DE69122122T2

DE69122122T2 - Hydroxamsäuren zur prävention von peperfusionsschäden

Info

Publication number: DE69122122T2
Application number: DE69122122T
Authority: DE
Inventors: Michael Davies; Catherine Rice-Evans
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1990-11-15
Filing date: 1991-11-15
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2011-11-16
Also published as: AU8906791A; ATE142487T1; EP0559677B1; EP0559677A1; ES2091949T3; GB9124272D0; GB2252246B; GB2252246A; GB9024820D0; DE69122122D1; JPH06504988A; ZA919069B; US5506266A; WO1992008453A1; AU661980B2; CA2095606A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Regulierung der durch freie Radikale induzierten Schädigung, die aufgrund einer Reperfusionsverletzung an Geweben entsteht, und insbesondere die Regulierung einer Herzschädigung.
Die Schädigung der Herzstruktur bzw. des Herzgewebes ist eine der allgemeinsten Ursachen für Krankhaftigkeit und Sterblichkeit beim Menschen. Die gängigste Art der Behandlung von Patienten, die einen myokardialen Infarkt erlitten haben, ist einfach die Verabreichung thrombolytischer Wirkstoffe. Bei Verletzungen durch Reperfusion nimmt man an, daß, wenn auch die Gewebeschädigung von der Dauer der Anoxie abhängig ist, die Schädigung durch die plötzliche Perfusion von Sauerstoff, die zur Entstehung verschiedener Arten freier Radikale führt, verschlimmert wird. Obwohl viele Studien die Beteiligung von freien Radikalspezies mit einbeziehen, welche bei der zellulären Schädigung bei myokardialer Reperfusionsverletzung, ebenso wie bei Verletzungen durch Reperfusion an anderen Geweben beobachtet wurden, bleibt das Erscheinungsbild, der Ausgangspunkt und die Lokalisation trotzdem umstritten.
Untersuchungen an isolierten Herzpräparationen mit einer Ligatur der Koronararterien haben gezeigt, daß die Inkorporation von Hydroxylradikalfängern und Desferrioxamin vor der Reperfusion das Auftreten von Arrhythmien am Herzen und andere Kennzeichen der radikal- vermittelten Schädigung bei Reperfusion senkt, eine derartige Arbeit wird bei Rice-Evans et al., Free Rad. Res. Comm., 1989, 7, 49 diskutiert. Die Rolle von Desferrioxamin bei der Eingrenzung von myokardialen ischämischen/ Reperfusionsverletzungen wurde auch von Reddy et al., Free Rad. Biol. Med., 1989, 7, 45, anhand von Experimenten bei Hunden bestätigt.
Wir haben jetzt jedoch herausgefunden, daß bestimmte andere Hydroxamatverbindungen gegenüber Desferrioxamin eine viel bessere Wirkung bei der Bekämpfung einer Herzschädigung zeigen, die aus einer durch freie Radikale induzierten Schädigung, entstanden aus einer Reperfusionsverletzung, herrührt.
Dementsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung den Einsatz einer Verbindung der Formel (I)
bei der R und R' jeweils unabhängig aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen und mit einer Arylgruppe substituierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Eindämmung einer, durch freie Radikale induzierten Schädigung, die aus einer Reperfusionsverletzung am Gewebe entsteht, ausgewählt werden.
Bestimmte Verbindungen der Formel (I) sind zur Verwendung als Zwischenprodukte für die Herstellung von Herbizidverbindungen beschrieben, wie im US Patent 4.507.148 beschrieben. Das US Patent 4.604.407 beschreibt neue Hydroxamatverbindungen, die die Verbindungen der Formel (I) beinhalten, die das Enzym Lipoxygenase hemmen und so als Anti-Allergiesubstanzen nützlich sind. Die europäische Patentanmeldung 0 365 210 legt Hydroxamsäurederivate offen, die insbesondere Verbindungen der Formel (I) umfassen, bei denen R Methyl, n-Propyl oder Phenyl ist und R' Undecyl ist, welche ebenso Lipoxygenaseinhibitoren sind und es angezeigt ist, daß sie hilfreich bei der Behandlung von bronchialem Asthma, Allergien, Entzündungskrankheiten und ischämischen Herzkrankheiten sind. Die europäische Patentanmeldung 0 273 451 legt Hydroxamatverbindungen offen, die Verbindungen der Formel (I) beinhalten, die ebenfalls Lipoxygenaseinhibitoren sind, und es wird angeführt, daß sie die Bildung bestimmter Mediatoren verhindern, welche bei bestimmten entzündlichen und allergischen Krankheitszuständen beteiligt sind. Die Hemmung der Lipoxygenase und die Verhinderung der Ausbildung solcher Mediatoren als Ergebnis, mildert die davon herrührenden entzündlichen und allergischen Zustände.
