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CN105462824B - 在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进 - Google Patents

在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进 Download PDF

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CN105462824B CN201410227620.9A CN201410227620A CN105462824B CN 105462824 B CN105462824 B CN 105462824B CN 201410227620 A CN201410227620 A CN 201410227620A CN 105462824 B CN105462824 B CN 105462824B
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Abstract

在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进。指出在液体食物产品中是否存在微生物的系统。该系统具有一瓶子，用于容纳待被检测的样本。该瓶子具有一传感器，该传感器将监控和检测至少一个样本参数中的变化，但是该瓶子不存在包含支持微生物生长的营养的添加物。该瓶子被放入孵化器中，且该瓶子中的传感器被监控是否发生变化。孵化器被编程，从而，如果传感器检测到监控的参数的值到达特定值，那么样本对于微生物生长被确认为呈阳性。

Description

在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进
技术领域
本发明涉及在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进。
背景技术
由食物传播的疾病是广泛关注的问题。多数发达国家具有适当的政策和程序保证可靠安全的食物供应，以避免会引起由食物传播的疾病的由病原体造成的污染。
许多国家都已经开出了测试和协议以检查食物是否被污染，以保证被污染的食物不会进入食物供应中。这种协议的一个例子是中华人民共和国国家食品安全标准。在美国监控食物供应的病原体的检测和标准是由美国农业部公布并实施的。
这些检测的目标是使不安全或可能不安全的食物远离消费者。然而，像任何这样的检测一样，检测的完善性对确定食物对于食用是可能不安全的并使它们远离消费者而没有对病原体或污染的样本检测误判是至关重要的。伪阳性会对社会造成经济负担，对于供应商和消费者都一样。所以任何检查食物的方法、系统或设备在对会引起现实的公众健康危机的食物进行检查时都必须精确。
中国检查标准的协议如图1所示。基本上，当静止于其被包装的容器中时，样本100(例如，如牛奶)被检查(120)以在容器完整性上标记容器损坏或裂口。如果容器被确定为是可靠的，容器在步骤140被放入孵化器中。在约35℃下容器被存储在孵化器中10天。在这段时间之后，容器被直观地检查任何指示微生物的存在的膨胀或扩张的迹象。如果容器具有在孵化过程中在容器中有微生物生长的特征，该容器在样本被打开并检查之前被放入冷藏室中冷却。这确保了被污染的样本在容器被打开时不会被抽出容器。参照样本也被放入冷藏室中作为经过孵化的样本的调节。当经过孵化的样本的内容物的PH值被测量时，与经过冷却的样本的内容物的PH值进行对比。0.5或更大的PH值差值表示在经过孵化的样本中有微生物生长。
在孵化(且在适当的时候进行冷却)的基础上，表现出微生物生长的物理特征的容器被打开(150)。一部分内容物被移出(160)且被放入无菌容器中。留下的样本被移植到培养基上，且样本被培养以确认这些微生物是微生物污染的来源。
