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DE3587380T2 - Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden und Verwendung als fluoreszierende Markierungen. - Google Patents

Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden und Verwendung als fluoreszierende Markierungen.

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Publication number
DE3587380T2
DE3587380T2 DE85401838T DE3587380T DE3587380T2 DE 3587380 T2 DE3587380 T2 DE 3587380T2 DE 85401838 T DE85401838 T DE 85401838T DE 3587380 T DE3587380 T DE 3587380T DE 3587380 T2 DE3587380 T2 DE 3587380T2
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DE
Germany
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bis
macropolycyclic
rare earth
bipyridine
dioxaoctamethylene
Prior art date
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Application number
DE85401838T
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DE3587380D1 (de
Inventor
Jean Marie Lehn
Gerard Mathis
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CIS Bio International SA
Original Assignee
CIS Bio International SA
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Publication date
Application filed by CIS Bio International SA filed Critical CIS Bio International SA
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Publication of DE3587380T2 publication Critical patent/DE3587380T2/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Description

  • Die vorliegende Erfindung, die auf eine Zusammenarbeit mit Prof. J.M. Lehn und seinem Arbeitskreis der Universität Louis Pasteur, Straßburg, zurückgeht, betrifft das Gebiet der Fluoreszenz und insbesondere von fluoreszierenden makropolyzyklischen Komplexen, die insbesondere als Marker bei immunologischen Bestimmungen geeignet sind.
  • Es ist bekannt, daß Nachweismethoden, die sich der Fluoreszenz bedienen, von Natur aus sehr empfindlich sind und Nachweisgrenzen, die unter den mit Radioaktivitätsmessungen erreichten Grenzen liegen, ermöglichen, insbesondere durch Verwendung von Laserquellen (I. Wieder, Immunofluorescence and related staining techniques, 1978, Elsevier).
  • Jedoch werden in der Praxis diese Nachweisgrenzen nicht erreicht, da die Messung in einer Matrize durchgeführt wird, die nicht die zum Erreichen dieses Optimums erforderlichen Eigenschaften aufweist. Im allgemeinen ist das Meßmedium trübe und begünstigt die Diffusion. Ferner können andere Moleküle, die bei der gleichen Wellenlänge fluoreszieren, im Meßmedium vorhanden sein.
  • In bestimmten Fällen reichen Verbesserungen an der Meßapparatur nicht aus, um diese Nachweisgrenze merklich zu verbessern, oder diese Verbesserungen sind sehr kostspielig (Laser, Monochromatoren und dergl.
  • Dieser Umstand ist auf dem Gebiet der Biochemie und der Immunologie noch störender, wo die Messung von sehr kleinen Mengen an aktiven Molekülen in biologischen Medien durchgeführt werden muß, die eine Trübung aufweisen oder selbst fluoreszierende Proteine oder andere Moleküle (Trübung und naturgegebene Fluoreszenz von Serum) enthalten können.
  • Bei immunologischen Bestimmungen unter Verwendung eines fluoreszierenden Tracers und bei der Markierung eines Antigens oder Antikörpers mit einem fluoreszierenden Molekül, muß dieses fluoreszierende Molekül folgende Eigenschaften aufweisen:
  • - Es muß eine chemische Funktion besitzen, die eine Kupplung mit dem biologischen Molekül ermöglicht, ohne daß dieses denaturiert oder in seinen immunologischen Eigenschaften verändert wird;
  • - der molare Absorptionskoeffizient des fluoreszierenden Moleküls muß so hoch wie möglich sein;
  • - die Quantenausbeute der Fluoreszenz muß möglichst hoch sein;
  • - die Stokes-Verschiebung muß möglichst ausgeprägt sein;
  • - die Emissionswellenlänge muß nach Möglichkeit größer als 500 nm sein;
  • - es muß in Wasser oder Pufferlösungen löslich sein. Diese Bedingungen sind beispielsweise im Artikel von E. Soini, Clin. Chem., Bd. 25 (1979), S. 353 näher ausgeführt. Jedoch sind bei bisher bekannten Molekülen diese Eigenschaften bei weitem nicht verwirklicht.
  • Die Fluoreszenz von bestimmten Chelaten von Seltenen Erdmetallen ist dank der Arbeiten über deren Anwendung auf dem Gebiet der Laser seit vielen Jahren bekannt (A.P.B. Sinha, Spectroscop. Inorg. Chem., Bd. 2 (1971), S. 255.
  • Diese Komplexe sind gebildet:
  • - einerseits aus einem chelatbildenden Molekül mit einem elektronischen System, das befähigt ist, den Triplett-Zustand T&sub1; durch Intersystem-Umwandlung nach Anregung des Singulett- Zustands S&sub1; als Folge der Absorption von Lichtenergie zu besetzen;
  • - andererseits aus einem Ion eines Seltenen Erdmetalls, das bei Fluoreszenzanwendungen eine hohe Intensität der Ionenfluoreszenz (Eu, Tb) oder eine mittlere Intensität (Sm, Dy) aufweist und dessen Resonanzniveau durch nicht-strahlende Energieübertragung ausgehend vom Triplett-Zustand des Komplexierungsmittels besetzt ist.
  • Um eine starke Fluoreszenz des Chelats des Seltenen Erdmetalls zu erreichen, muß gewährleistet sein, daß die Triplett- Energie des komplexbildenden Moleküls über dem Resonanzniveau des Ions liegt und daß seine Lebensdauer ausreichend ist (Vorherrschen dieses Typs von Inaktivierung im Vergleich zu anderen Prozessen, wie Phosphoreszenz und nicht-strahlende Desaktivierung, beispielsweise thermische Desaktivierung). In diesem Fall beobachtet man nach Anregung in der Absorptionsbande des Chelats eine Fluoreszenzcharakteristik des Ions des Seltenen Erdmetalls.
  • Diese Verbindungen besitzen große Vorteile auf dem Gebiet des Nachweises durch Fluoreszenzmessungen; beispielsweise sind sie charakterisiert durch:
  • - eine erhebliche Stoke-Verschiebung,
  • - einen im Vergleich zum Seltenen Erdmetall erhöhten molaren Absorptionskoeffizienten ε,
  • - die Möglichkeit zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren Chelaten unter Austausch des Seltenen Erdmetalls,
  • - ein für das Seltene Erdmetall charakteristisches Emissionsspektrum (Linienspektrum, λ der maximalen Emission > 500 nm),
  • - lange Lebensdauer (von einer Mikrosekunde bis zu einer Millisekunde).
  • Das US-Patent 4 058 732 beschreibt ein auf Fluoreszenz beruhendes spektroskopisches Analysenverfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Molekülen (Chelate von Seltenen Erdmetallen) mit einer relativ langen Lebensdauer. Aufgrund der Tatsache, daß die Diffusion aufgrund von Teilchen der Matrize und die Fluoreszenz des Großteils der diese bildenden organischen Moleküle Erscheinungen von kurzer Dauer darstellen (im allgemeinen unter 1 usec), werden im vorgenannten Patent eine pulsierte Anregung und ein Seltenes Erdmetall-Chelat, das zur Markierung von zu identifizierenden biologischen Molekülen funktionalisiert ist, empfohlen, wobei der Nachweis zwischen den einzelnen Pulsierungen und nach einer ausreichend langen Zeitspanne, um eine Verringerung von unerwünschten Erscheinungen in erheblichem Umfang zu gewährleisten, vorgenommen wird.
  • Gemäß dem vorgenannten Stand der Technik weisen die Chelate von Seltenen Erdmetallen theoretisch alle Voraussetzungen für eine Klasse von idealen fluoreszierenden Molekülen auf, insbesondere als Marker für biologische Moleküle bei immunologischen Bestimmungen, in der Zytologie und für Zelltrennvorrichtungen:
  • - US-Patent 4 058 732
  • - Soini, Clin. Chem., Bd. 25 (1979), S. 353
  • - L.M. Vallarino et al., Automation of Uterine Cancer Cytology.
  • 2. Proceeding of 2nd Int. Conf., G.L. Wied, G.F. Gahr, P.H. Bartel, Editors Tutorials of Cytology, Chicago, IL, 1977.
  • Jedoch stellt man in der Praxis fest, daß die bisher verwendeten Chelate nicht alle nachstehend aufgeführten, für derartige Anwendungszwecke erforderlichen Eigenschaften aufweisen, wobei es sich vorwiegend um folgende Eigenschaften handelt:
  • - eine erhöhte Quantenausbeute der Fluoreszenz und ein erhöhter molarer Absorptionskoeffizient,
  • - eine angepaßte Triplett-Energie des chelatbildenden Mittels,
  • - eine nicht-vorliegende Hemmung durch das Lösungsmittel (Wasser oder ein anderes Lösungsmittel) oder durch im Medium, in dem die Messung durchgeführt wird, vorhandene Moleküle,
  • - eine erleichterte Funktionalisierung im Hinblick auf die Kupplung an Moleküle von biologischem Interesse oder andere Bestandteile,
  • - eine Selektivität der Chelatbildung zu Gunsten des Seltenen Erdmetalls und zu Lasten anderer Kationen, die sich in erheblichen Mengen im Meßmedium befinden können,
  • - eine Löslichkeit in Wasser unter den Anwendungsbedingungen der immunologischen Bestimmungen,
  • - eine hohe Stabilität, insbesondere bei schwacher Verdünnung.
  • Die im US-Patent 4 058 732 beschriebenen Chelate von β-Diketonen sind in Wasser und biologischen Medien wenig oder gar nicht löslich und ihre Fluoreszenz wird durch Wasser weitgehend gehemmt.
  • Weitere Chelate wurden als Marker in immunologischen Bestimmungen vorgeschlagen. Zu erwähnen sind insbesondere die Chelatderivate von EDTA, HEDTA und DTPA, Imidodiacetat und ähnlichen Produkten, die beispielsweise in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 72 (1975) , S. 4764, im US-Patent 4 374 120 sowie in den Patentanmeldungen EP-A-0068 875 und DE-OS 30 33 691 beschrieben sind. Man nimmt an, daß ihre Wirksamkeit auf dem erhöhten Wert ihrer Stabilitätskonstanten von im allgemeinen mehr als 10¹&sup0; beruht.
  • Ein derartiges Kriterium, das allein auf thermodynamischen Erwägungen beruht, ist sicherlich nicht ausreichend, da gezeigt worden ist, daß es sich um eine Verlängerung der Lebensdauer eines Tb(III)-EDTA-Komplexes durch Addition von Apotransferrin handelt (Biochem., Bd. 19 (1980), S. 5057), die charakteristisch für eine Protein-Chelat-Bindung ist.
  • Kürzlich wurde empfohlen, bei der Verwendung von Markern des Typs Eu(III)-EDTA, wie sie beispielsweise im US-Patent 4 374 120 beschrieben sind, einen Puffer mit einem Gehalt an DTPA zu verwenden, um das freie Europium, das vom Chelat dissoziiert ist, zu entfernen, was gut die Instabilität derartiger Chelate zeigt (Clin. Chem., Bd. 29 (1983), S. 60.
  • Dieser Stand der Technik zeigt, daß die Chelate von Seltenen Erdmetallen, die bisher eingeführt worden sind, nicht bei schwacher Verdünnung in wäßrigen Medien mit einem Gehalt an anderen Kationen oder in biologischen Medien und insbesondere bei immunologischen Bestimmungen verwendbar sind und daß es zweckmäßig ist, Kriterien wie die kinetische Stabilität (Geschwindigkeit der Dissoziation des Komplexes) und die Selektivität der Komplexbildung des Seltenen Erdmetalls zu berücksichtigen.
