DE68919565T2

DE68919565T2 - Immuntestverfahren unter Verwendung magnetischer Markerteilchen.

Info

Publication number: DE68919565T2
Application number: DE68919565T
Authority: DE
Inventors: Makoto Nakamura; Ryouhei Shimizu; Toyohiro Tamai
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1988-07-20
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2009-07-21
Also published as: US20030049864A1; EP0351857A3; EP0351857B1; EP0351857A2; DE68919565D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunassayverfahren, um ein in einer Probe vorhandenes Antigen oder einen Antikörper durch eine Immunagglutinationsreaktion zu messen.
Ein Partikel-Agglutinationsverfahren ist als ein herkömmliches Verfahren zum Nachweisen eines in einer Probe vorhandenen Antigens oder Antikörpers auf der Basis einer Immunagglutinationsreaktion bekannt. Dieses Verfahren verwendet bestimmte Markerpartikel, welche einen Antikörper oder ein Antigen aufweisen, die auf der Oberfläche jedes Partikels immobilisiert sind und in der Lage sind, spezifisch an eine zu messende Substanz gebunden zu werden. Die Markerpartikel werden mit einer Probe in einem Behälter gemischt, um mit dem zu messenden und in der Probe enthaltenen Antigen oder Antikörper in einer Immunreaktion umgesetzt zu werden, und dann wird ihnen erlaubt, sich auf einer vorbestimmten Wandoberfläche (z.B. einer Bodenoberfläche) des Behälters zu sammeln. Die Markerpartikel, welche sich auf der Wandoberfläche des Behälters gesammelt haben, haben ein unterschiedliches Verteilungsmuster, abhängig davon, ob die Immunreaktion mit der zu messenden Substanz aufgetreten ist oder nicht. Daher kann ein positives oder negatives Ergebnis bezüglich der Gegenwart der zu messenden Substanz aus dem Verteilungsmuster der Markerpartikel bestimmt werden, welche sich auf der Wandoberfläche des Behälters gesammelt haben.
Ein gemischtes Agglutinationsverfahren wurde von Wiener, A.S. und Herman, M.H. als ein anderes herkömmliches Verfahren zum Nachweisen eines in einer Probe vorhandenen Antigens oder Antikörpers berichtet (J. Immunol., 36, 255 (1939)). Dieses Verfahren wurde bis zu einem Ausmaß weiterentwickelt, daß Blutgruppen bestimmt werden können (Coombs, R.R.A. und Bedford, D., Vox Sang., 5, 111 (1955); Coombs, R.R.A. et al., Lacet, i, 461 (1956)). Anwendungen zum Bestimmen der Blutgruppen auf der Basis dieses Verfahrens werden beispielhaft in den U.S.-Patenten Nr. 4,608,246, 4,275,053 und 4,328,183 dargestellt.
U.S.-Patent Nr. 2,770,572 offenbart ein Verfahren zum Fixieren eines Antikörpers, welcher auf einer Oberfläche eines vorgetrockneten festen Körpers mit einem Antigen in einer Probe umgesetzt oder an dieses gebunden werden kann, wodurch die Empfindlichkeit der Bestimmung von Blutgruppen auf der Oberfläche des festen Körpers verbessert wird.
Rosenfield, R.E. et al. berichteten ein Verfahren, in welchem bewirkt wurde, daß ein Erythrozytenantigen mit einem seiner Antikörper auf der Oberfläche eines festen Körpers umgesetzt wurde, indem das Prinzip des gemischten Agglutinationsverfahrens verwendet wurde (Paris, Proc. 15th Gong. Intl. Soc. Blood Transfusion, 27 (1976)).
Gemäß den herkömmlichen Partikel- und gemischten Agglutinationsverfahren werden präzipitierbare Partikel außer den Markerpartikeln, welche in der Probe enthalten sind, präzipitiert und daher wird die Bestimmungsgenauigkeit vermindert. Daher muß, um eine akkurate Bestimmung durchzuführen, ein Waschen oder dergleichen der Probe durchgeführt werden, um die natürlich präzipitierbaren Partikel zu entfernen.
Die meisten der herkömmlichen Partikel- und gemischten Agglutinationsverfahren verwenden eine Technik zum Bewirken einer Immunreaktion in einem vorbestimmten Behälter und Sammeln der Markerpartikel durch natürliche Sedimentation. Es dauert eine lange Zeitperiode, um die Markerpartikel und besonders die nicht umgesetzten Partikel gleichmäßig auf die Bodenoberfläche zu präzipitieren und ein Verteilungsmuster zu bilden. Beispielsweise dauert es ca. vier bis sechs Stunden, um ein Verteilungsmuster eines anti-IgG Cell-Kit" (Warenzeichen), welches von der Olympus Optical Co. Ltd. verkauft wird und verwendet wird, um einen anti-Blutplättchen-Antikörper nachzuweisen, zu bestimmen.
Um auf einfache Weise eine Sedimentationsgeschwindigkeit zu vergrößern, kann die spezifische Schwere (gravity) oder Partikelgröße der Markerpartikel vergrößert werden. Jedoch muß die spezifische Schwere und Partikelgröße der Markerpartikel in dem Bereich ausgewählt werden, welcher ein grobes Sedimentationsmuster der Partikel verhindert. Daher kann durch dieses Verfahren eine große Verminderung der Meßzeit nicht erwartet werden.
