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Die Erfindung betrifft die Verwendung von Carnosinsäure
aufgrund ihrer antikarzinogenen und antiviralen Eigenschaften.
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Carnosinsäure ist ein Phenylditerpen mit der Summenformel
C20H2804 und der Struktur I.
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Sie ist ein Bestandteil der Arten Salvia und Rosmarinus, in
denen sie hauptsächlich in den Blättern lokalisiert ist. Sie
wurde zum ersten Mal von Linde in Salvia officinalis [Halv.
Chim. Acta 47, 1234 (1962)] und von Wenkert et al. in
Rosmarinus officinalis [J. Org. Chem. 30, 2931 (1965)] gefunden.
Später wurde sie in verschiedenen anderen Salbeiarten positiv
identifiziert, und zwar beispielsweise in Salvia canariensis
[Savona und Bruno, J. Nat. Prod. 46, 594 (1983)] oder Salvia
willeana [de la Torre et al., Phytochemistry 29, 668 (1990)].
Sie tritt auch in Salvia triloba und Salvia sclarea auf.
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Carnosinsäure ist ein starkes Antioxidans [Brieskorn und
Dömling, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 141, 10 (1969)] und, nach
einer Reihe von russischen Arbeiten, wo sie den Namen Salvin
trägt, ein Antibiotikum gegen Staphylococcus aureus [CA 86,
117603r; 90, 49011b; 97, 67513r, 69163a, 69164b; 104, 221930w;
111, 130594t] und gegen manche Mikroorganismen, die für die
Karies der Zähne und üblen Mundgeruch verantwortlich sind [CA
97, 84835q]. Der Stand der Technik erwähnt sie im Zusammenhang
mit der letztgenannten Eigenschaft bei der Herstellung von
Zahnpflegemitteln und Mundwasser [JP 59'103'665, Lion Corp.].
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Trotz dieser umfangreichen Erwähnungen wurde die Isolation der
Carnosinsäure aus Rosmarin oder Salbei im präparativen Maßstab
noch nie beschrieben, und zwar weder bei Line oder Wenkert,
bei denen ihre Existenz indirekt belegt wird, noch bei
denjenigen, die sie anschließend in verschiedenen Salbeiarten
identifiziert haben.
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Dagegen wurden mehrere andere Phenolditerpene mit ähnlicher
Struktur wie Carnosinsäure in der einen und/oder der anderen
der beiden Arten Salvia und Rosmarinus isoliert. Von diesen
ist das Carnosol zu erwähnen [Brieskorn et al., Chem. Ber. 95,
3034 (1962); J. Org. Chem. 29, 2293 (1964)] und aus jüngerer
Zeit Rosmanol [Inatani et al., Agric. Biol. Chem. 46, 1661
(1982)] oder Rosmaridiphenol [Houlihan et al., J. Am. Oil
Chem. Soc. 61, 1036 (1984)], wobei die beiden letztgenannten
als neue antioxidierende Bestandteile des Rosmarins patentiert
wurden [USP 4'450'097, Nakatani et al., Lion Cor., Tokio; USP
4'638'095, Chang et al., Research Corp., N. Y.].
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Obwohl alle diese Verbindungen als Antioxidanzien interessenat
sind, besitzen sie doch verglichen mit Carnosinsäure gewisse
wenig günstige Aspekte: ihr Gehalt im Rosmarin oder im Salbei
ist viel kleiner als der der Carnosinsäure.
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Man kennt auch phenolartige Zusammensetzungen mit einer
antioxidierenden Aktivität. Der Artikel der Zeitschrift
Pharmaceutical Science, Vol. 69, No. 12, Dezember 1980, Seiten 1455 bis
1457 erwähnt die Verwendung von Butylhydroxyanisol und
Butylhydroxytoloul als Antikrebsmittel. Die Zeitschrift Infections
Disease, Vol. 138, Nr. 1, Juli 1978, Seiten 91 bis 94 erwähnt
die Verwendung von Butylhydroxytoluol für virale Behandlungen.
Das Patent EP 0 269 545 erwähnt die Verwendung von Vitamin E
für die Behandlung von Krebs. Der Artikel von Vestn. Oftalmol.
Vol. 104, Nr. 4, 1988, Seiten 65 bis 68 erwähnt die Verwendung
von alpha-Tocopherol für die Behandlung von Herpes.
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Getrocknete Blätter von Rosmarin oder Salbei (Art Salvia
officinalis) enthalten zwischen 1,5 und 2,5% Carnosinsäure und
nur etwa 0,3-0,4% Carnosol. Rosmanol und Rosmaridiphenol sind
in nicht feststellbaren Konzentrationen vorhanden.
Hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit eines Herstellungsverfahrens
besitzt Carnosinsäure also einen nicht bestreitbaren Vorteil.
Gemäß der Angaben des Patents US 4'450'097 beispielsweise kann
man errechnen, daß die Ausbeute an aus Rosmarin isoliertem
Rosmanol nur etwa 0,01% beträgt.
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Wie von Wenkert et al. gezeigt wurde, ist Carnosol ein
Oxidationsartefakt der Carnosinsäure. Diese Oxidation findet in
Gegenwart von Sauerstoff sowohl nach der Ernte des Rosmarin
oder des Salbeis in den Blättern statt, die man in der Luft
trocknen läßt (man kann übrigens nachweisen, daß die frisch
geschnittenen Rosmarinblätter kein Carnosol enthalten), als
auch wenn diese Blätter Extraktionsoperationen mit
Lösungsmittel unterzogen werden oder die Extrakte selbst bekannten
Fraktionierungs-, Anreicherungs- und Reinigungsarbeitsgängen
unterzogen werden. Es gibt allen Grund anzunehmen, daß das
Rosmanol, das in einer einer alkalischen Behandlung
unterzogenen Rosmarinfraktion identifziert wurde, ebenfalls ein
späteres Produkt der Oxidation der Carnosinsäure ist, wie es
Wenkert et al. bereits nahegelegt haben und was man
berechtigterweise auch von Rosmaridiphenol annehmen kann.
