DE2318784A1 - N-(2,4-dihydroxybenzoyl)-4-aminosalizylsaeure - Google Patents

Description

München Abholfach

ZAIDAN HOJlN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU ICAI No. 14-23» 3-chome, Karaiosaki, Shinagawa-lcu, Tokyo (Japan)

N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalizylsäure

Erfindung betrifft N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-arainosalizyD-säure und ihre nicht toxischen pharmazeutisch ven-zendbaren Salze. Diese Verbindungen inhibieren stark die Enzymaktivität von Histidindecarboxylase und Xanthinoxidase. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen dieser Verbindung, pharmazeutische Zusammensetzungen» die die oben angegebenen Verbindungen als aktive Bestandteile enthalten und die pharmazeutische Verwendung dieser Zusammensetzungen b?;w. * Mischungen.

In der japanischen Patentanmeldung i-Ir. 96 778/*/Ί wurde

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berichtet, daß Lecanonsäure, die in großen Mengen durch' den Pilz der Pyricularia-Art erzeugt wird, eine stark inhibierende Aktivität gegenüber Histidindecarboxylase zeigt, das ein Enzym ist, das die Umwandlung von Histidin zu Histamin katalysiert. Die Lecanorsäure ist eine 4-0-(2,4-Dihydroxy-6-methylbenzoyl)-2-hydroxy-6-methylbenzoe~ säure. Es wurde festgestellt, daß diese Säure in Tieren hydrolysiert wird und daß ihre Aktivität gegen Entzündungen bedeutend schwächer ist, als erwartet wurde. Aus diesem Grunde wurde die strukturell analoge Verbindung zu Lecanorsäure synthetiziert, um eine Verbindung zu erhalten, die eine starke Inhibition von Histidindecarboxylase in vitro zeigt und eine starke Aktivität gegen Entzündungen in vivo. Bei diesen Untersuchungen gelangte man zu der N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure, die durch ihre Struktur mit Lecanorsäure in Beziehung steht,-jedoch mittels chemischer Synthese hergestellt werden kann. Diese Verbindung inhibiert Histidindecarboxylase und ist bedeutend stabiler in Tieren als die Lecanorsäure. Weiterhin konnte festgestellt werden, daß diese Verbindung ebenfalls eine starke inhibierende Aktivität gegenüber Xanthinoxidase besitzt.

Es ist bekannt, daß verschiedene Versuche durchgeführt wurden, um spezifische Stoffwechselinhibitoren· herzustellen, die spezifische chemotherapeutische Anwendungen erlauben. Die Verwendung von 4-Bromo-3-hydroxyhippursäure und deren kationischen Salze ist in der US-PS 3 646 121 beschrieben. Diese Verbindungen können die Bildung von Histamin in Säugetieren verhindern, indem sie die' Histidindecarboxylase inhibieren. Als Inhibitor von Histidindecarboxylase ist auch Brocresin (4-Bromo~3~hydroxybenzylo.xaminphophat) bekannt. ·

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Allopurinol oder 4-Hydroxypyrazol-(3,4-d)-pyrimidin, das in der US-PS 3 474 098 beschrieben wird, dient als ein therapeutisches Mittel zur Inhibierung der Bildung von Harnsäure beim katabolischen Zyklus von Purin, indem es die Aktivität von Xanthinoxidase störend beeinflußt. Jedoch ist über einige unerwünschte Nebenwirkungen berichtet worden und diese Droge ist nur für eine begrenzte Anwendung geeignet (Physician's Desk Reference 1973, Seiten 651 bis 652). . .

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Verbindung zu schaffen, die in vivo Enzym inhibierende Eigenschaften besitzt und die Enzymaktivität von Histidindecarboxylase und Xanthinoxidase inhibiert. Der Erfindung lag weiterhin die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Synthese von N-(2,4~Dihydro'xybenzoyl)-4-aminbsalicylsäure zu entwickeln sowie neuartige pharmazeutische Mischungen und Zusammensetzungen herauszufinden sowie Anwendungsverfahren für diese Präparate.

Die neuartigen Verbindungen .sowie das Verfahren zur Herstelluni dieser Verbindungen v/erden in der folgenden Beschreibung anhand der beiliegenden Zeichnungen im einzelnen erläutert.

Die Erfindung betrifft N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure der folgenden Formel:

-MH (' V-COOH

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- 4

-ir- -

sowie die nicht toxischen pharmazeutisch anwendbaren Salze dieser Verbindung.

Die Verbindung nach der Formel I kann, sich in maskierter Form befinden, in der eine oder zwei der Hydroxylgruppen in 2,4-Dihydroxybenzoylteilen der Verbindung durch maskierende Gruppen wie eine niedere Alkanojrlgruppe, eine niedere Aroylgruppe, eine niedere Carboalkoxylgruppe und eine Carbobenzoxygruppe maskiert sein können. Diese Maskierung kann durch die folgende Formel dargestellt werden:

COOH

Darin ist R^ eine niedere Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine 'niedere Carboalkoxylgruppe oder eine Carbobenzoxygruppe und FU ist ein ¥asserstoffatom, eine niedere Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine niedere Carboalkoxylgruppe oder eine Carbobenzoxygruppe.

Fig. 1 ist ein Infrarotspektrum der freien Säureform von N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure,

Fig. 2 ist das Infrarotspektr'um des Mononatriumsalzes dieser Verbindung.

B'ig. 3 ist das Infrarotspektrum des Monokaliumsalzes dieser Verbindung.

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Fig. 4 ist das Infrarotspektrum des Monokalziumsalzes dieser Verbindung (C₁^H₁₁OgN)₂ · Ca.

Fig. 5 ist das Infrarotspektrum des Dikalziumsalzes dieser Verbindung (C₁^H₁₁OgN)₂ ·

Fig. 6 ist das kernmagnetische Resonanzspektrum der freien Säureform dieser Verbindung. Die Bestimmung wird mit einer Strahlung von 60 Megahertz in einem mit Deuterium markierten Dimethylschwefelmonoxidlösungsmittel durchgeführt, wobei die chemischen Verschiebungen von einer Tetramethylsilanbezugsverbindung gemessen werden und auf der Delta-Skala als eine je Million (ppm) des gesamten angelegten magnetischen Feldes gezeigt werden.

Fig. 7 ist das kernmagnetische Resonanzspektrum des Mononatriumsalzes, das analog bestimmt wird mittels einer Strahlung von 1000 Hertz.

Fig. 8 ist das Infrarotspektrum der freien Säureform von N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure.

Fig. 9 ist das kernmagnetische Resonanzspektrum der freien Säureform von N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure, das analog bestimmt wurde mittels einer Strahlung von 60 Megahertz ..

In der folgenden Beschreibung wird die neue Verbindung N-(2,4--Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure der oben angegebenen Formel beschrieben sowie ihre nicht toxischen

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pharmazeutisch anwendbaren Salze. Es kann sich dabei um einfache, vermischte oder Doppelsalze mit einem, oder mehreren anorganischen Kationen handeln wie beispielsweise Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium oder Aluminium. Die Verbindung nach der Erfindung hat folgende charakteristischen Eigenschaften:

Physikalische Eigenschaften:

Die freie Säureform der Verbindung nach der Erfindung wird in Form von weißen bis leicht braunen Kristallnadeln erhalten, die sich bei 280 bis 285°C zersetzen. Bei der Dünnschichtchromotographie auf Silicagel unter Vervrendung von DC-Fertigplatten Kieselgel 60F 254 ; (Merck, Deutschland) und einem Lösungsmittelsystem von Äthylacetat:Methanol:2 % Essigsäure (10:1:0,1-5) erhält man einen einzigen Flecken mit einem R~-Wert von 0,35, indem man mit Schnell Blau B Farbe besprüht.

Die Elementaranalyse (als C.»Hu -lOgN) ergibt:

berechnet:

C 58,13 %, H 3,83 %, 0 33,19 %, N 4,84 %

gefunden:

C 58,54 %, H 4,25 %, 0 32,84 %, W, 4,66 %.