Wir sind uns einer früheren Indikation in der Literatur nicht bewußt, bei der Verbindungen der Formel (I) in der Behandlung und Prävention einer Reperfusionsverletzung eingesetzt werden.
Wie gezeigt, enthalten die Verbindungen der Formel (I) die Gruppen R und R', welche unabhängig voneinander aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen und mit einer Arylgruppe substituierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen gewählt werden. Der Begriff aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen wird hierbei in Bezug zu beiden, unsubstituierten und den, substituierten Gruppen verwendet, um beide, nicht zyklische und zyklische Gruppen, die ungesättigt oder gesättigt sein können, zu umfassen, wobei die nicht zyklischen Gruppen eine verzweigte Kette oder insbesondere eine gerade Kette haben. Bevorzugte unsubstituierte Gruppen sind jene von bis zu 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatomen, besonders von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bei nicht zyklischen Gruppen und 3 bis 6 Kohlenstoffatome bei zyklischen Gruppen, zum Beispiel nicht zyklische Gruppen von 1, 2, 3 , 4 ,5, oder 6 Kohlenstoffatomen und zyklische Gruppen von 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen. Während die zyklischen aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen bevorzugt gesättigt sind, zum Beispiel, daß sie Cyclopropyl oder Cyclohexyl sind, haben sowohl gesättigte und ungesättigte Gruppen Bedeutung, im Falle von nicht zyklischen Gruppen, zum Beispiel Allyl, Propargyl, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl, die letzten vier Begriffe werden hier verwendet um beide, die verzweigten und die geraden, Kettengruppen miteinzubeziehen, obwohl die letzteren generell von größerem Interesse sind.
Was die substituierten aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen betrifft, können diese, wie eben für die unsubstituierten Gruppen beschrieben, ausgewählt werden, obwohl eine stärkere Bevorzugung für die kleineren Gruppen existiert, besondere jene mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bei nicht zyklischen Kohlenwasserstoffgruppen und 3 bis 6 Kohlenstoffatome für die zyklischen Kohlenwasserstoffgruppen und besonders von 1, 2, 3, oder 4 bzw. 3 oder 4 Kohlenstoffatomen. Es gibt eine Bevorzugung für gesättigte Gruppen und gewöhnlicherweise auch für nicht zyklische Gruppen,wobei Aralkygruppen von besonderem Interesse sind. Eine weiter Bevorzugung existiert für gerade Kettengruppen und für endständig substituierte Gruppen. Substituierte C&sub1;&submin;&sub6; Alkylgruppen sind daher von besonderem Interesse, insbesondere substituierte Ethyl- und insbesondere substituierte Methylgruppen, da eine Präferenz für die Gesamtgröße der aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe, die durch eine Arylgruppe substituent ist, von bis zu 8 oder 10 Kohlenstoffatome vorliegt.
Der Begriff Arylgruppe wird hierbei in seiner gewöhnlichen Bedeutung verwendet, d.h um eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe anzuzeigen, und schließt als solches insbesondere eine 1 - oder 2-Naphtylgruppe oder speziell eine Phenylgruppe mit ein, deren Gruppen wahlweise durch eine oder mehrere aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen substituiert werden können. Diese Substitutionsgruppen können passenderweise aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen, wie die hier voranstehend beschriebenen, speziell C&sub1;&submin;&sub4; Alkylgruppen, insbesondere Methyl oder Ethyl sein. Die Arylgruppen, ob sie eine Arylgruppe R oder R' sind oder ein Teil einer Gruppe R oder R', der eine aliphatische, durch eine Arylgruppe substituierte Kohlenwasserstoffgruppe trägt, besitzen vorzugsweise bis zu 8 oder 10 Kohlenstoffatome, besonders 6 bis 8 Kohlenstoffatome.