Carnosinsäure ist also das einzige Phenolditerpen, das im Rosmarin und
im Salbei im nativen Zustand vorhanden ist und in dieser
Hinsicht das alleinige Anrecht auf die Bezeichnung Naturprodukt
hat.
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Verschiedene Wege zur Herstellung von Carnosinsäure durch
chemische Synthese wurden auch in der Literatur von W. L. Meyer
et al. vorgeschlagen [Tetrahedron Letters 1966, 4261; 1968,
2963; J. Org. Chem. 41, 1005 (1976)]. Es handelt sich hierbei
jedoch um langwierige und komplexe Synthesewege, die aus
ökonomischen Gründen für ein industrielles Verfahren unanwendbar
sind. Außerdem führen diese Synthesen zu racemischen
Mischungen von Vorläufern der Carnosinsäure und nicht zu den reinen
Enantiomeren. Es ist noch zu erwähnen, daß diese Arbeiten bei
der Herstellung von Vorläufern Carnosinsäure stehenbleiben und
die Beschreibung des Endschritts oder der Endschritte der
Herstellung auslassen. Eine andere Art der Herstellung von
Carnosinsäure wurde auch in der Literatur von Brieskorn und
Dömling beschrieben [Arch. Pharm. 302, 641 (1969)], die in
einer katalytischen Reduktion von Carnosol besteht. Auch hier
kommt eine Anwendung dieses Verfahrens in großem Maßstab nicht
in Betracht, da Carnosol nicht verfügbar ist.
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Ein Verfahren zur Gewinnung von Carnosinsäure ausgehend von
Rosmarin oder Salbei, Gegenstand der Hauptanmeldung, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Gewürz mit einem unpolaren
Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln erhöhter
Unpolarität extrahiert, den erhaltenen Extrakt einer
selektiven Adsorptionsbehandlung an einem festen Träger unterwirft,
die Carnosinsäure mit einem polaren Lösungsmitel oder einer
Lösungsmittelmischung erhöhter Polarität desorbiert und das
Lösungsmittel verdampft.
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Carnosinsäure ist wie jedes Molekül vom Typ Catechol
(Orthodiphenol) eine reaktive Verbindung, die für Oxidation und damit
auch für alle gewöhnlich zur Isolierung von natürlichen
Substanzen vorgenommenen Operationen (Extraktion, Flüssig-
Flüssig-Verteilung, chromatographische Fraktionierung usw.)
sehr empfindlich ist. Dagegen wurde jedoch festgestellt, daß
Carnosinsäure in ihrer gereinigten und kristallisierten Form
stabil ist und ohne übermäßige Vorsichtsmaßnahmen manipuliert
werden kann, daß diese Gewinnung in kristallisierter Form
jedoch nur ausgehend von einer bereits bezüglich Carnosinsäure
angereicherten Pflanzenmaterialzubereitung vorgenommen werden
kann.
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Das Verfahren gemäß der Hauptanmeldung gestattet die
Beibehaltung der chemischen Unversehrtheit der Carnosinsäure, da
es nur zwei Behandlungsschritte enthält, diese Schritte
schonen das Basisprodukt und sind gegenüber der Carnosinsäure
selektiv.
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Das Gewinnungsverfahren für die Carnosinsäure nützt zwei
physikalisch-chemische Eigenschaften der Carnosinsäure aus.
Einerseits besitzt das Molekül als polar geltende Funktionen
wie die Carboxylsäure- und Phenolfunktion. Andererseits
verleiht der Rest seines Gerüsts, im wesentlichen eines
Kohlenwasserstoffgerüsts, ihr einen relativ unpolaren Charakter,
verglichen mit allen anderen Phenolverbindungen wie die
Flavonoide oder die Hydroxybenzoesäuren oder Hydroxyzimtsäuren,
mit denen Pflanzen wie Salbei oder Rosmarin reichlich
ausgestattet sind. So umfaßt das Verfahren nur zwei Operationen:
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1. Extraktion des Pflanzenmaterials (Salbei oder Rosmarin)
in einem im wesentlichen apolaren Lösungsmittel, wodurch
die Carnosinsäure und die unpolaren Verbindungen des
Pflanzenmaterials in den Extrakt übergehen.
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2. Selektive Adsorption der im Extrakt enthaltenen
Carnosinsäure an einem festen Träger, der aufgrund seiner
Affinität und seiner Selektivität an der Stelle der polaren
Funktionen der Carnosinsäure gewählt wird, wobei auf die
Adsorption die Desorption der Carnosinsäure vom Träger
mit Hilfe eines polaren Lösungsmittels folgt.
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Im ersten Schritt werden Rosmarin- oder Salbeiblätter durch
ein im wesentlichen unpolares Lösungsmittel extrahiert, so daß
der erhaltene Extrakt neben allen anderen unpolaren oder sehr
wenig polaren Verbindungen der Blätter dieser Pflanzen wie die
Bestandteile des ätherischen Öls, Lipide, Wachse,
Chlorophyllpigmente und verschiedene Triterpene, die Carnosinsäure
praktisch als einzige Verbindung vom Phenoltyp, die in den
Extrakt übergeht, enthält. Der Extraktionsgrad der
Carnosinsäure liegt zwischen 70 und 100% und ihr Gehalt im Extrakt
beträgt 13 bis 25%.
