,89 7,68 5,86

gefunden: C H N S Na

55,66 4,64 7,75 6,04 3,19
Bpy·Bpy·-Tetrasäure-makrozyklus (10)
Eine Lösung von 0,15 g (0,15 mmol) des Tosylmakrozyklus (9) in 1 ml konzentrierter H₂SO₄ wird 3 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre bei 100°C erhitzt. Anschließend wird das Reaktionsmedium im Eisbad abgekühlt, durch Zugabe von 5 ml Wasser verdünnt und danach durch Zugabe von 7 ml 5 N NaOH auf pH 3,0 gebracht. Der gebildete Niederschlag wird anschließend abfiltriert, gründlich mit Wasser (50 ml) gewaschen und danach getrocknet. Der auf diese Weise (wahrscheinlich in Form des Aminsalzes) isolierte Tetrasäuremakrozyklus (10) wird ohne weitere Aufreinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
Bpy·Bpy·Diamin-tetraethylester-makrozyklus (11)
Eine Suspension von 53 mg Verbindung (10) in 100 ml absolutem Ethanol und 0,5 ml konzentrierter H₂SO₄ wird 28 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückflut erhitzt. Die erhaltene homogene Lösung wird danach nacheinander im Eisbad abgekühlt, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung neutralisiert und mit 80 ml CHCl₃ (4 × 20) versetzt, so daß 60 mg Verbindung (11) (quantitativ) erhalten werden.
DC: Rf: 0,7 [Al₂O₃/CH₂Cl₂-MeOH (80/20)]
HPLC: Tr: 17,2
UV: CHCl₃: 243,1 nm (24150); 303,2 nm (25210).
NMR: ¹H (CDCl₃); innerer Standard TMS.
1,44 (t, J = 7,0 Hz, 12H, CH₃); 2,29 (s, breit, NH);
4,17 (s, 8H, CH₂) 4,39 (q, J = 6,9 Hz, 8H, CH₂-Ester);
7,43 (d, J = 1,4 Hz, 4H, BPy); 8,29 (d, J = 1,1 Hz, 4H, BPy).
¹³C (CDCl₃); innerer Standard 77,0 ppm.
14,9 (CH₃, CO₂CH₂ CH ₃); 56,8 (CH₂); 62,3 (CO₂CH₂ CH ₃); Ct (119; 122,5); Cq (138,9; 158,9; 161,4); 165,7 (CO₂C₂H₅)
MS(FAB⁺): Thioglyzerinmatrix
683 (M⁺, 100)
MA: C₃₆H₃₈N₆O₈, H₂O (700,74)