Spezifische Beispiele für Arylgruppen und aliphatische Gruppen, die durch eine Arylgruppe substituiert wurden, sind Phenyl, Tolyl, Benzyl, α-Methylbenzyl und Phenethyl.
Gewöhnlich enthalten die bevorzugten Verbindungen (I) eine Gruppe R', die eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe darstellt, und passenderweise ist die Gruppe R ebenfalls eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe. Dementsprechend enthalten die Verbindungen (I) von besonderem Interesse zwei aliphatische C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Kohlenwasserstoffgruppen, insbesondere zwei C&sub1;&submin;&sub5;- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppen, zum Beispiel C-&sub1;, C&sub2;-, C&sub3;-, C&sub4;-, C&sub5;- oder C&sub6;-Alkylgruppen Somit können R und R' insbesondere jeweils unabhängig aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl Pentyl und Hexyl gewählt werden. Was die Einfachheit der Synthese der Verbindungen im besonderen betrifft, gibt es eine Bevorzugung, wo größere Gruppen in den Verbindungen (I) vorhanden sind, ob diese nun aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen oder mit einer Arylgruppe substituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen sind, wobei R eine solche Gruppe ist, da im allgemeinen R' bevorzugterweise Ethyl oder insbesondere Methyl ist Beispiele für spezifische Verbindungen (I) sind N-Methyl-acetohydroxamsäure (R=R'=CH&sub3;), N-Ethyl-acetohydroxamsäure (R= CH&sub3;, R'= C&sub2;H&sub5;), N-Methyl-Propionohydroxamsäure (R=C&sub2;H&sub5;, R'=CH&sub3;) und N-Ethyl-propionohydroxamsäure (R=R'=C&sub2;H&sub5;), und deren Analoga, bei denen R' Methyl und R Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Phenyl oder Benzyl ist und bei denen R' Ethyl und R Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Phenyl oder Benzyl ist. Die am meisten bevorzugte Verbindung ist jedoch N-Methyl-hexanhydroxamsäure (R&sub1;= CH&sub3;, R'= C&sub5;H&sub1;&sub1;), von der gezeigt wurde, daß sie bessere Eigenschaften gegenüber seinen Analogen besitzt bei denen R'= CH&sub3; und R CH&sub3;, n-C&sub3;H&sub7;, n-C&sub9;H&sub1;&sub9; und C&sub6;H&sub5; ist.
Die Erfindung schließt die unter den Verbindungen (I) mit ein, die per se neu sind und ebenso die Verwendung jener Verbindungen in der Therapie, die per se nicht neu sind, aber nicht im Zusammenhang mit einer therapeutischen Anwendung beschrieben wurden.
Wenn gewünscht, können die Verbindungen (I) in Form von einem physiologisch annehmbaren Salz davon eingesetzt werden. Insbesondere können diese mit verschiedenen Basen geformt werden. Beispiele für entsprechende Basen sind die Alkalimetallhydroxide, zum Beispiel Natriumhydroxid, quarternäre Ammoniumhydroxide und Amine wie Tris (Tris steht für 2 - Amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol). Die Verbindungen (I) sind jedoch nur schwache Säuren, und im allgemeinen ist deswegen die freie Säure von größerem Interesse als die Salze.
Die Verbindungen werden leicht durch Reaktion einer geeigneten Verbindung RCOX, bei der X eine geeignete Abgangsgruppe ist, insbesondere eine Halogengruppe, so daß RCOX ein Säurehalogenid ist, zum Beispiel ein Säurechlond RCOCl, mit dem geeigneten N-substituiertem Hydroxylamin, R'NHOH in einem entsprechenden Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol hergestellt. Eine Reaktionsdauer von 30 Minuten und eine Temperatur von 0-5 ºC sind oft angemessen.
Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der Formel (I)
bei der R und R' jeweils unabhangig aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen und mit einer Arylgruppe substituierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen gewählt werden, umfaßt so die Reaktion eines N-substituierten Hydroxylarnins der Formel R'NHOH, bei der R' wie für die Verbindung (I) ist, mit einer Verbindung der Formel RCOX, bei der R wie flir die Verbindung (I) ist und X eine geeignete Abgangsgruppe ist, und wählfreies Bilden eines physiologisch annehmbaren Salzes davon.
Ohne Festlegung zu irgeneiner bestimmten Wirkungsweise der Verbindungen (I), kann angegeben werden, daß sie, wenn sie in der Bekämpfüng einer Reperfusionsschädigung, einem Myokardinfarkt nachfolgend eingesetzt werden, man glaubt, daß sie durch ihre Wirkung auf den erhöhten Spiegel an freien Radikalspezies fiinküonieren, was das im Körper vorhandene Ferrylmyoglobin, das dem Infarkt folgt, mit einschließt. Man ist der Überzeugung, daß diese eine der freie Radikale erzeugenden Spezies ist, welche vom Myoglobin durch Interaktion mit oxidierenden Mitteln wie Wasserstoffperoxid, das von Superoxidradikalen, die aus zellulären Quellen erzeugt wurden, stammen, und eine der Hauptquellen an freien Radikalen, die bei der Reperfusionsverletzung entstehen, ist und eine wichtige beitragende Rolle beim Auftreten einer Herzschädigung oder Reperfusion spielt. Von den Verbindungen (I) wird angenommen, daß sie ihre Wirkung durch beides, die Hemmung der Oxidation von Myoglobin zu Fenylmyoglobin und durch die Reduktion des Ferrylmyoglobins, das bereits gebildet wurde, ausüben. Da man von den Verbindungen (I) annimmt, daß sie Antioxidantien sind, können sie zusätzlich als Fänger anderer potentieller reaktiver Radikalspezies, die entstehen könnten, wirken.
Die Verbindungen der Formel (I) sind jedoch nicht nur bei der Behandlung von Patienten, die einen Myokardinfarkt durchgemacht haben, zur Regulierung einer Verletzung durch die Reperfusion aufgrund einer plötzlichen Verfügbarkeit von Sauerstoff für das Herzgewebe von Wert sondern auch bei der Regulierung einer Reperfussionsschädigung im allgemeinen oder bei der Wiederversorgung des Gewebes mit Sauerstoff Daher sind die Verbindungen der Formel (I) von Interesse für den Einsatz in der Eindämmung einer Reperfusionsverletzung des Gehirns nach einem Schlaganfall. Ein weiteres besonderes Beispiel der Anwendbarkeit der Erfindung ist bei Organtransplantationsoperationen, zum Beispiel des Herzens, der Niere oder der Leber, bei der die Einführung des Spendertransplantationsorgans in den Empfängerkörper in einer plötzlichen Pertusion von Sauerstoff ins Organ führt, was, wenn keine Behandlung erfolgt, zu einer Verletzung durch die Reperfusion aufgrund freier Radikale, die gebildet werden, führen kann.
Die Verbindungen (I) können mit einem physiologisch verträglichem Verdünnungsmittel oder einem Trägerstoff zur Verwendung als Medikamente für die Veterinärmedizin formuliert sein, besonders im Zusammenhang mit Säugern und speziell für die Anwendung beim Menschen mit einer Vielzahl von Methoden. Zum Beispiel können sie als Zusammensetzung, in die ein flüssiges Verdünnungsmittel oder ein Trägermaterial eingebracht ist, zum Beispiel eine wäßrige oder ölige Lösung, Suspension oder Emulsion angewendet werden, was oft für parenterale Verabreichung, wie eine Injektion oder Infusion angewendet wird, und sie sollte daher geeigneterweise steril und pyrogenfrei sein. Die orale Verabreichung kann auch eingesetzt werden, aber die Notwendigkeit so schnell wie möglich mit der Behandlung bei der Regulation der Refusionsverletzung zu beginnen, bedeutet, daß diese Strategie weniger bevorzugt ist. Obwohl in Zusammensetzungen für die orale Anwendung ein flüssiges Verdünnungsmittel oder einen Träger enthalten können, ist es gängiger, einen Feststoff zu verwenden, zum Beispiel ein herkömmliches festes Trägermaterial wie Stärke, Laktose, Dextrin oder Magnesiumstearin. Derartige feste Zusammensetzungen können günstigerweise von einer bestimmten Form sein, zum Beispiel als Tabletten, Kapseln (inklusive Spansules) usw.
