DE68923720T2

DE68923720T2 - Einrichtung und Gerät für die Detektion von Mikroorganismen.

Info

Publication number: DE68923720T2
Application number: DE68923720T
Authority: DE
Inventors: Michael John Calandra; James Lawrence Diguiseppi; Richard Cornelius Driscoll; Thurman Clay Thorpe; James Edward Turner
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1988-03-15
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2009-03-07
Also published as: EP0333253B1; ES2031807T1; GR3017974T3; DE333253T1; AU631533B2; JPH0216965A; US4945060A; KR890014749A; DE68923720D1; IE67634B1; JP2862556B2; KR970003150B1; ES2031807T3; EP0333253A3; DK123889D0; DK123889A; IE890746L; ATE126267T1; CA1339512C; AU3128889A

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Gerät zur kontinuierlichen Überwachung von pH- oder CO&sub2;- Änderungen in einer Probe, die ein Wachstumsmedium und einen geschlossenen Behälter verwendet, zur Verfügung, ohne in den Behälter einzudringen, nachdem die Probe vorbereitet und der Behälter verschlossen ist. Als weitere Vorteile verhindert die Erfindung, dass Bestandteile der Probe kolorimetrische Bestimmungen beeinflussen und stellt auch ein Mittel zur im wesentlichen kontinuierlichen Überwachung von pH- oder CO&sub2;- Konzentration in der Probe zur Verfügung.