  • Ferner ist festzustellen, daß der Großteil der Chelate gemäß dem Stand der Technik aufgrund ihrer erhöhten Bildungskonstanten (im allgemeinen > 10¹&sup0;) ihre Anwendung in der Abbildung durch y-Technik gefunden haben, bei der man schwere, γstrahlende Ionen von relativ geringer Lebensdauer verwendet, die in verdünnten wäßrigen Lösungen erhalten worden sind. Die Fixierung des Ions muß dann rasch am in Frage stehenden biologischen Molekül, das das chelatbildende Mittel trägt, erfolgen; insbesondere muß die Geschwindigkeit der Bildung des Chelats erhöht sein:
  • L + n EDTA L (EDTA)n
  • wobei K&sub1; und K-1 die Geschwindigkeitskonstanten der Bildung bzw. der Dissoziation bedeuten; im Gleichgewichtszustand gilt:
  • K = k&sub1;/k-1 = L (EDTA)n/[L] [EDTA]n
  • Für sämtliche bisher verwendeten Komplexe hat man aus den vorstehend aufgeführten Gründen immer Chelate verwendet, die die Erzielung eines erhöhten K&sub1;-Werts zulassen [ 1,9·10²²M&supmin;¹ ·min&supmin;¹ für Eu³+ EDTA; vgl. J. Inorg. Nucl. Chem., Bd. 33 (1971), S. 127). Es ergibt sich, daß für einen gegebenen Wert von K die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation relativ wichtig ist, was bedeutet, daß die Geschwindigkeit des Austausches des Ions zwischen dem Chelat und der Lösung relativ rasch ist.
  • Weitere makropolyzyklischen Verbindungen, die zur Bildung von Komplexen geeignet sind und bestimmte Metallionen enthalten, wurden bereits beschrieben. Diesbezüglich ist insbesondere auf das FR-Patent 2 088 519 hinzuweisen, das makropolyzyklische Heteroamine zum Gegenstand hat, die mit "Kronen"-, "Laternen" - und "Hantel" -Verbindungen verwandt sind.
  • Man hat nunmehr makropolyzyklische Komplexe von Seltenen Erdmetallen aufgefunden, die hervorragende Selektivitäts- und Stabilitätseigenschaften aufweisen, insbesondere eine kinetische Stabilität in wäßrigen und biologischen Medien. Diese makropolyzyklischen Komplexe eignen sich besonders gut als fluoreszierende Marker von biologischen Substanzen bei immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung aufgrund von Fluoreszenz. Sie eignen sich auch als reaktive Bestandteile bei Lumineszenzreaktionen.
  • Man hat tatsächlich festgestellt, daß es möglich ist, die Fluoreszenz eines Ions eines Seltenen Erdmetalls in wäßriger Lösung zu erhöhen, indem man es mit einer makropolyzyklischen Verbindung komplexiert, die eine Einheit aufweist, die eine Triplett-Energie spendet, die größer ist als das Emissionsniveau des Ions des Seltenen Erdmetalls und diese Donoreinheit anregt.
  • Während die Anregung eines Ions eines Seltenen Erdmetalls eine sehr schwache Fluoreszenz erzeugt, da Seltene Erdmetalle im allgemeinen niedere molare Absorptionskoeffizienten E besitzen, ermöglicht es die Anregung der Donoreinheit der nachstehend definierten makropolyzyklischen Verbindung, eine Erhöhung der charakteristischen Fluoreszenz des Seltenen Erdmetallions zu erzielen. Die auf diese Weise gebildeten Komplexe von Seltenen Erdmetallen sind hervorragende fluoreszierende Marker, bei denen es sich außerdem um in wäßrigen Medien stabile Verbindungen handelt, die eine sehr hohe Selektivität gegenüber den Ionen von Seltenen Erdmetallen aufweisen.
  • Im Gegensatz zu den Chelaten des Stands der Technik, die durch eine erhöhte Bildungskonstante charakterisiert sind, besitzen die erfindungsgemäßen Komplexe von Seltenen Erdmetallen als wesentliche Eigenschaft eine erhöhte kinetische Stabilität (geringe Dissoziationsgeschwindigkeit) . Diese Eigenschaft ist noch wichtiger, da die biologischen Lösungen, die bei den immunologischen Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung verwendet werden, im allgemeinen Proteine enthalten, die ebenfalls zur Fixierung des Ions des Seltenen Erdmetalls befähigt sind. Dagegen ist die Bildungsgeschwindigkeit der erfindungsgemäßen Komplexe nicht kritisch. Die Komplexbildung des Seltenen Erdmetalls einerseits und die Kupplung des erhaltenen Komplexes an das biologische Molekül andererseits können getrennt voneinander realisiert werden. Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Komplexbildung des Seltenen Erdmetalls unter nicht-biologischen Bedingungen erreicht werden kann (Verwendung von organischen Lösungsmitteln, Möglichkeit der Energiezufuhr, Zeit und dergl.).
  • Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von makropolyzyklischen Komplexen von Seltenen Erdmetallen, die mindestens aus einem Salz von Seltenen Erdmetallen bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der allgemeinen Formel
  • komplexiert ist, in der Z ein drei- oder vierwertiges Atom, wie Stickstoff, Kohlenstoff oder Phosphor, ist, R nichts oder Wasserstoff, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder ein Kohlenwasserstoffradiakal darstellt, die zweiwertigen Reste "(A)", "(B)" und "(C)" unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten sind, die ggf. ein oder mehrere Heteroatome enthalten und ggf. durch einen Hetero-Makrozyklus unterbrochen sind, wobei mindestens eines der Reste "(A)", "(B)" oder "(C)" zusätzlich eine molekulare Einheit (Motiv) aufweist oder im wesentlichen durch eine molekulare Einheit gebildet ist, wobei die molekulare Einheit eine Triplett-Energie besitzt, die höher als die des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenen Erdmetallions ist, als fluoreszierende Markierungen, insbesondere bei immunologischen Nachweis- und Bestimmungsverfahren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Erhöhung (Exaltation) der Fluoreszenz eines Seltenen Erdmetallions, das darin besteht, daß man mindestens ein Seltenes Erdmetallion mit einer makropolyzyklischen Verbindung gemäß der vorstehenden Definition, das eine molekulare Einheit aufweist, die eine Triplett-Energie spendet, die höher ist als die des Emissionsniveaus des Seltenen Erdmetallions, komplexiert und daß man den auf diese Weise gebildeten Komplex mit einer Absorptionswellenlänge der Donoreinheit anregt. Bei den vorstehend definierten Komplexen von Seltenen Erdmetallen handelt es sich um neue Verbindungen, mit Ausnahme der Komplexe von Europium und Terbium mit der makropolyzyklischen Verbindung der nachstehenden Formel
  • und der Komplexe von Lanthan und Praseodym mit der vorstehend angegebenen Formel, in der R&sub1; die Bedeutung NH&sub2; hat. Die letztgenannten Komplexe sind in Chemical Abstracts, Bd. 99, Nr. 10 (5. September 1983), S. 676, Nr. 81500q beschrieben.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung als neue Verbindungen Komplexe von Seltenen Erdmetallen, die mindestens aus einem Salz eines Seltenen Erdmetalls bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der vorstehenden Formel I komplexiert ist, vorausgesetzt, daß, wenn das Seltene Erdmetallsalz ein Europium- oder Terbiumsalz ist, Z Stickstoff ist, "(A)" -(CH&sub2;)&sub2;-O-C&sub6;H&sub3;R&sub1;O-(CH&sub2;)&sub2;- mit R&sub1; = H oder NH&sub2; ist, von "(B)" und "(C)" nicht gleichzeitig das eine der Rest -(CH&sub2;)&sub2;- O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- und das andere der Rest -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;ist und daß, wenn das Seltenen Erdmetallsalz ein Lanthan- oder ein Praseodymsalz ist, Z Stickstoff ist, "(A)" -(CH&sub2;)&sub2;- O-C&sub6;H&sub3;NH&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- ist, "(B)" und "(C)" nicht gleichzeitig - (CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- und -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- sind.
  • Die Kohlenwasserstoffketten, die die Reste "(A)", "(B)" und "(C)" bilden, können zwei Kohlenstoffatome enthalten oder können ggf. durch Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome unterbrochen sein.
  • Für die Zwecke der Erfindung bevorzugte Kohlenwasserstoffketten sind Ketten von Polyethern, insbesondere Oxyethylen- oder Polyoxyethylenketten.
  • Die molekulare Einheit, die das wesentliche Element der erfindungsgemäßen makropolyzyklischen Verbindung darstellt, ist eine Donoreinheit von Triplett-Energie, die aus Molekülen oder Molekülgruppen zusammengesetzt ist, die eine Triplett- Energie besitzen, die höher ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenen Erdmetallions.
  • Die Energieübertragung erfolgt vom Triplett-Niveau der Donoreinheit zu den Emissionsniveaus des komplexierten Seltenen Erdmetalls. Beispielsweise besitzt Europium die Emissionsniveaus &sup5;D&sub0; bei 17270 cm&supmin;¹; &sup5;D&sub1; bei 19030 cm&supmin;¹ und ggf. &sup5;D&sub2; und Terbium besitzt das Emissionsniveau &sup5;D&sub4; bei 20480cm&supmin;¹.
  • Die erfindungsgemäß geeigneten Energie-Triplett-Donoreinheiten müssen eine Triplett-Energie besitzen, die höher ist als die der Emissionsniveaus des Seltenen Erdmetalls oder gleich mit diesen ist. Beispielsweise muß im Fall von erfindungsgemäßen Europium- und Terbiumkomplexen das Triplett-Niveau der Donoreinheit größer als 17270 cm&supmin;¹ sein.
  • Die Fluoreszenzerscheinung, die auf die strahlende Desaktivierung eines Triplett-Zustands zurückzuführen ist, ein Kriterium der Wahl der Donoreinheiten, kann bei der Wellenlänge der Phosphoreszenzemission dieser Einheiten erfolgen. Man wählt beispielsweise Einheiten, die eine Phosphoreszenz bei im Vergleich zu den der Besetzung der Emissionsniveaus des Seltenen Erdmetalls entsprechenden Wellenlängen niedrigeren Wellenlängen (höheren Energien) emittieren. Im vorliegenden Fall muß die Wellenlänge der Phosphoreszenz der Donoreinheit unter 580 nm liegen.
  • Es ist festzustellen, daß die erfindungsgemäßen Komplexe eine oder mehrere Donoreinheiten aufweisen können, wobei diese Donoreinheiten teilweise oder ganz aus den Resten "(A)", "(B)" und "(C)" bestehen.
  • Als molekulare Einheiten kann man in nicht-beschränkender Weise sämtliche Triplett-Sensibilisatoren verwenden, die die erforderliche Triplett-Energie aufweisen, beispielsweise die in der Patentanmeldung EP-A-0068875 oder in Spectroscop. Inorg. Chem., Bd. 2 (1971), S. 255 beschriebenen Produkte, wobei diese Druckschriften durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Beschreibung gemacht werden.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugte molekulare Einheiten sind Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, Bi- und Terphenyl, Bipyridine, Bichinoline, insbesondere Biisochinoline, beispielsweise 2,2'-Bipyridin, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin oder 2,2'-Biisochinolin.
  • Als Beispiele für die Reste "(A)", "(B)" und "(C)", die eine Energiedonor-Einheit aufweisen, lassen sich insbesondere die nachstehend aufgeführten Ketten erwähnen:
  • -C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-C&sub6;H&sub4;-X&sub2;-C&sub2;H&sub4;-C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2; -X&sub2;-C&sub2;H&sub4;in denen X&sub1; und X&sub2; gleich oder verschieden sein können und Sauerstoff oder Schwefel bedeuten;
  • wobei X Sauerstoff oder Wasserstoff ist.
  • Die erfindungsgemäßen makropolyzyklischen Komplexe von Seltenen Erdmetallen lassen sich nach klassischen Herstellungsverfahren für Metallkomplexe erhalten, die in der Umsetzung der komplexierenden Verbindung mit einer Verbindung, die als Donor des zu komplexierenden Kations wirkt, bestehen.
  • Verfahren dieses Typs sind insbesondere in den US-Patenten 3 888 377, 3 966 766 und 4 156 683 beschrieben, die durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Beschreibung gemacht werden.
  • Beispielsweise lassen sich die makropolyzyklischen Komplexe durch Umsetzung einer als Donorverbindung für das Kation des Seltenen Erdmetallkation mit der makropolyzyklischen Verbindung, die die vorstehend definierten Eigenschaften aufweist, erhalten, wobei jede Verbindung vorteilhafterweise in Lösung, vorzugsweise im gleichen Lösungsmittel oder in gegenüber der Komplexierung inerten, verträglichen Lösungsmitteln vorliegt. Im allgemeinen verwendet man als Lösungsmittel Acetonitril, DMSO oder Ethanol.
  • Als Donorverbindung für das Kation des Seltenen Erdmetalls kann man beliebige Salze von Seltenen Erdmetallen verwenden, vorteilhafterweise ein Chlorid, ein Acetylacetonat oder ein Nitrat.