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Im zweiten Schritt wird der vorhergehende Extrakt in einem
adsorbierenden festen Stoff behandelt, der eine Affinität für
die Verbindungen mit polaren Funktionen oder eine besondere
Selektivität an der Stelle der Phenolverbindungen besitzt, wie
beispielsweise Silicagel, Aluminiumoxid, um anorganische
absorbierende Stoffe zu nennen, oder Polyamid und
Polyvinylpyrrolidon, um Beispiele von organischen absorbierenden
Stoffen zu nennen. Bei dieser Behandlung wird die
Carnosinsäure mit hoher Affinität oder Selektivität an dem
Adsorptionsmittel adsorbiert, wobei die anderen Betandteile
des Extrakts im wesentlichen in der flüssigen Phase bleiben.
Nachdem diese entfernt wurde, wird die Carnosinsäure vom
Adsorptionsmittel durch Kontakt mit einem polaren
Lösungs
mittel desorbiert, das nach Verdampfen einen Rückstand ergibt,
der 65 bis 95% Carnosinsäure enthält, deren Reinigung
nötigenfalls noch durch Rekristallisierung vervollständigt werden
kann.
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Die Ausbeute des Herstellungsverfahrens an Carnosinsäure, die
bezüglich des Gehalts des Ausgangspflanzenmaterials an dieser
Säure errechnet wird, beträgt 60 bis 90%.
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Das Ausgangspflanzenmaterial und die Größe der Pflanzenteile
spielen bei der Extraktionsausbeute der Carnosinsäure eine
Rolle. Im Prinzip bevorzugt man die Verwendung von fein
gemahlenem Rosmarin oder Salbei, da ein feines Mahlgut im
allgemeinen bessere Ausbeuten ergibt. Obwohl es vorteilhafter
ist, vom ganzen Gewürz auszugehen, könnten es die nach
Hydrodestillation des ätherischen Öls erhaltenen Rückstände ggf.
auch tun, es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß, da diese
Operation mit großen Carnosinsäureverlusten in Form von
Oxidationsprodukt verbunden ist, das Verfahren zur Herstellung der
Carnosinsäure wirtschaftlich weniger günstig ist. Man kann als
Rohstoff auch die Rückstände verwenden, die nach Extraktion
des ätherischen Öls mit einem Lösungsmittel in superkritischer
Phase wie beispielsweise superkritisches CO&sub2; erhalten werden.
In diesem Fall haben die Rückstände eine bessere Qualität
hinsichtlich ihres Gehalts an Carnosinsäure, da diese Technik der
Herstellung des ätherischen Öls die wertvollen Verbindungen
des Pflanzenmaterials mehr schont.
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Allgemein läßt sich die Carnosinsäure leichter aus dem Salbei
als aus dem Rosmarin extrahieren. Die Erklärung hierfür ist
sicher, daß die Salbeiblätter weniger faserig als die
Rosmarinblätter sind. Rosmarin ist jedoch eine Pflanze mit
viel größerer Verbreitung als Salbei und bildet somit einen
billigeren und viel leichter in großen Mengen verfügbaren
Ausgangsstoff.
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Unabhängig vom verwendeten Extraktionstyp oder dem verwendeten
Pflanzenmaterial ist es aus den obengenannten Gründen wichtig,
daß das Extraktionslösungsmittel so unpolar wie möglich ist.
Es handelt sich hierbei um gewöhnlich als
Extraktionslösungsmittel verwendete Lösungsmittel, d. h. Lösungsmittel mit
relativ niedrigem Siedepunkt, wie verzweigte oder unverzweigte
gesättigte Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Hexan, Pentan,
Heptan, 2-Methyl-butan, 2-Methyl-hexan und Cyclohexan oder die
gesättigten Kohlenwasserstoffmischungen (Petrolether),
aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol, binäre Mischungen eines
der vorhergehenden Lösungsmittel in starkem Überschuß mit
einem chlorierten Lösungsmittel (beispielsweise
Methylenchlorid, Chloroform, Chlorethylen) oder sauerstoffhaltige
Lösungsmittel wie ein Ether (beispielsweise Dietyhlether), ein
Keton (beispielsweise Aceton), ein Ester (beispielsweise
Ethylacetat) oder ein Alkohol (beispielsweise Ethanol,
Methanol usw.). Man kann beispielsweise eine Mischung von
Petrolethern, Toluol oder Hexan mit Dichlormethan oder Ethanol
in Anteilen von 99/l bis 90/10 verwenden. Im Fall von Salbei
beispielsweise ist es möglich, die Carnosinsäure quantitativ
mit einem Lösungsmittel vom Typ gesättigtem Kohlenwasserstoff
zu extrahieren. Bei allen anderen Kombinationen von
Plfanzenmaterial/Extraktionsvariante muß ein Lösungsmittel mit leicht
erhöhter Polarität verwendet werden, wenn man einen guten
Carnosinsäureextraktionsgrad erhalten möchte.
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Der Schritt der Extraktion des Gewürzes kann durch Erschöpfen
des Pflanzenmaterials durch Lösungsmittel beispielsweise in
einem Extraktionsgerät vom Typ Soxhlet (Variante I),
ansatzweise, d. h. durch Eintauchen des Pflanzenmaterials in das
Lösungsmittel (Variante II), durch Perkolation, durch
Extraktion in gepulster Säule oder durch jede andere bekannte
Technik der Lösungsmittel-Fest-Extraktion durchgeführt werden.
Hier werden jedoch die beiden ersten Varianten im
nachstehenden als Beispiele beschrieben. Die Variante I ergibt
bessere Carnosinsäureextrak-tionsgrade als die Variante II.
Diese ist jedoch einfacher durchzuführen, wenn große Mengen
Pflanzenmaterial zu extrahieren sind.