Hintergrund der Erfindung

Das Vorliegen von mikrobieller Verunreinigung in klinischen Proben wird üblicherweise durch Kultivieren der Proben in Gegenwart von Nährstoffen und Nachweis von mikrobieller Aktivität durch Änderungen in der Probe oder in der Atmospäre über der Probe nach einer gewissen Zeit ermittelt. Zum Beispiel wird in dem U.S. Patent 4,182,656 von Ahnell et al. die Probe in einen Behälter mit Kulturmedium, das ein mit Kohlenstoff-13 markiertes fermentierbares Substrat umfasst, gegeben. Nach Verschluss des Behälters und nachdem die Probe biologische Aktivität fördernden Bedingungen ausgesetzt wurde, wird das Verhältnis von Kohlenstoff-13 zu Kohlenstoff-12 in der gasförmigen Atmosphäre über der Probe bestimmt und mit dem anfänglichen Verhältnis verglichen. Im U.S. Patent 4,152,213 wird ein Verfahren beansprucht, welches die Präsenz von sauerstoffzehrenden Bakterien in einer Probe in einem verschlossenen Behälter durch Nachweis einer Verringerung der Sauerstoffmenge in der Atmosphäre über der Probe durch Überwachung des Gasdrucks im Behälter bestimmt. Das U.S. Patent 4,073,691 stellt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von biologisch aktiven Agentien, einschliesslich Bakterien, in einem geschlossenen, ein Kulturmedium enthaltenden Behälter durch Messen von Änderungen in der Natur der gasförmigen Atmosphäre über der Probe nach einer Zeitspanne zur Verfügung. Ein Verfahren zum nicht-invasiven Nachweis von CO&sub2;-Anderungen in der gasförmigen Atmosphäre wird von Suppman et al. gelehrt, wie in der EP-Anmeldung 83108468.6 offenbart wird, die am 4. April 1984 veröffentlicht wurde. Die in diesen und anderen Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren und Geräte erfordern alle entweder ein radiometrisches Verfahren oder das Eindringen in den verschlossenen Behälter, um nach Kultivierung Änderungen in der gasförmigen Atmosphäre zu messen oder erfordern spezielle Infrarotlicht-durchlässige Materialien.
Andere bekannte Verfahren zur Messung von mikrobieller Kontamination von Proben, insbesondere von Blutkulturen, schliessen die Messung von winzigen Änderungen von Temperatur, pH, Trübung, Farbe, Biolumineszenz und Impedanz ein. Im allgemeinen bestimmen diese Verfahren mikrobielle Kontamination durch den Nachweis von bakteriellen Stoffwechselnebenprodukten. Mikrobielle Verunreinigung kann auch durch Subkultivieren und/ oder Anfärben abgeschätzt werden. Von diesen Verfahren erlauben nur Impedanz, Radiometrie und Infrarotspektrometrie die Möglichkeit der automatischen Bearbeitung von klinischen Proben. Und ausser Impedanz- und Infrarotmessungen erfordern diese Verfahren auch das Eindringen in den Behälter, um eine Messung an der flüssigen Probe oder der gasförmigen Atmosphäre über der Probe vorzunehmen. Zusätzlich zur Wahrscheinlichkeit der Kontamination und zur Schaffung der Wahrscheinlichkeit die Zusammensetzung der Atmosphäre über der Probe zu ändern, jedesmal wenn eine Bestimmung vorgenommen wird, erlauben diese Verfahren keine kontinuierlichen oder in kurzen Zeitabständen wiederholten Messungen über einen längeren Zeitraum. Dies ist ein signifikanter Nachteil, da sich die Wachstumsrate von kontaminierenden Organismen in Abhängigkeit vom Organismus und von der Anzahl Organismen in der ursprünglichen Probe unterscheidet, sodass nicht vorausgesagt werden kann, wann eine kontaminierte Probe wahrnehmbare Änderungen in der Atmosphäre oder Probenflüssigkeit zeigen wird. Bei einem verwandten Problem, bei der Kontaminationsbestimmung durch pH-Änderungen in der flüssigen Probe, werden verschiedene Stoffwechselprodukte den pH der Probe unterschiedlich beeinflussen. Zum Beispiel wird die Bildung von Ammoniak den pH erhöhen, während die Bildung von CO&sub2; ihn senken wird. Unterschiedliche Wachstumsraten von unterschiedlichen kontaminierenden Organismen könnten zu einem gewissen Zeitpunkt zu einem pH-Anstieg, zu einem anderen Zeitpunkt zu einer pH-Senkung führen, was nicht wahrgenommen würde, wenn der pH in grossen Intervallen gemessen wird. Eine andere Fehlerquelle bei dem Nachweis von Änderungen durch pH-Messung in ganzen Blutproben, insbesondere wenn ein Indikatorfarbstoff das Mittel zur pH-Bestimmung ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Erscheinungsform des Farbstoffes durch die Präsenz der Blutzellen beeinflusst oder getrübt werden kann. Kolorimetrische Indikatoren können nur wirkungsvoll verwendet werden, wenn verhindert wird, dass durch die Natur der Probe verursachte Eehler die Erscheinung des Farbstoffes beeinflussen. Das U.S. Patent 4,456,380 offenbart ein Testsystem zur Identifikation von Bakterien, das an automatische Auswertung angepasst ist. Das System benutzt eine Kulturplatte, die eine Vielzahl Zellen umfasst. Papierscheiben-Sensoren, die mit farbbildenden Reagentien imprägniert sind, werden in den einzelnen Zellen plaziert. Nach dem Inkubieren der zu bestimmenden bakteriellen Proben in den Zellen wird die Farbreaktion der Papierscheiben durch Messen der Intensitäten des reflektierten Lichts von besagten Scheiben mit Hilfe einer externen, lichtmessenden Einheit bestimmt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gerät und eine Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit von Mikroorganismen in klinischen Proben, wie Blut oder andere Körperflüssigkeiten, durch Kultivieren der Proben mit einen sterilen Wachstumsmedium in einem durchsichtigen, verschlossenen, sterilen Behälter. Die Anwesenheit von Mikroorganismen wird durch Nachweis oder Messen von Änderungen des pH der Probe bestimmt oder durch die Produktion von CO&sub2; in der Probe unter Verwendung eines wegwerfbaren Sensors, der an der inneren Oberfläche des Behälters befestigt wird. Gemäss dieser Erfindung können Mikroorganismen bei Vorliegen von störenden Materialien, wie hohe Konzentrationen von roten Blutzellen, durch nicht-radiometrische und nicht-invasive Mittel bestimmt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figuren umfassen folgendes:

Figur 1 -- Blutkultur-Instrument

Diese Zeichnung zeigt die Gesamterscheinung des funktionellen Teils des Instruments, die Montage des Detektors, mit (1) dem Gefäss, (2) Sensor, (3) Kulturmedium, (4) der Lichtquelle, (5) Photodetektor, und die zugehörige Elektronik, die die (6) Stromquelle, (7) Strom-Spannungskonverter und (8) Filter mit geringem Durchlass einschliesst.
Jede Detektormontage umfasst vorzugsweise eine Photodiode in einer eingesenkten Vertiefung und eine oder mehrere LEDs, die so angeordnet sind, dass Licht auf die zu überwachende Oberfläche, jedoch nicht auf den Detektor selbst fällt. Die elektronischen Schaltungen in dieser Ausführungsform schliessen Verstärker und Filter zur Konditionierung der Detektorsignale, Multiplexer zur Auswahl unter den verfügbaren Signalen und konstante Stromquellen für die Beleuchtungskörper ein.
Die ganze Vorrichtung wurde auf einem Schüttler in einem 37ºC-Brutschrank plaziert, der eine geeignete Umgebung für mikrobielles Wachstum zur Verfügung stellte und Raumlicht von den Photodetektoren ausschloss.