U.S.-Patent Nr. 4,297,104 offenbart das folgende Verfahren, welches eine Zentrifugalkraft verwendet, um die Zeit zu verkürzen, welche zur Bildung eines Sedimentationsmusters aus Erythrozyten, welche als Markerpartikel verwendet werden, benötigt wird. Gemäß diesem Verfahren wird ein Antikörper (IgG) sowohl auf der Bodenoberfläche eines Meßbehälters mit einer symmetrischen Achse als auch auf der Oberfläche jedes Erythrozyten, welcher als ein Markerpartikel verwendet wird, immobilisiert. Das Antigen in der Probe wird mit dem Antikörper, welcher auf der Oberfläche jedes Erythrozyten in dem Behälter im voraus immobilisiert wird, umgesetzt und ein anti-IgG-Antikörper gegen den Antikörper, welcher auf der Oberfläche des Erythrozyten und auf der Wandoberfläche des Behälters immobilisiert ist, wird dazu hinzugegeben. Der erste Zentrifugationsvorgang wird durchgeführt, um zu bewirken, daß die Erythrozyten als die Markerpartikel durch das zugegebene anti-IgG an der Wandoberfläche des Behälters haften. Nachdem der erste Zentrifugationsvorgang unterbrochen ist, wird der zweite Zentrifugationsvorgang durchgeführt, um die Erythrozyten, welche nicht mit dem Antigen in der Probe reagiert haben, auf der Bodenoberfläche des Behälters zu sammeln, und dadurch ein Sedimentationsmuster zu bilden.
Das Zentrifugationsverfahren ist sehr wirkungsvoll, um eine Agglutination über eine Immunreaktion und Sedimentation der Markerpartikel zu beschleunigen. Jedoch wirft der Zentrifugationsvorgang die folgenden Probleme auf.
Als erstes ist es schwierig, den Meßbehälter bei einer Reihe von Vorgängen, welche von Probenahmen bis zum Durchführen der Reaktion, Bestimmung, Abfallentsorgung und dergleichen reichen, ruhig zu handhaben. Insbesondere ist es nicht leicht, die Symmetrieachse des Meßbehälters nach einer Richtung der Zentrifugalkraft auszurichten.
Als zweites ist es schwierig, verschiedene Proben (items) zu analysieren. Eine Analyse von verschiedenen Proben macht verschiedene Sedimentationsbedingungen nötig. Es ist sehr schwierig, für entsprechende Proben in demselben Zentrifugationszyklus verschiedene Stärken an Zentrifugalkräften und verschiedene Zentrifugationszeiten festzusetzen. Um eine Mehrzahl von Proben zu analysieren, muß daher für entsprechende Analyseproben eine Mehrzahl von Zentrifugationsvorgängen unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden, oder für die entsprechenden Analyseproben müssen eine Mehrzahl von Zentrifugiermaschinen, welche für die verschiedenen Bedingungen eingestellt sind, verwendet werden.
Als drittes wird, da eine Zentrifugiermaschine in einem automatischen Analyseprozeß verwendet werden muß, die Vorrichtung sperrig.
In der JP 61,128,168 sind Agglutinationstests offenbart, in welchen sowohl magnetische als auch markierte unlösliche Trägerpartikel mit Antikörpern oder Antigenen sensibilisiert werden und ihnen erlaubt wird, mit einer Probe, welche Antigene oder Antikörper enthält, zu reagieren, wodurch die magnetischen Partikel unter dem Einfluß eines Magnetfeldes entfernt werden und die Markierung in den agglutinierten Partikeln für den Nachweis der Antigene oder Antikörper in der Probe quantitativ gemessen wird.
Es ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein über ein Partikel-Agglutinationsverfahren laufendes Immunassayverfahren zu verbessern und insbesondere, die Zeit, welche zum Bestimmen einer Agglutinationsreaktion benötigt wird, ohne Verwendung von Markerpartikeln, welche eine große spezifische Schwere oder eine große Teilchengröße aufweisen, und ohne Verwendung eines Zentrifugationsvorganges, zu verkürzen.
Es ist eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunassayverfahren zur Durchführung von hochpräzisen Messungen einer Probe, welche außer einer zu messenden Substanz eine präzipitierbare Substanz enthält, zur Verfügung zu stellen, ohne durch die präzipitierbare Substanz gestört zu werden.
Die oben beschriebenen Aufgaben werden durch ein Immunassayverfahren, wie in Anspruch 1 beschrieben, und durch eine Vorrichtung, wie in Anspruch 10 beschrieben, gelöst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß eine gegebene Substanz, welche spezifisch an die zu messende Substanz gebunden wird oder mit dieser in Wettbewerb stehen kann, ebenfalls im voraus auf der inneren Oberfläche des vorbestimmten Wandoberflächenbereichs des Meßbehälters immobilisiert wird.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die magnetischen Markerpartikel, welche ein magnetisches Material enthalten, als Marker für die zu messende Substanz verwendet. Eine Sedimentationsgeschwindigkeit der magnetischen Markerpartikel wird durch Verwendung eines geeigneten Magneten vergrößert. Das Sedimentationsmuster der Markerpartikel kann, verglichen mit dem herkömmlichen Partikel- Agglutinationsverfahren, innerhalb einer sehr kurzen Zeitperiode gebildet werden. Daher kann die Zeit, welche zur Bestimmung des Sedimentationsmusters benötigt wird, verkürzt werden.