当容器被打开时，内容物的PH值被测量，且样本的有特殊感觉的特性(例如，由感官感觉到的特性如味道、颜色等)被检查(170)。然后准备对该样本进行显微镜检查(180)。显微镜检查是为了确认微生物污染的来源并确定微生物是否是致病的。在检查后会发出报告。该报告指出样本是可接受的(即，商业无菌的)或是不可接受的(非商业无菌的)。
由于长时间等待样本的孵化，图1所述的方法很费时。已经作出努力以加速这种样本的检查，使用了自动化的系统来检测样本中的微生物生长。Zheng,J.等人的“study onrapid detect commercial sterilization of fungus(i.e.mushroom)cans with BacT/ALERT3D system”，Food Science and Technology第9期，第196-199页(2007年)公开了利用BacT/ALERT3D系统使用3天时间进行检测。在BacT/ALERT中，样本被放入具有培养基的瓶中。该瓶还具有CO2传感器。该传感器检测样本中的二氧化碳的存在。如果系统检测到采样瓶的二氧化碳成分的增加在孵化过程中超出了一定值，该系统将该样本标记为对微生物生长是阳性的。对于这种研究，使用了两种包含培养基的瓶子。一个(i AST瓶)包含用于需氧细菌检测的培养基，而另一个(i NST瓶)包含用于厌氧细菌检测的培养基。这些瓶子(包含培养基的)被加入了低水平的不同种的细菌和10ml的产品(蘑菇罐头中的溶液)。使用BacT/ALERT获得结果的时间被列在表1中，且在16小时至30小时的范围内被记录。还被记录的是使用45个包含蘑菇的罐头的未被注入的样本试验。从BacT/ALERT得到的结果与利用中国协议检查得到的结果进行比较，此处中国协议指的是标准测试协议。BacT/ALERT在45个样本中确认了一个阳性样本，且该污染使用标准测试协议进行了验证。
Zheng,J.等人的“Application of BacT/Alert3D system in detection ofCommercial Sterilization of Konjac Cans”，NEED TO INSERT NAME OF JOURNAL,第29卷，第10期，第463-467页(2008年)描述了以BacT/Alert3D检测Konjac罐头。59个罐头的样本(未被强化)被检测。结果与使用标准测试进行检测的结果进行对比。在这个检测中，使用三个容器。从一个容器中，10ml的样本被加入了每个BacT/Alert瓶中。特别地，10ml样本被加入i. AST和i.NST瓶的每一个中。第二个容器被标准测试协议分析，而第三个容器保持室温以备用于随后的检测中。对于使用标准检测协议检测的罐头，没有罐头的质量控制是失败的。然而，以BacT/Alert检测的样本中的19个被报告为在一个或两个瓶子中对微生物生长呈阳性。当与参照(使用标准检测进行检测的)相对比时，这些阳性结果被认为是伪阳性。在这19个BacT/Alert阳性样本中，其中三个是确定不含微生物的。为了确定是否存在微生物，从阳性瓶子中取出的样本被接种到五个不同的标准培养基上以检测是否存在微生物生长。同时，从阳性瓶子中取出的样本也在显微镜下被检查，作为微生物生长的证据。从这些内容，由于对于这些样本中的所有的三个，没有从被接种的培养基或被使用显微镜检查的样本中找到微生物生长的迹象，可以确定三个阳性样本是伪阳性样本。从其它16个通过使用BacT/Alert检测而被确认为阳性的瓶子中分离出了不同的细菌。根据这篇论文，Konjac罐头很可能包含一些活的微生物，但是由于高PH值环境(10-12.5)，那些微生物不会在Konjac罐头中生长。从而，在这些罐头中，无论出现哪种微生物都不是致病的，不会使得内容物对于食用是不安全的，且会通过由中国政府建立的标准检测协议。然而，一旦样本在包含培养基的瓶子中被稀释以用于BacT/Alert检测，微生物能够生长且引起BacT/Alert装置报告阳性结果。
Dong,R.等人在黑龙江省CDC，中国初级保健(Chinese Primary Health Care)第23卷，第12期(2009年12月)上描述了将BacT/Alert用于评估牛奶的无菌性。在这项研究中，一种超高温度(UHT)牛奶被以两种细菌菌株(E.coli和B.cereus)强化。由于这两种细菌菌株在有氧环境下生长，仅评估了AST瓶。该检测证明了较大提及的样本更为灵敏，但是由于没有将利用BacT/Alert得到的结果与标准检测协议的结果进行比较，没有陈述伪阳性的结果。