Das Molekulargewicht der Verbindung v/urde mit 289 bestimmt.

Das Ultraviolettspektrum ergab Absorptionspeaks bei 285 und 318 m/a in saurem Methanol (0,01 N HCl - Methanol), bei 283 und 316 ΐημ in Methanol, und bei 222 und 288 inp. in-

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alkali.schem Methanol (0,01 N NaOH - Methanol).

Das InfrarotSpektrum der Säureform, des Natriumsalzes, des Kaliumsalzes und des Kalziumsalzes wurde in KBr-Pillen bestimmt und man verwendete ein*Infrarotspektrumphotometer von Hitachi Modell EPT-G2. Die dabei erhaltenen Spektren sind in den Fig. 1 bis 5 dargestellt.

Die fcernmagnetischen Resonanzspektren sowohl der Säureform als auch des Natriumsalzes wurden in üblicher Weise gemessen unter Verwendung eines Varian HA-100 SPECTRUM . Die kernmagnetisehen Resonanzspektren sind in den Fig. 6 und 7 dargestellt.

Ebenfalls wurden das Infrarotspektrum und das kernmagnetische Resonanzspektrum von N-(2,4-Diacetoxybenzoyl) -4-aminosalicylsäure bestimmt. Diese sind in den Fig. 8 und 9 dargestellt.

Herstellung

Die Verbindung nach der Erfindung ist ein Kondensationsprodukt zwischen ß-Resorcylsäure (2,4-Dihydroxybenzoesäure) der Formel:

OR'

III

. worin R und R¹ jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxy-maskierende Gruppe und X eine Hydroxylgruppe oder ein Halogenatom sind, mit para-Aminosalicylsäure oder Salzen davon. Da diese Reaktion prinzipiell eine De-

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hydratisierungs-Kondensation zwischen einer aromatischen Karbonsäure und einem aromatischen Amin ist, um eine AmidverMndung zu erhalten, eignen sich zur Herstellung dieser Verbindung eine Reihe von herkömmlichen Verfahren, die im allgemeinen für die Amidsynthese geeignet sind. Beispielsweise kann die in Formel I dargestellte Verbindung hergestellt werden durch Kondensation eines Säurehalogenids wie beispielsweise einem Säurechlorid oder einem Säurebromid der ß-Resorcylsäure mit -para-Aminosalicylsäure, oder beispielsweise durch die Kondensation von ß-Resorcylsäure mit para-Aminosalicylsäure unter Zuhilfenahme von Amidkondensationsmitteln wie .beispielsweise des Dicyclohexylcarbodiimids.

Die Reaktion wird vorzugsweise über einen Zeitraum von 30 Minuten bis 2 Stunden in . einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete inerte organische Lösungsmittel sind polare organische Lösungsmittel, in denen die Reaktionsteilnehmer löslich sind unddie nicht nachteilig auf den Verlauf der Reaktion einwirken· Lösungsmittel solcher Art sind gut bekannt und es können beispielsweise Ketone wie Aceton und Nitrile wie Acetonitril verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur kann im Bereich des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung bis zum Siedepunkt des flüchtigsten Bestandteils derselben liegen. Vorzugsweise

liegt die Temperatur bei oder unter Raumtemperatur, so beispielsweise bei 0 bis 25⁰C. So lange eine flüssige Phase aufrecht erhalten wird, kann ein erhöhter oder ein erniedrigter Druck angewendet werden. Vorzugsweise wird bei

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-sr- ■

Normaldruck gearbeitet.

Um eine hohe Kondensationsausbeute zu erreichen und unerwünschte Nebenreaktionen auf ein Mindestmaß zu reduzieren, wird die ß-Resorcylsäure vorzugsweise mit maskierten Hydroxylgruppen in die Kondensationsreaktion eingeführt. Die maskierten Hydroxylgruppen können beispielsweise in Form von Acylderivaten vorliegen.

Durch das Maskieren der Hydroxylgruppen wird die maskierte-Verbindung weniger hydrophiel. Dies kann sowohl bei der ¥ahl des Reaktionslösungsmittels berücksichtigt werden als auch falls erwünscht bei der Wahl eines pharmazeutisch ge-. eigneten Trägers, wenn das maskierte Produkt direkt verwendet werden soll, ohne daß die maskierten Gruppen entfernt werden sollen. Geeignete Hydroxy-maskie'rende Gruppen sind beispielsweise solche Gruppen, die die freie.' Hydroxygruppe in ein Ester oder in einen Äther umwandeln, d.h. beispielsweise durch Veresterung mit einer Karbonsäure, einem Karbonsäurehalogenid (wie beispielsweise einem Chlorid) einem Karbonsäureanhydrid oder einem anderen Ester. Die Maskierung kann auch mit Hilfe von Sulfonsäuren, Sulfonylchlorid, Schwefelsäure oder dergleichen durchgeführt werden.

Bevorzugte Maskierungsgruppen sind Acylgruppen wie beispielsweise Alkanoyl und Aroylgruppen und insbesondere die niederen Alkanoylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie eine Acetylgruppe oder eine Benzoylgruppe. Als Maskierungsgruppen können weiterhin niedere Carboalkoxylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Carbomethoxygruppen und Carboäthoxygruppen sowie Carbobenzoxygruppen verwendet

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werden. Bevorzugte Maskierungsgruppen sind Acetylgruppen, Benzoylgruppen, Carbomethoxygruppen, Carboäthoxygruppen, Carbobenzoxygruppen, Tritylgruppen, Trimethylsilylgruppen, Tetrahydropyrany Igrupp en oder andere herkömmliche schützende Gruppen, die von dem kondensierten Produkt abgespalten werden können, ohne daß eine gleichzeitige Hydrolyse der neu gebildeten Amidbindung stattfindet. Solche Schutz- oder maskierenden Gruppen (falls diese im Ausgangsmaterial vorhanden sind) können aus dem Endprodukt mittels herkömmlicher milder Hydrolyseverfahren entfernt werden. Ebenfalls kann p-Aminosalicylsäure bei der Reaktion in den verschiedensten Formen verwendet werden, so beirspielsweise als Salze von Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen wie beispielsweise Ammonium-, Natrium-, Kalium-, Kalzium- oder Magnesiumsalzen. Diese können ebenfalls maskierte Hydroxylgruppen besitzen wie im Falle der ß-Resorcylsäure. Zusätzlich kann die Aminogruppe fakultativ mit anorganischen Säuren neutralisiert sein wie beispielsweise mit Salzsäure und Schwefelsäure oder mit organischen Säuren wie beispielsweise Essig-säure.

Das durch die Kondensationsreaktion gebildete Produkt kann aus der Reaktionsmischung durch herkömmliche Verfahren zur Isolierung eines Amids abgetrennt v/erden wie beispielsweise durch Ausfällung des Produkts nach Abdampfung des Reaktions-Lösungsmittels oder durch Zugabe von überschüssigem Wasser. Falls erwünscht kann die freie Säureform des Produkts I entweder vor oder nach der Isolierung aus der Reaktionsmischung in eines seiner Salze umgewandelt werden durch Zusatz von mindestens eines der pharmazeutisch anwendbaren Alkalimetallionen oder Erdalkalimetallionen oder Aluminiumionen, d.h. in der Form eines Hydroxids, eines Carbonate,

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eines Bicarbonats oder eines Oxids. Jede der verschiedenen Verfahrensweisen, die sich zur Bildung eines Salzes von aromatischen Karbonsäuren eignet, kann zur Bildung des Karbonsäure-Additionssalzes verwendet werden.