Da nur die Sedimentation der magnetischen Markerpartikel beschleunigt werden kann, kann zusätzlich das Sedimentationsmuster der magnetischen Markerpartikel gebildet werden, bevor andere präzipitierbare Partikel präzipitieren. Daher kann eine hochempfindliche Messung durchgeführt werden, ohne natürlich präzipitierbare Partikel außer der zu messenden Substanz vorher zu eliminieren.
Diese Erfindung kann vollständiger durch die folgende detaillierte Beschreibung verstanden werden, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, in welchen:
Fig. 1A und 1B eine Draufsicht bzw. eine Seitenansicht sind, welche eine Anordnung von Magneten zeigen, wenn eine Mikroplatte gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als ein Meßbehälter verwendet wird;
Fig. 2A und 2B Ansichten sind, welche ein positives Sedimentationsverteilungsmuster zeigen, welches durch Verwendung von magnetischen Markerpartikeln erhalten wurde, welche spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können;
Fig. 3A und 3B Ansichten sind, welche ein negatives Sedimentationsverteilungsmuster zeigen, welches durch Verwendung von magnetischen Markerpartikeln erhalten wurde, welche spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können;
Fig. 4A eine Ansicht ist, welche ein erstes positives Sedimentationsverteilungsmuster zeigt, welches durch Verwendung von magnetischen Markerpartikeln, die spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können, und eines Meßbehalters, welcher die gegebene Substanz aufweist, die auf der inneren Oberfläche des Behälters immobilisiert ist und spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden kann, erhalten wurde;
Fig. 4B eine Ansicht ist, welche ein zweites positives Sedimentationsverteilungsmuster zeigt, welches durch Verwendung von magnetischen Markerpartikeln, die spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können, und eines Meßbehälters, welcher die gegebene Substanz aufweist, die auf der inneren Oberfläche des Behälters immobilisiert ist und spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden kann, erhalten wurde;
Fig. 4C eine Ansicht ist, welche ein negatives Sedimentationsverteilungsmuster zeigt, welches durch Verwendung von magnetischen Markerpartikeln, die spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können, und eines Meßbehälters, welcher die gegebene Substanz aufweist, die auf der inneren Oberfläche des Behälters immobilisiert ist und spezifisch an die zu inessende Substanz gebunden werden kann, erhalten wurde;
Fig. 5 eine perspektivische Ansicht ist, welche einen Meßbehälter und einen Magneten gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 6 eine Vorrichtung zur Beschleunigung einer Reaktion ist, welche geeignet in der vorliegenden Erfindung verwendet wird; und
Fig. 7 eine andere Vorrichtung zur Beschleunigung einer Reaktion ist, welche geeignet in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
Eine zu messende Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Antigensubstanz, wie z.B. Viren, Bakterien oder verschiedene Proteine, und ein Antikörper gegen die Antigensubstanz sein. Die zu messende Substanz kann eine lösliche oder unlösliche Substanz sein.
Eine Markersubstanz (z.B. ein spezifischer Antikörper oder ein Antigen), welche spezifisch an eine zu messende Substanz gebunden werden oder mit dieser im Wettbewerb stehen kann, wird auf der Oberfläche jedes bekannten magnetischen Partikels, welcher ein magnetisches Material enthält, immobilisiert, um magnetische Markerpartikel herzustellen. Diese magnetischen Markerpartikel können spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden bzw. mit dieser im Wettbewerb stehen. Beispiele der magnetischen Partikel sind "DYNABEAS M-450" (Warenzeichen), erhältlich von der DYNAL Corp., und magnetische Latexkügelchen "Estapor" (Warenzeichen), erhältlich von der RHONE-POULENC Corp. Gelatinepartikel, welche ein magnetisches Material enthalten, wie in dem japanischen Patent Nr. 59-19516 offenbart, können verwendet werden. Zusätzlich können Zellen, wie z.B. Erythrozyten, welche ein inkorporiertes ferromagnetisches Material, wie z.B. ein Eisenpulver, enthalten, ebenfalls verwendet werden. Verschiedene bekannte Verfahren können als ein Verfahren der Immobilisierung des spezifischen Antikörpers oder Antigens auf den Oberflächen dieser magnetischen Partikel verwendet werden.
Die zu messende Probe wird mit den magnetischen Markerpartikeln gemischt und in einer Immunreaktion umgesetzt.
Die Reaktionslösung wird dann in einem vorbestimmten Meßbehälter gelagert. Wahlweise kann die obige Reaktion in diesem Meßbehälter durchgeführt werden. Der Typ des Meßbehälters ist nicht auf einen bestimmten Typ beschränkt. Jedoch hat ein Meßbehälter vorzugsweise eine schräge Wandoberfläche, wie z.B. eine halbkugelförmige oder konische Oberfläche, um die magnetischen Markerpartikel in einem vorbestimmten Bereich zu sammeln, wenn sich die magnetischen Markerpartikel entlang der Wandoberfläche des Behälters in einer vorbestimmten Richtung bewegen. Die schräge Wandoberfläche des Meßbehälters kann eine Seitenoberfläche sein, ist aber vorzugsweise eine Bodenoberfläche. Ein Beispiel des bevorzugten Meßbehälters ist ein Teströhrchen oder eine Mikroplatte, welche z.B. eine halbkugelförmige oder konische Bodenoberfläche aufweisen.