Figur 2 -- pH-Sensitivität

Ausser subjektivem Testen des Instruments mit verschiedenen gefärbten Flaschen wurde es auch mit den pH-sensitiven Membranflaschen getestet. Diese Figur zeigt den durchschnittlichen Spannungsausgang von sieben verschiedenen Detektoren nach Äquilibrieren des Sensors mit verschiedenen Puffern über einen pH-Bereich von 5,8 bis 8,2. Detaillierte Studien zeigten, dass das System Änderungen von 0,1 pH-Einheit über einen pH-Bereich von 6,0 bis 7,5 zuverlässig unterscheiden konnte.

Figur 3 -- pH- und CO&sub2;-Änderung bei mikrobiellem Wachstum

Das Instrument wurde benutzt, um mikrobielles Wachstum sowohl durch pH-Änderung als auch durch CO&sub2;-Bildung nachzuweisen. Diese Figur zeigt die durch Wachstum des Bakteriums E. coli resultierende Änderung des pH und CO&sub2;.

Figur 4 -- Nachweis einer Auswahl von Mikroorganismen

Im wesentlichen setzen alle Organismen bei ihrem Stoffwechsel CO&sub2; frei. Deshalb kann dieses System benutzt werden, um das Wachstum einer sehr grossen Auswahl von Mikroorganismen nachzuweisen. Diese Figur zeigt den Nachweis von CO&sub2;, das während des Wachstums von E. coli, ein Gram-negatives Bakterium; S. pyogenes, ein Gram-positives Bakterium; P. aeruginosa, ein Gramnegatives, nicht-fermentierendes Bakterium; B. fragilis, ein anaerobes Bakterium; und C. albicans, eine Hefe gebildet wurde. Die Einheiten zeigen die relative CO&sub2;-Konzentration im Medium bezogen auf die CO&sub2;-Konzentration zu Beginn des Versuchs an. Weil die Probenbehälter und Medien Raumtemperatur (annähernd 20 ºC) haben, und der Behälter und die Probe während dem Versuch bei 37ºC inkubiert werden, wird wegen der reduzierten Löslichkeit von CO&sub2; in der Flüssigkeit bei erhöhter Temperatur während den ersten 2 bis 4 Stunden CO&sub2; in den Raum über der flüssigen Probe und dem Medium freigesetzt. Ausser wenn die Behälter und Medien vor Einführen der Probe und Plazierung im Instrument bei 37ºC aufbewahrt werden, kann eine verlässliche Anzeige der Anwesenheit von Mikroorganismen erst gemessen werden, wenn die minimale CO&sub2;-Konzentration vorbei ist, typischerweise innerhalb der ersten 2 bis 4 Stunden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Der Apparat und die Vorrichtung der Erfindung stellen ein nicht-invasives Mittel zum Nachweis der Anwesenheit von Mikroorganismen in klinischen Proben, wie Blutproben oder andere Körperflüssigkeiten, durch Messung der Zunahme von durch Mikroorganismen gebildeten Stoffwechselprodukten zur Verfügung. Die Probe wird einem speziell zusammengesetzten Medium zugegeben, das die Bildung gewisser mikrobieller Stoffwechselprodukte verstärkt, die durch einen einzigartigen, wegwerfbaren, am Boden der Kulturflasche befindlichen Sensor nachgewiesen werden. Der Sensor umfasst eine feste Zusammensetzung oder Membran, auf die wir uns als Befestigungs- oder Trägermittel beziehen, mit einem darauf oder darin immobilisierten Indikatormedium. Der Sensor wird bündig an der inneren Oberfläche eines Behälters befestigt, sodass das Indikatormedium von der Aussenseite sichtbar ist, und luftdicht verschlossen um zu verhindern, dass Zellen, Proteine, andere Festkörper oder andere undurchsichtige oder gefärbte Komponenten zwischen Sensor und Oberfläche des Behälters gelangen. In gewissen Ausführungsformen wird der Sensor von der Probe und ihrem Wachstumsmedium durch eine Membran oder eine feste Schicht getrennt, die den Durchgang von Gasmolekülen erlaubt, den Durchgang von Ionen jedoch verhindert. Mikroorganisinen in Proben von Körperflüssigkeiten wie Blut, die geringe Mengen wie 1 Organismus pro Milliliter enthalten, können unter Verwendung dieser Erfindung nachgewiesen werden. Solche Proben können bis zu 7 Tage Inkubation erfordern, bevor die Organismenpopulation einen kritischen Pegel erreicht, bei dem eine Zunahme von Stoffwechselprodukten gemessen werden kann. Wir fanden, dass eine Konzentration von 10&sup6; KBE/ml bei gewissen Arten von Organismen messbare Änderungen von pH oder CO&sub2; lieferte. Alle Organismen zeigten messbare Resultate bei Konzentrationen von 10&sup6; bis 10&sup8; KBE/ml.