Salzbildung;

Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verbindung sowohl in der Form der freien Säure als auch ihrer Salze mit einem organischen oder einem anorganischen Kation. Es werden selbstverständlich die physiologisch anwendbaren und geeigneten Salze bevorzugt, jedoch können auch toxische Salze zur Isolierung und/oder zur Reinigung verwendet werden. Die Salze' können monobasisch oder dibasisch und sowohl einfache oder vermischte Salze sein und schließen ebenfalls Salze vom Carboxylattyp ein. Aufgrund der leichten Salzbildung ist die Verbindung nach der Erfindung ein wertvolles Chelatemittel analog zu den in der US-PS 3 514 481 beschriebenen Verbindungen,

Zur Herstellung der· Alkalisalze wird die Säurevsrbindung I in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel suspendiert wie beispielsweise Methanol und/oder Aceton. Dazu wird eine wässrige Lösung der Alkaliverbindung, die sich vorzugsweise in der neutralisierten Form wie beispielsweise als Hydroxid oder Bicarbonat befindet, in einem gleichen oder leicht überschüssigem Molverhältnis tropfenweise unter Rühren zugesetzt. In ähnlicher Weise wird die Erdalkaliverbindung, die vorzugsweise atis einem Hydroxid oder einem Bicarbonat besteht, in einem

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geeigneten Molverhältnis zugesetzt, um ein Salz zu bilden, das 'das Erdalkalimetall in einem halben oder einem äquivalenten Molverhältnis zu der Säureverbindung I enthält.

Die Verbindung nach der Erfindung bildet ebenfalls Aluminiumsalze wie beispielsweise alkalische Aluminiumsalze, die ein halbes Molverhältnis von Aluminium zur Säure I enthalten und neutrale Aluminiumsalze, die ein Drittel Molverhältnis von Aluminium zur Säure I enthalten. Zu diesem Zweck wird zu einer Lösung der Säureverbindung I in Alkohol oder wässrigem Alkohol unter Rühren eine salzbildende Aluminiumverbindung wie beispielsweise eine Aluminiumhydroxidlösung oder eine Aluminiumalkoxidlösung in dem erwünschten Molverhältnis zu der Säure I zugesetzt, um die erwünschte Art des Aluminiumsalzes zu bilden. ' .

Es können ebenfalls Komplexsalze der Säureverbindung I mit Aluminium und entweder mit einem Alkalimetall oder einem Erdalkalimetall hergestellt werden. Dazu wird bei der erwünschten Temperatur die erwünschte Menge des Aluminiumsalzes und vorzugsweise ein alkalisches Aluminiumsalz als auch die erwünschte Menge des Alkalimetalls oder des Erdalkalimetalls in der Hydroxidform oder in der Oxidform zu der Säure I zugesetzt, die sich in wässriger oder wässrig/alkoholischer Form befindet. In ähnlicher Weise können Komplexsalze auch hergestellt werden durch "Vermischen eines Aluminiumsalzes und vorzugsweise des alkalischen Aluminiumsalzes der Säure I mit einem Alkalimetall oder durch Vermischen des Aluminiumsalzes und vorzugsweise des alkalischen Aluminiumsalzes der Verbindimg J

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mit einem Alkalimetallsalz oder Erdalkalimetallsalz der Verbindung I.

Pharmazeutische Eigenschaften
1. Akute Toxicität.

Die akute Toxicität wurde für die orale, intraperitoneale (i.p.) und intravenöse (i.v.) Verabreichung bestimmt. Der LD50 Wert für die Säureform lag im Bereich von 900 bis 1010 mg/kg bei der intraperitonealen Verabreichung je nach Art der Tiere und ist größer als 6000 mg/kg bei oraler Verabreichung bei Mäusen. Das Natriumsalz erscheint weniger toxisch als die Säureform und der LD50 Wert beträgt 1660 mg/kg bei intraperitonealer Verabreichung bei Mäusen. Die maskierte-Form nach Formel II d.h. die N-CZ^-DiacetoxybenzoylJ^-aminosalicylsäureverbindung und die N-(2,4-Dicarboäthoxyoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureverbindung führten zu keinem Todesfall bei Mäusen und Ratten bei intraperitonealer Verabreichung einer Dosis von 1000 mg/kg. Der angegebene LD50 Wert ist die sogenannte Dosis Letalis, d.h. daß eine Einzelinjektion 50 % der Versuchstiere tötet. Die Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefas st.

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	Tabelle 1	i.p. oral	LD50BgAg	LD5Omg/kg
		i.p.	1010 6000	800 5000
		i.p.	900	800
Formel I (Säureform)	Tier Verabreichung	i.p.	900	800
	Mäuse Mäuse	i.v.	1660	1200
	Ratten	i.p. i.p.	600	480
Formel I	Kaninchen	i.p.		>1000 >1000
(Natriumsalz)	Mäuse	i.p.	—	>1000
Formel II Cn-(2,4-Di- acetoxybenzoyl)- 4-aminosalicyl säurej	Mäuse		-	>1000
Formel II	Mäuse Ratten
0T-(2,4-Di-	Mäuse
carboäthoxv- oxybenzoylj- 4-aminosalicyl- säurejf	Ratten

2. Allgemeine Toxicität

Die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Fortpflanzungsgeschwindigkeit und der Entwicklung des Fötus wurden untersucht indem acht Gruppen von weiblichen Wistar-Ratten untersucht wurden. Dazu wurden zehn .Ratten je Untersuchung verwendet mit einem durchschnittlichen Gewicht von 180 g. Die Verbindung nach der Formel I in der Säureform wurde oral oder intraperitoneal jeder Gruppe verabreicht und zwar in täglichen Dosen von 3,1»

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12,5, 50 und 200 rag/kg über einen Zeitraum von sieben aufeinanderfolgenden Tagen, wobei vom achten Tag der Schwangerschaft begonnen wurde. Sowohl die Fortpflanzungsgeschwindigkeit der Maus ( breeding rate ) als auch das Gewicht des Fötus blieben normal und man konnte bei diesen Untersuchungen keine Mißbildungen feststellen.

Es konnte ebenfalls keine Careinogenitat bei Ratten festgestellt werden, denen tägliche Dosen von 50, 100 und 200 mg/kg des Natriumsalzes über einen Zeitraum von einem Jahr oral verabreicht wurden. Diese Untersuchungen zeigen, daß die Verbindung bzw. die Verbindung nach der Erfindung ein sehr niedriges allgemeines Toxicitätsprofil besitzen.

3. Inhibierung der Histidindecarboxylase.

Die Verbindung nach der Erfindung ist ein starker Inhibitor der Histidine arboxylase. Die Inhibierungsgeschv/indigkeit wurde in einem Inkubationssystem mit Reagenzgläsern untersucht, das 2,5 χ 10"⁵M 1-histidin 2-¹^C (0,05pCi), 3,5 x 10 M Pyridoxalphosphat, 0,1 ml Histidindecarboxylase (eine rohe Enzymzubereitung, die aus trächtigen Ratten.erhalten wurde, die 1 mg Protein/ml enthielt, und 0,1 ml eines 0,67 M Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8. Zu diesem Inkubationssystem wurde die Testverbindung in wässriger Lösimg zugesetzt und das Gesamtvolumen wurde mit Pufferlösung auf 1 ml gebracht. Nach 2 Stunden Inkubiemng bei 37 C wurde das gebildete Histamin 2- C auf einem Ionenaustauscherharz (Amberlite CG-50 Ammoniaktyp) ge~ samme^-t, aus dem, das Histamin nach Waschen mit Wasser in einer 1N-wässrigen Ammoniaklösung herausgelöst wurde. Dann wurde die Radioaktivität gemessen.

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Die Menge an Inhibitor, die eine 50 ^ige Inhibierung der Enzymakivität bei diesem Versuchssystera ergibt, liegt bei 5 x 10"⁸M für die Säureform I, bei 1,5 x 10"⁷M für die N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-r-aminosalicylsäurever"6indung und bei 2,8 χ 10"⁷M für die N-(2,4-Dicarboäthoxyoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureverbindung.