Ein Magnet wird wenigstens in der Nähe des schrägen Wandoberflächenbereichs der äußeren Wandoberfläche des Behälters angeordnet. Wie beispielsweise in den Figuren 1A und 1B gezeigt, werden, wenn eine Mikroplatte 1 als ein Meßbehälter verwendet wird, Magneten 4, welche auf einem Trägerelement 3 angeordnet sind, entsprechend in der Nähe der halbkugelförmigen Bodenoberflächen der Vertiefungen 2 angeordnet. Fig. 1A ist eine Drauf sicht, welche die Mikroplatte zeigt, und Fig. 1B ist eine Seitenansicht, welche die Beziehung zwischen den Magneten 3 und den Vertiefungen 2 zeigt. Die Herstellung der magnetischen Markerpartikel und die Immunreaktion zwischen den magnetischen Markerpartikeln und einer Probe kann in dem Meßbehälter durchgeführt werden. Wenn die Magneten 4 in der Nähe der Bodenoberfläche des Meßbehälters angeordnet sind, werden die magnetischen Markerpartikel zu dem Magneten 4 hin angezogen und können mit einer Geschwindigkeit präzipitiert werden, welche höher ist als die der natürlichen Sedimentation.
Das Verteilungsmuster der präzipitierten magnetischen Markerpartikel ändert sich abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit der zu messenden Substanz in der Probe. Das Verteilungsmuster ändert sich ebenfalls abhängig davon, ob die magnetischen Markerpartikel spezifisch an die zu messende Substanz binden können oder mit dieser im Wettbewerb stehen.
Als erstes ist nachstehend der Fall beschrieben, in welchem magnetische Markerpartikel verwendet werden, die spezifisch an eine Substanz gebunden werden können. Wenn in diesem Fall die zu messende Substanz in einer Probe vorhanden ist, wird eine Mehrzahl von magnetischen Markerpartikeln 5 an eine zu messende Substanz 6 gebunden, um ein Agglutinat zu bilden, wie in Fig. 2A gezeigt ist. Aus diesem Grund können sich die magnetischen Markerpartikel 5 nicht weiter bewegen. Wie in Fig. 2B gezeigt ist, verteilt sich daher ein Verteilungsmuster der magnetischen Markerpartikel 5 gleichmäßig auf der kugelförmigen Wandoberfläche des Meßbehälters 1 (positives Ergebnis). Auf der anderen Seite wird, wenn eine zu messende Substanz nicht in einer Probe vorhanden ist, kein Agglutinat gebildet.
Daher bewegen sich die magnetischen Markerpartikel, welche auf der kugelförmigen Wandoberfläche des Behälters präzipitiert wurden, entlang der kugelförmigen Wandoberfläche nach unten und sammeln sich in dem untersten Bereich der kugelförmigen Wandoberfläche, wie in Fig. 3A gezeigt ist. Als ein Ergebnis bilden die magnetischen Markerpartikel 5, welche sich in dem Zentralbereich der kugelförmigen Wandoberflache gesammelt haben (negatives Ergebnis), ein Verteilungsmuster, wie in Fig. 3B gezeigt ist. Daher ist es durch Beobachten des Verteilungsmusters der präzipitierten magnetischen Markerpartikel mit dem bloßen Auge oder einer optischen Meßeinheit möglich, die Gegenwart oder Abwesenheit der zu messenden Substanz zu bestimmen und die zu messende Substanz quantitativ zu messen.
Wenn die magnetischen Markerpartikel, welche mit der zu messenden Substanz im Wettbewerb stehen, (beispielsweise ist die immobilisierte Substanz dieselbe wie die zu messende Substanz) verwendet werden, muß eine Quervernetzungssubstanz, welche sowohl an die zu messende Substanz als auch an die magnetischen Markerpartikel bindet, zusätzlich zu den magnetischen Markerpartikeln zu einer Probe zugegeben werden. Wenn eine zu messende Substanz nicht in einer Probe vorhanden ist, wird die Quervernetzungssubstanz an die magnetischen Markerpartikel gebunden. Daher wird eine Mehrzahl von magnetischen Markerpartikeln durch die quervernetzende Substanz gebunden und miteinander agglutiniert. Daher ist das resultierende Sedimentationsmuster dasselbe, wie in den Figuren 2A und 2B gezeigt (negatives Ergebnis). Wenn in Gegensatz dazu die zu messende Substanz in einer großen Menge in einer Probe vorhanden ist, wird die Quervernetzungssubstanz an die zu messende Substanz gebunden. Aus diesem Grund tritt eine Agglutination der magnetischen Markerpartikel durch die Quervernetzungssubstanz nur gering oder nicht auf. In diesem Fall ist das Sedimentationsmuster dasselbe, wie in den Figuren 3A und 3B gezeigt (positives Ergebnis). Dieses Verfahren ist als eine Agglutinations- Inhibitionsreaktion bekannt. Wenn eine Messung mit der Agglutinations-Inhibitionsreaktion durchgeführt wird, sind die Verteilungsmuster der präzipitierten magnetischen Markerpartikel entgegengesetzt zu jenen, welche erhalten werden, wenn magnetische Markerpartikel verwendet werden, die an die zu messende Substanz gebunden werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die gegebene Substanz, welche an die zu messende Substanz in der Probe gebunden werden oder mit dieser im Wettbewerb stehen kann, ebenfalls auf der Wandoberfläche des Meßbehälters immobilisiert werden.