Die Erfindung ist in mehreren Beziehungen einzigartig und vorteilhaft:
1) die mikrobiellen Stoffwechselprodukte werden in der flüssigen Phase der Kulturflasche statt in der Atmosphäre über der Probe gemessen;
2) weil der einzigartige, wegwerfbare Sensor an der inneren Oberfläche der Flasche befestigt ist, können Messungen von ausserhalb der durchsichtigen Wand der Flasche gemacht werden, ohne die Integrität der Flasche zu verletzen;
3) die externen Messungen können durch visuelle Inspektion oder mit einem das Reflektionsvermögen messenden Instrument durchgeführt werden;
4) undurchsichtige oder gefärbte Komponenten in der Probe beeinträchtigen die Fähigkeit des Sensors Änderungen nachzuweisen oder die Messung dieser Änderungen nicht, und
5) eine hohe Konzentration von Indikatormolekülen wird in einem kleinen Volumen, d.h. auf der Membran gehalten, sodass ein Farbwechsel leicht beobachtet werden kann.
Die Nährstoffkomponenten, aus denen ein komplexes mikrobielles Medium besteht, beeinflussen die von Mikroorganismen benutzten Stoffwechselwege. Organische Säuren, Basen und verschiedene Gase werden in von den verfügbaren Nährstoffen abhängigen Verhältnissen gebildet. Diese Produkte unterscheiden sich auch von Art zu Art des Mikroorganismus. Das Vorliegen dieser Produkte im flüssigen Medium kann dessen pH ändern. Die in der Erfindung benutzten Sensoren umfassen pH-empfindliche Indikatoren, die eine messbare Änderung als Reaktion auf eine pH-Änderung in der Umgebung zeigen. In der Ausführungsform, in weicher der pH-Sensor mit einer gasdurchlässigen, Ionenundurchlässigen Membran bedeckt ist, wird das Vorliegen von Gasen, wie CO&sub2; oder Ammoniak, die den pH des Indikators beeinflussen, gemessen. Folglich kann mikrobielles Wachstum entweder durch Änderungen im pH des flüssigen Kulturmediums oder durch Messen von im Medium gelösten, von Mikroorganismen gebildetem Gas nachgewiesen werden. Kohlendioxid ist ein universelles Stoffwechselprodukt, das von allen Organismen gebildet wird, und ist daher das bevorzugte Stoffwechselprodukt zum Nachweis von mikrobiellem Wachstum.
CO&sub2;- und pH-Sensoren teilen sich zwei gemeinsame Komponenten, eine als pH-Indikator verwendbare Molekülart und ein Befestigungs-/Trägermedium. Der pH-Indikator kann entweder kovalent oder nicht-kovalent ans Trägermedium gebunden sein. Alternativ kann der Indikator in einer gasdurchlässigen, polymeren Matrix eingekapselt sein, wie ein in einer polymeren Matrix vor dem Vulkanisieren emulgierter pH-Indikator. Der CO&sub2;- Sensor hat eine dritte Komponente, eine semipermeable Substanz, die die Indikatormembran vollständig von Probe und Wachstumsmedium trennt. Diese Sensoren werden innerhalb eines geeigneten, durchsichtigen Gefässes mit einem geeigneten Klebstoff befestigt.
Eine Anzahl von verschiedenen fluoreszierenden und sichtbaren pH-Indikatoren kann als die aktive Molekülart in pH- oder CO&sub2;-Sensoren verwendet werden. Im allgemeinen sind die einzigen Einschränkungen bezüglich der Auswahl der Indikatoren die Anforderungen, dass sie annehmbare dynamische pH-Bereiche und Wellenlängenänderungen aufweisen, die durch existierende Frontflächen-Fluoreszenz oder Reflektionstechniken leicht nachweisbar sind.
Sensoren zum der Erfindung gemässen Nachweis von pH- Änderungen im Kulturmedium sollten eine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität oder einen sichtbaren Farbwechsel über einen pH-Bereich von ungefähr 5,0 bis etwa 8,0 aufweisen.
Indikatoren für den CO&sub2;-Sensor sollten eine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität oder einen sichtbaren Farbwechsel zwischen etwa pH 10 und ungefähr 6 aufweisen, um Änderungen in der CO&sub2;-Konzentration nachzuweisen.
Nur gewisse pH-Indikatormoleküle können kovalent oder nicht-kovalent an ein Trägermedium gebunden werden und dabei ihre pH-anzeigenden Eigenschaften bewahren. Wir fanden, dass Indikatoren, die zu den Xanthen-, Phenolphthalein- und Phenolsulfonphthaleingruppen gehören, verwendbar sind. Beispiele dafür umfassen Fluorescein, Cumarin, Phenolphthalein, Thymolphthalein, Bromthymolblau, Xylenolblau und α-Naphtholbenzein.