4. Inhibierung der Xanthinoxidase

Die Verbindung nach der Erfindung wird ebenfalls charakterisiert durch eine starke Inhibition der Xanthinoxidase. Die Inhibierung der Xanthinoxidase wurde bestimmt durch eine modifizierte Verfahrensweise der H.M. Kalcker^fs \ Methode, die im J. Biöl. Chem. 169 : 429 (1947) beschrieben wird. Die Inkubationsmischung enthält 3,7 x 10 ^M Hypoxanthin, 5 χ 10 ^M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von -7,4, 0,1 ml Xanthinoxidaselösung,(die ein Milligram Protein oder 0,005 ' Enzymeinheiten enthält) und die Testverbindung mit einem Gesamtvolumen von 3 ml. Die Enzymlösung war entweder ein Rattenleberenzym; ... ,, das durch eine Zentrifugen-Fraktionierung hergestellt worden war, oder ein im Handel erhältliches Milchenzym. Eine Einheit des Enzyms wird definiert als fähig zur Bildung eines Mikromols Harnsäure je Minute aus Xanthin bei 25⁰C und bei einem pH-Wert von 7,4. Die Inkubierung wurde bei 25⁰C durchgeführt und die Menge der gebildeten Harnsäure wurde in Abständen von einer Minute bestimmt indem man über einen Zeitraum von 5 Minuten die spezifische Absorption der Harnsäure bei, 290 mu misst. Die Inhibierungsgeschwindigkeit (in Prozent) wird durch die folgende Berechnung erhalten:

C-S

Inhibierungsrate = - χ 100

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ft

Darin bedeuten

S = der Anstieg der optischen Dichte bei 290 rau in einem Zeitraum von 1 bis 5 Minuten in der Gegenwart der Te stverbindung.

C = der optische Dichtewert in Abwesenheit der Testverbindung.

In dem oben beschriebenen System lag die Konzentration der Säureform, die erforderlich ist, um 50 % der Enzymaktivität zu inhibieren, bei 3,5 χ 10" M für die Säureform I, bei 4,0 χ 10 M für die N-(2,4-Dia.cetoxybenzo3'l)-4-aminosalicylsäureverbindung und bei 5,6 χ 10""% für die N-(2,4-Dicarboäthoxyoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureverbindung.

5. Inhibierung eines durch Carrageenin induzierten Ödems bei Ratten.

Eingen Gruppen von männlichen Wistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 165 g wurden Dosen von 3,1, 12,5 oder 50 mg/kg der Verbindung der Formel I oder II oral oder intraperitoneal verabreicht. Jede Versuchsgruppe bestand aus 5 Tieren. Eine Stunde nach Verabreichung des Arzneimittels wurden 0,1 ml einer 1%igen Carrageeninlösung in Kochsalzlösung subcutan in die linke hintere Pfote injiziert und das Anschwellvoluraen des so induzierten Ödems wurde eine Stunde, drei Stunden und fünf Stunden anschließend gemessen und mit einer Kontrollgruppe verglichen, die kein Mittel gegen Entzündung erhalten hatte und mit Tiergruppen, denen Aspirin und Phenylbutazon vor der Innoculierung der Pfote verabreicht worden war.

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Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden als ED^Q-Werte ausgedrückt, d.h. das sind wirksame Dosen des Arzneimittels die notwendig sind, um das Ödemvolumen um 30 % zu reduzieren im Verhältnis zu der Kontrollgruppe. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 2 dargestellt und zeigen, daß die Verbindung nach der Erfindung eine stark Entzündungen reduzierende Aktivität besitzt.

Tabelle 2	oral i.p.	ED30(mg/kg)
	oral i.p.	20 4,5
	oral i.p.	18 7 -
Arzneimittel · Verabreichung	oral	18 8
Formel I (Säureform)	i.p.	20
Formel II £,N-(2,4~Diacetoxybenzoyl)-4- aminosalicylsäurej	i.p.	10
Formel II /[Ν- (2,4-Dicarbomethoxyoxy- oxybenzoyl)^-aminosalicylsäuren		48
Phenylbutaz on
Aspirin

6. Antipyretische Aktivität in mit Pyrexia-induzierten Kaninchen.

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/a

Normale weiße männliche japanische Laboratoriumskaninchen mit einem Körpergewicht von 2,0 bis 3,0 kg wurden durch die Ohrvene mit 20 Mikrogramm/kg eines Pyrexia hervorrufenden TTG-Präparats Nr. 2 injiziert (es handelt sich dabei rim ein gereinigtes Po^saccharidpräparat, das aus Pseudomonas aeruginosa erhalten wurde und von der Fujisawa Pharmaceutical Co., Japan vertrieben wird) und die Körpertemperatur wurde rektal mit einem Thermometer vom Thermistortyp kontrolliert. Vor der TTG Injektion wurde das Test-Arzneimittel für Kaninchen einer jeder Versuchsgruppe verabreicht. Die Gruppe 1 erhielt 100 mg/kg intraperitoneal eine Stunde vor der Injektion, während die Gruppe 2 200 mg/kg oral 3 Stunden vor der Injektion erhielt. Dazu wurde die Säureform der Verbindung nach Formel 1 benutzt. Eine dritte Gruppe erhielt 100 mg/kg eines wirksamen antipyretischen Mittels (Aminopyrin) und zwar intraperitoneal eine Stunde vor der Injektion, während eine Kontrollgruppe nur das Pyrexia hervorrufende TTG Präparat erhielt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefasst und zeigen, daß die Verbindung nach der Erfindung eine sehr gute antipyretische Aktivität zeigt.

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?318784

to

Tabelle 3

Erhöhung der Körpertemperatur (°C)

1 Std. 2 Std. 3 Sfd. 4 Std. 5 Std.

Kontrolle 1,0 1,1 1,8 -1,6 1,3

Gruppe 1 .(100 '

mg/kg, i.p.) 0,8 0,6 1,0 1,0 0,4

Gruppe 2 (200

mg/kg, oral) 0,7 0,8 1,1 0,4 0,3

Aininopyrin

(100 mg/kg, i.p.) 0,8 0,4 . ' 0,4 0,3 0,1

7. Analgetische Aktivität bei Mäusen. . ·

Männliche Mäuse des DDY-Stammes mit einem mittleren Körpergewichts von 20 g wurden in vier Gruppen je zehn Tiere aufgeteilt und diesen Tieren wurde das Natriumsalz der Verbindung nach Formel I oder Aminopyrin in Kochsalzlösung intraperitoneal oder'subcutan verabreicht. Die Dosen lagen bei 200, 50 oder 12,5 "mg/kg. 30 Minuten später wurden 0,2 ml je 20 g Körpergewicht einer 0,7 ^igen Essigsaurelosung in Kochsalzlösung intraperitoneal eingespritzt und die Anzahl der charakteristischen Streckbewegungen wurde im Ablauf von 20 Minu-ten gezählt und mit einer Kontrollgruppe verglichen, die kein analgetisches Mittel vor der Injektion der Essigsäurelösung erhalten hatte.

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~ 21 -

Die bei diesen Versuchen festgestellten Werte sind in der Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle

Streckbewegungen

Arzneimittel

Formel I (Natriumsalz)

Formel II N-(2,4-

Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure

Formel II N~(2,4-

Biäthoxyoxybenzoyl) 4-aminosalicylsäure

Aminopyrin

	200	50 BElM.	12,5 mg/kg	Kontrolle
	14	20	33
i.p.	15	29	41
S.C.	11	24	- 38	55
i.p.	15	31	39 ,
oral	13	28	38
i.p.	,15	33	40
oral	1	7	20
i.p.	1	15	35
S.C.