berechnet: C H N

61,7 5,75 11,99

gefunden: C H N

62,2 6,01 11,48
b) Herstellung des Alkalicryptats der Formel (12) [Na⁺ ⊂ Py·Bpy(CO₂Et)₂·Bpy(CO₂Et)₂]Br^–
Ein Gemisch aus 180,7 mg (0,265 mmol) makrozyklischem Diamin (11) und 195,5 mg (2,65 mmol) Li₂CO₃ in 360 ml wasserfreiem CH₃CN wird unter einer Stickstoffatmosphäre 35 min am Rückfluß erhitzt. Die erhaltene Suspension wird mit einer Lösung von 70,7 mg (0,267 mmol) 2,6-Dibrommethylpyridin (7) [die Darstellung dieser Verbindung wurde von Vogtle, ausgehend von Lutidin, beschrieben: Synthesis, 1977, 273] in 360 ml wasserfreiem CH₃CN langsam versetzt (5 Stunden). Die Rückflußtemperatur wird 72 Stunden beibehalten und das Reaktionsmedium anschließend im Eisbad abgekühlt. Nach Filtration der unlöslichen Carbonate wird das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoffrückstand wird an einer Aluminiumoxidsäule mit CH₂Cl₂/EtOH als Elutionsmittel (99/1–85/15) unter Erhalt von 78 mg (12) (33%) chromatographiert.
DC: Rf = 0,6 [Al₂O₃/CHCl₃-MeOH (90/10)]
HPLC: Tr = 20,8
UV: CHCl₃: 250 nm (24900); 316 nm (18900)
NMR: ¹H (CDCl₃); innerer Standard TMS
1,45 (t, J = 7,1 Hz, 12H, CH₃); 4,07 (s, 4H, CH₂); 4,14 (d, J = 15,4 Hz, AB, 4H, CH₂); 4,22 (d, J = 15,3 Hz, AB, 4H, CH₂); 4,46 (q, J = 7Hz, 8H, CH₂-Ester); 7,27 (d, J = 7,7 Hz, 2H; Py); 7,66 (t, j = 7,7 Hz, 1H, Py); 7,93 (s, 4H, Bpy); 8,42 (s, 4H, Bpy).
¹³C (CDCl₃); innerer Standard 77 ppm.
14,3 (CH₃, CO₂Et); 59,4 (CH₂); 59,5 (CH₂); 62,5 (CH₂, CO₂Et); Ct (119,3; 122,8; 123; 138,1); Cq (140,5; 155,1; 157,8; 160,1); 164,5 (CO₂Et).
MS: (FAB⁺/NBA-Matrix)
808,4 (Ligand-Li⁺+Na⁺, 100%); 663,3 (Ligand+Na⁺-2CO₂Et, 5%).
MA: C₄₃H₄₃N₇O₈NaBr, CH₂Cl₂ (972, 68)