Das Befestigungs-/Trägermedium kann eine Substanz wie Zellulose sein, an das ein pH-Indikator mittels organischen Reaktionen kovalent gebunden werden kann. Nicht-kovalente Bindung von pH-Indikatoren kann durch Verwenden von ionischen Trägermaterialien wie Nylonmembranen erreicht werden, die ein positives oder negatives Zeta-Potential aufweisen. Andere ionische Trägermaterialien, die benutzt werden können, sind positiv oder negativ geladene ionische Harze wie Diethylaminoethylharz (DEAE) oder DEAE-Zellulose. Vorbehandlung des Trägermaterials mit einem Protein kann erforderlich sein, wenn die Indikatormembran in direktem Kontakt mit dem mikrobiellen Wachstumsmedium stehen soll.
Die pH-Indikator-Sensoren steilen direkt pH-Änderungen fest, die auf die pH-Umgebung in dem mikrobiellen Wachstumsmedium zurückzuführen sind. Diese Sensoren können jedoch veranlasst werden, selektiv auf Gase (z.B. Kohlendioxid, Ammoniak) im flüssigen Wachstumsmedium zu reagieren, indem sie mit einer selektiv semipermeablen Zusammensetzung oder Membran bedeckt werden, wie Silikon, Latex, Teflon oder verschiedene Plastikmaterialien, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Fähigkeit haben, die Diffusion eines Gases selektiv zu erlauben, während der Durchgang von Ionen verhindert wird. Für Sensoren, die einen in einer polymeren Matrix eingekapselten Indikator umfassen, kann das die Matrix bildende Polymer als semipermeable Barriere dienen, die den Durchgang von Gasen aber nicht von Ionen erlaubt.
In der Ausführungsform mit dem eingekapselten Indikator besteht der CO&sub2;-Sensor aus vier Komponenten. Die erste Komponente ist ein sichtbarer oder fluoreszierender pH-Indikator, der im pH-Bereich zwischen 6 und 10 reaktiv ist. Beispiele von Indikatoren, die diese Kriterien erfüllen, sind Bromthymolblau, Xylenolblau, Phenolphthalein, Cumarin und Fluorescein. Die zweite Komponente ist Natriumhydroxid oder eine gleichwertige Base, die eine optimale pH-Umgebung zum Nachweis von CO&sub2; durch den ausgewählten Indikator aufrecht erhält. Die dritte Komponente ist Glycerin oder ein gleichwertiger Emulgator, der Mizellen von der Indikatorlösung bilden kann, die im unvulkanisierten Polymer emulgiert ist. Die vierte Komponente ist das unvulkanisierte Polymer, wie z.B. bei Raumtemperatur vulkanisierendes (RTV) weisses Silikon, das eine passende Umgebung für den Indikator aufrechterhält. Jedes Polymer, das die chemische Aktivität des Indikators weder durch seine eigenen chemischen oder physikalischen Eigenschaften noch durch seine Anforderungen ans Vulkanisieren beeinflusst, kann verwendet werden, solange es für Gase aber nicht für Ionen durchlässig ist und diese Eigenschaften bei der Sterilisierung durch Autoklavieren nicht verändert werden. Andere Silikonpolymere, die ebenfalls zufriedenstellend sind, sind diejenigen, die durch hohe Temperatur, katalytische Aktivität oder durch ultraviolette Vulkanisierung vulkanisiert werden. Eine Emulsion aus den vier Komponenten wird hergestellt, und das Polymer wird vulkanisiert, sodass es um die pH-Indikatormizellen eine semipermable Matrix bildet, welche die selektive Diffusion von CO&sub2; und anderen Gasen aus dem mikrobiellen Wachstumsmedium erlaubt, was zu einer messbaren Änderung im Indikator führt. Der Sensor kann separat, z.B. in einer Gussform, hergestellt, vulkanisiert und mit einem geeigneten Klebstoff, z.B. Silikonklebstoff, an der Kulturflasche befestigt werden. Alternativ und bevorzugterweise wird der Sensor auf dem Boden der Flasche gebildet und in situ vulkanisiert. Nach dem Vulkanisieren wird die Flasche mit dem Sensor sterilisiert, z.B. durch Autoklavieren.
Die folgenden einzelnen Beispiele für pH- und CO&sub2;-Sensoren dienen zur Illustration der Erfindung aber nicht zur Eingrenzung ihres beanspruchten Geltungsbereichs.