8. Wirkung bei Tuberculinhautreaktion bzw. Hautempfindlichkeit .

Weibliche weiße Meerschweinchen mit einem Gewicht von 350 bis

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400 g wurden sensibilisiert, indem in die Oberschenkelmuskeln eines jeden Hinterbeines 0,25 ml einer Zeilhomogenatsuspension von Mikrobakteriumtubereulosis, Stamm Aoyama B injiziert wurde. Die Suspension wurde hergestellt, indem trocken getötete Zellen, die in flüssiges Paraffin getaucht worden waren, vollständig in einem Achatmörser nass zerrührt wurden und auf eine Konzentration von 0,1 mg Trockenzellen je Milliliter eingestellt wurden. Sechs .Wochen nach der Sensibilisierung wurde die Hautempfindlichkeit untersucht mittels einer subtanen Injektion mit 0,1 jug eines Standard PPD-Präparats (gereinigtes Proteinderivat) und diejenigen Tiere, die einen Hof (Halo) von nicht weniger als. 14 mm im Durchmesser zeigten, wobei der durchschnittliche Durchmesser bei 18 mm lag, wurden für das anschließende Experiment benutzt»

Den sensibilisierten Tieren wurde die Säureform der Verbindung nach Formel I in einer Kochsalzlösung subcutan verabreicht und zwar bei einem pH-Wert von 7,4 in Dosen von 100, 50 und 20 mg/kg und zwar eine Stunde, vier Stunden, und zehn Stunden vor der subcutanen Injektion von PPD. In jeder Gruppe wurden sechs Tiere verwendet. Im anschließenden 2 4-Stundenzeit raum wurde das Arzneimittel ad lib den Tieren mittels Trinkwasser verabreicht, wobei die Arzneimittelkonzentrationen bei 1000, 500 und 250 mg/ml für jede Gruppe lag. .

Das Erythema (E) und die Verhärtung (i) in den injizierten Bezirken wurde untersucht und zwar 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion \^on PPD. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefasst und zeigen, daß die Verbindung nach der Formel I die Tuberculinhaut-Empfindlichkeit bzw. Hautreaktion unterdrückt.

309843/1166 - 23 -

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309843/1166

-Zk-

9. Wirkung auf den anaphylactisehen Schock bei Mäusen.

Mäuse vom DDY-Stamm wurden mittels subeutaner Injektion einer Mischung aus 0,1 ml (100 jag) Eialbumin (Nutritional Biochemical Corp., USA, fünfmal kristallisiert) und 0,1 ml "Freund's complete adjuvant" (Difco Co., USA) in Kochsalzlösung sensibilisiert. Diese Mäuse wurden für die Untersuchung 3 Monate später verwendet. Die sensibilisierten Tiere wurden in drei Gruppen je vier Tiere aufgeteilt, denen subeutan die Säureform der Verbindung nach Formel I verabreicht wurde.und zwar mehrere Male vor der Antigeneinwirkimg (antigen challenge) um einen anaphylactisehen Schock zu verursachen. Die Gruppe 1 erhielt 100 mg/kg 1.9 Stunden und 50 mg/kg 9,4 Stunden und 1 Stunde vor der Antigeneinwirkungj. Die Gruppe 2 erhielt 100 mg/kg 9 Stunden vor und 50 mg/kg 4 Stunden und 1 Stunde vor der Antigeneinwirkung. Die Gruppe 3 war eine Kontrollgruppe, der nur Kochsalzlösung verabreicht wurde.

Nach der Antigeneinwirkung mittels einer intravenösen Injektion von 100 ug Eialbumin in einer Kochsalzlösung starben sämtliche Tiere der Kontrollgruppe an einem anaphylactischen Schock innerhalb von 20 bis 25 Minuten. Im Falle der Anwendung des Arzneimittels nach der Erfindung wurde das Erscheinen der Schocksymptome stark verzögert und zwei Tiere in Gruppe 1 und ein Tier in Gruppe 2 überlebten. Die Untersuchungsergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengefasst.

25 -

309843/1166

Tabelle

Gruppe 1 _t Zeit Auftreten der
Symptome

Todeszeitpunkt

Maus 1 Mans 2 Maus 5 Maus 4

überlebt überlebt

15

25

Gruppe 2, Zeit

Auftreten der
Symptome

Todeszeitpunkt

10

30

45

überlebt

Gruppe 3, Zeit Auftreten der
Symptome

TodesZeitpunkt

20 25 (Minuten nach der Auswirkung)

10. Wirkung auf Hyperuricacidemia bei Ratten.

Die Wirkung der Verbindung nach der Erfindung auf die Harnsäurebildung wurde nach der von ¥.G. Johnson. B. Stavric und A. Chartrand beschriebenen Verfahrensweise in Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 13 : 81 (1969) untersucht. Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 310 bis 330 g'wurden mit mit Allantoxansäure und Harnsäure entsprechend den beschriebenen Verfahren injiziert, um die Hyperuricacidemie zu verursachen. Die Verbindung wurde in Dosen von 30 mg/kg

309843/ 1166

- 26 -

intramuskulär oder von 60 mg/kg oral verabreicht. Der Gehalt 'an Harnsäure im Blut wurde kolorimetrisch 3»5,7,10 und Stunden nach der Verabreichung des Mittels untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst und geben Mittelwerte für die vier Tiere einer jeden Gruppe. Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die erfindungsgemäße Verbindung den Harnsäuregehalt im Blut stark erniedrigt und die Bildung von Harnsäure durch die Xanthinoxidation unterdrückt.

Tabelle 7

Weg-und "Dosis Harnsäureniveau (jag/ml bei:

0 .Std. 3 Std. 5 Std. 7 Std. 10 Std- 24 Std.

Kontrolle

95,3 187,1 216,4 240,3 223,1 60,8

Formel I
(Natriumsalz)

I.m. 97,8 151,0 160,1 172,5 156,3 48,2

30 mg/kg

Oral . 90,3 154,6 170,9 177,2 156,8 47,3

60mg/kg

Formel II , ·

01-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureJ

I.m. 95,8 154,0 161,5 174,3 158,3 50,1

30 mg/kg

Oral 97,5 152,3 162,2 170,6 154,2 46,9

60mg/kg "■

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Pharmazeutische Verwendbarkeit

'Aufgrund ihrer enzyininhibi er enden Aktivität sind die Verbindungen nach der Erfindung wertvolle Inhibitoren für Histidindecarboxylase und/oder Xanthinoxidase in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin. Die Verbindungen nach der Erfindung haben sich als sehr vorteilhaft erv/iesen bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten und Stoffwechselunregelmässigkeiten, bei denen ein Überschuß an Histamin und Harnsäure eine Rolle spielt. Solche Krankheiten und Stoffwechselstörungen treten beispielsweise auf als verschiedene Arten von Entzündungen und Schmerz, Pyrexia, allergischen Krankheiten wie beispielsweise Asthma und Nesselfieber, dermatologische Krankheiten, Mastocytosis, Hyperacidität, Rheuma, Arthritis, Hyperuricacidemia, die beispielsweise durch Gicht und Uratsteiiie verursacht wird. Zusätzlich zu ihrer in vitro-Verwendung können die Verbindungen nach der Erfindung beispielsweise für die lokale, enterale und parenterale Therapie von Entzündungen verwendet werden und zwar in ähnlicher ¥eise wie die bekannten Verbindüngen Phenylbutazon, Mephenamsäure, Bucolom u. dgl.

Die Verbindungen nach der Erfindung können in Mischung mit herkömmlichen Excipientien, d.h. pharmazeutisch verwendbaren organischen oder anorganischen Trägersubstanzen verwendet werden, die sich für eine parenterale, enterale·oder lokale Verwendung eignen und nicht in nachteiliger Weise mit den aktiven Komponenten reagieren. Geeignete pharmazeutische Träger sind "beispielsweise Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Pflanzenöle, Polyäthylenglykol, Gelatin, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viscoses Paraffin, Parfüraöle, Fettsäure-Monoglyceride, Fettsäure-Diglyceride, Pentaerythrititfettsäureester, HydroxymethylZellulose,

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Polyvinylpyrrolidone u. dgl. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert -und falls erwünscht mit Hilfsmitteln vermischt werden wie beispielsweise Schmiermitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisierungsmitteln, Benetzungsmitteln, Emulgierungsmitteln, Salze zum Beeinflußen des osmotischen Drucks, Puffer, Farbmittel, Geruchsmittel und/ oder aromatische Substanzen u. dgl., die nicht in nachteiliger Weise mit den aktiven Verbindungen reagieren.