因而，能较少测试时间但又能在伪阳性或伪阴性的数量的方面顺利地与标准检测协议相比较的测试食物的病原体的替代的方法和系统还是持续被探寻中。
发明内容
本发明提出用于检测液体食物污染的系统。该系统使用一样本容器，该容器适合被用于孵化器中，该孵化器监控置于容器中的样本以证明微生物的生长。在这方面，一传感器被置于容器中。该传感器在样本在孵化器中被加热时监控样本的至少一个参数。该参数是样本的一个条件，该条件在样本被孵化的过程中发生微生物生长时会发生变化。在这方面，该传感器会对样本参数中的变化提供相应，该样本参数响应于微生物的代谢活动而变化。这种参数包括样本中的氧气浓度、样本中的二氧化碳浓度、或样本的PH值。
当监控传感器时，如果该参数的测量值超出预定值时，该系统将瓶子标记为对微生物的存在为阳性。该传感器被置于容器中，从而，当样本被引入容器中时，传感器与样本接触。该系统被规划了预定阈值，该阈值为与微生物生长相关的监控参数的阈值。在这方面，如果测得的参数是由微生物的代谢活动产生的(例如，CO2)，测得的参数会增加。由此得出结论，如果测量参数值被微生物代谢活动消耗(例如，O2)，则该参数会降低。
该系统在孵化器中具有容器用于接收样本容器。该样本容器被放置成使得系统检测器能在样本在孵化器中孵化的过程中监控传感器。该样本容器是为了向其中引入样本而不含包括供微生物生长的营养的添加物而提出的。
本发明还描述了检测液体食物的微生物污染的方法。在该方法中，从被检查的商业包装的样本中抽出检测样本。该检测样本被引入无菌容器中，该容器中具有监控与微生物生长相关的参数的传感器。样本以液体形式被引入容器中。然而，样本可以是液体样本(例如牛奶) 或盐水或液体包裹有其他固体样本，或为了检测而被溶解的固体样本。此处该样本指的是液体样本，该被检测的样本在环境和检测温度下是液体。
该传感器被放置在容器中，从而在随后的孵化过程中会接触到检测样本。该容器中不具有支持微生物生长的营养。该样本接着在从约30℃到38℃的温度下被孵化，同时监控传感器的由传感器监控的参数的变化。如果传感器的读数是与微生物生长相关的预定值，样本被标记为微生物生长为阳性的样本。
附图说明
结合附图进行阅读，本发明的这些和其他目的、优点以及新颖的特点将从下述的详细描述中变得更加显而易见，其中：
图1是标准测试协议的流程图；
图2是采用根据本发明的一实施例的多路孵化和测量仪的系统的框图，其每个都利用光热光谱来监控采样瓶中的气体，例如，氧气或二氧化碳的浓度，从而检测采样瓶中的微生物的生长；
图3是图1所示的系统中所用的仪器的详细视图；
图4是图3中的仪器的剖面顶视图；和
图5是为用于此处描述的系统和方法中而配置的BACTEC瓶。
优选实施例的详细描述
图2示出了根据本发明的实施例的用于检测样本培养中的微生物的生长的系统100。如图所示，系统100包括与中央计算机104相连的多个孵化和测量模块102。中央计算机104 可控制孵化温度和时间，以及由模块102完成的测量的时间设置，且能对由模块102获得的数据读取的搜集和分类。系统100还可包括数据输出设备，例如打印机106，其可被中央计算机104控制以打印由孵化和测量模块102获得的数据读取。
这种系统的例子是本领域技术人员所熟知的，因而此处不再赘述。这种系统的一个例子是BD BACTECTM FX40，其可从Becton Dickinson购得。BD BACTECTM FX40的操作在文件号为8090414以及产品目录号为441980的BD BACTECTM FX40的仪器用户手册中进行了描述，该手册在此处以引用的方式被合并。BD BACTECTM FX40和其他类似仪器(例如，LansingMichigan的Neogen Corporation的SolerisR)的操作是本领域技术人员所公知的，因而此处不再赘述。