Beispiel 1. Herstellung eines fluoreszierenden pH-Sensors

Dialysierschlauch aus Zellulose (Spectrapor, 12.000-14.000 molekulares Ausschlussgewicht, 0,001 Zoll Stärke im Trockenzustand) wurde mit einem Locher in Scheiben mit 5/16 Zoll Durchmesser geschnitten. Die Zellulosescheiben (1,2 Gramm davon) wurden in destilliertem Wasser während 30 Minuten eingeweicht, abgetropft und danach in trockenem Isopropanol (12 ml) 10 Minuten eingeweicht. Die Membranen wurden abgetropft und in einer 100-ml-Rundbodenflasche mit einem Rührstäbchen plaziert. Trockenes Isopropanol (50 ml) und Triethylamin (5 ml) wurden in die Flasche gegeben, und danach wurden 75 mg FITC (Fluoresceinisothiocyanat) im Gemisch aufgelöst. Dieses Gemisch wurde unter Rückfluss während fünf Stunden vorsichtig gerührt.
Die Zellulosemembranen wurden abgekühlt, abgetropft und danach zehnmal mit je 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gesättigten Zellulosemembranen wurden mit einem Silikonklebstoff (GE 2501 Silicone Sealant, clear) auf dem Boden einer geeigneten Glasflasche befestigt. Nach dem Vulkanisieren wurde Wachstumsmedium zugegeben und die verschlossene Flasche wurde durch Autoklavieren 15 Minuten bei 121º C und 15 psi sterilisiert.

Beispiel 2. Herstellung von pH-Sensoren mit nicht- fluoreszierenden Indikator

Modifizierte Nylonmembranen mit positivem Zeta-Potential (Zeta-Probe, Biorad) wurden in einer 3% Lösung aus tryptischem Sojabouillon plaziert und während einer Stunde bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln auf einem rotierenden Schüttler eingeweicht. Überschüsse der tryptischen Sojabouillon wurden mit entionisiertem Wasser ausgiebig von den Nylonmembranen abgewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden in einer 0,0001 bis 0,1% Lösung des pH-Indikators (Bromthymoiblau) in 0,1 N NaOH eingelegt. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur während einer Stunde unter sanftem Schütteln reagieren gelassen. Überschüssige Indikatorlösung wurde von den Membranen durch ausgiebiges Waschen mit entionisiertem Wasser, bis kein Indikator mehr abgewaschen zu werden schien, entfernt. Die pH- Indikatormembranen wurden während 24 Stunden an der Luft getrocknet und 11/16-Zoll grosse Scheiben wurden aus den Membranen ausgestanzt.
Die pH-Indikatormembranen wurden mit einem Silikonklebstoff (GE 2501 Silicone Sealant, clear) am Boden von Glasgefässen befestigt. Diese Flaschen wurden mit mikrobiellen Wachstumsmedium gefüllt und durch Autoklavieren sterilisiert.

Beispiel 3. Herstellung von CO&sub2;-Sensoren mit nicht- fluoreszierendem Indikator

Modifizierte Nylonmembranen mit positivem Zeta-Potential (Zeta Probe, Biorad) wurden in Indikatoriösung, die in 0,1 N NaOH gelöstes 0,001 bis 0,1% Xylenolblau und 0,0001 bis 0,1% Bromthymolblau umfasste, plaziert. Die Membranen wurden während einer Stunde unter leichtem Schütteln reagieren gelassen. Nach der Reaktion mit der Indikatorlösung wurden die Membranen mit entionisiertem Wasser ausgiebig gespült, um überschüssigen Indikator zu entfernen. Die Indikatormembranen wurden während 24 Stunden luftgetrocknet und Scheiben von 11/16 Zoll Durchmesser wurden aus den Membranen ausgestanzt. Die Indikatormembranen wurden dann mit Silikonklebstoff (GE Silicone Sealant II, klar) auf der inneren Bodenfläche von klaren Glasflaschen befestigt und eine zweite Schicht von Silikonklebstoff wurde oben auf der Indikatormembran angebracht, um die Nylonindikatormembran vollständig abzudichten.
Diese Flaschen wurden mit mikrobiellem Wachstumsmedium gefüllt und durch Autoklavieren sterilisiert.