Für eine parenterale Anwendung sind insbesondere Lösungen geeignet wie vorzugsweise ölige Lösungen wie Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl, oder wässrige Lösungen als auch Suspensionen, Emulsionen oder einzusetzende Kapseln einschließlich Suppositorien. Die erfindungsgemäßen Präparate können auch in Form von Ampullen verwendet werden.

Für die enterale Anwendung eignen sich insbesondere Tabletten, "Dragees oder Kapseln, die einen Talk und/oder einen Kohlenhydratträger oder ein Bindemittel u. dgl, enthalten, wobei die Träger vorzugsweise aus Lactose, Kornstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Agar, Pectine, Talk, Kaliumcarbonat oder Natriumkarbonat bestehen können. Ebenfalls können die Verbindungen nach der Erfindung in Sirup, in einem Elixier oder in ähnliehen Mitteln angewendet werden, die in gesüßter Form benutzt werden. Die Verbindung nach der Erfindung können auch in Mischungen verwendet werden, die in Depotform verabreicht werden, d.h. die aktive Verbindung ist durch differential!! abbaubare Schutzüberzüge geschützt sowie auch in Mischungen., in denen der Träger oder das Verdünnungsmittel selbst erst nach einem bestimmten Zeitablauf zersetzt werden. Solche Materialien sind beispielsweise Glycerylmonostearat oder' Glyceryldistearat entweder alleine oder zusammen mit Wachs.

309843/1166

Die Verbindungen nach der Erfindung werden normalerweise in Dosiseinheiten verabreicht, die aus 1 bis 2500 mg eines pharmazeutischen Trägers je Dosiseinheit bestehen und aus etwa 50 bis 1250 mg der aktiven Verbindung nach der Erfindung je Dosiseinheit.

Für eine örtliche Anwendung werden die Verbindungen nach der Erfindung in Form von nicht versprühbaren Materialien , viskosen bis halbfesten oder festen Materialien verwendet, wobei geeignete Träger für eine lokale Anwendung benutzt werden, die eine dynamische Viskosität besitzen, die vorzugsweise größer ist als die von Wasser. Geeignete Zusammensetzungen bzw. Mischungen können aus Lösungen , Suspensionen, Emulsionen, Creme, Salben, Pulvern, Linimente, Salben, Aerosole u. dgl. bestehen, die falls notwendig sterilisiert und mit verschiedenen Hilfsmitteln wie beispielsweise .Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Paffern oder Salzen zum Beeinflußen des osmotischen Drucks versetzt sind. Für die lokale Anwendung kommen auch versprühbare Aerosolpräparate in Frage, worin der aktive Bestandteil vorzugsweise verwendet wird in Kombination mit einem festen oder flüssigen inerten Trägermaterial, das in einem Gefäß zusammen mit einem unter Druck stehenden sich verflüchtigenden und normalerweise gasförmigen Treibmittel wie beispielsweise Freon verwendet wird. Normalerweise werden die aktiven Verbindungen nach der Erfindung in örtlich anwendbaren Mischungen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 5 Gew.?6 eingebaut.

Die aktiven Verbindungen nach der Erfindung können bei Menschen und den verschiedensten Arten von Tieren wie Säugetiere, Geflügel u. dgl. benutzt werden. Eine gegen Entzündungen wirksame tägliche Dosis der aktiven Verbindung, die Menschen

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verabreicht wird, beträgt etwa 1 bis 100 und im allgemeinen · 2 bis 5 0 und vorzugsweise 2 bis 25 mg/kg des Körpergewichts ' zusammen mit 1 bis 5000 mg eines pharmazeutisch verwendbaren Trägers. Die Dosis kann auf einmal oder in Teildosen während des Tages.verabreicht werden.

Die Verbindungen nach der Erfindung werden vorzugsweise oral verabreicht, wobei sie sich insbesondere eignen für die Behandlung von Entzündungen und Schmerzen, Pyrexia, allergischen Krankheiten wie beispielsweise Asthma und Nesselfieber, dermatologischen Krankheiten, Mastoeytosis, Hyperacidität, Rheuma, Arthritis, Hyperuricacidemia, wie sie durch Gicht und Uratsteinen verursacht wird. In dieser Hinsicht können die Verbindungen nach der Erfindung in der gleichen Weise verwendet werden wie die bekannten Präparate Phenylbutazon, Mephenamsäure und Bucolam.

Die tatsächlich und vorzugsweise verwendeten Mengen der aktiven Verbindung nach der Erfindung hängen ab von der speziell verwendeten Verbindungsform, von der Zusammensetzung der benutzten Mischung, von der Art der Anwendung und von dem Sitz des Organismus, der behandelt werden soll. Viele Faktoren modifizieren die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen wie beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Art der Verabreichung, die Exkretionsrate, die Arzneimittelkombination, die Reaktionsempfindlichkeiten und den Grad der Erkrankung. Die optimale Anwendung der Verbindungen nach der Erfindung wird in.herkömmlicher Weise durchgeführt.

Neben einer Behandlung von Tieren kommt auch eine Verwendung als Zuraischung bei Trägersubstanzen, Geraiciden, Fungiciden oder Seifen wie beispielsweise für antiseptische Lösungen in Frage und dergleichen.

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In den folgenden Beispielen werden die Verbindungen nach der Erfindung und die Herstellung- und Anwendungsverfahren im einzelnen erläutert. Die angegebenen Temperaturgrade sind ⁰C und die angegebenen Gewichte und Teile sind Gewichtsteile und Gewichtsprozentsätze.

Beispiel- 1

319 mg ß-Resorcylsäure und 313 mg ρara-Aminosalicylsäure wurden in 30 ml Acetonitril aufgelöst und zu dieser Lösung wurden 437 mg Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach Inkubierung über einen Zeitraum von einer Stunde unter kontinuierlichem Prägen wird der Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff abgefiltert und einmal mit 20 ml v/armen Aceton gewaschen bzw. gespült. Die aus Filtrat und Waschlauge kombinierte Lösung wurde unter reduziertem Druck eingedampft und ergab 713 mg eines trockenen leicht gelben Pulvers.

Dieses Pulver wurde mittels Silicagel-Säulenchromatography (Mallinckrodt Co., USA) gereinigt·, indem ein Entwicklungssystem aus Äthylacetat und Äthanol in einem Verhältnis von 10 : 1 verwendet wurde. Man erhielt dabei 50 mg nadelartiger Kristalle, die aus N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure bestanden. Diese Verbindung hat einen Schmelzpunkt von 280 bis 285⁰C unter Zersetzung und man erhielt eine Ausbeute von 8,3 %.

Beispiel 2

1. Herstellung von mono-Carbomethoxy-ß-resorcylsäure.

61 g ß-Resorcylsäure wurden in 660 ml 2N-Natriumhydroxid in einem mit einem Rührer ausgerüstetem Reaktionsgefäß auf-

309843/1166

gelöst, das eine Kühlvorrichtung besaß. Unter starkem Rühren bzw. Bewegen im Kalten wurden 61 g Monochloromethylcarbonat zugesetzt und das Rühren wurde fortgesetzt, bis der Chlorgeruch nicht mehr vorhanden war. Der dabei gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und der Filterkuchen wurde in 460 ml Wasser bei 30 C wieder aufgelöst. Durch Ansäuren der Lösung mit verdünnter Salzsäure erhiejlt man einen Wiederschlag von weichen Kristallen, die durch Vakuumfiltration gesammelt wurden. Man erhielt 70 g an trockenen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 141 bis 142 C.

2« Herstellung von Dicarbomethoxy-ß-resorcylsäure.