  • Vorzugsweise arbeitet man bei der Siedetemperatur des Lösungsmittels.
  • Wenn der gebildete makropolyzyklische Komplex im Reaktionslösungsmittel löslich ist, wird er aus der Lösung durch Eindampfen zur Trockne isoliert. Wenn der gebildete makropolyzyklische Komplex im Reaktionslösungsmittel kristallisiert, wird er durch Filtration oder durch andere klassische, geeignete Maßnahmen abgetrennt. Die auf diese Weise erhaltenen Komplexe können durch Kristallisation gereinigt werden.
  • Man kann die vorstehende Reaktion auch durchführen, indem man eine Lösung der makropolyzyklischen Verbindung und die Donorverbindung für das Kation in kristalliner Form einsetzt. Ferner kann auch ein synergistisches Desaktivierungs-Schutzmittel in die Koordinationssphäre des Kations eingeführt werden, wie bereits in J. Chem. Phys., Bd. 40 (1964), S. 2790 und Bd. 41 (1964), S. 157 beschrieben worden ist.
  • In der nachstehenden Beschreibung werden die erfindungsgemäßen makropolyzyklischen Komplexe auch als "Kryptate" und die makropolyzyklische Verbindung allein als "Kryptand" bezeichnet. Es wird nachstehend die von Lehn zur Bezeichnung von Kryptaten und Kryptanden definierte Nomenklatur übernommen. Diesbezüglich wird insbesondere auf die Artikel von J. M. Lehn in Strukt. Bonding (Berlin), Bd. 16 (1973), S. 1 und Acc. Chem. Res., Bd. 11 (1978), S. 49 verwiesen.
  • Sämtliche Ionen von Seltenen Erdmetallen eignen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. Jedoch werden die Ionen bevorzugt, die die intensivste Fluoreszenz des Ions aufweisen, z. B. Terbium und Europium und im geringeren Maße Samarium und Dysprosium.
  • Als makropolyzyklische Verbindungen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, kann man bekannte Kryptandenmittel verwenden, z. B.:
  • 1) Benzo-Kryptanden der allgemeinen Formel
  • in der "(A)", "(B)" und "(C)" unabhängig voneinander die folgenden Gruppen 2B, 2 und 1 mit den nachstehend angegebenen Bedeutungen darstellen:
  • 2B = -C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-C&sub6;H&sub4;-X&sub2;-C&sub2;H&sub4;- oder
  • -C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-X&sub2;-C&sub2;H&sub4;2 = -C&sub2;H&sub4;-Y&sub1;-C&sub2;H&sub4;-Y&sub2;-C&sub2;H&sub4;1 = -C&sub2;H&sub4;-Z&sub1;-C&sub2;H&sub4;worin X1,2, Y1,2 und Z&sub1; jeweils ein unter Sauerstoff und Schwefel ausgewähltes Heteroatom bedeuten und X&sub1;X&sub2; und Y&sub1;Y&sub2; gleich oder verschieden sein können.
  • Als Beispiele für derartige Kryptanden lassen sich solche aufführen, in denen die Einheiten "(A)", "(B)" und "(C)" folgendermaßen zusammengesetzt sind:
  • "(A)", "(B)" und "(C)" = (2B11); (2B21); (2B22); (2B2B2); und die Verbindung der Formel
  • 2) Kryptandenmittel, die stickstoffhaltige Heterozyklen aufweisen, wie sie beispielsweise in JACS, Bd. 99 (1977) , S. 4683 beschrieben sind, der Formel I, in der
  • - "(A)"und "(B)", die gleich sind, eine Polyoxyethylenkette der Formel -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- bedeuten und
  • - "(C)" eine Kohlenwasserstoffkette mit einem stickstoffhaltigen Heterozyklus als Energiedonoreinheit bedeutet. Als Beispiele für derartige Verbindungen lassen sich insbesondere die nachstehend aufgeführten Verbindungen erwähnen:
  • - (22) Pyridinamid:
  • 2,6-[N,N',N,N'-Bis-(3,6-dioxaoctamethylen)bis-(aminocarbonyl)]-pyridin
  • - (22) Pyridinamin:
  • 2,6-[N,N',N,N'-Bis-(3,6-dioxaoctamethylen)bis-(aminomethylen)]-pyridin
  • - (22) Bipyridin:
  • 6,6'-[N,N',N,N'-Bis-(3,6-dioxaoctamethylen)bis-(aminomethyl)]-2,2'-bipyridin
  • - (22) Bipyridinamid:
  • 6,6'-[N,N',N,N'-Bis-(3,6-dioxaoctamethylen)bis-(aminocarbonyl)]-2,2'-bipyridin
  • - (22) Azopyridin:
  • 6,6'-[N,N',N,N'-Bis-(3,6-dioxaoctamethylen)bis-(aminocarbonyl)]-2,2'-azopyridin
  • 3) Kryptandenmittel, die als Energiedonoren mehrere stickstoffhaltige Heterozyklen enthalten, beispielsweise die Verbindung der nachstehenden Formel:
  • die in J. Am. Chem., Soc., Bd. 101 (1979), S. 1047 beschrieben ist.
  • 4) Polyzyklische Kryptandenmittel mit einem Gehalt an aromatischen Einheiten, beispielsweise die Verbindungen der nachstehenden Formel:
  • oder die Verbindungen der Formel I, in der die Kohlenwasserstoffkette, die ein oder mehrere Donoreinheiten aufweist, durch einen Heteromakrozyklus unterbrochen ist, z. B. die Verbindungen der nachstehenden Formeln
  • Diese Verbindungen sind insbesondere beschrieben in:
  • Angew. Chemie, Bd. 86 (1974), S. 443
  • Tet. letters, Bd. 21 (1980), S. 941 und Chem. Comm., (1981), S. 833.
  • Als Kryptanden-Mittel kann man auch die makropolyzyklischen Verbindungen der vorstehenden Formel I verwenden, in der die eine oder mehrere molekulare Einheiten, die ein im Vergleich zu dem der "Kryptierung" zu unterziehenden Seltenen Erdmetall höheres Energie-Triplett aufweisen, unter Phenanthrolin, Anthracen, Bipyridinen und Bichinolinen, die ggf. an geeigneten Positionen durch Gruppen substituiert sind, die die Wirksamkeit der Energieübertragung erhöhen oder das Anregungsspektrum des Kryptats des Seltenen Erdmetalls modifizieren können, ausgewählt sind (J. Phys. Chem., Bd. 68 (1964), S. 3324). Als Beispiel für derartige Gruppen ist insbesondere die Phenylgruppe zu erwähnen.
  • In den neuen makropolyzyklischen Verbindungen entspricht mindestens einer der Reste "(A)", "(B)" oder "(C)" vorzugsweise einer der nachstehend angegebenen Formeln:
  • Eine besondere Klasse der makropolyzyklischen Verbindungen besteht aus den Verbindungen der Formel I, in der Z Stickstoff bedeutet, "(A)" und "(B)" zwei Mono- oder Polyoxyethylenketten, vorzugsweise Dioxyethylenketten, bedeuten und "(C)" einer der vorstehenden Formeln entspricht.
  • Zu den neuen makropolyzyklischen Verbindungen gehören auch die Verbindungen der Formel I, in der "(A)" und "(B)" jeweils die folgende Gruppe bedeuten
  • und "(C)" eine der folgenden Gruppen bedeutet:
  • Eine weitere besondere Klasse von Verbindungen der neuen makropolyzyklischen Verbindungen besteht aus den Verbindungen der Formel I, in der Z Stickstoff bedeutet und "(A)", "(B)" und "(C)" identisch sind und einen der vorstehenden Heterozyklen, insbesondere 2,2'-Bipyridin und Phenanthrolin, bedeuten.
  • Die makropolyzyklischen Verbindungen der Formel I, in der die eine oder mehreren molekularen Einheiten Phenanthrolin, Anthracen, Bipyridine oder Chinoline bedeuten, sind neue Verbindungen, mit Ausnahme der Verbindungen der Formel I, in der "(A)" und "(B)" jeweils eine Kette der Formel -(CH&sub2;)&sub2;-O- (CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- bedeuten und "(C)" eine Gruppe der Formel
  • oder eine Gruppe der Formel
  • bedeutet, die in Chem. Ber., Bd. 111 (1978), S. 200-204 beschrieben sind.
  • Die makropolyzyklischen Verbindungen der Formel I können nach bekannten chemischen Verfahren erhalten werden, bei denen es sich insbesondere um Kondensations- und/oder Additionsreaktionen handelt. Als Beispiele für derartige Verfahren lassen sich insbesondere die im FR-Patent 70 21079 (2 052 947) und in den US-Patenten 3 888 877, 3 966 766 und 4 156 683 beschriebenen Verfahren erwähnen. Diese Verfahren eignen sich insbesondere zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, in der Z Stickstoff oder Phosphor bedeutet.
  • Um die Verbindungen der Formel I zu erhalten, in der Z Kohlenstoff bedeutet und R der vorstehenden Definition entspricht, bedient man sich analoger Kondensationsverfahren.
  • In sämtlichen Fällen reicht es aus, als Ausgangsprodukte die chemischen Verbindungen zu verwenden, die jeweils einen der Reste "(A)", "(B)" oder "(C)" und endständige Gruppen, die substituierbar sind oder leicht eliminierbare Reste aufweisen, tragen.
  • Es ist beispielsweise darauf hinzuweisen, daß die Verbindung der Formel I, in der Z Kohlenstoff bedeutet, R eine Hydroxylgruppe bedeutet und "(A)", "(B)" und "(C)" jeweils 2,2'-Bipyridin bedeuten, durch Kondensation von 6,6'-Dilithiobipyridin mit 6,6'-Dicyano-2,2'-bipyridin, Hydrolyse der Cyanogruppe des auf diese Weise erhaltenen Makrozyklus und Kondensation des erhaltenen Produkts mit 6,6'-Dilithiobipyridin erhalten werden kann.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die neuen makropolyzyklischen Verbindungen der Formel I, in der Z Stickstoff bedeutet und "(A)" und "(B)" Polyoxyethylenketten bedeuten, erhalten durch Umsetzung:
  • - eines stickstoffhaltigen Makrozyklus, der aus zwei Polyoxyethylenketten besteht, mit
  • - einer die genannte molekulare Einheit aufweisenden Kohlenwasserstoffkette, wobei diese Kette abspaltbare endständige Gruppen aufweist, beispielsweise Halogengruppen.
  • Diese Kupplungsreaktion wird vorzugsweise in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid (DMSO) und Acetonitril, ggf. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Natriumhydrid, oder von Natriumcarbonat, durchgeführt. Auf diese Weise erhält man die makropolyzyklische Verbindung in Form des Natriumsalzes.
  • Man arbeitet vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb des Siedepunkts des Lösungsmittels, beispielsweise zwischen 60 und 100ºC.
  • Um die freie makropolyzyklische Verbindung zu erhalten, kann man das auf diese Weise erhaltene Natriumsalz mit Silbernitrat unter Bildung des entsprechenden makropolyzyklischen Silberkomplexes umsetzen, der dann anschließend mit einem H&sub2;S-Strom behandelt wird. Der gebildete Niederschlag wird sodann mit einer Lösung von N(CH&sub3;)&sub4;OH neutralisiert und mit Methylenchlorid extrahiert.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß der erfindungsgemäße makropolyzyklische Komplex des Seltenen Erdmetalls ausgehend von einem freien Komplex oder von einem Salz desselben, beispielsweise vom Natriumsalz, erhalten werden kann.
  • Im vorstehenden Verfahren kann man vorteilhafterweise als Makrozyklus eine der monozyklischen, stickstoffhaltigen Makrozykloverbindungen verwenden, die im US-Patent 3 966 766 beschrieben sind, wobei folgende Verbindungen bevorzugt sind: 1,7,10,16-Tetraoxa-4,13-diazacyclooctadecan der Formel:
  • oder 1,7,16-Trioxa-4,13-diazacyclodecan der Formel:
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß die erfindungsgemäßen bevorzugten Komplexe, die aus den vorstehenden Makrozyklen erhalten worden sind, als Derivate von Kryptaten des Typs 222 oder 221 angesehen werden können, in denen die Ethereinheiten an mindestens einer der Kohlenwasserstoffketten durch Energiedonoreinheiten (im allgemeinen aromatische oder polyaromatische Einheiten, die Heteroatome enthalten können) substituiert sind.