Mit Bezug auf die Figuren 4A bis 4C wird nachstehend ein Fall beschrieben, worin eine Fangsubstanz 7, welche spezifisch an eine zu messende Substanz 6 in einer Probe binden kann, als die gegebene Substanz, welche auf der Wandoberfläche des Behälters 1 immobilisiert ist, verwendet wird und magnetische Markerpartikel 5, welche spezifisch an die zu messende Substanz gebunden werden können, verwendet werden.
Eine Probe wird in den Meßbehälter 1 gebracht und inkubiert. Die Probe wird entfernt und dann wird der Behälter gewaschen. Eine in der Probe zu messende Substanz 6 wird an die Fangsubstanz 7 gebunden und darauf eingefangen. Eine Lösung der magnetischen Markerpartikel wird in den Behälter 1 gegossen und ein Magnetfeld von den Magneten 4 wird angelegt, um die magnetischen Markerpartikel 5 zu präzipitieren. Die präzipitierten magnetischen Markerpartikel 5 werden an die Substanz 6, welche auf der Fangsubstanz 7 eingefangen ist, gebunden, wie in Fig. 4A gezeigt und bewegen sich nicht entlang der Wandoberfläche des Behälters nach unten. Die präzipitierten magnetischen Markerpartikel 5 weisen ein gleichmäßiges Verteilungsmuster auf (positives Ergebnis), wie in Fig. 2B gezeigt. Wenn in Gegensatz dazu die Substanz 6 nicht in der Probe vorhanden ist, werden die präzipitierten magnetischen Markerpartikel 5 nicht an die Wandoberfläche des Behälters gebunden. Daher bewegen sich die magnetischen Markerpartikel 5 zu dem Zentralbereich der Wandoberfläche des Behälters, um ein Verteilungsmuster zu bilden (negatives Ergebnis), welches in dem Zentralbereich der kugelförmigen Wandoberfläche konzentriert ist, wie in Fig. 3B gezeigt. Da in diesem Fall die Probe aus dem Behälter 1 entfernt wird, der Behälter 1 gewaschen wird und dann die magnetischen Markerpartikel 5 zugegeben werden, wird die Bildung der Verteilungsmuster der magnetischen Partikel nicht durch andere Bestandteile in der Probe gestört. Daher ist es möglich, hochempfindliche Messungen durchzuführen. Da die magnetischen Partikel bei der positiven Reaktion an die Wandoberfläche des Behälters gebunden werden, können positives und negatives Ergebnis genauer bestimmt werden, was zu einer Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit beiträgt.
Anstatt die Probe zu entfernen und den Meßbehälter 1 zu waschen, nachdem die magnetischen Markerpartikel zu der Probe zugegeben wurden, kann die inkubierte Probe, welche in dem Meßbehälter enthalten ist, verdünnt werden. Dieses kann ebenfalls die Meßempfindlichkeit verbessern. In diesem Fall ist das Agglutinationsmuster der magnetischen Markerpartikel bei der positiven Reaktion ein Zustand, welcher nicht in Fig. 4A sondern in Fig. 4B gezeigt ist.
Wenn die Fangsubstanz auf der Wandoberfläche des Behälters 1 immobilisiert ist und die magnetischen Markerpartikel, welche mit der zu messenden Substanz im Wettbewerb stehen, verwendet werden, stehen die zu messende Substanz 6 und die magnetischen Markerpartikel 5 bezüglich der Fangsubstanz 7 auf der Wandoberfläche des Behälters miteinander im Wettbewerb. Aus diesem Grund werden die positiven und negativen Verteilungsmuster umgekehrt. Das heißt, die Fangsubstanz 7 wird an die zu messende Substanz 6 gebunden und in einer positiven Reaktion gesättigt. Daher werden die magnetischen Markerpartikel 5 nicht eingefangen und das Verteilungsmuster (Fig. 4C), welches in dem Zentralbereich der kugelförmigen Wandoberfläche konzentriert ist, wird erhalten. In Gegensatz dazu wird die Fangsubstanz 7 auf der Wandoberfläche des Behälters in einer negativen Reaktion nicht gesättigt. In diesem Fall werden die magnetischen Markerpartikel 5 an die Fangsubstanz 7 gebunden, wodurch sie ein gleichmäßiges Verteilungsmuster bilden, wie in Fig. 4A gezeigt.
Die Substanz (z.B. dieselbe Substanz wie die zu messende Substanz 6), welche mit der zu messenden Substanz 6 im Wettbewerb steht, kann auf der Wandoberfläche des Behälters 1 immobilisiert werden. In diesem Fall sind die Verteilungsmuster der präzipitierten magnetischen Markerpartikel 5 entgegengesetzt zu jenen, worin die Fangsubstanz, welche spezifisch an die Substanz 6 binden kann, auf der Wandoberfläche des Behälters immobilisiert ist. Ein Mechanismus zur Bildung der umgekehrten Verteilungsmuster wird nicht beschrieben.
Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich ist, ist es gemäß der vorliegenden Erfindung durch Verwendung der magnetischen Markerpartikel und der Wirkung des Magneten möglich, die Sedimentation der Markerpartikel zu beschleunigen. Selbst wenn die Größe oder spezifische Schwere der Markerpartikel nicht vergrößert wird oder der Zentrifugationsvorgang nicht angewendet wird, kann die Zeit zur Bildung des Sedimentationsmusters der magnetischen Partikel stark verkürzt werden. Daher kann eine Grobheit der Sedimentationsmuster verhindert werden, Nachteile, welche durch den Zentrifugationsvorgang auftreten, können verhindert werden und die Meßzeit kann stark verkürzt werden.
Da gemäß der vorliegenden Erfindung nur die Sedimentation der magnetischen Markerpartikel selektiv beschleunigt werden kann, kann eine Messung genau durchgeführt werden, ohne durch eine unlösliche Substanz oder eine präzipitierbare Substanz außer der, die in der Probe gemessen werden soll, gestört zu werden. Insbesondere ist es möglich, ein Sedimentationsmuster der magnetischen Markerpartikel zu bilden, bevor die unlösliche oder präzipitierbare Substanz außer der zu messenden, präzipitiert wird, indem ein Magnetfeld von dem Magneten vor oder in der Anfangsphase der Sedimentation der unlöslichen oder präzipitierbaren Substanz angelegt wird. Weiterhin kann, selbst wenn eine Probe eine Lösung mit einer hohen Viskosität oder eine Lösung mit einer größeren spezifischen Schwere als die der magnetischen Markerpartikel ist, die Sedimentation der magnetischen Markerpartikel selektiv beschleunigt werden, um genaue Messungen durchzuführen.
Da die magnetischen Markerpartikel gemäß der vorliegenden Erfindung zwangsweise durch die Wirkung des Magneten bewegt werden, können die magnetischen Markerpartikel in eine Richtung bewegt werden, welche von der Sedimentationsrichtung der unlöslichen oder präzipitierbaren Substanz außer der zu messenden verschieden ist. Wenn beispielsweise ein Teströhrchen als ein Meßbehälter verwendet wird, kann ein Magnet neben seiner Seitenwand angeordnet werden, um die magnetischen Markerpartikel auf der Seitenwand zu sammeln, während die unlösliche oder präzipitierbare Substanz außer der zu messenden durch natürliche Sedimentation präzipitiert wird. Gemäß diesem Verfahren kann ein Sedimentationsverteilungsmuster der magnetischen Markerpartikel gebildet werden, ohne daß es nachteilig durch die präzipitierbare Substanz außer der zu messenden beeinflußt wird.
Da die Messung durchgeführt werden kann, ohne durch Sedimentation der Substanz, außer der zu messenden, gestört zu werden, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung wirkungsvoll auf Proben angewendet werden (z.B. Vollblut oder Chylomikronämie-Blut), welche außer der zu messenden präzipitierbare oder unlösliche Substanzen enthalten. Das bedeutet, ohne Abtrennen einer präzipitierbaren oder unlöslichen Substanz außer der zu inessenden aus einer Probe können gute Meßergebnisse erhalten werden.
Darüber hinaus kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig mit den herkömmlichen Messungen, welche nicht-magnetische Markerpartikel verwenden, durchgeführt werden. Beispielsweise werden Messungen unter Verwendung von magnetischen Markerpartikeln in einigen Vertiefungen einer Mikroplatte durchgeführt, während Messungen unter Verwendung von nicht-magnetischen Markerpartikeln in anderen Vertiefungen derselben Mikroplatte durchgeführt werden. In anderen Worten, selbst wenn der Magnet ein Magnetfeld anlegt, um die Sedimentation der magnetischen Markerpartikel in einigen Vertiefungen zu beschleunigen, beeinflußt das Magnetfeld nicht die nicht-magnetischen Markerpartikel in anderen Vertiefungen. Daher ist die vorliegende Erfindung sehr wirkungsvoll, um gleichzeitig Messungen von vielen Proben durchzuführen.
Der Magnet, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht auf einen bestimmten Magnettyp beschränkt und kann ein permanenter Magnet oder ein Elektromagnet sein. Die Stärke des Magneten kann gemäß einer Substanz, welche gemessen werden soll, und dergleichen geeignet ausgewählt werden. Der Magnet muß nicht auf einen mit scheibenförmiger Gestalt beschränkt sein, sondern er kann jede Gestalt haben. Ein nadelartiger Magnet 8 mit einer scharfen Spitze, wie in Fig. 5 gezeigt, ist aus dem folgenden Grund am meisten bevorzugt. Wie in den Figuren 3A oder 4C gezeigt, können, wenn die magnetischen Markerpartikel 5 in dem Zentrum der Bodenoberfläche des Meßbehälters konzentriert sind, die magnetischen Markerpartikel 5 in einem schmaleren Bereich zusammen gesammelt werden, indem der nadelartige Magnet 8 verwendet wird. Daher kann ein Unterschied zwischen den positiven und negativen Mustern klarer werden und die Meßempfindlichkeit kann verbessert werden. Die Wandoberfläche der Vertiefung 2 mit einer konischen Gestalt (Fig. 5) ist der mit einer kugelförmigen Gestalt vorzuziehen.