68 g Mono-Carbomethoxjr-ß-resorcylsäure wurden mit 1130 g Benzol vermischt und dann mit 77 g Dimethylamin, um eine einheitliche Lösung herzustellen. Nach Kühlen würden 33 g Mono-chloromethylcarbonat in kleinen Portionen unter starkem Rühren zugesetzt, bis sich die Lösung in'eine Aufschlämmung umwandelte. Nachdem die Reaktion weitere 3 1/2 Stunden durchgeführt worden war, wurde 2N-Salzsäure im Überschuß zugesetzt und man erhielt einen Niederschlag, der mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit kaltem Benzol und anschließend mit Petroläther gespült bzw. gewaschen wurde.

Die Rekristallisation aus einer 60 ?oigen wässrigen Lösung ergab 69,3 g weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 155 bis 157°C

3-. Herstellung von Dicarbomethoxy-ß-resorcinoylchlorid.

69 g Dicarbomethoxy-ß-resorcylsäure wurden in 700 ml

309843/1166 " ³³

Thionylchlorid aufgelöst, indem bei Raumtemperatur vermischt wurde. Nachdem die Reaktion abgelaufen war (dies konnte man durch die Bildung einer einheitlichen Lösung feststellen), wurde die Lösung unter reduziertem Druck bei 40⁰C kondensiert bzw. eingedampft, um das überschüssige Thionylchlorid zu entfernen. Man erhielt 73,7 g eines weißen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 86 bis 87⁰C

herstellung von N-(2,4-Dicarbomethoxyoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure.

39 g p-Aminosalicylsäure wurden-in 400 ml 1N-Natriumhydro:cia und 320 g Aceton in einem Reaktionsgefäß aufgelöst, das mit einer Mischvorrichtung und einer Kühlvorrichtung ausgerüstet war. Nach Abkühlen auf 5°C wurden 69 g Dicarbomethoxy-ßresorcinoylchlorid in einer Lösung von 320 g wasserfreiem Aceton langsam unter kontinuierlichem Rühren und über einen ■ Zeitraum von einer Stunde zugesetzt. Man ließ die Reaktion eine v/eitere Stunde bei 5 C weitergehen und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und mit 4000 ml ¥asser verdünnt. Nach Abfiltrieren des dabei gebildeten Niederschlags und nach Trocknen des Niederschlags erhielt man 83 g eines Pulvers. Nach Rekristallisation aus Aceton und Wasser erhielt man leicht gelbe nadelartige Kristalle von N- (2,4-Dicarbomethoxyoxybenzo3''l)-4~aminosalicyl~ säure mit einer Ausbeute von 70 g und einem Schmelzpunkt von 230 bis 240°C.

Beispiel 3

68 g des N-(2,4-Dicarbomethoxyoxyben^o]/l)-4-aminosalic3''l-säurepulvers nach Beispiel 2 wurden in 500 ml 2N-Natrium-

309843/1 166 - 34 -

hydroxidlösung aufgelöst. Nach 2-stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit Salzsäure neutralisiert und man erhielt einen leicht braunen Wiederschlag in ei.ner Menge von 53,5 g. Dieser Niederschlag wurde in 350 ml eines 50 %lgen- wässrigen Acetons unter leichtem Erwärmen aufgelöst und man ließ zunächst einige Stunden im Dunklen bei Raumtemperatur stehen und dann 12 Stunden lang im Kalten bei 5⁰C. Dadurch erhielt man N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)*-4-aminosalicylsäure in Form von weißen bis leicht braunen Kristallnadeln. Die Ausbeute betrug 40,1 g. Das Produkt zersetzte sich bei 280 bis 285⁰C.

Beispiel 4 .

1. Herstellung von Diacetyl-ß-resorcylsäure.

70 ml Acetylchlorid wurden tropfenweise in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 40 g ß-Re s ο rc yl säure, 400 ml Aceton und 80 ml Trimethylamin enthielt. Der- dabei gebildete Niederschlag von Triäthylaminhydrochlorid wurde abfiltriert und das ■ Filtrat wurde eingedampft bis man ein öliges Kondensat erhielt. Zu diesem wurde dann eine geringe Menge Wasser unter Rühren über einen Zeitraum von einigen Minuten zugesetzt. Man ließ diese Mischung über Nacht im Kühlen stehen. Das ausgefallene Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und dann aus Ethanol und Wasser rekristallisiert. Man erhielt dadurch prismenartige Kristalle von Diacetyl-ß-resorcylsäure in einer Ausbeute von 27,4 g und mit einem Schmelzpunkt von 136 bis .1.37⁰C.

2. Herstellung von Diacetyl-ß-resorcinoylchlorid.

30 9843/1 166 - 35 -

25 g Diacetyl-ß-resorcylsäure wurden bei Raumtemperatur zu 30 ml Thionylchlorid zugesetzt. Nachdem man eine einheitliche Lösung erhalten hatte wurde unter reduziertem Druck bei 40°C verdampft, um das überschüssige Thionylchlorid zu entfernen. Dadurch erhielt man als öliges Produkt 28 g Diacetyl-ß-resorcinoylchlorid.

3. Herstellung von N-{2,4-Diacetylbenzoyl)-4-arainosalieylsäure

In ein Reaktionsgefäß, das 16 g p-Aminosalicylsäure- und 13 ml Ν,η-Dimethylanilin, die in 150 ml Aceton aufgelöst worden waren, enthielt, wurden 20 g Diacetyl-B-resorcinoylchlorid in 100 ml trockenem Aceton tropfenweise zugesetzt. Nach 3-stündiger Umsetzung bei Raumtemperatur und anschließender Verdampfung erhielt man 31 g eines Niederschlags indem mit verdünnter Salzsäure angesäuert wurde. Den Niederschlag erhielt man mittels Filtration, Dar Niederschlag wurde aus Aceton und. Wasser rekristallisiert und man erhielt nadelartige Kristalle von N-(2,4~Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalieylsäure in einer Ausbeute von 35 g und mit einem Schmelzpunkt von 199 bis 202°C.

Beispiel 5

20 g des nach Beispiel 4 erhaltenen N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäurepulvers wurden in 200 ml einer 2N-Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Man ließ dann 3 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen und die Lösung wurde anschließend mit Salzsäure neutralisiert und es entstand ein Niederschlag. Dieser Niederschlag wurde aus Aceton und Wasser rekristallisiert und man erhielt 12,5 g eines weißen Pulvers aus N-(2,4-Dihj»-droxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure. Der Zersetzungs-

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punkt lag bei 280 bis 285°C

Beispiel 6

18 g N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure wurden in-370 ml Methanol aufgelöst. Zu dieser Losung wurden 2,76 g Natriumhydroxid in 96 ml. wässriger Lösung tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,6 bis 7.8 eingestellt und das Methanol wurde abgedampft. Durch Abkühlen der eingedampften Lösung fielen Kristalle aus, die durch Filtration abgetrennt und mit Aceton gev/aschen wurden. Nach Trocknen unter reduziertem Druck erhielt man schwachgelbe Kristalle des Mononatriumsalzes von N~(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure in einer Ausbeute von 14,2 g. Der Zersetzungspunkt dieses Produktes lag bei 250 bis 255°C.

Das gleiche Verfahren wurde leicht modifiziert angewendet, um das Monokaliumsalz von N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)~4-aminosalicylsäure herzustellen, indem Kaliumhydroxid anstelle von Natriumhydroxid verwendet wurde. Der Zersetzungspunkt des Monokaliumsalzes lag bei 247 bis 252°C.

Beispiel 7 . .

1. 5g N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure und 0,64.g Kalziumhydroxid wurden in einer Mischung aus 100 ml Wasser und 200 ml Methanol aufgelöst, indem auf 50⁰C erwärrat wurde. Nach vollständiger Auflösung wurde das Methanol unter reduziertem Druck abgedampft und man ließ die'eingedampfte Lösung bei 5 C stehen. Die dabei erhaltenen weißen Kristalle wurde abfiltriert, mit Wasser gev/aschen und über Nacht im Vakuum bei 40 C getrocknet. Man erhielt dadurch

~ 37 — 309 8 43/1166

[jfö-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureJ₂· Ca in einer Ausbeute von 5,1 g. Dieses Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 260 bis 265°C unter Zersetzung.