  • Die Europiumkryptate der Typen 222 oder 221 weisen in wäßrigen Lösungen sehr geringe Dissoziationsgeschwindigkeiten auf, obgleich ihre Bildungskonstanten relativ nieder sind (K = 106,8 bzw. 105,9 für die Kryptate 221 und 222; Inorganic Chem., Bd. 20 (1981), S. 616 und J.A.C.S., Bd. 102 (1980), S. 2278). Diese Kryptate entsprechen nicht den im Stand der Technik definierten Stabilitätskriterien. Im Gegenteil, die Substitution von Ethereinheiten durch Energiedonoreinheiten, die die bevorzugten erfindungsgemäßen Komplexe liefert, modifiziert nicht das Dissoziationsverhalten dieser Kryptate, ermöglicht aber die Anregung der Energiedonoreinheit in seiner Absorptionsbande, wodurch man eine stark erhöhte Fluoreszenz und die charakteristische Beschaffenheit des Seltenen Erdmetall-Kryptats erreicht.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Kryptate von Seltenen Erdmetallen zur spezifischen Markierung von biologisch aktiven Molekülen unter Zuhilfenahme einer kovalenten Bindung verwendet werden, können sie an einem oder mehreren grundlegenden Atomen durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein, die ausreichend zugänglich sind und eine oder mehrere molekulare Einheiten aufweisen, die eine Kupplung mit dem biologischen Molekül unter den Arbeitsbedingungen, die mit dessen biologischer Integrität vereinbar sind, ermöglichen.
  • Als nicht beschränkende Beispiele für molekulare Einheiten lassen sich folgende Reste aufführen: Alkylamino, Arylamino, Isothiocyano, Cyano, Isocyano, Thiocyano, Carboxyl, Hydroxyl, Mercapto, Phenol, Imidazol, Aldehyd, Epoxid, Halogenid: Von Thionyl, von Sulfonyl, von Nitrobenzol, von Carbonyl; Triazo, Succinimido, Anhydrid, Halogenacetat, Hydrazino, Dihalogentriazinyl und dergl. (Biol. Chem., Bd. 245 (1070), S. 3059). Die Länge des Arms, der den makropolyzyklischen Komplex mit dem in Frage stehenden biologischen Molekül verbindet, kann beispielsweise von 1 bis 20 Atomen variieren. Dieser Arm kann Kohlenstoffatome, aber auch Heteroatome, wie N, O, S und P, enthalten. Die Erfindung betrifft somit auch biologische Komplexe, die aus einem biologischen Molekül, das durch Kupplung oder Adsorption an einen erfindungsgemäßen makropolyzyklischen Komplex assoziiert ist, bestehen.
  • Um die Kupplung durchzuführen, kann man sich sämtlicher Reaktanten, die hierfür in der Literatur beschrieben sind, bedienen und das markierte Molekül des nicht-umgesetzten makropolyzyklischen Komplexes durch beliebige geeignete Trennmaßnahmen (beispielsweise Gelfiltration) abtrennen.
  • Unter den Molekülen von biologischem Interesse, die für eine Markierung mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung in Frage kommen, lassen sich in nicht-beschränkender Weise erwähnen: Antigene, Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente und Kombinationen von Antikörper-Fragmenten, Arzneistoffe, Rezeptoren, Hormone, hormonelle Rezeptoren, Bakterien, Steroide, Aminosäuren, Peptide, Vitamine, Viren, Nucleotide oder Polynucleotide bei Hybridisierungsverfahren, Enzyme und deren Substrate, Lectine, Nucleinsäuren, DNA und RNA.
  • Die erfindungsgemäßen makropolyzyklischen Komplexe von Seltenen Erdmetallen finden ein wichtiges Anwendungsgebiet als fluoreszierende Marker bei immunologischen Bestimmungen sowie bei Bestimmungsverfahren, die in kompetitiver Weise oder in Gegenwart eines Überschusses in homogener oder heterogener Phase ablaufen. Derartige Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben; Landon, Ann. Clin. Biochem., Bd. 18 (1981), S. 253 und Soini, Clin. Chem., Bd. 25 (1979), S. 353.
  • Bei heterogenen Methoden kann man vorteilhafterweise einsetzen:
  • - Röhrchen, die mit für die zu bestimmende Substanz spezifischem Antikörper beschichtet sind, wobei das Ablesen der Fluoreszenz durch die vorstehend beschriebenen Methoden direkt durch das Röhrchen erfolgt (Clin. Chem., Bd. 29 (1983), S. 60)
  • - oder eine andere feste Phase, insbesondere ein Band oder ein gelatinöser Film, worauf vorher ein einen spezifischen Antikörper enthaltendes Medium abgeschieden worden ist, wobei die Fluoreszenzablesung mit einem von der Anregung und der Reflexion der anregenden Wellenlänge abweichenden Winkel oder direkt durch den Träger, falls dieser durchsichtig ist, vorgenommen wird.
  • Es ist ferner möglich, im Hinblick auf das Linienspektrum dieser Marker gleichzeitig mehrere Antigene nachzuweisen, und zwar unter Verwendung der Kryptate verschiedener Seltener Erdmetalle, deren Fluoreszenzlinien nicht überlappen (z. B. Tb und Eu) oder unter Verwendung von klassischen fluoreszierenden Markern (Fluorescein und Rhodamin) und den Markern der vorliegenden Erfindung.
  • Ein weiteres Anwendungsgebiet betrifft die Immunochemie, wo die Fluoreszenz der markierten Zelle mikroskopisch nachgewiesen wird, wie es beispielsweise von R. C. Nairn in "Fluorescent Protein Tracing Longman Group Ltd.", 1976, beschrieben worden ist, wobei ebenfalls die Möglichkeit des Mehrfachnachweises besteht.
  • Ein anderes Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Komplexe von Seltenen Erdmetallen betrifft die Zytologie und Zelltrennvorrichtungen, wo die Verwendung eines Markers, der ein Linienspektrum bei erhöhter Wellenlänge aufweist, in Verbindung mit der Verwendung von klassischen Markern die Möglichkeit der Analyse von mehreren Parametern eröffnet.
  • Ferner ist es bei einem gegebenen Kryptanden und bei unterschiedlichen Ionen von Seltenen Erdmetallen möglich, bei einer einzigen Anregungswellenlänge, bei der es sich um die Anregungswellenlänge der molekularen Einheit handelt, die die Energie überträgt und die mit einer einzigen Quelle (z. B. Laser) erzeugt werden kann, zwei Fluoreszenzspektren mit charakteristischen Linien der beiden, der Kryptierung unterworfenen Ionen (z. B. Tb und Eu) zu erhalten und auf diese Weise die jeweiligen biologischen Moleküle, die auf diesen Kryptaten fixiert sind, nachzuweisen.
  • Ein weiteres Anwendungsgebiet betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Kryptate von Seltenen Erdmetallen auf dem Gebiet der Gentechnik, beispielsweise als Indikator bei Hybridisierungsreaktionen, wie sie beispielsweise in den Patentanmeldungen EP-A-0 070 685 und EP-A-0 070 687 beschrieben sind.
  • Nachstehend wird die Erfindung durch nicht-beschränkende Beispiele näher erläutert.
    • Beispiel 1 Herstellung von (22)Phenanthrolin: 2,9-[N'N',N,N'-Bis-(3,6- dioxaoctamethylen)-bis-(aminomethyl)]-1,10-phenanthrolin (nachstehend bezeichnet als: (22)phen)
  • Bei dem bei dieser Synthese verwendeten Lösungsmittel handelt es sich um DMSO, das mehrere Tage über Molekularsieb 4 A getrocknet und schließlich unter vermindertem Druck destilliert worden ist.
  • 1 mMol (366 mg) der trockenen und frisch chromatographierten Dibrommethylphenanthrolin-Verbindung (Di-CH&sub2;-Br-phen) wurden in 10 bis 20 ml DMSO gelöst. Das Produkt wurde sodann in einen trockenen Tropftrichter gegeben. Das Volumen wurde mit trockenem DMSO auf 100 ml aufgefüllt.
  • Sodann wurden 100 bis 200 g NaH in Öl (Fluka) in einen trockenen Kolben gegeben. 5 ml trockenes Toluol (oder Hexan) wurden zu dem Gemisch gegeben. Sodann ließ man das Gemisch absetzen. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck (1 Torr) innerhalb von 1 h eingedampft. Das NaH wurde erneut in 20 ml trockenem DMSO gelöst (H&sub2;-Entwicklung). Ggf. kann auf 50ºC erwärmt werden.
  • 1 mMol Makrozyklus-N&sub2;O&sub4; (262 mg) wurde getrocknet und mit 10 bis 20 ml trockenem DMSO versetzt.
  • Die Lösungen von NaH und N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus wurden jeweils in einen Tropftrichter gegeben. Das Volumen wurde mit trockenem DMSO auf 100 ml aufgefüllt.
  • In einem Dreihalskolben wurden 100 ml trockenes DMSO vorgelegt. Auf den Dreihalskolben wurden die beiden Tropftrichter, ein Rückflußkühler und ein Trocknungssystem (Silicagel) aufgesetzt. Der Kolben wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer auf 60-100ºC erwärmt.
  • Innerhalb von 1 bis 2 h wurde tropfenweise gleichzeitig der Inhalt der beiden Tropftrichter zugegeben.
  • Das Reaktionsgemisch wurde nach Zugabe der Reaktanten 1 h erwärmt. Anschließend wurde das Gemisch unter vermindertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen.
  • Es ist möglich, eine geringe Menge an Wasser zuzusetzen, um Hydride und Basen zu beseitigen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde sodann zur Trockne gebracht. Man erhielt einen trockenen oder pastenförmigen roten Rückstand.
  • 100 bis 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden zugesetzt. Die Paste wurde bei Umgebungstemperatur mindestens 30 Minuten verrieben. Der Rückstand wurde filtriert und gewaschen. Die flüssige organische Phase wurde gewonnen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck (1 Torr, mindestens 30 Minuten) getrocknet.
  • Der Rückstand wurde mit 100 ml Ethylether versetzt, vermischt und zum Absetzen stehengelassen. Dieser Vorgang wurde 3 bis 4 mal wiederholt.
  • Um den Rest an Monozyklus-N&sub2;O&sub4; vollständiger zu entfernen, wurde der Rückstand mit 50 ml Hexan und 1 ml CH&sub3;OH versetzt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck (leichtes Erwärmen) bis zum Auftreten einer Trübung eingedampft. Sodann wurde die Lösung dekantiert. Dieser Vorgang wurde mehrmals wiederholt.
  • Der rote Rückstand wurde der Plattenchromatographie (Polygram Alox N/UV&sub2;&sub5;&sub4;, Macherey-Nagel) unterworfen. Mit dem Laufmittel CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH 9/1 erhielt man folgende Werte:
  • (22)phen Rf = 0,4-0,8
  • Monozyklus N&sub2;O&sub4; Rf = 0,2-0,5.
  • Der Rückstand wurde der Chromatographie an einer Säule (20 cm 15 cm) die mit neutralem aktivierten Aluminiumoxid 90, 70- 230 mesh (Merck) gepackt war, unterzogen, wobei als Laufmittel folgende Gemische verwendet wurden:
  • CH&sub2;Cl&sub2;:CH&sub3;OH (5%), CHCl&sub3;/C&sub2;H&sub5;OH (5%), CH&sub3;OH/Hexan 9 : 1.
  • Die Ausbeuten betrugen je nach den Betriebsbedingungen 12 bis 35%.
  • Auf diese Weise erhielt man das Natriumsalz von (22)phen der Formel [Na&spplus;C(22)phen)Br; H&sub2;O] mit folgender Elementaranalyse:
  • gefunden: C 53,00 H 6,21 N 9,44
  • berechnet: C 53,16 H 6,18 N 9,55
    • B - Bildung des Komplexes [Eu³&spplus;C(22)phen]
  • 0,07 Mol (19,4 mg) wasserfreies EuCl&sub3; wurden in 4 ml trockenem CH&sub3;CN in Lösung gebracht und 90 Minuten unter Rückfluß erwärmt. Sodann wurden 35 mg des vorstehend erhaltenen Natriumsalzes von (22)phen in 2,5 ml CH&sub3;CN zugesetzt. Anschließend wurde 2 ½ h unter Rückfluß erwärmt. Nach Stehenlassen des Gemisches über Nacht bei 4ºC wurde der gelbe Niederschlag abfiltriert.