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Die Extraktion durch Erschöpfung durch ein Lösungsmittel
findet in einem Soxhlet-Extraktor statt, der aus einer
Rückflußvorrichtung (Kolben + Kühler) besteht, die das
Extraktionslösungsmittel enthält und zwischen deren beiden
Teilen ein Heberextraktor eingesetzt ist, der mit einer das zu
extrahierende Pflanzenmaterial enthaltenden porösen Kartusche
versehen ist. Die Dämpfe des im Kolben bis zum Sieden
erhitzten Lösungsmittels wandern längs des Extraktors in einer
hierzu vorgesehenen Leitung und kondensieren zur Flüssigkeit,
wenn sie im Kühler angelangt sind. Das kondensierte
Lösungsmittel fällt wieder in die Extraktionskartusche und füllt
diese. Sobald der Flüssigkeitsstand im Extraktor in Höhe der
Heberleitung angelangt ist, entleert der Extraktor seinen
Flüssgkeitsinhalt, welcher zum Kolben zurückkehrt, indem er
eine gewisse Menge gelöstes Pflanzenmaterial mit sich
mitnimmt.
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Dieser Vorgang kann als ein Extraktionszyklus definiert
werden.
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Je nach der Extraktionsart sind die bevorzugten Lösungsmittel
bei Salbei die leichten azyklischen Kohlenwasserstoffe,
beispielsweise Petrolether, vorzugsweise mit einem
Siedepunktintervall von 40 bis 60ºC und bei Rosmarin dieselben
Lösungsmittel oder eine binäre Kombination eines von ihnen mit einem
chlorierten Lösungsmittel, beispielsweise Dichlormethan, in
Volumensverhältnissen von 99/1 bis 9/1. Die Anzahl der auf das
zu extrahierende Material angelegten Extraktionszyklen beträgt
etwa 5 bis 20.
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Wenn man ansatzweise extrahiert, werden das Pflanzenmaterial
und das Extraktionslösungsmittel in einem herkömmlichen
Reaktor in Kontakt gebracht, und während der gesamten
Operation gerührt. Lösungsmittel und Pflanzenmaterial stehen
vorzugsweise in einem Volumen/Gewichts-Verhältnis von 5/1 im
Fall von Rosmarin und 10/1 im Fall von Salbei (die größere
Lösungsmittelmenge im Fall von Salbei wird durch die Dichte
des Salbeis bestimmt, die viel geringer als die des Rosmarins
ist). Im allgemeinen nimmt man zwei oder drei
aufeinanderfolgende Extraktionen des Pflanzenmaterials vor, nachdem man
zwischen jedem Arbeitsgang die flüssige Phase und die feste
Phase durch Filtration oder Zentrifugation getrennt hat. Jede
Extraktion dauert etwa eine 1/2 bis 2 h, im allgemeinen 1 h.
Die bevorzugten Lösungsmittel bei dieser Extraktionsart sind
bei beiden Pflanzenmaterialen, Salbei und Rosmarin, die
aromatischen Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Toluol, oder eine
binäre Kombination eines leichten azyklischen
Kohlenwasserstoffs, beispielsweise Petrolether oder Hexan, mit einem
sauerstoffhaltigen Lösungsmittel, vorzugsweise Ethanol oder
Methanol in Volumensverhältnissen von 99/1 bis 9/1.
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Der erste Extraktionsschritt wird mit einer Temperatur von 20
bis 50ºC ausgeführt.
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Im zweiten Schritt wird der im ersten Schritt erhaltene
pflanzliche Extrakt mit einem festen Adsorptionsstoff
behandelt. Die Carnosinsäure des Extrakts wird an dem festen
Stoff selektiv adsorbiert und dann nach Entfernung der
flüssigen Phase im konzentrierten Zustand durch Desorption mit
einem reinen polaren Lösungsmittel gewonnen, wie Aceton,
Methanol, Ethanol oder Ethylacetat oder einer Mischung eines
dieser Lösungsmittel in einem großen Anteil mit einem
unpolaren oder wenig polaren Lösungsmittel.
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Im Prinzip kann der flüssige Extrakt mit jedem beliebigen
adsorbierenden festen Stoff behandelt werden, der eine
Affinität oder Selektivität für diesen Typ von Verbindungen
besitzt. Eine nicht erschöpfende Liste von adsorbierenden
Stoffen, die hierzu verwendet werden können, ist im
vorstehenden bereits angeführt. Es handelt sich hier im
wesentlichen um die Stoffe, die man gewöhnlich in den Trennverfahren
durch Flüssigchromatographie verwendet.
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Von den wirtschaftlich interessanten adsobierenden Stoffen
sind Polyamid oder jedes ähnliche Polymer wie
Polyvinylpyrrolidon Stoffe der Wahl für die Adsorption der
Carnosinsäure. Diese Stoffe zeigen nämlich eine ganz bemerkenswerte
Affinität an der Stelle der Phenolverbindungen (vgl.
beispielsweise "The Flavonoids", Harborne et al., eds.,
Chapman and Hall, 1975, Kap. 1, S. 11). Außerdem sind dies
chemisch träge Träger, bei denen nicht die Gefahr besteht, daß
die Verbindungen, mit denen sie in Kontakt gebracht werden,
merklich verändert werden.