Andere Verabreichungsformen als durch Injektion, Infusion oder über dem oralen Weg können ebenfalls sowohl bei Menschen und im veterinärem Zusammenhang in Erwägung gezogen werden, sind aber wieder von geringerem Interesse als die Darreichung durch Injektion oder Infusion. Solche alternativen Formen beinhalten die Verwendung von Suppositorien oder Pessaren und von Zusammensetzungen für die bukkale oder nasale Anwendung, zum Beispiel Pastillen, Nasentropfen oder ein Aerosolspray.
Demzufolge umfaßt die Erfindung weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung (I), wie hier zuvor beschrieben, in der das Medikament in einer injizierbaren oder infundierbaren Form vorliegt.
Die Zusammensetzungen können in einer Einheitsdosierungsform formuliert sein, d.h. in der Form von definierten Portionen, von denen jede eine Dosiseinheit enthält, oder ein Vielfaches oder weniger als ein Vielfaches der Dosiseinheit. Während die Dosierung der verabreichten aktiven Verbindung von verschiedenen Faktoren abhängen wird, einschließlich von der jeweiligen Verbindung, die in der Zusammensetzung verwendet wird und dem Zustand, der behandelt werden soll, kann in einer Gebrauchsanweisung festgelegt werden, daß die Behandlung, nach einem Myokardinfarkt, oft eine Dosierung von ungefähr 10 bis 90 mg/kg - je nach Bedarf - wiederholt benötigen wird, d.h. gewöhnlicherweise täglich, aber oft häufiger unmittelbar nach dem Myokardinfarkt, und vergleichbare Dosierungen werden üblicherweise in anderen Zusammenhängen angemessen sein. Tierärztliche Dosierungen sind in einem breiten Bereich vergleichbar. Jedoch wird anerkannt, daß es unter bestimmten Gegebenheiten angemessen sein könnte, Dosierungen der Verbindungen (I) zu geben, entweder unterhalb oder oberhalb dieser Werte.
Wo gewünscht, könnte mehr als eine Verbindung (I) in der pharmazeutischen Zusammensetzung (gewöhnlich mit einem Gesamtdosisspiegel wie hier zuvor angegeben) dargereicht werden, oder, tatsächlich, können andere aktive Bestandteile in der Zusammensetzung eingeschlossen werden. Insbesondere wenn man einen Myokardinfarkt oder einen Verschluß behandelt, werden gewöhnlich thrombolytische Mittel, normalerweise durch Infusion angewendet, und es ist gebräuchlich, die Verbindungen (I) zum gleichen Zeitpunkt zu verabreichen. Deshalb, wenn gewünscht, kann ein solcher Wirkstoff in die Zusammensetzung als zusätzlicher aktiver Bestandteil davon aufgenommen werden. Beispiele für spezifische thrombolytische Wirkstoffe sind Streptokinase, Urokinase und Gewebeplasminogenaktivator (jetzt als rekombinantes Material verwendet).
Wenn die Erfindung in Verbindung mit einer Organtransplantation angewendet wird, kann es auch angemessen sein, die Verbindung oder Verbindungen (I) dem Medium, in dem das Organ gelagert ist, zuzugeben, zum Beispiel in einer Konzentration zwischen 10 und 50 mM, als auch vor der Transplantation in den rückspülenden oder den ausspülenden Lösungen. Im Fall von Aufbewahrungsmedien wird das Medium gewöhnlicherweise empfohlene Nährstoffe wie in klinisch anerkannten Lösungen, solche wie hohes Kalium, niedriges Natrium mit Citrat oder Lactobionat umfassen. Zusätzlich ist es bei Nieren- und Lebertransplantaten nötig, das Organ vor der Transplantation mit einer Spüllösung zu durchspülen. Es ist daher zuträglich, die Verbindung oder Verbindungen (I) in die Spüllösung zuzugeben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und die begleitenden Abbildungen die in Beispiel 4 beschrieben sind, veranschaulicht.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung von N-Methyl-acetohydroxamsäure