  • Der gewonnene Niederschlag (11 mg) weist in Lösung in H&sub2;O und CH&sub3;OH eine starke Eigenfluoreszenz auf (UV 254 nm).
  • Es wurden keine Veränderungen der Anregungs- und Emissionsspektren nach 3-monatigem Belassen in wäßriger Lösung bei einer Konzentration unter 10&supmin;&sup4; Mol/Liter festgestellt.
    • Beispiel 2 Herstellung von (22)Phenanthrolinamid: 2,9-[N,N',N,N'-Bis- (3,6-dioxaoctamethylen)-bis-(aminocarbonyl)]-1,10-phenanthrolin (nachstehend bezeichnet als: (22)phenamid)
  • Bei dieser Synthese wurde als Lösungsmittel über P&sub2;O&sub5; destilliertes Acetonitril verwendet. Es wurde in einer trockenen Glasapparatur gearbeitet.
  • 305 mg umkristallisiertes und trockenes Di COCl phen (1 mMol) wurden in 50 ml CH&sub3;CN gelöst. Nach Stehenlassen über Nacht wurde die Lösung abfiltriert und in einen Tropftrichter gebracht. Das Volumen wurde mit CH&sub3;CN auf 90 ml aufgefüllt.
  • 524 mg (22) (2 mMol) wurden unter vermindertem Druck (< 1 Torr; über Nacht) getrocknet. Das Produkt wurde in 90 ml CH&sub3;CN gelöst und in einen Tropftrichter gegeben.
  • Die beiden Tropftrichter wurden auf einem 2-3 Liter fassenden Kolben mit einem Gehalt von 1 Liter CH&sub3;CN angebracht. Innerhalb von 2 bis 2 ½ Stunden wurde unter raschem Rühren (Magnetrührer) die gleichzeitige Zugabe der beiden Reaktanten durchgeführt. Der Rührvorgang wurde nach der Zugabe weitere 30 Minuten fortgesetzt. Sodann wurde das Lösungsmittel bei 50ºC unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde 1 h bei einem Druck von < 1 Torr getrocknet. Sodann wurde der Rückstand 30 Minuten in 300 ml CH&sub2;Cl&sub2; gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Anschließend wurde eine Chromatographie an aktiviertem neutralem Alox 90 (Säule 30 cm 1,5 cm) durchgeführt, wobei als Elutionsmittel CH&sub2;Cl&sub2; mit einem Gehalt an 1% CH&sub3;OH verwendet wurde. Es wurde das am ersten eluierte Produkt gewonnen.
  • Man gewann 310 mg des (22)phenamids in einer Ausbeute von 63 %. Das Produkt wurde in einer Mischung aus Toluol/Hexan 1 : 1 umkristallisiert.
  • F: 300-302ºC
  • IR-Amidbande bei 1630 cm&supmin;¹
  • Massenspektrum M&spplus; bei 494 für MG = 494,55
  • Elementaranalyse: C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub4;O&sub6;
  • berechnet: C 63,15, H 6,11, N 11,33
  • gefunden: (C 59,8, H 5,7, N 10,5
  • (C 59,9, H 5,9, N 10,6
    • B - Bildung des Komplexes [Eu³&spplus;C(22)phenamid]
  • 45 mg (0,17 mMol) wasserfreies EuCl&sub3; wurden in 10 ml trockenem CH&sub3;CN gelöst. Nach 3-stündigem Erwärmen unter Rückfluß einer Lösung von 80 mg (0,16 mMol) (22)phenamid in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden 50 ml CH&sub3;CN zugegeben. Sodann wurde bis zum Siedepunkt von CH&sub3;CN erwärmt (CH&sub2;Cl&sub2; wurde durch Verdampfen entfernt). Anschließend wurde die Lösung von Eu³&spplus; zugegeben.
  • Nach 2-stündigem Erwärmen unter Rückfluß ließ man das Gemisch bei Umgebungstemperatur stehen. Der weiße Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen (50 mg). Das Produkt wies eine starke rote Fluoreszenz (&lambda; Anregung: 254 nm) ebenso wie in Lösung in H&sub2;O, CH&sub3;OH und DMSO auf.
  • Elementaranalyse für Eu C(22)phenamid (OH) Cl&sub2;·2H&sub2;O
  • C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub7;N&sub4;O&sub1;&sub0;Cl&sub2;Eu: MG = 788,47
  • berechnet: 39,61 4,73 7,11
  • gefunden: (40,1 4,9 7,2
  • (40,3 4,8 7,1
  • Es wurden keine Veränderungen der Anregungs- und Emissionsspektren des Komplexes nach 3-monatigem Stehenlassen in wäßriger Lösung mit einer Konzentration unter 10&supmin;&sup4; Mol/Liter festgestellt.
    • Beispiel 3 Herstellung von (22)Anthracenamid: 9,10-[N,N',N,N'-Bis-(3,6- dioxaoctamethylen)-bis-(carbamoylmethyl)]-anthracen
  • In diesem Beispiel bediente man sich der Methode mit hoher Verdünnung.
  • - 0,564 g des Disäurechlorids 1 (1,7 mMol) wurden in 70 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und in einen Tropftrichter von 100 ml gegeben,
  • - 0,446 g Makrozyklus(22), d. h. 1,7 mMol, und 0,47 ml Triethylamin (2 · 1,7 mMol) wurden ebenfalls in 70 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und in einen Tropftrichter von 100 ml gegeben.
  • In einem 3 Liter fassenden Dreihalskolben wurden 0,4 ml Toluol und 0,15 Liter wasserfreies Methylenchlorid vorgelegt. Die gleichzeitige Zugabe der beiden vorstehend hergestellten Reaktanten aus den Tropftrichtern in den Dreihalskolben wurde innerhalb von 5 h (14 ml/h) durchgeführt.
  • Sodann wurde die organische Phase gewonnen, auf ein Volumen von einigen ml eingeengt und sodann unter Druck über eine SiO&sub2;-Säule gegeben (Säulendurchmesser 3,5 cm; Höhe = 17 cm; Elutionsmittel
  • CH&sub2;Cl&sub2; - 1% Methanol).
  • Man erhielt ein blaßgelbes, kristallisiertes, fluoreszierendes Produkt.
  • Ausbeute: 45%
  • Dünnschichtchromatographie (DSC)
  • Lösungsmittel CH&sub2;Cl&sub2;/2% Methanol; SiO&sub2;; Rf = 0,6
  • NMR ¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;/CD&sub2;Cl&sub2; 5/5 bei 200 MHz
  • ppm 2,53 (m)
  • 2.93 (m)
  • 3,18 (m) 24 H, HCH&sub2; + OCH&sub2; Krone
  • 3,42 (m)
  • 4,02 (d)
  • &delta;A = 4,62 JAB = 16 Hz 4H OCCH&sub2;N
  • &delta;B = 5,03
  • 7,6 (m) 4H
  • 8,43 (d) 2H aromatisch
  • 8,82 (d) 2H
  • Mikroanalyse: C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub6;O&sub6;N&sub2;
  • berechnet: C 69,20, H 6,97, N 5,38
  • gefunden: C 69,07, H 7,00, N 5,22
  • Molekulargewicht 520,55.
  • Das in diesem Beispiel als Ausgangsprodukt verwendete Disäurechlorid 1 kann gemäß den Verfahren, die von M.W. Miller et al in R.W. Amidon, P.O. Tawney, J.A.C.S., Bd. 77 (1955), S. 2845 oder von B.M. Mikhailov, Izvest. Akad. Nank. SS. Osdel. Khim. Nank., 1948, S. 420-426 (CA, Bd. 42, S. 6350) beschrieben sind, erhalten werden.
    • Beispiel 4 Herstellung von (22)Anthracen: 9,10-[N,N',N,N'-Bis-(3,6- dioxaoctamethylen)-bis-(aminoethyl)]-anthracen
  • 380 mg Diamid 3 (0,73 mMol) wurden teilweise in 20 ml wasserfreiem THF, das in einem Kolben enthalten war, gelöst.
  • Der Kolben wurde unter Argonatmosphäre unter Rückfluß erwärmt und bei Umgebungstemperatur mit 8 ml einer 1,1 m B&sub2;H&sub6;-Lösung in wasserfreiem THF versetzt.
  • Das gesamte Produkt wurde über Nacht unter Rückfluß erwärmt. Anschließend wurde überschüssiges Diboran bei 0ºC durch einige Tropfen destilliertes Wasser zerstört.
  • Nach Abdampfen der Lösungsmittel wurde der erhaltene weiße Rückstand mit 40 ml 6 n HCl-Lösung versetzt.
  • Nach 30-stündigem Erwärmen unter Rückfluß unter Argonatmosphäre wurde die Lösung dunkelgrün.
  • Nach Abkühlenlassen wurde das Wasser abgedampft und der erhaltene Rückstand 1 Stunde mit einer Radialschieberpumpe getrocknet und sodann in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden zugegeben. Die beiden Phasen wurden bewegt. Sodann wurde die wäßrige Phase abgetrennt und bei 0ºC mit einer wäßrigen Lösung von LiOH auf den pH-Wert 13 gebracht. Ein Feststoff fiel aus. 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden zugegeben. Sodann wurden die beiden Phasen bewegt und zum Absetzen gebracht. Die organische Phase wurde gewonnen und über MgSO&sub4; getrocknet.
  • Das Rohprodukt wurde auf eine Aluminiumoxid-Säule aufgesetzt und mit CH&sub2;Cl&sub2; mit einem Gehalt an 1% Methanol eluiert. Man erhielt ein kristallines Produkt, das sich bei der Dünnschichtchromatographie als rein erwies.
  • Ausbeute: 62-70%
  • DSC: Al&sub2;O&sub3;; Elutionsmittel CH&sub2;Cl&sub2;/6% MeOH
  • Rf: 0,33
  • F.: > 260ºC
  • NMR ¹³C : Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • ppm 25,2 (CH&sub2; aromatisch)
  • 54,3)
  • 56,3) NCH&sub2; Makrozyklus + Verzweigung
  • 69,3)
  • 70,0) OCH&sub2; Makrozyklus
  • NMR¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • ppm 2,39 (t) 8H NCH&sub2; Makrozyklus
  • 2,55 und 2,76 (m)-2 · 4H OCH&sub2;
  • 2,89 und 3,19 (m)-2 · 4H OCH&sub2;
  • 3,03 und 3,82 (t)-2 · 4H - CH&sub2; - CH&sub2;
  • 7,47 und 8,31 (AB) - 4H) H aromatisch
  • 7,50 und 8,36 (AB) - 4H)
  • Mikroanalyse: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub0;O&sub4;N&sub2; (MG 492,6)
  • berechnet: C 73,13, H 8,18, N 5,6
  • gefunden: C 73,06, H 8,04, N 5,2.
  • Man verfuhr gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 und stellte den Komplex [Eu³&spplus; C(22)Anthracen] her.