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Der flüssige Pflanzenextrakt des ersten Schritts des
Verfahrens kann in der Praxis so, wie er ist, mit dem
adsorbierenden Stoff in Kontakt gebracht werden. Ggf. wurde der
Extrakt zuvor gefiltert, um ihn von kleinen Mengen
ausgefällter fester Stoffe zu befreien, die sich möglicherweise
während oder nach der Extraktion bilden konnten. In der Praxis
ist es jedoch vorteilhaft, den flüssigen Extrakt vor dem
Inkontaktbringen mit dem Adsorptionsmittel zu konzentrieren,
um den Übergang der Carnosinsäure aus dem gelösten Zustand in
den adsorbierten Zustand zu begünstigen. In zahlreichen
Fällen, wenn der Arbeitsgang der Konzentration sich in der
Bildung eines festen Niederschlags äußert, bevorzugt man es,
das Lösungsmittel vollständig aus dem Extrakt auszutreiben und
den Rückstand in einem zweiten Lösungsmittel aufzunehmen, das
wegen seiner Fähigkeit gewählt wird, die Carnosinsäure des
Extrakts leicht und vollständig zu lösen. In der Praxis hat
man gefunden, daß sich die Lösungsmittel vom Typ aromatische
Kohlenwasserstoffe oder die chlorierten Lösungsmittel für
diesen Arbeitsgang gut eignen, wobei Toluol und Dichlormethan
die bevorzugten Lösungsmittel sind.
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Der Kontakt zwischen dem flüssigen Extrakt und dem
adsorbierenden Stoff kann durch Eintauchen oder durch Durchgang des
Extrakts durch eine mit adsorbierendem Stoff, gefüllte Säule
stattfinden. Diese zweite Technik ist wirksamer und geht
folgendermaßen vor sich: der flüssige Extrakt wird oben in
einer Säule eingebracht, die mit adsorbierendem Stoff gefüllt
ist, der mit demselben Lösungsmittel wie der Extrakt
konditioniert ist. Wenn der Extrakt mit dem adsorbierenden Stoff
einmal in Kontakt ist, wäscht man die Säule mit frischem
Lösungsmittel, bis alle Stoffe des Extrakts mit Ausnahme der
Carnosinsäure entfernt wurden, die an dem Träger adsorbiert
bleibt. Die Carnosinsäure wird nun von dem adsorbierenden
Stoff desorbiert, indem man durch die Säule ein mittelpolares
bis polares Lösungsmittel leitet, beispielsweise eine Mischung
von Dichlormethan oder Toluol mit Ethanol oder Methanol. Man
treibt das Lösungsmittel des Eluats aus, und der Rückstand
kann anschließend noch durch Rekristallisation gereinigt
werden, um den gewünschten Reinheitsgrad der Carnosinsäure zu
erreichen.
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Die Erfindung betrifft die Verwendung von Carnosinsäure für
die Herstellung einer Zusammensetzung oder eines
Diätnahrungsmittels, das für die Vorbeugung und Behandlung von Krebs
bestimmt ist.
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Manche chemische Verbindungen besitzen Eigenschaften, die die
durch andere chemische Produkte hervorgerufene mutagene
Aktivität direkt oder indirekt verringern oder unterdrücken.
Tatsächlich wurde nachgewiesen, daß die freien Reste an der
DNA eine große Anzahl verschiedener Verletzungen verursachen
können und auch am Prozeß des Krebses, des Alterns und
kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt sind. Carnosinsäure hat
eine hemmende Wirkung auf die durch freie Reste verursachte
Zerstörung der DNA, was ihre Verwendung zur Prävention und
Behandlung von Krebserkrankungen oder kardiovaskulären
Erkrankungen in Betracht kommen läßt.
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Die diätetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen
können verschiedene Aufmachungen besitzen, die an die Form der
Verabreichung beispielsweise auf oralem, enteralem oder
parenteralem Weg angepaßt sind. Beispielsweise können
Kapseln, Gelantinekapseln oder Sirupe hergestellt werden. Im
Fall einer enteralen oder parenteralen Verabreichung haben
die Zusammensetzungen die Form von physikalisch und chemisch
stabilisierten Emulsionen oder Lösungen.
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Physiologische Dosen können in der Prävention oder ggf. bei
der Behandlung von gewissen Arten von Krebs und
kardiovaskulären Erkrankungen verabreicht werden.
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Carnosinsäure kann außerdem zur Herstellung einer
Zusammensetzung verwendet werden, die für die Behandlung der Herpes,
einer Viruserkrankung, bestimmt ist. Diese Zusammensetzung
kann verschiedene Formen haben, die an die Art der
Verabreichung beispielsweise auf oralem Weg oder durch topische
Anwendung angepaßt sind. Beispielsweise kann man Kapseln,
Gel
antinekapseln oder Salben herstellen. Physiologische Dosen
werden zur Behandlung dieser Erkrankung verabreicht.
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Im nachstehenden werden Beispiele beschrieben
Beispiele 1 bis 21
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In der nachstehenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse angeführt,
die man bei einer Reihe von Extraktionsversuchen mit Rosmarin
und Salbei gemäß den Extraktionsvarianten I und II unter
Verwendung der obengenannten Lösungsmittel erhalten hat. Man
sieht, daß je mehr die Polarität des Lösungsmittel zunimmt
(Spalte 5), um so besser ist der Extraktionsgrad der
Carnosinsäure (Spalte 8), um so weniger groß ist jedoch auch
ihre Konzentration im Extrakt (Spalte 7) und um so
beträchtlicher ist damit der Ballast im Extrakt, wobei dieser Ballast
aus anderen Phenolverbindungen als der Carnosinsäure besteht,
die deshalb mit dieser im zweiten Schritt des Verfahrens
negativ interferieren können.