berechnet: C H N 10

54,3 4,6

gefunden: C H N

54,9 4,0 9,8
Beispiel 4: Herstellung des Europiumcryptats der Formel 12a [Eu³ ⁺ ⊂ Py·Bpy(CO₂H)₂·Bpy(CO₂H)₂]
a) Herstellung des Europiumkomplexes von Ligand 12 aus Beispiel 3 [Eu³⁺ ⊂ Py·Bpy(CO₂Et)₂Bpy(CO₂Et)₂]
33 mg (9 × 10^–5 mol) EuCl₃·6H₂O werden zu 69 mg (7,7 × 10^–5 mol) des in 32 ml wasserfreiem CH₃CN vorliegenden Natriumcryptats (12) gegeben. Die erhaltene Suspension wird 27 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt; nach Abkühlen wird das Lösungsmittel abgezogen. Anschließend ergibt eine Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands 25 mg des Europiumcryptats [Eu³⁺ ⊂ 12] (25%).
HPLC: Tr: 21
UV: EtOH/330 nnm (21000)
MS: (FAB⁺) Thioglyzerinmatrix
1164,2 [ (Eu³ ⁺ ⊂ 12 + 2CF₃CO₂ ^–)⁺, 64%
1051,8 [Eu³⁺ ⊂ 12 + CF₃CO₂ ^– + H) 100%]
937,4 [ (Eu² ⁺ ⊂ 12 – 1H) 35%]
b) Herstellung des Säurecryptats der Formel 12a
100 μl wäßrige 1,6 M Natriumhydroxidlösung werden zu einer wäßrigen Lösung von 10 mg (7,83 × 10^–6 mol) Europiumcryptat [Eu³ ⁺ ⊂ 12] gegeben. Das erhaltene Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und anschließend zur Trockne eingeengt. Die Aufreinigung des erhaltenen Rückstands mittels (Umkehrphasen-)Chromatographie mit einem Gemisch von H₂O mit 1% TFA/CH₃CN als Elutionsmittel ergibt 8 mg (quantitativ) des Europiumcryptats der Formel 12a.
Beispiel 5: Herstellung des Pyridindiethylesterbispyridin-tetra-tert.-butylester-makrobizyklus der Formel (16)
a) Herstellung von 2,6-Dibrommethyl-3,5-pyridincarbonsäurediethylester der Formel (14)
Diese Verbindung wird nach einer herkömmlichen Vorschrift zur Bromierung mit freien Radikalen, wobei von kommerziellem 2,6-Dimethyl-3,5-pyridincarbonsäurediethylester ausgegangen wird, synthetisiert.
Ein Gemisch von 0,5 g (2 mmol) 2,6-Diethyl-3,5-dimethylpyridincarboxylat, 0,89 g (5 mmol) NBS und 4 mg AIBN in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff wird 2 Stunden unter Bestrahlung mit einer Lampe im sichtbaren Bereich (100 W) am Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Suspension im Eisbad abgekühlt und danach zur Abtrennung des gebildeten Succinimids filtriert. Das Filtrat wird dann zur Trockne eingeengt; die Chromatographie des erhaltenen Rückstands an Siliziumdioxid mit einem Hexan/Chloroform-Gemisch als Elutionsmittel (Gradient: 50/50–30/70) ergibt 195 mg des Bromderivats der Formel (14) (26%).
DC: Rf = 0,4 (SiO₂/CH₂Cl₂)
HPLC: Tr = 25,5
UV: CHCl₃/245 nm (9400)
NMR: ¹H (CDCl₃); innerer Standard TMS
1,45 (t, J = 7,0 Hz, 6H, CH₃); 4,47 (q, J = 7,2 Hz, 4H CH₂); 5 (s, 4H, CH₂Br); 8,80 (s, 1H, Py)
b) Herstellung des Diamin-bisbipyridin-tetra-tert.-butylester-makrozyklus der Formel (15)
Diese Verbindung wird durch einfache Umesterung synthetisiert, wobei von Lithium-tert.-butanolat und dem Makrozyklus (11) aus Beispiel 3 ausgegangen wird.
Ein Gemisch aus 251 mg Makrozyklus (11) (0,36 mmol), 363 mg (4,5 mmol) Lithium-tert.-butanolat, 35 ml trockenem Toluol und 35 ml trockenem tert.-Butanol wird bei 80°C unter einem Stickstoffstrom etwa 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das tert.-Butanol durch Abdampfen abgetrennt; die zurückbleibende organische Phase wird zunächst mit Wasser auf einen neutralen pH-Wert gewaschen (6 × 50 ml) und anschließend nacheinander über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockne eingeengt. Durch Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands mit CH₃CN und H₂O mit 1% TFA als Elutionsmittel erhält man 117 mg des Makrozyklus (15) (40%).