Wenn eine Mikroplatte, mit einer großen Anzahl von Vertiefungen 2 als ein Meßbehälter verwendet wird, wird vorzugsweise eine Vorrichtung zur Beschleunigung der Reaktion wie in Fig. 6 gezeigt ist, verwendet. Die Vorrichtung zur Beschleunigung der Reaktion hat eine Trägerbasis mit einem erhöhten Rand (flange) an der Kante, um eine Mikroplatte mit 8 x 12 Vertiefungen zu tragen, ohne Positionierungsfehler zu verursachen. Runde Vertiefungen 11 sind in der Trägerbasis 10 an Stellen gebildet, welche entsprechend mit den Vertiefungen der Mikroplatte übereinstimmen. Nadelartige Ferritmagnete 12 (Magnetflußdichte: 2.200 Gauss), welche jeweils eine konische Gestalt aufweisen, sind in die Vertiefungen 11 eingepaßt. Wenn diese Vorrichtung zur Beschleunigung der Reaktion verwendet wird, können die nadelartigen Magnete 12 automatisch entsprechend an den zentralen Bereichen der Bodenoberflächen der Vertiefungen lokalisiert werden, wenn die Mikroplatte auf die Trägerbasis 10 gestellt wird.
Fig. 7 zeigt eine andere Vorrichtung zur Beschleunigung der Reaktion, welche vorzugsweise verwendet werden kann. In der Vorrichtung sind kreisförmige Vertiefungen 13 mit weiblichen Gewinden in der Trägerbasis 10 an Positionen gebildet, welche entsprechend mit den Vertiefungen der Mikroplatte übereinstimmen. Zylindrische Magnete 14 mit männlichen Gewinden werden entsprechend in die Vertiefungen 14 geschraubt. Das Schrauben des zylindrischen Magneten 14 wird durchgeführt, indem der Magnet 14 gedreht wird. Um den Magneten 14 durch Verwendung eines Schraubenziehers zu drehen, ist eine Kerbe 15 auf der oberen Endfläche des Magneten 14 gebildet. Die Kerbe 15 kann entweder minusförmig (-) oder plusförmig (+) sein. Das obere Ende des Magneten 14 kann ein N-Pol oder S-Pol sein. In der in Fig. 7 gezeigten Vorrichtung ist es leicht, eine feine Einstellung der Höhe der oberen Endfläche des Magneten in der Vertiefung 13 zu erreichen, indem die Drehung des Magneten 14 kontrolliert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Schritt des Anlegens eines Magnetfeldes von jedem Magneten, um die Sedimentation der magnetischen Markerpartikel zu beschleunigen, durchgeführt werden, während der Meßbehälter stationär gehalten wird oder transportiert wird.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail durch ihre nachfolgend aufgeführten Beispiele beschrieben werden.

Beispiel 1

Screenen von irregulären Antiköroern durch Antiglobulintest (Coomb's Teste

[A] Herstellung einer mit 0-Zellen beschichteten Mikroplatte

Eine Mikroplatte mit einem U-förmigen Boden (Herstellungsnummer 464,394, erhältlich von der NUNC Corp.) wurde vorbereitet. 100 ul einer Weizenkeimlektin-Lösung (WGA, erhältlich von Seikagaku Kogyo K.K.), welche unter Verwendung einer 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (PBS) mit pH 7,0 hergestellt wurde, um eine Konzentration von 10 ug/ml aufzuweisen, wurden zu jeder Vertiefung der Mikroplatte zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Jede Vertiefung wurde fünfmal gewaschen, indem jedesmal 300 ul des 0,01 M PBS mit pH 7,0 verwendet wurden. Die Mikroplatte wurde dann bei Raumtemperatur getrocknet, um eine WGA- behandelte Platte zu erhalten.
Ein Surgisurge-Screen (Herstellungsnummer 355837, erhältlich von der Ortho Corp.), wie menschliche Erythrozyten der Gruppe 0 mit Blutgruppen-Antigenen, welche in Tabelle 1 gezeigt sind, wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf 0,3% verdünnt. Der verdünnte Surgiscreen wurde zu der WGA-behandelten Platte in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zugegeben und die Mikroplatte wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, um den Surgiscreen an der Oberfläche von jeder Vertiefung der Mikroplatte zu adsorbieren. Jede Vertiefung wurde dreimal unter Verwendung von 200 ul (jedesmal) 0,01 M PBS mit pH 7,0, welcher 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, gewaschen. Tabelle 1 Spendernummer 41901, Gentyp: R&sub2;R&sub2; Anmerkung +: Antigen ist vorhanden -: Antigen ist nicht vorhanden.

[B] Herstellung von anti-Human-IgG-sensibilisierten Latexkügelchen

Eine Lösung (Konzentration: 0,4%) von dunkelbraunen magnetischen Latexkügelchen (Warenzeichen: Estapor, erhältlich von der RHONE-POULENC Corp.; Herstellungsnummer LMP233), die jeweils eine Partikelgröße von 1 u aufwiesen, wurden hergestellt, indem eine 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Pufferlösung mit pH 8,3 verwendet wurde (welche im folgenden als eine Glycin-Pufferlösung bezeichnet wird). Eine Lösung (Konzentration: 1 ug/ml) eines anti-Human-IgG (Herstellungsnummer 0601-0081, erhältlich von der Capple Corp.) wurde hergestellt, indem dieselbe Glycin-Pufferlösung verwendet wurde. 2 ml der vorhergehenden Lösung wurden mit 2 ml der letzteren Lösung gemischt und damit bei 37ºC eine Stunde lang umgesetzt, um die magnetischen Latexkügelchen mit dem anti-Human-IgG zu sensibilisieren. Die sensibilisierten Latexkügelchen wurden dreimal mit 2 ml der 0,1 M Glycin-Pufferlösung mit pH 8,3, welche 1% BSA enthielt, gewaschen und wurden dann in derselben 2 ml-Pufferlösung 30 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt, wodurch eine Blockierung zum Inhibieren einer nicht spezifischen Agglutination durchgeführt wird. Die Latexkügelchen wurden dann dreimal mit 2 ml (jedesmal) des 0,01 M PBS mit pH 7,0 gewaschen, welcher 0,01% Natrium-N-Lauroylsarcosinat (oberflächenaktives Mittel, erhältlich von der Nikko Chemicals K.K.) und 0,1% BSA enthielt. Der resultierende Latex wurde in denselben 4 ml PBS aufbewahrt.