(Dieses Verfahren beruht auf demjenigen von Ulrich et al, J. Chem. Soc., 1963, 1098-1101.)
Acetylchlorid (7,85 g, 0,1 Mol) wird unter Rühren und Eiskühlung tropfenweise zu einem Gemisch aus Natriumkarbonat (10,6 g, 0,1 Mol) und N-Methylhydroxylaminhydrochlorid (8,35 g, 0,1 Mol) in Methanol (60 ml) zugegeben, die Temperatur wird unter 5 ºC gehalten Nach weiteren 30 Minuten Rühren wird das Gemisch gefiltert und das Lösungsmittel wird unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt. Der resultierende Rückstand wird nochmals gefiltert, und der Rückstand wird unter Vakuum destilliert, um N-Methyl-acetohydroxamsäure als ein Öl zu erhalten; Sdp.: 74-76º /0,8 mm

Beispiel 2 Herstellung von N-Methyl-hexanhydroxamsäure

(Dieses Verfahren basiert auf demjenigen von Ulrich et al. 3. Chem. Soc., 1963, 1098-1101.)
Hexanoylchlorid ( g, 0,1 Mol) wird unter Rühren und Eiskühlung zu einer Mischung aus Natriumkarbonat (10,6 g, 0,1 Mol) und N-Methylhydroxylaminhydrochlorid (8,35 g, 0,1 Mol) in Methanol (60 ml) tropfenweise zugegeben, die Temperatur wird unter 5 ºC gehalten. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wird die Mischung gefiltert und das Lösungsmittel durch einen Rotationsverdampfer entfernt. Der resultierende Rückstand wird rückfiltriert und der Restanteil unter Vakuum destilliert, um N-Methyl-hexanhydroxamsäure als ein Öl zu erhalten; Sdp.: 87-90 ºC/0,1 mm.
In einem ähnlichen Verfahren, wie oben beschrieben, werden Butyrlchlorid, Decanoychlorid und Benzoylchlorid verwendet, um N-Methyl-butyrohydroxamsäure, N-Methyl-decanhydroxamsäure und N-Methyl-benzohydroxamsäure herzustellen.

Beispiel 3: Zubereitungsform

Die Verbindungen von Beispiel 1 und 2 (13 mg) werden in Wasser (25 ml) gelöst, und ein geeignetes Aliquot wird mit Wasser verdünnt, um eine geeignete Endkonzentration für die Darreichung bereitzustellen. Das Verfahren wird unter sterilen und pyrogenfreien Bedingungen ausgeführt, um eine geeignete Zusammensetzung für die Injektion oder Infüsion bereitzustellen.