HPLC: Tr = 22,4
UV: CHCl₃/311 nm (18000); 280 nm (8300); 268 nm (7200)
NMR: ¹H (CDCl₃); innerer Standard TMS
1,65 (s, 36H, CH₃); 4,69 (s, 8H, CH₂); 7,97 (s, 4H, H bpy); 8,51 (s, 4H, Hbpy).
MS: (ES) 796 (M+H).
c) Herstellung des Alkalicryptats der Formel (16) (Li⁺ ⊂ bpy(CO₂tbu)₂·bpy(CO₂tbu)₂·Py(CO₂Et)₂]Br^–
Ein Gemisch aus 25,3 mg (3,18 × 10^–5 mol) Makrozyklus (15) und 27 mg (3,65 × 10^–4 mol) Li₂CO₃ in 25 ml wasserfreiem CH₃CN wird 15 min unter einem Stickstoffstrom am Rückfluß erhitzt. Eine Lösung von 12,7 mg (3,1 × 10^–5 mol) 2,6-Diethyl-3,5-dibrommethylpyridincarboxylat (14) in 12 ml CH₃CN wird über 10 min zu der erhaltenen Suspension zugetropft. Unter diesen Bedingungen wird 23 Stunden lang gerührt und das Reaktionsmedium anschließend im Eisbad abgekühlt und danach filtriert. Nach Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhält man durch Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands 12 mg (35%) Makrobizyklus (16)
HPLC: Tr = 28,5
MS: (ES) 1042,3 [Ligand-Li⁺-Br^– (100%)]; 1064,3 [Ligand-Li⁺-Br^–+Na⁺ (30%)]
Beispiel (6): Herstellung des Europiumcryptats der Formel (19) [Eu³ ⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(NH₂)₂]
a) Herstellung des Europiumkomplexes des Liganden (16) aus Beispiel (6) [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂tbu)₂·bpy·(CO₂tbu)₂·Py(CO₂Et)₂
12,8 mg (3,5 × 10^–5 mol) EuCl₃·6H₂O werden zu einer Lösung von 17,1 mg (1,51 × 10^–5 mol) Lithiumcryptat (16) in 10 ml wasserfreiem Acetonitril gegeben. Anschließend wird der Reaktionsansatz 3 Stunden unter einem Stickstoffstrom am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel abgezogen und der erhaltene Rückstand (m = 27,6 mg) ohne weitere Aufreinigung im anschließenden Schritt eingesetzt.
b) Herstellung des Säure-Europiumcryptats [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(CO₂Et)₂](CF₃CO₂)₃
Diese Reaktion besteht in der selektiven Hydrolysierung der von den Bipyridinuntereinheiten getragenen tert.-Butylester durch Versetzen mit reiner Trifluoressigsäure.
27,6 mg des in Abschnitt a) aus Beispiel 6 erhaltenen Rückstands werden in 14 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die erhaltene homogene Lösung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockne eingeengt, indem die Säure im Vakuum abgezogen wird. Durch Umkehrphasenchromatographie mit einem Gemisch von H₂O mit 1% TFA/CH₃CN als Elutionsmittel erhält man 10,4 mg des Europiumcryptats [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(CO₂Et)₂](CF₃CO₂)₃
HPLC: Tr = 13,7
UV: MeOH/324,6 nm (16000); 337 nm (13300)
c) Herstellung des Europiumcryptats der Formel (19)
Eine Lösung von 300 μl Ethylendiamin (4,45 × 10^–3 mol) in 300 μl wasserfreiem MeOH wird über 5 min unter Kühlen im Eisbad sowie einem Stickstoffstrom zu einer Lösung von 10 mg (8,03 × 10^–6 mol) Europiumcryptat [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·Py(CO₂Et)₂] in 2 ml wasserfreiem MeOH gegeben. Anschließend erhöht man die Temperatur des Mediums allmählich auf 20°C, wonach 2,5 Stunden unter diesen Bedingungen gerührt wird. Nach Abziehen des Lösungsmittels erhält man durch Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands mit einem Gemisch von H₂O mit 1% TFA/CH₃CN als Elutionsmittel 5,5 mg Cryptat (19) (45%).
UV: MeOH/325 nm (17000)
Beispiel 7: Herstellung des Europiumcryptats der Formel (20)
Diese Verbindung wird gemäß dem nachfolgend dargestellten Schema hergestellt.