图3和4示出了孵化和测量模块102的更多细节。如图所示，本实施例中的每个孵化和测量模块102包括外壳108和能沿箭头A的方向滑入和滑出外壳108的两个搁板110。每个搁板110都包括多个开口112，每个开口都适于容纳一个采样瓶114。开口112被设置于如图所示的多个行和列中，且每个搁板110都可具有任意实际数目的开口。例如，开口112可被设置成9行，每行具有9列，从而每个搁板110上具有共81个开口112。
当样本待被孵化和测量模块102分析时，样本被放置于采样瓶114中，而采样瓶114被加载入孵化和测量模块102中的相应开口112中。在本实施例中采样瓶114是密闭的采样瓶。孵化和测量模块102还可包括键盘、条形码阅读器、或任何其他适合的接口，其使实验员能将关于样本的信息输入存储于存储器中的数据库里，存储器可被置于孵化和测量模块102、中央计算机104中，或同时置于两者中。所述信息可包括，例如，患者信息、样本类型、被加载入采样瓶114的开口112的行和列，等等。
每个孵化和测量模块102还包括一可移动的监控装置116，其适于通过监控置于采样瓶 114中的传感器210发出的信号来监控采样瓶114中的培养基的内容。参见图5。这种传感器在孵化过程中监控采样瓶114中的参数。这种样本包括氧气含量水平、二氧化碳含量水平、 PH值等。传感器将检测这种条件下随时间产生的变化。这种传感器是本领域技术人员所熟知的，因而此处不再赘述。配置孵化器，从而当被监控的参数的值超过特定阈值时，系统对于微生物的生长将瓶子(及其内容)标记为负。
如上所述，保证食品供应没有被病原体污染是很重要的。根据世界卫生组织(WHO/FAO)，食品供应的目标是商业无菌。这被定义为“没有适合在常规的非冷藏条件下在食品中生长的微生物，在该条件下食品可能在生产、分配和存储过程中被保持(held)”。
由中华人民共和国食品安全标准推荐的商业无菌标准测试协议(GB4789.26-2013)是在 36℃+/-1℃下将包装食品孵化10天，寻找涨袋，然后将所有的包装打开进行PH值测试、目测和显微镜检查。
尽管每次手工测试的成本相对较低，手工标准是费时且艰苦的过程。大容量孵化器(用于容纳各种各样的大体积包装的食品)的需求明显增加了食品制造商和检测食品的那些机构的成本。在此处描述的实施例中，用于检测血培养中微生物的生长的现有的仪器已经被适应性地改编并改造以监控食品是否存在微生物。这种仪器，例如，BD BACTECTMFX40，在此处描述的方法中的使用提供了一种方法和系统，该方法和系统在控制伪阳性和伪阴性的数量时提供了更快的获得结果的时间。从而，此处描述的该系统和方法提供了更快的时间获得结果，而不增加比现有的方法明显增加的伪阳性或伪阴性的数量。
在此处描述的方法中，食品样本(例如牛奶)被放入被配置为用于该系统的采样瓶中，该系统为微生物的生长而监控血培养。采样瓶114具有放置于其内部的传感器210，优选将该传感器放置在当样本被放入该瓶中时能接触到样本的位置处。该瓶114是无菌的，且空气实质上被完全从其中排空。
该瓶的容量约为50ml。该瓶的尺寸可以改变，从而瓶的容量也可以改变。然而，瓶子必须具有适当的容量以容纳能确保样本具有足够的灵敏度。在这一点上，如果该瓶只能容纳极少的样本，该样本在采样部分中的污染物(如果有的话)方面的样本内容可能不具代表性。例如，如果容器的尺寸是一加仑，而用于检测的样本体积仅为10ml，真有可能存在样本部分可能不包含微生物甚至它们是存在于容器中的可能性。对于此处描述的方法和设备，最小的样本尺寸应该是不少于10ml，且优选不少于50ml。
该瓶优选处于一定程度的真空下，从而该样本易于被引入采样容器中。用于将液体样本引入容器中的设备是公知的，因而在此处不再赘述。
典型的传感器是CO2传感器。合适的传感器的示例在Gentle等的US专利No.5,998,517中被描述，该专利在此处以引用的方式被合并。该传感器，例如硅传感器，被置于凝胶基质中。该传感器在孵化过程中被访问以监控样本中的二氧化碳含量水平的变化。当瓶中的二氧化碳含量水平超过预定的阈值时，该瓶被标记为包含被检测为其中对微生物的存在为阳性的样品。