Erläuterung der Abkürzungen:
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AC: Carnosinsäure
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IQ: Qualitätskennzahl
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Lösungsmittel: P = Petrolether E = Ethanol A = Aceton
D = Dichlormethan T = Toluol
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Man kann aus den gemessene Daten der Tabelle eine
Qualitätskennzahl (IQ) des Extrakts bestimmen, die ausgehend von
Wirksamkeits- und Selektivitätskriterien des
Extraktionslösungsmittels ermittelt wird. Die Wirksamkeit (E) des
Lösungsmittels wird durch den Extraktionsgrad der Carnosinsäure (Spalte
8) gemessen. Je wirksamer das Lösungsmittel ist, um so höher
ist die Ausbeute an am Ende des Verfahrens gewonnener
Carnosinsäure. Die Selektivität (S) des Extraktionslösungsmittel
wird durch den Gehalt des Extrakts an Carnosinsäure gemessen
(Spalte 7); je selektiver das Lösungsmittel ist, um so höher
ist die Reinheit der am Ende des Verfahrens isolierten
Carnosinsäure. Die Qualitätskennzahl (IQ) kann nun definiert
werden als das Produkt der Faktoren E und S. wobei dieses
Produkt durch den Carnosinsäuregehalt T im
Ausgangspflanzenmaterial (Spalte 3) gewichtet wird.
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IQ = (E · S)/T
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Um den Vergleich zwischen den einzelnen Beispielen der
Tabelle 1 zu erleichtern, hat man die Qualitätskennzahl (Spalte
9) auf eine Skala von 0 bis 100 bezogen, wobei die Daten von
Beispiel 4 willkürlich als optimal betrachtet wurden.
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Aus den Daten der Tabelle läßt sich folgendes ableiten:
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1) Die Qualitätskennzahl ist der Ausdruck eines Kompromisses
zwischen Selektivität und Wirksamkeit. Das ideale
Lösungsmittel wäre dasjenige, das den gesamten gesuchten
Wirkstoff, und zwar nur diesen extrahieren würde. Der
Kompromiß besteht darin, daß man ein Gleichgewicht
zwischen der Ausbeute des Verfahrens zur Gewinnung des
Wirkstoffes und der Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens
findet.
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2) Bei vergleichbaren Anwendungen der Extraktionsvariante und
des Lösungsmittels läßt sich Carnosinsäure leichter aus
Salbei als aus Rosmarin extrahieren.
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3) Bei vergleichbarer Lösungsmittelverwendung und beliebigem
Pflanzenrohstoff ist die Extraktionsvariante I wirksamer
als die Variante II.
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4) Die Verwendung von binären Mischungen von
Extraktionslösungsmitteln mit zunehmendem Anteil des polarsten von
ihnen gestattet die Festlegung einer optimalen
Konzentration dieses Lösungsmittels, die im Fall der in der
Tabelle angeführten Beispiele um 5% beträgt (Beispiele 7-
9, 10-12, 15-17, 18-19).
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Im nachstehenden werden konkrete Beispiele für die Extraktion
von Carnosinsäure gemäß den Beispielen 4, 1, 2, 7 und 18 der
vorstehenden Tabelle beschrieben.
Salbei, Extraktion Variante I, gemäß Beispiel 4
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In einen Extraktor vom Typ Soxhlet, der mit einer Cellulose-
Kartusche versehen ist, bringt man 297 g gemahlenen Salvia
officinalis ein, der 2,5% Carnosinsäure enthält Man
extrahiert 48 h unter Luftabschluß (Stickstoffatmosphäre) mit
Petrolether (2,5 L; Siedep. 40-60ºC). Nach Beendigung der
Extraktion wird das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer
ausgetrieben, und man gewinnt 30 g gefärbten öligen Extrakt
(Ausbeute 10%), der 7,4 g Carnosinsäure enthält (Ausbeute
100%).
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Man löst den Extrakt in Dichlormethan (150 ml), und nachdem
man diese Lösung zur Entfernung eines kleinen Anteils
unlöslicher Substanz gefiltert hat, gießt man sie auf eine Säule,
die mit Polyamid gefüllt ist und mit einer Suspension von 150
g dieser Substanz in 1 l Dichlormethan präpariert ist. Man
eluiert mit demselben Lösungsmittel, um die Stoffe des
Extrakts zu beseitigen, die nicht auf dem Polyamid
zurückgehalten wurden und einer stark gefärbten Fraktion entsprechen
(Fraktion 1, 700 ml, 18 g Rückstand ohne Lösungsmittel). Man
führt die Elution mit einer Mischung aus Dichlormethan und
Methanol in einem Volumensverhältnis von 8/2 weiter. Die
Übergangszone zwischen den beiden Lösungsmitteln manifestiert
sich auf der Säule durch Auftreten einer gelben ringförmigen
Zone, die der Carnosinsäure entspricht. Man gewinnt eine
Zwischenfraktion (Fraktion 2, 700 ml, 2 g Rückstand ohne
Lösungsmittel) und dann die Ringzone (Fraktion 3, 100 ml, 6,1 g
Rückstand nach Austreiben des Lösungsmittels).
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Der halbkristalline Rückstand der Fraktion 3 nach Feinmahlung
in Petrolether ergibt 6,0 g eines hellgelben festen Stoffes
(Schmelzp. 170-195ºC), der 95% Carnosinsäure enthält.
Ausbeute 82%.
Rosmarin, Extraktion Variante I gemäß Beispiel 1
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Man bringt in einen Extraktionsbehälter eines
Soxhlet-Extraktors einen dünnen Gewebestrumpf, der 383 g gemahlenen
Rosmarin enthält, dessen Gehalt an Carnosinsäure 1,85 Gew.-%
beträgt. Die Höhe der Pflanzenmasse im Extraktor beträgt 30 cm.