Eine Lösung von 195 µg (4,45 × 10^–7 mol) SulfoSMCC 168 µl Phosphatpuffer wird über 45 min zu einer im Eisbad gekühlten Lösung von 0,2 mg (1,28 × 10^–7 mol) Verbindung (19) in 200 µl 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zugetropft. Nach erfolgter Zugabe wird die Temperatur des Mediums auf 20–25°C zurückgebracht und die Reaktion unter diesen Bedingungen weitere 3 Stunden fortgesetzt. Anschließend erhält man durch direkte Aufreinigung mittels Umkehrphasenchromatographie mit einem Gemisch von H₂O mit 1% TFA/CH₃CN als Elutionsmittel 100 µg Cryptat (20) (50%).
Beispiel 8: Kupplung der Verbindung der Formel (20) mit Protein
a) Aktivierung des Proteins
3,14 mg (4,43 mg/ml) Antikörper (freier PSA, Klon A455, CIS bio international, Frankreich) werden 30 min bei Raumtemperatur in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aktiviert, indem mit 26,2 µl einer ethanolischen Lösung von SPDP mit 2 mg/ml (ursprüngliches Molverhältnis von Reagens zu Protein: 8) versetzt wird. Am Ende dieses Zeitraums werden Thiolfunktionen (SH) erzeugt, indem das Reaktionsmedium mit 37 µl einer Dithiothreitol(DTT)-Lösung mit 61,7 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) versetzt wird und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert wird; anschließend wird das Gemisch an einer Sephadex G25 HR10-10-Säule mit dem während der Aktivierung verwendeten Puffer als Elutionsmittel aufgereinigt.
b) Kupplung des aktivierten Proteins und des Cryptats der Formel (20)
55 µl einer Lösung mit 1 mg/ml Cryptat der Formel (20) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) werden zu 386 µl einer Lösung des Antikörpers A455 (1,2 mg/ml im gleichen Puffer), der gemäß der in Abschnitt a) aus Beispiel 8 beschriebenen Vorschrift aktiviert wurde, gegeben, wonach 20 Stunden bei 4°C inkubiert wird; am Ende dieses Zeitraums wird der Reaktionsansatz an einer Sephadex G25 HR10-30-Säule mit dem Puffer für die Kupplungsreaktion als Elutionsmittel aufgereinigt. Absorptionsmessungen des Antikörper-Cryptat-Konjugats bei 280 nm und 325 nm ergeben einen Markierungsgrad von 8,0 sowie eine Ausbeute von 80%.
Beispiel 9: Demonstration der geringen Empfindlichkeit der Pyridincryptate aus Beispielen 2, 4(b), 6(c), 7 und 8 gegenüber Löschung im Serum.
Die unten angegebenen Bestimmungen wurden an einem LS-50-Spektrofluorimeter von Perkin-Elmer durchgeführt.
Die Fluoreszenzlebensdauermessungen der getesteten Cryptate wurden gemäß der in der EP 0 601 113 offenbarten Vorschrift durchgeführt.
Die Verbindungen wurden in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) sowie in NCS (Newborn Calf Serum) getestet. Die Lösungen zur Messung der Cryptatkonzentration von etwa 10^–6 M/l wurden durch Verdünnen der Stammlösung auf 1/100 entweder mit dem Puffer allein oder mit einem Gemisch aus 2/3 Puffer bis 1/3 Serum hergestellt.
Die Pyridincryptate aus Beispielen 2, 4(b), 6(c), 7 und 8 wurden im Vergleich mit dem Trisbipyridindiamincryptat (KNH₂) und dem Pyridinbispyridin-cryptat [Eu³ ⁺Cpy·Bpy·Bpy], deren Herstellung jeweils in der EP 0 321 353 bzw. in der Helv. Chim. Acta 1988, 71, 1042 beschrieben ist, getestet.
Die Formeln dieser beiden Moleküle sind nachfolgend angegeben:
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen, daß der Austausch einer Bipyridineinheit gegen eine Pyridineinheit in einer Trisbipyridin-Cryptatstruktur dazu führt, daß die durch das Serum verursachte Fluoreszenzlöschung reduziert wird. Diese Ergebnisse zeigen ebenso, daß das Vorliegen von Carboxylatgruppen an den Bipyridineinheiten einen günstigen Einfluß auf die Reduzierung der Löschung hat.