Kulturmedium-Zusammensetzungen

Das Medium für den mikrobiellen Nachweis durch eine pH- Änderung umfasst 3% tryptisches Sojabouillon (DIFCO), 0,5% Proteose-Pepton (DIFCO) #3, 1,25% D-Glukose und 1% L-Arginin. Weitere Komponenten sind reduzierende Agentien (0,01% L- Cystein) und ein Antikoagulans (0,05% SPS Natriumpolysulphonat). Dieses Medium hat eine niedrige Pufferkapazität, sodass alle den pH beeinflussenden Stoffwechselprodukte leicht den pH des Mediums ändern können. Glukose ist ein fermentierbares Kohlenhydrat, das, wenn es von Mikroorganismen verstoffwechselt wird, zur Bildung von organischen Säuren führt, die eine Senkung des pH verursachen. Arginin wird als Substrat für diejenigen nicht-fermentierenden Mikroorganismen (d.h. Pseudomonas aeruginosa) zugefügt, die Glukose normalerweise nicht verstoffwechseln. Die Zugabe von Arginin führt zur Freisetzung von basischen Stoffwechselprodukten, die einen Anstieg des pH im Medium verursachen. Wenn CO&sub2;-Bildung durch Pseudomonas aeruginosa gemessen werden soll, wird Arginin nicht zugegeben. Andere Kohlenhydrate oder Aminosäuren können ins Medium integriert werden, um eine pH-Änderung hervorzurufen, wenn sie durch andere Arten von Mikroorganismen verstoffwechselt werden.
Gerät zum automatischen Nachweis mikrobieller Verunreinigung Sowohl durch mikrobielles Wachstum verursachte pH-Änderung als auch CO&sub2;-Bildung können unter Verwendung des unten beschriebenen Instruments festgestellt und gemessen werden.
Die von diesem Instrument überwachten Sensoren umfassen Indikatoren, welche die Farbe ändern, wenn wachsende oder Mikroben mit aktivem Stoffwechsel vorhanden sind. Obwohl die Farbwechsel vom unbewaffneten Auge wahrgenommen werden können, verschafft die Benutzung des Instruments die Vorteile von Objektivität, Empfindlichkeit und Kontinuität der Messungen. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Instrument im wesentlichen ein Reflektometer für sichtbares Licht, das den Farbwechsei des Sensors überwacht. Um die kontinuierliche Überwachung aller Proben zu erlauben, ist die Benutzung eines Detektors für jede einzelne Probe zu bevorzugen. Andere Möglichkeiten, wie die Verwendung von konventionellen Mitteln um Probebehälter an einem oder mehreren stationären Detektoren vorbeizuführen oder einen oder mehrere Detektoren an stationären Proben vorbeizubewegen, sind für den Fachmann offensichtlich.
In der bevorzugten Ausführungsform werden Feststadium- Beleuchtungskörper und Detektoren verwendet. Glüh- und Bogenlampen können ebenfalls als Lichtquellen in Verbindung mit Spiegeln, Linsen, Glasfasern und anderen Mitteln verwendet werden, die Licht zum Sensor leiten.
Die verschiedenen in Tabelle 1 aufgeführten Mikroorganismen wurden unter Verwendung der Erfindung nachgewiesen. Diese Resultate zeigen, dass diese, alle weiteren Organismen desselben Typs und alle Organismen, die nachweisbare Gase oder andere den pH des flüssigen Mediums beeinflussende Produkte bilden, unter Verwendung der Erfindung nachgewiesen werden können.

Beispiel 4. Herstellung eines Sensors mit eingekapseltem Indikator

Stammlösungen von 0,1 - 1,0% Phenolphthalein, Xylenolblau oder Bromthymolblau in 25 - 75% Glyzerin, das 0,0005 - 0,5 N NaOH enthielt, wurden hergestellt. 0,1 - 0,5 ml der Indikator- NAOH-Glyzerin-Stammlösung wurden zu 1,0 Gramm nicht- vulkanisiertem RTV-weissem Silikon (GE Silicone II, weiss) gegeben und gemischt bis eine feine Emulsion entstand. Die Silikon-Indikatoremuision wurde in einen Spritzendispenser gegeben und in 0,1 - 0,2 ml grossen Portionen gleichmässig auf den Boden des Glasgefässes verteilt. Der Indikator- Silikonemulsion-Sensor wurde bei Raumtemperatur bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von weniger als 50% während mindestens 24 Stunden vulkanisiert. Nach dem Vulkanisieren wurden die Gefässe mit den CO&sub2;-Sensoren mit mikrobiellem Wachstumsmedium gefüllt und durch Autoklavieren sterilisiert. Tabelle 1 Enterobacteriaceae Escherichia coli Staphylococcus spp. Koagulase-negativer Staphylococcus S. aureus Streptococcus spp. S. pneumoniae Gruppe Enterokokken Hefen Candida albicans Cryptococcus neoformans Torulopsis glabrata Nichtfermenter Pseudonionas aeruginosa Acinetobacter calcoaceticus Anaerobier Bacteroides fragilis Clostridium perfringens Fusobacterium necrophorum Peptostreptococcus anaerobius Andere Mikroorganismen Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