Man setzt den Extraktor unter neutrale Atmosphäre und
extrahiert mit Petrolether (2,5 l; Siedep. 40-60ºC) in 4 Füll- und
Absaugzyklen von einer Dauer von jeweils 75 min. Man treibt
das Lösungsmittel mit dem Rotationsverdampfer aus und gewinnt
35 g dunklen öligen Extrakt (Ausbeute 9,1%), der 5,6 g
(Ausbeute 97%) Carnosinsäure enthält.
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Man löst den Extrakt in 240 ml Dichlormethan und schüttet die
Lösung auf eine Polyamidsäule. Man eluiert wie oben, indem
man 3 Fraktionen erhält Fr. 1: 700 ml; Fr. 2: 550 ml; Fr. 3:
500 ml.
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Man treibt das Lösungsmittel der letzten Fraktion aus und
erhält 7,3 g einer dunkelgelben festen Masse, die 5,6 g (77%)
Carnosinsäure enthält, was die Gesamtheit der extrahierten
Fraktion dieser Säure ausmacht. Ausbeute: 79%.
Rosmarin, Extraktion Variante I gemäß Beispiel 2
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Man geht wie im vorhergehenden Beispiel vor, wobei man jedoch
mit einer Mischung aus Petrolether und Dichlormethan in einem
Volumensverhältnis von 9/l extrahiert. Der Extrakt wiegt 38 g
(Ausbeute 10,1%) und enthält 6,2 g (Ausbeute 87%)
Carnosinsäure. Ein Teil des Extrakts (4 g) ist in Dichlormethan nicht
löslich, und dieser feste Stoff muß gefiltert werden, bevor
der Extrakt auf die Polyamidsäule gebracht wird. Der
Rückstand der Fraktion 3 der Elution wiegt 7,7 g und enthält 5,3
g (59%) Carnosinsäure. Ausbeute: 74%.
Rosmarin, Extraktion Variante II nach Beispiel 7
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In einen Reaktor von 20 l bringt man 2,5 kg gemahlenen
Rosmarin, der 1,8% Carnosinsäure enthält, und 12,5 l einer
Mischung aus Hexan und Ethanol im Volumenverhältnis von 98/2
ein. Man rührt das Ganze 1 h bei Raumtemperatur unter
Stickstoff. Man trennt die flüssige Phase von der festen Phase
durch eine Vakuumfiltration (Büchner). Man setzt die Lösung
des Extrakts zur Seite und unterzieht die Pflanzenmasse einer
zweiten Extraktion, die der ersten ähnlich ist. Nach
Filtration vereinigt man die beiden Extraktlösungen und beseitigt
das Lösungsmittel mit dem Rotationsverdampfer. Man erhält 206
g (Ausbeute 8,2%) dunklen öligen Extrakt, der 33 g (Ausbeute
73%) Carnosinsäure enthält.
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Man löst den Extrakt in 1,6 l Dichlormethan und gießt die
Lösung auf eine Polyamidsäule. Man eluiert wie in Beispiel 1,
indem man 3 Fraktionen sammelt: Fr. 1 : 3,36 l; Fr. 2 : 3,23 l;
Fr. 3: 1,65 l. Diese letzte Fraktion ergibt nach Verdampfen
des Lösungsmittels einen halböligen Rückstand (41,5 g), der
in Petrolether bis zur festen Konsistenz feingemahlen wird.
Das auf diese Weise erhaltene gelbe Produkt wiegt 37 g und
enthält 73% Carnosinsäure. Ausbeute: 27 g (60%).
Salbei, Extraktion Variante II gemäß Beispiel 18
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Man rührt 1 h bei Raumtemperatur und unter Stickstoff eine
Mischung von 50 g gemahlenem Salbei (Carnosinsäuregehalt 1,8
%) und 600 ml Toluol. Nach Trennung der festen und der
flüssigen Phase durch Filtration unterzieht man die pflanzliche
Masse einem zweiten Extraktionsgang. Man vereinigt die beiden
Extraktlösungen und treibt das Lösungsmittel mit dem
Rotationsverdampfer aus. Man erhält 5,1 g (10,2%) öligen Extrakt,
der 0,82 g (Ausbeute 91%) Carnosinsäure enthält.
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Man löst den Extrakt wieder in 50 ml Toluol und filtert die
erhaltene Lösung zur Entfernung einiger nicht löslicher
Stoffe. Das Filtrat wird auf eine Polyamidsäule (30 g; 30 ·
2 cm) geschüttet, die mit Toluol konditioniert ist. Man
eluiert wie in Beispiel 1 mit Toluol und dann mit einer Mischung
von Toluol und Ethanol in einem Verhältnis von 8/2 und
gewinnt 3 Fraktionen: Fr. 1: 200 ml (3,3 g Pflanzenmaterial);
Fr. 2: 160 ml; 0,2 g; Fr. 3: 50 ml; 1,1 g. Diese letzte
Fraktion enthält 0,78 g (71%) Carnosinsäure. Ausbeute: 87%.