    • Beispiel 5 Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung der Formel (7): 6,6',6'',6''',6'''',6'''''-Bis-[nitrilotri-(methylen)]-tris- (2,2'-bipyridin) und des entsprechenden Europiumkomplexes A - Herstellung von 6,6'-Bis-brommethyl-2,2'-bipyridin
  • Ein Gemisch aus 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (2,76 g, 15 mMol) und N-Bromsuccinimid (5,10 g, 28,6 mMol) in CCl&sub4; (150 ml) wurde 30 Minuten unter Rückfluß erwärmt. Sodann wurde das Gemisch mit Benzoylperoxid (30 mg) versetzt. Das Gemisch wurde erneut 2 h unter Rückfluß erwärmt. Sodann wurde das Succinimid abfiltriert. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und der Feststoff mit Methanol gewaschen. Man erhielt das Bis-dibromid in Form eines kristallinen weißen Feststoffs (1,65 g)
  • Ausbeute: 32%; F.: 180-181ºC
  • Die CCl&sub4;-Lösung wurde eingeengt und der Säulenchromatographie (Kieselgelsäule) unter Elution mit einem Gemisch aus Dichlormethan/Methanol 98 : 1 unterzogen. Man erhielt:
  • - 6,6'-Bis-dibrommethyl-2,2'-bipyridin, 0,9 g, 12%
  • - 6,6'-Bis-brommethyl-2,2'-bipyridin, 1,38 g, 27%
  • - 6-Methyl-6'-brommethyl-2,2'-bipyridin, 0,55 g, 14%
    • B - Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung
  • Ein Gemisch des Makrozyklus Bis-bipyridin der Formel (5) (0,15 g, 0,38 mMol) (beschrieben in J. Org. Chem., Bd. 48, (1983), S. 4848) und Na&sub2;CO&sub3; (0,4 g) in Acetonitril (200 ml) wurde unter Rückfluß erwärmt. Sodann wurde eine Lösung von 6,6'-Bis-brommethyl-2,2'-bipyridin (0,12 g, 0,38 mMol) innerhalb von 3 h zugegeben. Anschließend wurde das Gemisch 20 h unter Rückfluß erwärmt. Das Na&sub2;CO&sub3; wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde an einer kurzen Aluminiumoxidsäule unter Elution mit CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH im Verhältnis von 98 : 2 filtriert. Man erhielt das Natriumsalz des Makrobizyklus Tris-bipyridin in Form eines weißen Feststoffs (0,16 g; 73%; F.: über 270ºC)
  • Mikroanalyse: C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub8;, NaBr (677,6)
  • berechnet: C 63,81, H 4,46, N 16,53
  • gefunden: C 63,79, H 4,48, N 16,49
  • NMR ¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • 3,85 (s, 6CH&sub2;);
  • 7,33 (dd, J=7,2; 1,2; 6H; H-C(5); H-C(5'))
  • 7,82 (t, J=7,2; 6H; H-C(4); H-C(4'))
  • 7,90 (dd, J=7,2; 1,2; 6H; H-C(3); H-C(3'))
  • Ein Gemisch aus Silbernitrat AgNO&sub3; (15 mg, 0,08 mMol) und dem vorstehend erhaltenen Natriumsalz (20 mg, 0,03 mMol) wurde mit 5 ml CH&sub3;OH 30 Minuten erwärmt. Sodann wurde das Methanol abgedampft. Der erhaltene Komplex wurde durch Passage über eine Kieselgelsäule mit CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH als Elutionsmittel (96 : 4) gereinigt.
  • Der auf diese Weise erhaltene Silberkomplex (20 mg) wurde in einem Gemisch aus Wasser/Methanol (1 : 1 - 5 ml) gelöst und 15 Minuten mit einem H&sub2;S-Strom behandelt. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert. Die Lösung wurde mit 0,1 n N(CH&sub3;)&sub4;OH neutralisiert und mit Methylenchlorid (3,5 ml) extrahiert. Sodann wurde die Lösung über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde über Kieselgel mit CH&sub2;Cl&sub2;:CH&sub3;OH (96 : 4) filtriert. Man erhielt den freien Komplex (13 mg; 86%) mit folgenden Eigenschaften:
  • NMR ¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • 3,82 (s, 12H, CH&sub2;)
  • 7, 44
  • 7,78 System ABX J=8, 7,5 und 0,9 Hz)
  • 7,83
  • Mikroanalyse: C&sub3;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub8; (574,7)
  • berechnet: C 75,24, H 5,26, N 19,50
  • gefunden: C 75,37, H 4.98, N 19,41
  • Ausgehend von der erhaltenen makropolyzyklischen Verbindung wurde der Komplex [Eu³&spplus;C (Makropolyzyklus Tris-bipyridin)] gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhalten.
  • Die charakteristischen Anregungs- und Emissionswellenlängen dieses Komplexes sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
    • Beispiel 6 Herstellung der Verbindung Makropolyzyklus-bis-bipyridinphenanthrolin der Formel (9): 2,9-[N,N',N,N'-[Bis-(2,2'- bipyridin-6,6'-dimethyl)]-bis-(aminomethyl)]-1,10- phenanthrolin des entsprechenden Europiumkomplexes
  • In einen 500 ml-Zweihalskolben wurden 0,158 mMol des Makrozyklus-bis-pyridin (5) eingewogen. 0,75 mMol Na&sub2;CO&sub3; (etwa 5-facher Überschuß) und 105 ml frisch destilliertes CH&sub3;CN wurden zugesetzt. Sodann wurde 30 Minuten unter Rückfluß erwärmt und mit einem Magnetrührer gerührt.
  • Anschließend wurde tropfenweise eine äquimolekulare Lösung von Dibromphenanthrolin in 100 ml Acetonitril zugegeben.
  • Die ausreichend langsame Zugabe (2 h 10 min) fand unter Rückfluß und magnetischem Rühren statt.
  • Sodann wurde das Produkt weitere 18 h unter den gleichen Bedingungen erwärmt. Die erhaltene Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Das in CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung erhaltene Rohprodukt wurde mit Wasser gewaschen. (Dünnschichtchromatographie an Aluminiumoxid mit dem Laufmittel CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH: 90/10).
  • Dieses Rohprodukt wurde an einer Säule mit standardisiertem Aluminiumoxid (Aktivität II-III) gereinigt. Als Elutionsmittel wurde CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH : 98/2 verwendet.
  • Mikroanalyse: C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub0;N&sub8;, NaBr, H&sub2;O (719,6)
  • berechnet: C 63,42, H 4,45, N 15,57
  • gefunden: C 62,77, H 4,46, N 15,31
  • NMR ¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • 3,91 (s, 8H, CH&sub2;-bpy)
  • 4,07 (s, 4H, CH&sub2;-phen)
  • 7,36 (dd, J=7,2; 1,3; 4H; H-C(5); H-C(5') von Bipyridin)
  • 7,64 (d, J=8,2; 2H; H-C(3); H-C(8) von Phenanthrolin)
  • 7,78 (s, 2H, H-C(5); H-C(6) von Phenanthrolin)
  • 7,83 (t, J=7,2; 4H; H-C(4); H-C(4') von Bipyridin)
  • 7,91 (dd, J=7,2; 1,3; 4H; H-C(3); H-C(3') von Bipyridin)
  • 8,27 (d, J=8,2; 2H; H-C(4); H-C(7) von Phenanthrolin)
  • Ausgehend von der auf diese Weise erhaltenen makropolyzyklischen Verbindung wurde der Komplex [Eu³&spplus;C (Makropolyzyklusbis-bipyridin-phenanthrolin)] gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt.
  • Die charakteristischen Anregungs- und Emissionswellenlängen des Komplexes sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.
    • Beispiel 7
  • Aus den makropolyzyklischen Verbindungen (22)Pyridinamid und (222B) wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 die nachstehend angegebenen makropolyzyklischen Komplexe erhalten:
  • [Eu³&spplus;C (22) Pyridinamid]
  • [Tb³&spplus;C(222B)]
    • Beispiel 8 Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung (22)Bisisochinolin der Formel (12): 1,1'-[N,N',N,N'-[Bis-(3,6- dioxaoctamethylen)-bis-aminomethyl]-3,3'-bisisochinolin und des entsprechenden Europiumkomplexes a) Herstellung von 1,1'-Bis-(brommethyl)-3,3'-bisisochinolin der Formel 10
  • Diese Verbindung wurde ausgehend von 1-Methyl-3-hydroxyisochinolin der Formel
  • hergestellt.
  • Das 1-Methyl-3-hydroxyisochinolin wurde durch Zyklisierung von N-(±)-Phenylethyl-diethoxyacetamid hergestellt. 72 g dieser Ausgangsverbindung, die gemäß dem von H. Fukumi et al "Heterocycles", Bd. 9 (9) (1978), S. 1197 beschriebenen Verfahren hergestellt und durch Destillation unter vermindertem Druck (140ºC - 0,1 mm Hg) gereinigt worden war, wurden tropfenweise und unter Rühren innerhalb von 1 Stunde zu 400 ml konzentrierter, auf 10ºC abgekühlter H&sub2;SO&sub4; gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während der Zugabe abgekühlt, wobei die Temperatur 10ºC nicht überstieg. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 10 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und sodann auf 600 g Eis gegossen. Nach Filtration wurde die klare Lösung mit 20-prozentigem Ammoniak unter wirksamer Kühlung neutralisiert. Der gelbe Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 41,5 g 1-Methyl-3-hydroxyisochinolin (Ausbeute 90 %).
  • Das auf diese Weise erhaltene 1-Methyl-3-hydroxyisochinolin wurde sodann tosyliert.
  • Eine Suspenion von 41,5 g 1-Methyl-3-hydroxyisochinolin wurde mit Pyridin (250 ml) unter Kühlung in einem Eisbad bewegt. Sodann wurden innerhalb von 30 Minuten nach und nach 70 g (1,5 Äquivalente) p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben. Dabei verschwand die gelbgefärbte Ausgangsverbindung. Die Reaktion wurde dünnschichtchromatographisch verfolgt. Mach Beendigung der Reaktion wurde Wasser (50 ml) zugegeben und eine weitere Stunde bewegt. Sodann wurde das Gemisch in 700 ml Wasser verdünnt und mit festem Na&sub2;CO&sub3; neutralisiert. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 70,5 g eines an Luft stabilen, nicht-hygroskopischen Produkts (Ausbeute 86%).
  • Das auf diese Weise erhaltene 1-Methyl-3-p-toluolsulfonyloxyisochinolin wurde sodann gemäß dem von M. Tiecco et al. in Synthesis (1984), S. 736 beschriebenen Verfahren gekuppelt.
  • In einem mit Argon gespülten Dreihalskolben, der mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, wurden 1 Liter Dimethylformamid (DMF), 236,3 g Triphenylphosphin und 53,5 g NiCl&sub2;·6H&sub2;O vorgelegt. Diese Produkte bildeten eine dunkle blaugrüne Lösung.
  • Sobald die Temperatur des Ölbads 50ºC erreicht hatte, wurden 14,64 g Zinkpulver zugegeben. Die Lösung verfärbte sich rotbraun. Nach 1 Stunde wurde die Lösung des Ausgangsprodukts (70,5 g in 200 ml DMF, d. h. 1-Methyl-3-p-toluolsulfonyloxyisochinolin, rasch tropfenweise unter Rühren und unter Erwärmen auf 50ºC zugegeben. Dieser Zustand wurde 6 h aufrechterhalten. Nach Abkühlung auf Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch in 4 Liter verdünnten Ammoniak (1,5 Liter H&sub2;O und 5 ml 20% NH&sub3;) gegeben. Ein heftiger Luftstrom wurde durch die Suspension geleitet, um den Komplex Ni&sup0; (Ph&sub3;P)&sub4; (Ph = Phenyl) zu oxidieren. Der Endpunkt der Oxidation wurde durch Verschwinden der braunen Färbung angezeigt. Sodann wurde die Suspension filtriert, mit Wasser gewaschen und in 400 ml 20% HCl gebracht, um das Bisisochinolin in das in Wasser unlösliche Hydrochlorid überzuführen. Anschließend wurde die Suspension mit 2 Portionen von je 400 ml Diethylether gerührt, um das Triphenylphosphin zu beseitigen. Die Säureschicht wurde abfiltriert und zur Entfernung von Spuren an Ph&sub3;P und Ph&sub3;PO mit 100 ml Wasser und Aceton gewaschen. Das Hydrochlorid wurde zusammen mit 200 ml 20% Ammoniak in einen Standkolben gebracht und zur Freisetzung der Base über Nacht gerührt. Das erhaltene weiße Produkt (26 g), nämlich 1,1'-Dimethyl-3,3-bisisochinolin wurde filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet (Ausbeute 81%). Das Produkt war in den meisten Lösungsmitteln wenig löslich und geringfügig löslich in CHCl&sub3; und THF.
  • Das auf diese Weise erhaltene 1,1'-Dimethyl-3,3'-bisisochinolin wurde anschließend zur Bildung von 1,1'-Bis-(brommethyl)- 3,3'-bisisochinolin bromiert.