Beispiel 4: Aktivität von Verbindungen als Hemmfaktoren von Ferrylmyoglobin

Ferrylmyoglobin wurde unter Verwendung von Wasserstoffperoxid aus Metmyoglobin (Metmb) erzeugt.
Das Metmyoglobin wurde zur Verwendung durch Oxidierung von 5 mi einer ca. 400 µM wäßrigen Lösung von Metmyoglobin mit einer 741 µM wäßrigen Lösung von Kaliumferricyanid in einem 1:1 (v/v)-Verhaltnis gereinigt. Dieses Verfahren wandelt den Hauptanteil von jeglichem Oxymyoglobin, das in Vermischung mit dem Metmyoglobin vorhanden sein könnte, in Metmyoglobin um. Die Mischung wurde dann über eine Sephadex G15-120-Säule geschickt, um das Kaliumferricyanid vom Metmyoglobin abzutrennen, das Letztere wird zuerst eluiert. Durch dieses Verfahren wurde eine Stammlösung von Metmyoglobin mit einer Konzentration von etwa 110 µM erhalten und diese wurde in gefroren Zustand in Ansätzen von passender Größe gelagert. Die gefrorene Lösung wurde vor der Verwendung be Raumtemperatur aufgetaut.
Eine Stammlösung von Wasserstoffperoxid mit einer 1 mM Konzentration wurde alle 4 -5 Stunden frisch hergestellt und im Kühlschrank gelagert und nach Entnahme aus dem Kühlschrank in eine Folie in einem Eiskübel eingewickelt, um den Zerfall zu verlangsamen.
Das Ferrylmyoglobin wurde in einem Endvolumen von 1 ml wäßriger Lösung, welche Myoglobin in einer Konzentration von 20 µM und Wasserstoffperoxid in einer 25-µM-Konzentration (1:1 ,25-Molverhältnis) enthielt, erzeugt. Dies benötigt die Verwendung von ca. 200 µl der Myoglobin-Stammlösung und 25 µl der Wasserstoffperoxid-Stammlösung. Die Mischung wurde dann 60 Minuten inkubiert. Der Prozentanteil an Ferrylmyoglobin (und Ferrylmyoglobinradikal), das durch die Einwirkung von Wasserstoffperoxid aus Myoglobin entstand, wurde während der 60 Minuten in Intervallen, unter Verwendung des Du65- und Du70- Spektrophotometers durch Scannen der Inkubationsmischung von 400-700 nm gemessen.
Unter Verwendung des Inkubationsgemisches, daß nur Myoglobin und Wasserstoffperoxid als Kontrolle enthielt, wurde die Wirkung des Einbaus in die Mischung, zusammen mit dem Myoglobin und vor der Zugabe des Wasserstoffperoxids, sowohl des Desferrioxamins als auch der Verbindung (I), N-Methylacetohydroxamsäure, bei einer Konzentration von 10 µM, 25 µM, 50 µM oder 100 µM, untersucht. In diesen Experimenten wurde der Gesamtspiegel an Ferrylmyoglobin (einschließlich Ferrvlmyoglobinradikal) spektrophotometrisch nach Zeitintervallen von 0,5, 6,5, 15,5, 30,5 und 60 Minuten nach Zugabe des Wasserstoffperoxids gemessen (es wurde keine signifikante Reaktion vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid nachgewiesen).
Die Wirkungen von Desferrioxamin und N-Methylacetohydroxamsäure nach diesen Zeitabschnitten werden in Form von Histogrammen in den Figuren 1 bzw. 2 erläutert. Bei Konzentrationen von 25µM und höher wurde gefunden, daß N-Methylacetohydroxamsäure wirksamer ist als Desferrioxamin und schneller wirkt. Bei 50µM und darüber wurde für N- Methylacetohydroxamsäure eine sehr wirksame Unterdrückung des Peaks der Ferrylmyoglobin. bildung gefunden, so daß bei 100µM der Peaklevel auf 30 % heruntergedrückt wurde und kein Ferrylmyoglobin nach 10 Minuten nachweisbar war.
Das obengenannte Experiment wurde mit den nachfolgenden Verbindungen bei eir Konzentration von 100µM wiederholt, das zum Zeitpunkt Null (vor der Bildung der freien Radikale) hinzugefügt wurde und in einem getrennten Experiment nach 15 Minuten (nach dei Bildung von freien Radikalen):-
Desferrioxamin
N-Methyl-acetohydroxamsäure (NAMH)
N-Methyl-benzohydroxamsäure (NBZMH)
N-Methyl-butyrohydroxamsäure (NBMH)
N-Methyl-hexanohydroxamsäure (NHMH).
Die Inkubationsmischung, die nur Myoglobin und Wasserstoffperoxid enthielt, wurde als Kontrolle verwendet.
Die Ergebnisse werden in den Figuren 3 und 4 gezeigt, die graphisch die Ergebnisse der zwei getrennten Experimente zeigen.
In dem Fall, in dem die Hemmstoffe vor der Radikalbildung zugegeben wurden, war NHMH die am meisten wirksame Verbindung, da es schneller wirkte als Desferrioxamin. NAMH war ebenfalls besser als Desferrioxamin. NBMH war nicht so wirksam.
Die Verbindungen waren ebenso bei der Reduktion der Ferrylmyoglobinkonzentration nach Radikalbildung wirksam. Beide, NBMH und NAMH, zeigten eine Anfangsreaktion, aber reduzierten die Menge des vorhandenen Ferrylmyoglobins nicht vollständig. Diese Beobachtung beruht wahrscheinlich auf dem Sachverhalt, daß ein Überschuß an Wasserstoffperoxid im Testsystem vorhanden ist. Dieser kann mit jedem beliebigen Metmyoglobin reagieren das durch die anfängliche Reduktion von Ferrylmyoglobin durch die Verbindungen gebildet wurde, und die Verbindungen sind bei dieser Konzentration nicht aktiv genug, um dieser Reaktion vorzubeugen. NHMH war die wirksamste der getesteten Verbindungen.