Claims

Verfahren zum Reduzieren der Fluoreszenzlöschung, die durch das Meßmedium bei einem Fluoreszenztest eines Analyten unter Verwendung von wenigstens einer Fluoreszenzmarkierung hervorgerufen wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein makropolyzyklischer Seltenerdkomplex in das Meßmedium eingeführt wird, wobei dieser Komplex aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die der Formel II entspricht:
in welcher: – der Ring der Formel
der Bis-Bipyridinmakrozyklus ist, mit der Formel:
– n = 0, 1 oder 2 ist, – R₁ eine -COOR₃-Gruppe ist, in welcher R₃ Wasserstoff, eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe oder eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist; – R₂ Wasserstoff oder eine Elektronendonorgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A, mit der Vorgabe, daß nicht mehr als einer der Substituenten R₁ und R₂ eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt und R₁ und R₂ nicht gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-YA oder -Y-A darstellen; – A eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent mit einer biologischen Substanz zu binden, – Y eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylen- oder Alkenylengruppen, C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen; C₆- bis C₁₄-Arylengruppen; C₁- bis C₂₀-Alkylen- oder Alkenylengruppen, die eines oder mehrere Heteroatome enthalten, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor oder eine oder mehrere Carbamoylgruppe(n) oder Carboxamidogruppe(n); wobei die Alkylen-, Alkenylen-, Cycloakylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls mit Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₃ gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ eine Elektronendonorgruppe ist, gewählt aus Carboxylat, -NH₂, -NHAlk, -N(Alk)₂, OH, O, -OAlk, Alk, -CH(Alk)₂, -C(Alk)₃, -NHCOAlk, welche gegebenenfalls substituiert sind mit Phenyl; wobei Alk eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexierte Seltenerdmetallion ein Europiumion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der makropoylzyklische Seltenerdmetallkomplex gewählt ist aus Europiumcryptaten [Eu³⁺ ⊂ py·bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂], [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·py(NH₂)₂] und [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂- py(CONH(CH₂)₂NHR₄]₂, bei weichem
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der makropolyzyklische Seltenerdmetallkomplex als alleinige Markierung oder als eine der Markierungen in dem Test verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Meßmedium ein biologisches Medium ist, insbesondere ein Serummedium.
Makropolyzyklischer Seltenerdmetallkomplex, der aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die der Formel II entspricht:
in welcher: – der Ring der Formel
der Bis-Bipyridinmakrozyklus ist, mit der Formel:
– n = 0, 1 oder 2 ist, – R₁ eine -COOR₃-Gruppe ist, in welcher R₃ Wasserstoff, eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe oder eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist; – R₂ Wasserstoff oder eine Elektronendonorgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A, mit der Vorgabe, daß nicht mehr als einer der Substituenten R₁ und R₂ eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt und R₁ und R₂ nicht gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-YA oder -Y-A darstellen; und mit der Vorgabe, daß wenn n = 0, R₂ verschieden von Wasserstoff ist, – A eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, sich kovalent mit einer biologischen Substanz zu verbinden, – Y eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylen- oder Alkenylengruppen, C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen; C₆- bis C₁₄-Arylengruppen; C₁- bis C₂₀-Alkylen- oder Alkenylengruppen, die eines oder mehrere Heteroatome enthalten, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor oder eine oder mehrere Carbamoylgruppe(n) oder Carboxamidogruppe(n); wobei die Alkylen-, Alkenylen-, Cycloakylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls mit Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
Komplex nach Anspruch 8, wobei R₃ gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppen.
Komplex nach Anspruch 8, wobei R₂ eine Elektronendonorgruppe ist, gewählt aus Carboxylat, -NH₂, -NHAlk, -N(Alk)₂, -OH, O, -OAlk, Alk, -CH(Alk)₂, -C(Alk)₃, -NHCOAlk, welche gegebenenfalls substituiert sind mit Phenyl; wobei Alk eine (C1-C4)-Alkylgruppe ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexierte Seltenerdmetall ein Europiumion ist.
Komplex nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die der Formel II entspricht, in welcher: n = 0, Y, A und R₁ wie in Anspruch 8 definiert sind, und R₂ wie in Anspruch 8 definiert ist und einer der Substituenten R₂ eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 8 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er gewählt ist aus Europiumcryptaten [Eu³⁺ ⊂ py·bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂], [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂·py(NH₂)₂] und [Eu³⁺ ⊂ bpy(CO₂H)₂·bpy(CO₂H)₂- py(CONH(CH₂)₂NHR₄]₂, bei weichem
Fluoreszenzkonjugat, bestehend aus einem Komplex nach einem der Ansprüche 8 bis 13, der konvalent an einen Teil eines Paars von Molekülen, die in der Lage ist spezifisch aneinander zu binden, gebunden ist, insbesondere ein Polypeptid, ein Protein, einen Zellrezeptor, ein Antigen, einen Antikörper oder eine Nukleinsäure.
Verwendung eines makropolyzyklischen Komplexes nach einem der Ansprüche 8 bis 13 zur Reduzierung der Fluoreszenzlöschung, die durch das Meßmedium bei einem Fluoreszenztest eines Analyten hervorgerufen wird.