  • 1,20 g 1,1'-Dimethyl-3,3'-bisisochinolin wurden in 500 ml CCl&sub4; unter Rückflußkochen gelöst und mit N-Bromsuccinimid (2,26 g, 3 Äquivalente) versetzt. Nach 10 Minuten wurden 10 g 2,2'-Azobis-(2-methylpropionitril) zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Innerhalb von 1 h wurden 2 weitere Initiatorportionen (jeweils 10 mg) zugesetzt. Nach 3 Stunden wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit- 150 ml Methanol behandelt, 30 Minuten gerührt und filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde mit 100 ml Methanol gewaschen. Der Filterkuchen wurde unter vermindertem Druck gewaschen, in kochendem Toluol (100 ml) gelöst und rasch filtriert. Das Produkt fiel über Nacht im Kühlschrank aus (1,28 g - Ausbeute 68%).
    • b) Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung der Formel 12
  • Ein gerührtes Gemisch von 1,416 g des N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus und 3,39 g Na&sub2;CO&sub3; in 250 ml CH&sub3;CN wurde innerhalb von 3 h mit einer Suspension von 1,1'-Bis-(brommethyl)-3,3'-bisisochinolin in CH&sub3;CN (100 ml) versetzt. Der Rührvorgang wurde 20 h aufrechterhalten. Nach Filtration, Waschen mit CH&sub3;CN und Eindampfen erhielt man ein Rohprodukt, das 2 mal chromatographiert wurde, zunächst an Aluminiumoxid (Elutionsmittel: 3% CH&sub3;OH in CHCl&sub3;, sodann 10% CH&sub3;OH in CH&sub2;Cl&sub2; Vol./Vol.) und sodann an Kieselgel (Elutionsmittel: 10% CH&sub3;OH in CHCl&sub3;). Die Ausbeute bei den beiden Reinigungen betrug 0,289 g, d. h. 14%. Eine weitere Reinigung wurde durch Kristallisation in einem Gemisch aus Ethanol und Ether durch Dampfdiffusion durchgeführt.
    • c) Herstellung des Komplexes [Eu³&spplus;C(22)-BisisochinolinI
  • 24,5 mg (1 Äquivalent) wasserfreies Europiumnitrat wurden in 0,5 ml wasserfreiem CH&sub3;CN gelöst. Der Natriumkomplex von (22)Bisisochinolin (37,0 mg) in 0,3 ml CH&sub3;CN wurde zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde gemäß Beispiel 2 B behandelt. Der erhaltene blaßgelbe Niederschlag wurde in 3 ml Acetonitril verdünnt und 2 Stunden erwärmt. Die Lösung wurde mehrere Tage bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Man erhielt ein gelbes kristallisiertes Produkt der Formel 12.
    • Beispiel 9 Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung (22)Diphenylbipyridin der Formel 18 : 6,6'-[N,N',N,N'-Bis- (3,6-dioxaoctamethylen)-bis-(aminomethyl)]-4,4'-diphenyl- 2 2'-bipyridin a) Herstellung von 6,6'-Bis-(brommethyl)-4,4'-diphenyl-2,2'- bipyridin (16)
  • Die Verbindung wurde unter Verwendung des handelsüblichen 4,4'-Diphenyl-2,2'-bipyridins als Ausgangsprodukt gemäß der nachstehenden Verfahrensweise hergestellt:
    • - 6,6'-Dimethyl-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin
  • Eine gerührte Suspension von 4,4'-Diphenyl-2,2'-bipyridin (4 g, 13 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF), die in einem Eisbad gekühlt war, wurde tropfenweise unter Stickstoffatmosphäre mit 1,5 in (3 Äquivalente) Methyllithium versetzt. Nach der Zugabe wurde die Lösung weitere 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen gerührt. Das erhaltene tiefrote Gemisch wurde sodann erwärmt und 3 Stunden unter Stickstoff bei 40ºC gerührt.
  • Sodann wurde bei 0ºC unter Stickstoff langsam ein Überschuß an Wasser zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase 3 mal mit Dichlormethan extrahiert. Sodann wurde die orangefarbene organische Lösung mit Mangandioxid (20- bis 40-fache Gewichtsmenge der Ausgangsverbindung) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch 30 bis 50 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt (Al&sub2;O&sub3; - Laufmittel: Toluol).
  • Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit Magnesiumsulfat versetzt und weitere 30 Minuten gerührt. Anschließend wurde filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde an Aluminiumoxid chromatographiert (Elutionsmittel: Toluol/Hexan 1 : 1). Man erhielt 2 Produkte:
  • 6,6-Dimethyl-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin, (0,85 g; 19%)
  • 6,6-Monomethyl-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin, (0,45 g; 10,8%)
    • - 6'6-Dimethyl-4'4'-diphenyl-2'2'-bipyridin-N'N'-dioxid
  • In einem 250 ml fassenden Kolben wurde eine Lösung der vorstehenden Verbindung (0,28 g, 0,83 mMol) in Chloroform (60 ml) vorgelegt. Die Lösung wurde gerührt und mit einem Eisbad gekühlt und sodann allmählich mit einer Lösung von m-Chlorperbenzoesäure (0,57 g, 3,3 mMol) in Chloroform (60 ml) versetzt. Der Rührvorgang wurde 3 h fortgesetzt, wobei man während dieser Zeit das Gemisch auf Umgebungstemperatur kommen ließ.
  • Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung (3,3 mMol) 30 Minuten unter Rühren behandelt.
  • Die organische Phase wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde erneut in Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) gelöst und über eine Säule mit basischem Aluminiumoxid gegeben. Eine zweite Chromatographie wurde an Standard-Aluminiumoxid durchgeführt, um das Produkt vollständig zu reinigen (0,21 g; 68%)
    • - 6,6'-Bis-acetoxymethyl)-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin
  • 0,21 g (0,57 mMol) der vorstehenden Verbindung wurden 1 Stunde unter Rückfluß in Essigsäureanhydrid (1,3 ml) erwärmt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und bis zur Bildung eines azeotrop siedenden Gemisches mit Toluol versetzt.
  • Der erhaltene Feststoff wurde erneut in Dichlormethan gelöst, mit einer 10-prozentigen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und durch Abdampfen vom Lösungsmittel befreit. Das Rohprodukt wurde über eine Kieselgelsäule gegeben und mit Dichlormethan eluiert. Man erhielt 0,126 g (Ausbeute 49%) der erwarteten Verbindung.
    • - 6,6'-Bis-(brommethyl)-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin 16
  • Eine gerührte Lösung der vorstehenden Verbindung (0,053 g; 0,117 mMol) in 47-prozentiger Bromwasserstoffsäure (0,9 ml) wurde 4 Stunden auf 130ºC erwärmt.
  • Anschließend wurde die Lösung in einem Methanol/Eis-Bad abgekühlt und mit 15 ml Wasser, 40 ml Chloroform und sodann nach und nach mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung bis zum Erreichen eines alkalischen pH-Werts der Lösung versetzt.
  • Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase mit Chloroform extrahiert (2 · 10 ml). Sämtliche organischen Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde an einer Aluminiumoxidsäule mit Chloroform als Laufmittel chromatographiert. Man erhielt 40 mg (Ausbeute 69%) des Dibromids der Formel 16.
    • b) Herstellung des Salzes [Na&spplus;C(22)-diphenylbipyridin·Br) der Formel 18
  • Man verfuhr wie in Beispiel 5 B unter Verwendung von:
  • 21,2 mg (0,081 mMol) des N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus der Formel 17
  • 43 mg (0,40 mMol) Natriumcarbonat
  • 40 mg (0,081 mMol) des Dibromids der Formel 16
  • Man erhielt 29,8 mg (Ausbeute 53%) des Komplexes der Formel 18.
    • Beispiel 10 Herstellung des makropolyzyklischen Komplexes Diphenylbipyridin-bis-bipyridin der Formel (19): 6,6'- [N,N',N,N'-[Bis-(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)]-bisaminomethyl)]-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin
  • Das Verfahren des vorstehenden Beispiels wurde wiederholt, wobei man anstelle des N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus der Formel 17 Makrozyklus-bis-pyridin der Formel (5) (Beispiel 5) verwendete. Es wurden eingesetzt:
  • 24,7 mg (0,063 mMol) Makrozyklus-bis-pyridin 5
  • 31,1 mg (0,063 mMol) des Dibromids der Formel 16
  • 0,1 mg (0,94 mMol) Natriumcarbonat.
  • Die Reaktion dauerte 23 h. Man erhielt die Verbindung der Formel 19 in einer Ausbeute von 20%.
    • Beispiel 11 Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung Isochinolinbis-dipyridin der Formel 20: 1,1'-[N,N',N,N'-[Bis-(2,2'- bipyridin-6,6'-dimethyl)]-bis-(aminomethyl)]-3,3' bisisochinolin
  • Das Verfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei anstelle des N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus der Formel 11 Makrozyklus-bis-bipyridin der Formel 5 verwendet wurde. Es wurden äquimolare Mengen der Verbindung der Formel 5 und des Dibromids der Formel 10 eingesetzt. Man erhielt die Verbindung der Formel 20.
    • Beispiel 12 Herstellung der makropolyzyklischen Verbindung (22) Bipyridin
  • Man verfuhr wie in Beispiel 5 und verwendete anstelle von Makrozyklus-bis-bipyridin der Formel 5 den N&sub2;O&sub4;-Makrozyklus der Formel 11. Man erhielt die makropolyzyklische Verbindung der Formel 21.
    • Beispiel 13
  • Man verfuhr wie in Beispiel 1 unter Verwendung der gemäß den Beispielen 9 bis 12 erhaltenen makropolyzyklischen Verbindungen. Man erhielt die nachstehend aufgeführten makropolyzyklischen Komplexe:
  • [Eu³&spplus;C(22)Bipyridin]: Eu³&spplus;-Komplex von 6,6'-[N,N',N,N'-Bis- (3,6-dioxaoctamethylen)-bis-(aminomethyl)]-2,2'-bipyridin.
  • [Eu³&spplus;C(bpy.bpy.bisisoch.)]: Eu³&spplus;-Komplex von 1,1'-[N,N',N,N'- Bis-2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)-bis-(aminomethyl)]-3,3' bisisochinolin.
  • [Eu³&spplus;C(22)Diph.bpy]: Eu³&spplus;-Komplex von 6,6'-[N,N',N,N'-Bis- (3,6-dioxaoctamethylen)-bis-(aminomethyl)]-4,4'-diphenyl- 2,2'-bipyridin.
  • [Tb³&spplus;C(22)Bipyridin]: Tb³&spplus;-Komplex von 6,6'-[N,N',N,N'-Bis- (3,6-dioxaoctamethylen)-bis-(aminomethyl)]-2,2'-bipyridin.
  • In entsprechender Weise wurde gemäß Beispiel 5 der Komplex [Eu³&spplus;C (Makropolyzyklus-tris-phenanthrolin)] (Eu³&spplus;-Komplex von 2,2',2'',9,9',9''-Bis-[nitrilotri-(methylen)]-tris-(1,10-phenanthrolin) unter Verwendung von 6,6'-Bis-brommethyl-phenanthrolin und des Makrozyklus Bis-(phenanthrolindiyl)-diamin hergestellt. Die makropolyzyklische Verbindung wies die nachstehend aufgeführten Eigenschaften auf:
  • Mikroanalyse: C&sub4;&sub2;H&sub3;&sub3;N&sub8;, NaBr, H&sub2;O (767,6)
  • berechnet: C 65,71, H 4,17, N 14,6
  • gefunden: C 65,23, H 4,26, N 13,10
  • NMR ¹H: Lösungsmittel CDCl&sub3;
  • 4,03, 4,45 (sehr breit; AB; 12H; CH&sub2;)
  • 7,66 (d, J=8,1; 6H; H-C(3); H-C(8))
  • 7,78 (s, 6H, H-C(5); H-C(6))
  • 8,27 (d, J=8,1; 6H; H-C(4); H-C(7)).
    • Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Kryptate a) Anregungsmaxima für eine gegebene Emissionswellenlänge
  • Für jeden Komplex wurden für eine gegebene Emissionswellenlänge, die für das Seltene Erdmetallion des Komplexes charakteristisch ist, die Anregungswellenlängen bestimmt. Die ermittelten Anregungsmaxima entsprachen nicht denen des Seltenen Erdmetallions allein. Ferner wurde festgestellt, daß bei Anregung des Komplexes mit der Wellenlänge, die dem vorstehend bestimmten Anregungsmaximum entsprach, das Fluoreszenzmaximum charakteristisch für das Seltene Erdmetallion war.