Claims

1. Vorrichtung zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe, die einen verschliessbaren, sterilisierbaren Probebehälter mit einer internen Kammer umfasst, in der eine Probe mit einem sterilen Kulturmedium zum Nachweis mikrobieller Verunreinigung kultiviert werden kann, und die mindestens eine durchsichtige Sektion in der Wand des genannten Behälters, und eine in der Region der durchsichtigen Sektion an die innere Oberfläche der Wand des genannten Behälters angebrachte Sensorvorrichtung besitzt, bei Änderungen in der Erscheinungsform der Sensorvorrichtung von ausserhalb des genannten Behälters durch die genannte durchsichtige Sektion festgestellt werden können, besagte Sensorvorrichtung umfasst ein immobilisiertes Indikatormedium, wobei das Indikatormedium nach seiner Fähigkeit, eine wahrnehmbare Änderung zu zeigen, wenn es den Produkten der Stoffwechselaktivität eines Organismus ausgesetzt wird, ausgewählt wird, genanntes Indikatormedium wird durch Binden des Indikators an ein Trägermedium oder Einkapseln des Indikators in eine polymere Matrix immobilisiert.

2. Vorrichtung von Anspruch 1, worin das Indikatormedium eine auf pH reagierende Molekülart ist.

3. Vorrichtung von Anspruch 1, worin die Sensorvorrichtung eine geladene Membran umfasst.

4. Vorrichtung von Anspruch 1, worin die Membran der Sensorvorrichtung an die innere Oberfläche des genannten Behälters gebunden ist.

5. Vorrichtung von Anspruch 4, worin die Membran der Sensorvorrichtung mindestens peripher an die innere Oberfläche des Behälters gebunden ist, wobei weder die Probe noch das Kulturmedium zwischen die Membran und die Oberfläche des Behälters gelangen können.

6. Vorrichtung von Anspruch 1, worin die Sensorvorrichtung der Probe in genannten Behälter durch eine semipermeable Membran getrennt ist.

7. Vorrichtung von Anspruch 6, worin die sempipermeable Membran eine in situ gebildete Membran umfasst.

8. Vorrichtung von Anspruch 1, worin die Sensorvorrichtung innerhalb einer polymeren Matrix immobilisierte Mizellen des Indikatormediums umfasst.

9. Vorrichtung von Anspruch 8, worin die Mizellen des Indikatormediums in der polymeren Matrix durch das Verfahren der Emulgation einer Indikatorlösung in einem nichtvulkanisierten Polymer und Vulkanisieren des Polymers gebildet ist.

10. Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe, das die Schritte umfasst:

Einführen der Probe unter sterilen Bedingungen in einen sterilen Probebehälter, wobei der Probebehälter wenigstens eine durchsichtige Sektion in der Wand und eine Sensorvorrichtung besitzt, die ein Indikatormedium enthält, das eine messbare Änderung zeigt, wenn es gasförmigen Produkten der Stoffwechselaktivität eines Organismus ausgesetzt wird, welche an der inneren Oberfläche der Wand des Behälters in dem Bereich der durchsichtigen Sektion befestigt ist,

Inkubieren der Probe in dem Probebehälter mit einem mikrobiellen Wachstumsmedium, wobei der Probebehälter so ausgerichtet ist, dass die Sensorvorrichtung vollständig in der Probe und dem Wachstumsmedium untergetaucht ist, und

Überwachen der Bildung von gasförmigen Produkten der Stoffwechselaktivität eines Organismus von ausserhalb des Behälters durch dessen durchsichtige Sektion, ohne die Integrität des Behälters zu verletzen, durch den Nachweis von Änderungen im Indikatormedium in der Sensorvorrichtung durch gasförmige Produkte, die von der Probe und dem Wachstumsmedium zur Sensorvorrichtung dringen.