其中分配有样本的采样瓶114不包含任何促进微生物生长的营养培养基。对于这种应用，重要的是保持样本完整并保证用于微生物生长的营养来自样本本身而不是来自添加到样本中的。如下面的例子所示，当营养培养基是存在于容器中时，伪阳性的数量惊人地增加，在该容器中样本被处理、孵化和监控是否存在微生物的生长。
使用UHT牛奶作为食物样本的一个例子，准备好不存在营养培养基的采样瓶。在一个实施例中，采样瓶是那些被配置成用于BACTEC血培养设备的采样瓶。UHT牛奶样本(50ml)是从三种不同的包装箱获得的。这些样本被掺入微生物(B.cereus,B.licheniform,C.perfringens,S.aureus；P.aeruginosa；L.fermentus)。为了对照，10ml的相同标准的UHT牛奶样本也被加入包含细胞溶素/厌氧(Lytic/Anaerobic)培养基的BACTEC瓶。所有的BACTEC瓶被放入FX200或BACTEC9240用于检测。
采用上述标准的测试协议测试加入了相同浓度的微生物的UHT牛奶样本。当使用标准的测试协议时，使用加入了50ml牛奶样本的空的BACTEC瓶的结果显示出了与获得的结果较好的关联性。尽管申请人并不期望有特定理论的支持，申请人相信，与在有培养基的瓶中的样本相比，在没有培养基的瓶中测试的样本具有的较低的伪阴性率是由于较大的样本尺寸 (50ml对10ml)和/或产生了错误结果的培养基的选择。对具有低浓度的微生物的样本来说，较大的样本尺寸更敏感。
当使用上述标准测试协议测试包装盒时，还观测到特定的细菌(例如C型产气荚膜杆菌) 在两种牛奶包装盒中不会生长。当在不具有使用BACTEC的培养基的瓶中测试50ml样本时，进行相同的观测。从而，此处描述的方法产生了与已建立的测试协议兼容的结果。相反，当向具有细胞溶素/厌氧(Lytic/Anaerobic)培养基的瓶中引入10ml的样本时，那些样本测得阳性的微生物生长。这被解释为是伪阳性。从而，使用不具有培养基的BACTEC瓶的结果的伪阳性率要低于使用具有培养基的采样瓶的结果(使用标准测试协议)。
从3种不同种类的包装盒中获得经使用超高温巴氏灭菌的牛奶(UHT牛奶)：i)预包装 (软塑料)；ii)利乐包(硬塑料)；和利乐砖(硬纸板盒)。这些产品均从中国当地超市购得。
细菌原液溶液被稀释至非常低的浓度，且相同的剂量被注入两个一样的UHT牛奶包装盒中(每个包装盒中注入0.01cfu-0.5cfu/ml)。一个被注入的包装盒被密封并放入36℃的孵化器中(现有技术的参考方法，也被称作标准协议)，而另一个则被用于含有或不含有培养基的 BACTEC瓶的研究。
在参考方法中，包装盒每天都被检查泄露/膨胀，并且如果在包装盒中观测到异常，会立刻打开包装盒以进一步检查。其他看上去正常的包装盒在被打开以进一步检测之前被留在孵化器中约10天。该检测是：i)PH值；ii)气味；iii)检查沉淀或聚合物质；和iv)将该物质涂在TSA和RCM琼脂上并在36℃下孵化后寻找菌落生长(colony growth)。一旦上述参数中的任意一个出现异常，这些样本被确认为被污染的样本。
这些样本中的一部分被放入包含用于BACTEC的标准细胞溶素/厌氧(Lytic/Anaerobic) 培养基的瓶中。这种培养基可以从Becton Dickinson商业获得，因而在此不再赘述。
对于另一组瓶子，培养基被抽出瓶子，就像任何残余气体一样。在那些瓶子中，注入了 50ml的经过强化的(spiked)UHT牛奶。
对于第三组瓶子，5ml生理盐水被加入空的BACTEC瓶，然后该瓶被热压处理。那些瓶子中的气体被注射器抽出以在瓶中生成足够的真空来将样本拉入。然后50ml经过强化的(spiked)牛奶被注入瓶中，且在每次试验中使用两个相同的瓶子。这些瓶子被载入BACTECFX200或BACTEC9240以进行检测。如果在五天的孵化后仍然是阴性的，那么样本被认为是商业无菌的。