  • Die vorstehenden Bestimmungen wurden mit einem Spektrophotometer Perkin-Elmer LS 5 unter den in der nachstehenden Tabelle I aufgeführten Bedingungen durchgeführt.
    • b) Messung der Lebensdauer &tau; der Kryptate von Europium und Terbium
  • Mit dem Spektrophotometer LS 5 wurde das Emissionsspektrum des Peaks zwischen 610 und 620 nm für Europium und zwischen 540 und 550 für Terbium aufgezeichnet, wobei die Lösung mit einem der Absorptionsmaxima angeregt wurde. Man arbeitete im Modus "Phosphoreszenz", wobei der Wert für das Fenster auf 1 MS = tg eingestellt wurde. Die Aufzeichnungen wurden für mehrere Werte td (Verzögerung) durchgeführt, nämlich 0,1; 0,2; 0,2; 0,4; und 0,5 ms. Die Intensität des Maximums It wurde gemessen. &tau; wurde durch die folgende Formel bestimmt:
  • Durch Zeichnen der Kurve log It als Funktion von td läßt sich Io bestimmen und T berechnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt. Tabelle I Anregungs- und Emissionseigenschaften der erfindungsgemäßen Komplexe (Perkin Elmer LS 5) Komplex Konzentration (Lösungsmittel) Spaltbreite Expansionsfaktor Anregung &lambda; Emission vorgegeben &lambda; Anregung aufgezeichnet Fluoreszenzmaximum beobachtet bei (Wasser) (Peak) (Schulter) (zweiter Peak) Tabelle I (Forts.) Anregungs- und Emissionseigenschaften der erfindungsgemäßen Komplexe (Perkin Elmer LS 5) Komplex Konzentration (Lösungsmittel) Spaltbreite Expansionsfaktor Anregung &lambda; Emission vorgegeben &lambda; Anregung aufgezeichnet Fluoreszenzmaximum beobachtet bei (Wasser) (Peak) Tabelle I (Forts.) Anregungs- und Emissionseigenschaften der erfindungsgemäßen Komplexe (Perkin Elmer LS 5) Komplex Konzentration Spaltbreite Expansionsfaktor Anregung &lambda; Emission vorgegeben &lambda; Anregung aufgezeichnet Fluoreszenzmaximum beobachtet bei (Peak) (Schulter) * Messung im Phosphoreszenzmodus: Verzögerung td = 0,1 msec; tg = 2 msec ** Messung im Phosphoreszenzmodus: Verzögerung td = 0,2 msec; tg = 5 msec

Claims (21)

1. Verwendung von makropolyzyklischen Komplexen von seltenen Erden, die mindestens aus einem Salz von seltenen Erden bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der allgemeinen Formel:
komplexiert ist, in der Z ein Atom, ausgewählt aus Stickstoff- Kohlenstoff oder Phosphor ist, R nichts ist oder Wasserstoff, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder ein Kohlenwasserstoffradikal darstellt, die bivalenten Radikale , und unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten sind, die mindestens zwei Kohlenstoffatome umfassen und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, die aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt und gegebenenfalls durch einen Hetero-Makrozyklus unterbrochen sind, mindestens eines der Radikale , oder zusätzlich mindestens ein molekulares Motiv aufweist oder im wesentlichen durch ein molekulares Motiv gebildet ist, das molekulare Motiv eine Triplett-Energie besitzt, die höher ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten seltenen Erdions - als Markierungen von biologischen Produkten in den immunologischen Detektions- und Bestimmungsverfahren durch Fluoreszenz.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Komplexe von seltenen Erden durch ein Radikal substituiert sind, das ausgewählt ist aus den Radikalen Alkylamino, Arylamino, Isothiocyano, Cyano, Isocyano, Thiocyano, Carboxyl, Hydroxyl, Mercapto, Phenol, Imidazol, Aldehyd, Epoxid, Halogen: von Thionyl, von Sulfonyl, von Nitrobenzoyl, von Carbonyl; Triazo, Succinimido, Anhydrid, Halogenacetat, Hydrazino, Dihalogentriazinyl.
3. Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden, die mindestens aus einem seltenen Erdsalz bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der Formel:
komplexiert ist, in der Z ein Atom, ausgewählt aus Stickstoff, Kohlenstoff oder Phosphor ist, R nichts ist oder Wasserstoff, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder ein Kohlenwasserstoffradikal darstellt, die bivalenten Radikale , und unabhängig von einander Kohlenwasserstoffketten sind, die mindestens zwei Kohlenstoffatome umfassen und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, die aus Sauerstoff und Schwefel ausgewählt und gegebenenfalls durch einen Hetero-Makrozyklus unterbrochen sind, mindestens eines der Radikale , oder zusätzlich mindestens ein molekulares Motiv aufweist oder im wesentlichen durch ein molekulares Motiv gebildet ist, das molekulare Motiv eine Triplett-Energie besitzt, die höher ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten seltenen Erdions, vorausgesetzt, daß, wenn das seltene Erdsalz ein Europium- oder Terbiumsalz ist, Z Stickstoff ist, -(CH&sub2;)&sub2;-O-C&sub6;H&sub3;R&sub1;-O-(CH&sub2;)&sub2;- mit R&sub1; = H oder NH&sub2; ist, und nicht gleichzeitig das eine das Radikal -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- und das andere das Radikal -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- ist und daß, wenn das seltene Erdsalz ein Lanthan- oder ein Praseodymsalz ist, Z Stickstoff ist, -(CH&sub2;)&sub2;-O-C&sub6;H&sub3;NH&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- ist, und nicht gleichzeitig -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- und -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- sind, als neue Produkte.
4. Komplexe gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenwasserstoffketten Oxyethylen- oder Polyoxyethylenketten sind.
5. Makropolyzyklische Komplexe gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das seltene Erdion ausgewählt ist aus Europium, Terbium, Samarium und Dysprosium.
6. Makropolyzyklische Komplexe gemäß irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Motiv-Energiedonor eine Phosphoreszenzwellenlänge unterhalb von 580 nm besitzt.
7. Makropolyzyklische Komplexe gemäß irgendeinem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das molekulare Motiv ausgewählt ist aus Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, den Bi- und Terphenylen, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin, den Bipyridinen, den Bichinolinen, insbesondere den Biisochinolinen und den Verbindungen der nachfolgenden Formeln:
-C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-C&sub6;H&sub4;-X&sub2;-C&sub2;H&sub4;-C&sub2;H&sub4;-X&sub1;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-X&sub2;-C&sub2;H&sub4;in denen X&sub1; und X&sub2; gleich oder verschieden sein können, Sauerstoff oder Schwefel bezeichnen;
X Sauerstoff oder Wasserstoff ist.
8. Makropolyzyklischer Komplex gemäß irgendeinem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er aus dem Terbium- oder Europiumion, das durch eine der nachfolgenden makropolyzyklischen Verbindungen komplexiert ist, besteht:
2,9-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-1,10-phen-anthrolin,
2,9-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminocarbonyl)]-1,10-ph-enanthrolin,
9,10-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminoethyl)]anthracen,
9,10-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(carbamoylmethyl)]anthr-acen,
1,1'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-3,3'-bii-sochinolin,
6,6'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-4,4'-dip-henyl-2,2'-bipyridin,
6,6'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-2,2'-bip-yridin,
6,6'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminocarbonyl)]-2,2'-b-ipyridin,
6,6',6'',6''', 6'''',6'''''-bis[nitrilotri(methylen)]tris-2,2'-bipyridin,
2,2',2'',9,9',9''-bis[nitrilotri(methylen)]tris(1,10-phenanthrolin),
2,9-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-1,-10-phenanthrolin,
1,1'-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyndin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-3,-3'-biisochinolin,
6,6'-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-4-,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin.
9. Makropolyzyklische Komplexe gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie Formel (I) entsprechen, in der Z = N ist.
10. Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden, die aus mindestens einem seltenen Erdsalz bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung komplexiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die makropolyzyklische Verbindung aus den nachfolgenden Verbindungen ausgewählt ist: -(22)Pyridinamid -(22)Pyridinamin -(22)Bipyridin -(22)Bipyridinamid -(22)Azopyridin
11. Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden, die mindestens aus einem seltenen Erdsalz bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung nach Formel (I) gemäß Anspruch 3 komplexiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß Z = N, und zwei mono- oder polyoxygenierte Ketten sind, und daß einer der nachfolgenden Formeln entspricht:
12. Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden, die mindestens aus einem seltenen Erdsalz bestehen, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 3 komplexiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß und jeweils die Gruppe
darstellen, und daß eine der nachfolgenden Gruppen ist:
13. Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden, die mindestens aus einem seltenen Erdsalz, das durch eine makropolyzyklische Verbindung der Formel (1) gemäß Anspruch 3 komplexiert ist, bestehen, dadurch gekennzeichnet, daß Z = N ist, , und identisch sind und einen der nachfolgenden Heterozyklen darstellen:
14. Makropolyzyklische Verbindung entsprechend der Formel:
in der Z ein Atom, ausgewählt aus Stickstoff- Kohlenstoff oder Phosphor ist, R nichts ist oder Wasserstoff- die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder ein Kohlenwasserstoffradikal darstellt, die bivalenten Radikale , und unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten sind, die mindestens zwei Kohlenstoffatome umfassen und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, die aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt und gegebenenfalls durch einen Hetero-Makrozyklus unterbrochen sind, mindestens eines der Radikale , oder zusätzlich mindestens ein molekulares Motiv aufweist oder im wesentlichen durch ein molekulares Motiv gebildet ist, das molekulare Motiv eine Triplett-Energie besitzt, die höher ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten seltenen Erdions und ausgewählt wird aus Phenanthrolin, Anthracen, Bipyridin und den Bichinolinen, insbesondere den Biisochinolinen, vorausgesetzt, daß, wenn Z Stickstoff ist und einer der nachfolgenden Formeln:
entspricht, und nicht gleichzeitig -(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;- sind.
15. Verbindung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß Z Stickstoff ist und und Polyoxyethylenketten sind.
16. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der nachfolgenden Verbindungen ist:
2,9- [N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-1,10-phenanth-rolin,
2,9-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminocarbonyl)]-1,10-ph-enanthrolin,
9,10-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminoethyl)]anthracen,
9,10-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(carbamoylmethyl)]anthr-acen,
1,1'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-3,3'-bii-sochinolin,
6,6'-[N,N',N,N'-bis(3,6-dioxaoctamethylen)bis(aminomethyl)]-4,4'-dip-henyl-2,2'-bipyridin.
17. Verbindung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung so ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13 definiert.
18. Verbindung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie 6,6',6'',6''',6'''',6'''''-bis[nitrilotri(methylen)]tris-2,2'-bipyri-din,
2,9-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-1,-10-phenanthrolin,
1,1'-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-3-,3'-biisochinolin,
2,2',2'',9,9',9''-bis[nitrilotri(methylen)]tris(1,10-phenanthrolin),
6,6'-[N,N',N,N'-bis(2,2'-bipyridin-6,6'-dimethyl)bis(aminomethyl)]-4-,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin.
19. Biologischer Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem biologisch aktiven Molekül besteht, das durch Adsorption auf oder Kupplung mit einem makropolyzyklischen Komplex von seltenen Erden, wie in den Ansprüchen 1, 3 bis 13 definiert, assoziiert ist.
20. Biologischer Komplex gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Molekül ausgewählt wird aus den Antigenen, den Antikörpern, den monoklonalen Antikörpern, den Fragmenten und Kombinationen von Antikörper-Fragmenten, den Arzneimitteln, den Rezeptoren, den Hormonen, den Hormonrezeptoren, den Bakterien, den Steroiden, den Aminosäuren, den Peptiden, den Viren, den Vitaminen, den Nucleotiden oder Polynucleotiden, den Enzymen, ihren Substraten, den Lektinen, den Nucleinsäuren, DNS und RNS.
21. Exaltationsverfahren der Fluoreszenz von seltenen Erdionen, dadurch gekennzeichnet, daß es darauf beruht, mindestens ein selten Erdion mit einer makropolyzyklischen Verbindung, wie in den Ansprüchen 1, 3 bis 13 definiert, zu komplexieren und das molekulare Motiv der Verbindung anzuregen.
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