Beispiel 5 Messung der Antioxidationsfahigkeit bei in vito-Systemen

Die Fähigkeit der Verbindungen der Erfindung als Antioxydantien zu wirken, welche die Zellmembranen gegen oxidativen Stress schützen und die Oxidation der Lipoproteine mit geringer Dichte (LDL= bw density lipoproteins) in in vitro-Systemen zu unterdrücken, wurde untersucht.
LDL (Proteinendkonzentration 0,25 mgiml) in Phosphatpuffer pH 7,4 wurde Ferrylmyoglobinradikalen durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (Endkonzentration: 25 µM) ausgesetzt und die Reaktion durch Zugabe von 20µM Metmyoglobin begonnen. Das Ausmaß der Peroxidation wurde unter Anwendung des Thiobarbitur-Assays gemessen.
Die hemmende Wirkung der Arzneimittel wurde durch die Einbringung der Monohydroxamatverbindung (zubereitet in Puffer), mit einer Endkonzentration wie in Tabelle 1 unten angegeben, vor dem Beginn des oxidativen, durch das Häm-Protein vermittelten, Streßes geprüft.
Die Wirksamkeit der Arzneimittel bezüglich der Hemmfahigkeit der Ausbreitung der Peroxidation wurde durch die Zugabe von Myoglobin allein zu der Präparation in der Anwesenheit der Arznei ausgeführt. Das Ausmaß der Lipidperoxidation wurde wie oben beschrieben beurteilt. Die Ergebnisse werden als Prozentwerte des Peroxidationsspiegels in Abwesenheit der Arznei ausgedrückt.
Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Tabelle 1 HEMMUNG DER EINLEITUNG UND DER AUSBREITUNG DER LIPIDPEROXIDATION DURCH BESTIMMTE HYROXAMAT-ARZNEISTOFFE
LDL Arzneikonzentration 100µM LDL-Konzentration 0,25 mg/ml Membranen Arzneikonz. 50µM Membrankonz. 1,00 mg/ml
NB Beide Konzentrationen in Form von Protein ausgedrückt.
Der oxidative Zustand von LDL, isoliert aus einzelnen Individuen, wird von deren Status der Plasmaantioxidantien abhängen. Demzufolge könnten die Individuen, deren LDL begrenzt Spiegel an endogenen Antioxidantien enthält, vorgeformte Lipid-Wasserstoffperoxide in ihrem LDL haben, wohingegen bei denen, deren Status an endogenen Antioxidantien hoch ist, es weniger wahrscheinlich wäre, daß sie signifikante Spiegel an vorgeformten Wasserstoffperoxiden in ihrem Blut haben. Wo vorgebildete Wasserstoffperoxide vorhanden sind, ist es nicht nötig, Radikale zu erzeugen, um die Lipidperoxidation des LDL einzuleiten, da sie bereits eingeleitet wurde. In diesem Fall testeten wir daher die Arzneimittel in ihrer Fälligkeit die Ausbreitung der durch das Häm-Protein herbeigeführten Peroxidation zu unterdrücken.
LOOH + Häm-Protein -T LOº) diese Radikale können dann die Peroxidation LOOº) erneut einleiten
Somit wird in diesem Fall gezeigt, daß die Verbindungen als kettenbrechende Antioxidantien wirken, wobei die Monohydroxamate wirkungsamer als Desferrioxamin sind.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Formel (I)

in der R und R' jeweils unabhängig aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen und mit einer Arylgruppe substituierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen gewählt werden, wobei die Verbindung gegebenenfalls in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes davon vorliegt, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Regulierung bzw. Bekämpfting einer durch freie Radikale induzierten Schädigung, hervorgerufen durch eine Reperfusionsverletzung in Gewebe.

2. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R und R' jeweils unabhängig aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen gewählt werden.

3. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 2, wobei R und R' jeweils unabhängig aus Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- und Hexylgruppe gewählt werden.

4. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, in der R' Methyl oder Ethyl ist.

5. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 4, welche N-Methyl-acetohydroxamsäure, N-Ethyl-acetohydroxamsäure, N-Methyl-propionohydroxamsäure, N-Ethyl-propionohydroxamsäure, N-Methyl-hexanhydroxamsäure oder N-Ethyl-hexanhydroxamsäure ist.

6. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 5, welche N-Methyl-hexanhydroxamsäure ist.

7. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Medikament für die Regulierung einer Herzschädigung ist.

8. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Medikament zur Regulierung einer durch freie Radikale induzierten Schädigung hervorgerufen durch eine Reperfusionsverletzung bei der Organtransplantation ist.

9. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüchen 1 bis 8, wobei das Medikament in injizierbarer oder infusionierbarer Form vorliegt.

10. Zusammensetzung zur Lagerung von Organen vor einer Transplantation, umfassend eine Verbindung der Formel (I)

in der R und R' jeweils unabhängig aus aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen, Arylgruppen und mit einer Arylgruppe substituierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen gewählt werden, wobei die Verbindung gegebenenfalls in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes davon vorliegt, zusammen mit einem Nährstoff und einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel.

11. Zusammensetzung zum Spülen von Organen vor der Transplantation, umfassend eine Verbindung der Formel (I)