相同的经过强化的(spiked)样本包装盒是样本的来源，该样本用于在没有培养基的瓶中研究和用于在有培养基的瓶中研究。每个包装盒包含大于200ml的牛奶，从而存在用于两种研究的足量的样本。注入每个包含细胞溶素/厌氧(Lytic/Anaerobic)培养基的瓶中的经过强化的(spiked)样本的量为10ml。两个相同的瓶子被用于每次试验。对于利用铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)强化(spiked)了的样本，一个包含含氧培养基的瓶子被用于除了其中两个具有厌氧培养基的瓶子以外的情况。如果在孵化5天后样本仍然是阴性的，这些样本被认为是商业无菌的。
表1培养基对于利用铜绿假单胞菌强化了的样本的结果的影响
Figure BDA0000511486080000081
结果显示不是所有的微生物都在所有的培养基中生长。如上所示，铜假绿单胞菌在含氧培养基中生长而不在厌氧培养基中生长。显然，如果使用不具培养基的瓶子，则不必选择微生物会在其中生长的特殊培养基。如果使用不具培养基的瓶子，则不必考虑培养基的选择。从不具培养基的瓶中的样本得到的测试结果与其中生长目标微生物的培养基(含氧培养基) 中的样本的结果完全一样。配置于不具培养基的瓶中的样本的结果与使用标准协议孵化的样本的结果完全一致。
表2利用酵母强化(spiked)了的样本中样本尺寸对结果的影响
Figure BDA0000511486080000091
这种试验示出在含培养基的瓶中且仅使用十毫升(mls)的样本时获得了伪阴性结果。并不是一直都获得伪阴性的结果，从而，将需要至少两个瓶子，瓶子中仅含十毫升样本加上培养基。这两个瓶子有必要标记伪阳性或伪阴性。这种伪阳性或伪阴性将被标记以与其他相同的样本矛盾的结果。当样本尺寸为50ml时，不会产生伪阴性的结果。不含培养基的结果与参考方法匹配(都示出了杂质)，而一半使用了培养基的瓶子(具有10ml的样本尺寸)产生了伪阴性结果。
表3培养基对微生物生长的影响，该微生物不在不含培养基的加入有产气荚膜梭菌 (perfringens)的样本中生长。
Figure BDA0000511486080000101
如使用参考协议得到的结果所示，产气荚膜梭菌不在那两种包装的UHT牛奶中生长[而且不是致病菌且不准备冒险]。然而，使用分配有厌氧培养基的瓶子对这些样本产生阳性结果。这种测试显示不含培养基的瓶中的样本的分析产生与检测协议更好的关联性。这是因为不存在表现出促进微生物生长的培养基。从而，鉴于含培养基的瓶子能促进微生物的生长，该微生物反而不会在样本中生长，本方法和系统将不会产生伪阳性结果。
本说明书中所述的只是本发明的较佳具体实施例，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明的限制。凡本领域技术人员依本发明的构思通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.检测液体食物污染的系统，该系统包括：
样本容器，该容器被配置为用于孵化器，该孵化器监控置于容器中的液体食物样本，所述样本容器包含由液体食物样本组成的样本；
传感器，置于容器中，该传感器被配置为当该液体食物样本在孵化器中被加热时监控选自氧气浓度、二氧化碳浓度和pH的至少一个参数，其中传感器被置于容器中，从而，当样本被引入容器中时，传感器与液体食物样本接触；
其中该系统以氧气浓度、二氧化碳浓度和pH中的至少一个的预定值规划，该预定值表现了微生物在样本中的生长；
其中所述系统具有外壳和滑入和滑出所述外壳的至少一个搁板，每个搁板包括开口，所述开口适于容纳在其中具有液体食物样本的样本容器；和
可移动的监控装置，用于在样本在孵化器中孵化的过程中监控来自传感器的信号；
其中，样本容器仅包含液体食物样本和传感器。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述液体食物样本是牛奶。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述外壳是孵化器，并且所述孵化温度为30摄氏度至38摄氏度。
4.根据权利要求1所述的系统，其中，容器的体积至少10ml。
5.根据权利要求1所述的系统，其中，样本的体积至少10ml。
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