Reinigung der Carnosinsäure
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30 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen gelben Produkts, das
73% Carnosinsäure enthält, werden zweimal in Cyclohexan in
Gegenwart von Aktivkohle rekristallisiert. Man erhält 16,4 g
Carnosinsäure in Form von farblosen Kristallen mit einer
Reinheit von über 95% (Schmelzp. 193-199ºC), Anstelle von
Cyclohexan kann das Produkt auch in Benzol oder Toluol
rekristallisiert werden
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Die physiologischen antikarzinogenen und antiviralen
Eigenschaften der Carnosinsäure werden in den folgenden Versuchen
dargestellt:
Antikarzinogene Wirkung der Carnosinsäure
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Die antimutagene Wirkung der Carnosinsäure wurde in einem
Ames-Test ermittelt, in dem der Stamm Salmonella typhimurium
TA 102 verwendet wurde, der dafür bekannt ist, daß er leicht
auf Aktivsauerstoffspezies reagiert. Dieser Stamm wird mit
tert.-Butylperoxid (tBOOH) in Kontakt gebracht, das dafür
bekannt ist, daß es peroxylierte Reste erzeugt und dessen
biologische Wirkung als besonders interessant gilt, da es die
Sauerstoffreste im Inneren der Zellen erzeugt. Das tBOOH
erzeugt eine gewisse Anzahl von punktförmigen Veränderungen an
der DNA der Bakterien, und man mißt die durch das Antioxidans
bewirkte Hemmung dieser Veränderungen, wenn man es dem
Kulturmedium beigibt. Die folgenden Antioxidanzien wurden in
einem Bereich von aktiven Dosen getestet: Carnosinsäure,
Carnosol und Ascorbinsäure. Die letztgenannte, deren
antikarzinogene Wirkung wohlbekannt ist, hat zur positiven Kontrolle
gedient. Um die "echte" antimutagene Wirkung von einer
bakteriziden Wirkung zu trennen, wird ein Vorinkubationstest
vorgenommen, und die Ergebnisse werden in Form des Verhältnisses
von induzierte Anzahl revertanter Kolonien zur Anzahl
überlebender Kolonien ausgedrückt [Aeschbacher et al., Food Safety,
8, 167-177 (1987)].
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Beschreibung des Tests: Zur Herstellung des
Irkubationsmediums mischt man 1 ml Bakteriensuspension (5 · 10&sup9; bact./ml)
von Salmonella typhimurium TA 102, hergestellt nach Maron und
Mies [Mutation Research, 113, 175-215 (1983)], 50 ul
Salzpuffer, 0,95 ml 0,15 M KCl und 2,8 ml Davis-Mingioli-Medium,
er
gänzt mit 24 ug Histidin und 10 ug Biotin pro ml. Man gibt
anschließend 0,5 ml tBOOH-Lösung (Endkonzentration 2,5 mM)
und 0,5 ml Antioxidanslösung in Wasser bei Ascorbinsäure und
in Triglyceriden mittlerer Kettenlänge bei den
nichtwasserlöslichen Antioxidanzien Carnosinsäure und Carnosol. Das
Medium wird 1 h bei 37ºC und dann nach Beigabe von 9 ml 0,8
%iger Nährbouillon noch einmal 3 h bei 37ºC inkubiert, um die
Mutation zu fixieren. Das Medium wird anschließend
zentrifugiert, und die gewaschenen Bakterien werden in 3,5 ml
Salzpuffer wieder in Suspension gebracht.
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Die Zählung der Kolonien von Revertanten und Überlebenden
wird auf Nähragarschalen bei Fehlen bzw. in Gegenwart von
Histidin vorgenommen, die 3 Tage bei 37ºC inkubiert werden und
auf die 0,1 ml der vorhergehenden Bakteriensuspension
aufgebracht wird. Die Zählung wird automatisch mit einem Zähler
Fisher count-All 800 vorgenommen.
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Tabelle 2 drückt die erhaltenen Ergebnisse in Form der
ermittelten Konzentrationen der getesteten Antioxidanzien aus, die
die durch tBOOH bei der Konzentration von 2,5 mM bei Fehlen
von Antioxidanzien hervorgerufene mutagene Wirkung um die
Hälfte reduzieren können (hemmende Konzentration 50 = CI 50).
Tabelle 2
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Aus den Daten der Tabelle geht klar hervor: während die
antikarzinogene Wirkung von Carnosol etwas geringer, aber von
vergleichbarer Größenordnung wie Ascorbinsäure (positiver
Vergleich) ist, ist die Wirkung der Carnosinsäure etwa 15 mal
größer als die der Ascorbinsäure und 50 mal größer als die
von Carnosol.
Antivirale Wirkung der Carnosinsäure
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Die antivirale Wirkung der Carnosinsäure wurde in vitro in
verschiedenen Konzentrationen (5; 2,5; 1,25; 0,62 ug/ml)
gegen infektiöse Gruppen von einfacher Herpes vom Typ 1 (HSV1)
und Typ 2 (HSV2) und von Poliovirus vom Typ 3 (Polio 3)
getestet, die auf dem Zellstamm VERO kultiviert wurden. Nach 2 h
Inkubation wurden die erhaltenen Gitter mit dem der
Vergleichssubstanzen ohne Inhibitor verglichen (Test 1).
Teilmengen von verschiedenen Testüberständen wurden anschließend
auf neue Zellen aufgepfropft. Nach 4 Tagen Inkubation
gestattet die Zählung der viralen Partikel diesmal die Ermittlung
der viralen Produktion in Gegenwart des Inhibitors (Test 2).
Tabelle 3 gibt die Ergebnisse dieser beiden Tests an.
Tabelle 3
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Die Ergebnisse des Test 1 zeigen, daß der Virusstamm Polio 3
durch Carnosinsäure nicht gehemmt wird. Dagegen ist die Anti-
HSV1- und Anti-HSV2-Wirkung vollständig signifikant, da
Titerverringerungen von bis zu 3 bis 4 Faktoren von 10
festgestellt werden. Es gibt also eine spezifische Wirkung der
Carnosinsäure. Die Ergebnisse von Test 1 werden durch die von
Test 2 bestätigt: man stellt fest, daß die Produktion von
Polio 3 bei beliebiger Carnosinsäurekonzentration als
äquivalent angesehen werden kann. Dagegen ist die Produktion von
HSV 1 und HSV 2 sehr beeinträchtigt. Dies bestätigt die
spezifische Wirkung des Produkts und auch das Fehlen von
Zelltoxizität, da die Produktion von Polio 3 bei der stärksten
Konzentration (5 ug/ml) nicht geändert wird.