2) In ähnlicher Weise wurden 5g N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-arainosalicylsäure und 1,28 g Kalziumhydoxid in einer Mischung aus 50 ml Wasser und 100 ml Methanol aufgelöst, indem 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt vnirde. Das Methanol wurde dann unter reduziertem Druck abgedampft bis die Kristalle anfingen auszufallen. Nach einer weiteren Kristallisation bei 5°C wurde der Niederschlag mittels Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40⁰C über Nacht getrocknet. Man erhielt dadurch £n-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure]ρ·Ca in einer Ausbeute von 4,6 g. Dieses Produkt hat einen Schmelzpunkt von 250 bis 255°C, wobei eine Zersetzung auftrat.

Beispiel 8

10 g N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure wurden in 200 ml Methanol und 10 ml Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 53,6 ml einer 0,5 N Natriumhydroxidlösung tropfenweise bei Raumtemperatur und unter Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde schließlich auf 7,6 bis 7,8 eingestellt. Nach Abdampfen des Methanols ließ man die eingedampfte Lösung . über Nacht im Kalten stehen und die ausgefallenen Kristalle wurden dann mittels Filtration gesammelt, mit Aceton ge-

waschen und getrocknet. Die dabei erhaltenen Mononatriumsalzverbindung von N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)4-aninosalicylsäure ergab eine Ausbeute von 8,2 g. Der Natriumgehalt lag bei 5,5 % und der Schmelzpunkt bei 190 bis 200°c.

309843/11 BS -38-

Beispiel 9 '

10 g N-(2,4-Diacetoxy"benzoyl)-4-aminosalicylsäure wurden in 200 ml Methanol und 100 ml Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 10 g eines Kalziumhydroxidpulvers zugesetzt. Nach 3 stUndigem Rühren bei Raumtemperatur hatten sich alle Bestandteile vollständig aufgelöst. Das Methanol wurde dann unter reduziertem Druck verdampft Ms Kristalle anfingen auszufallen. Man ließ bei 5°C stehen und filtrierte dann den dabei erhaltenen Niederschlag ab, der mit Wässer gewaschen und über Nacht im Vakuum bei 40 C getrocknet wurde. Dadurch wurde die Verbindung /jT-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-aminosalicylsäureip'Ca erhalten. Die Ausbeute betrug 8,5 g und der Kalziumgehalt 4,6 %, Der Schmelzpunkt lag bei 195 bis 204°C, wobei eine -Zersetzung stattfand.

Beispiel 10

Zwei Tablettenarten A und B, die sich für eine orale Verabreichung eignen, wurden mit den folgenden Bestandteilen mittels herkömmlicher Tablettierverfahren hergestellt.

A) Bestandteile: Gew. (mg)

Natrium n-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4- .

aminosalicylsäure 250

Natriumcarboxylmethy!cellulose . 10

Lactose ^r 213

Kornstärke 25

Magnesiurastearat 2

3 0 9 8 4 3/1166

B) Natrium n(2,4-Diaceto3rylDenzoyl)-

4-aminosalicylsäure Tragacanth

Lactose . 207,5

Kornstärke Talk .

Magnesiumstearat 2,5

Beispiel 11

Zwei Arten von trockenen gefüllten Kapseln A und B, wurden in herkömmlicher ¥eise mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:

Bestandteile Gewicht (mg)

A) N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-

aminosalicylsäure 250

inertes festes Verdünnungsmittel (e.g.,

Stärke, Lactose) . 248

Magnesiumstearat 2

- 40 -

3 0 9 8 4 3/1166

*■ B) N-(2,4-Diacetoxybenzoyl)-4-

aminosalicylsäure 250

Inertes festes Verdünnungsmittel

(e.g. Stärke, Lactose) 247,5

Magnesiumstearat 2,5

Die so hergestellten Kapseln wurden den Patienten in einer Dosis von 2 bis 4 Kapseln pro Tag verabreicht. Die in den Beispielen 10 und 11 angegebenen Bestandteile der Mischungen A und B können durch andere in den vorhergehenden Beispielen beschriebene Verbindungen ersetzt werden.

PateirtansDrUche:

- 41 -

309843/1166

Claims (1)

1. Patent ansOrüc he

   3 * N- (2,4-Dihydroxybenzoyl)-/+-aminosalicylsäure der Formel

   C-NH

   OH

   COOH

   und die nicht toxischen pharmazeutisch verwendbaren Salze dieser Verbindung.

   2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch g ek e η η zeichnet , daß das Salz ein Natriumsalζ, Kalziumsalz, Kaliumsalz, Magnesiumsalz oder Aluminiumsalz ist.

   3. N-(2,4-Dihydroxybenzoyl)-4-aminosalicylsäure der Formel

   worin R^ eine niedere Alkanoy!gruppe, eine Aroylgruppe, eine niedere Carboalkoxylgruppe oder eine Carbobenzoxygruppe und

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   Rp ein Wasserst off atom, eine niedere Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine niedere Carboalkoxylgruppe oder eine Carbobenzoxygruppe sind.

   4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich net, daß R^ und Rp Acetylgruppen sind,

   5. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß R,. und R„ Carbomethoxygruppen sind.

   6. Verbindung nach Anspruch 3₅ dadurch g e k e η η -

   ζ e i c h ne t , daß Κ_Λ und R Carboäthöxygruppen sind.

   ¹ 2

   7. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet , -daß eine ß-Resorcylsäureverbindung der Formel

   worin R und R'- jeweils ein Wasserst off atom oder eine Hydroxy-maskierende Gruppe und X eine Hydroxilgruppe oder ein Halogenatoin sindjinit einer p-Aminosalicylsäureverbindung der Formel

   COOY

   3/11S6

   kondensiert, wird, worin Y ein Wasserstoffatom oder ein physiologisch verwendbares Kation ist.

   8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxy-maskierenden Gruppen in dem Kondensationsprodukt in Wasserstoff umgewandelt werden.

   9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ jeweils eine niedere^ Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine niedere Carboalkoxylgruppe, eine Carbobenzoxygruppe, eine Tritylgruppe-, eine Trimethylsilylgruppe oder eine Tetrahydropyranylgruppe sind.

   10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η-zeichnet , daß Y ein Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Magnesium- oder Aluminiumkation ist.

   11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Produkt in ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon umgewandelt .wird.

   12. Verfahren zur Herstellung eines Komplexsalzes, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Ansprüchen 1 oder 3 erhaltene Verbindung mit einem Metallkation in Lösung umgesetzt wird, um ein Metallsalz dieser Verbindung zu bilden.

   13. Pharmazeutische Mischung bzw. Zusammensetzung , dadurch gekennzeichnet , daß eine Verbindung nach Ansprüchen 1 oder 3 in einer Menge mit einem pharmazeutisch verwendbaren Trager in Kombination gebracht wird, die ausreicht, um die, Enzymaktivität von mindestens Histidindecarboxylase und/oder Xanthinoxidase in vivo zu in-

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   hibieren.

   das biochemische Störungen hat,

   g e k e η nN^e i c h η e t , daß ein abnorm hpfetsr Körpergehalt an HistamÜs^mittels Verabreichung easier Verbindung nach Ansprüchen 1 oder 3 irN*einer ausreich@amen Dosis erniedrigt wird.

   15. Verfahren zur chem^fherapeutis^h^n Behandlung eines lebenden Tieres, da^mochemische StörungeiVshat, .dadurch g e k e η η ζ axi c h η e t , da.ß ein abnorm hoher Körpergehalt anJ&frnsäure mittels Verabreichung einer Verblödung *j--er—

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