[C] Nachweis von irregulären Antikörpern

60 ul einer LISS-Lösung und 30 ul von jedem der Antiseren (erhältlich von der Ortho Corp.) d.h., anti- , anti-K, anti-Fya und anti- wurden zu jeder Vertiefung der mit O- Zellen beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, zugegeben und wurden 30 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt. Zu derselben Zeit wurden 30 ml des 0,01 M PBS anstelle des Antiserums als eine negative Kontrolle zu einer Vertiefung zugegeben und in ähnlicher Weise umgesetzt.
Jede Vertiefung wurde viermal mit 200 ul (jedesmal) des 0,01 M PBS mit pH 7,0 gewaschen und 25 ul der magnetischen Latexkügelchen mit anti-Human-IgG wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nachfolgend wurden, wie in den Figuren 2A und 2B gezeigt, die Böden der Vertiefungen 7 entsprechend über den scheibenförmigen Ferrit-Magneten 5 angeordnet und eine weitere Reaktion wurde zwei Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt, während ein Magnetfeld in einer vertikalen Richtung an die Bodenoberflächen der Vertiefungen 7 angelegt wurde. Der Durchmesser von jedem Ferrit-Magneten 5 betrug 8 mm, seine Dicke betrug 3 mm und die Magnetflußdichte betrug 2.000 Gauss.
Durch die oben erwähnten Vorgänge wurden die anti-Human- IgG-Latexkügelchen auf die Bodenoberfläche von jeder Vertiefung 7 präzipitiert. Wenn die magnetischen Latexkügelchen mit anti-Human-IgG gleichmäßig verteilt waren, wurde diese Verteilung als eine positive Reaktion bestimmt. Wenn die magnetischen Latexkügelchen mit anti-Human-IgG in dem Zentrum von jeder Vertiefung konzentriert waren, wurde diese Verteilung als eine negative Reaktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse wurden mit den spezifischen Antigenen der Erythrozyten in Tabelle 1 verglichen. Tabelle 2 Antiserum Reaktionsmuster
Da die Sedimentation der magnetischen Latexkügelchen mit anti-Human-IgG als den magnetischen Markerpartikeln durch die Magneten beschleunigt wurde, wurde bei dem obigen Nachweis die Zeit, welche zur Bestimmung der Verteilungsmuster benötigt wurde, auf ca. 5 bis 20% der Zeit vermindert, welche in dem herkömmlichen Partikel-Agglutinationsverfahren benötigt wird.
Wie man aus der obigen Beschreibung verstehen kann, wurde Beispiel 1 mit dem Verfahren durchgeführt, welches mit Bezug auf die Figuren 4A und 4C beschrieben wurde. Das heißt, der Surgiscreen als die Fangsubstanz 7 wurde auf der Oberfläche von jeder Vertiefung immobilisiert. Die Vertiefung wurde gewaschen, nachdem die Probe umgesetzt worden war, wodurch ein stabiles klares Sedimentations-Verteilungsmuster der magnetischen Latexkügelchen und eine gute Nachweisempfindlichkeit erhalten wurde.
Das folgende Vergleichsexperiment wurde durchgeführt, um die Nachweisempfindlichkeit der vorliegenden Erfindung mit der des herkömmlichen Verfahrens zu vergleichen und die Nachweisempfindlichkeit der vorliegenden Erfindung aus zuwerten.

[D] Empfindlichkeitsvergleich mit dem herkömmlichen Verfahren

(a) Erythrozyten der Gruppe 0, welche entsprechend mit den zwölf kommerziell erhältlichen irregulären Antikörpern, welche in Tabelle 3 gezeigt sind, umgesetzt werden können, wurden aus dem Surgescreen (Herstellungsnummer 355119, erhältlich von der Ortho Corp.) ausgewählt, welcher drei Typen von Erythrozyten der Gruppe 0 (Nr. 1 bis 3) einschließt. Tabelle 3 Irregulärer Antikörper Herstellungslot Nr. Gruppe 0-Erythrozyten Nr., ausgewählt aus Surgiscreen Cooper Biomedical Ortho
Jeder Surgiscreen wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, um eine 0,7%ige Suspension herzustellen. Die verdünnte Suspension wurde in einer Menge von 25 ul pro Vertiefung auf eine WGA-behandelte Platte verteilt und wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Jede Vertiefung wurde mit der physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, um eine mit 0-Zellen beschichtete Mikroplatte herzustellen, welche mit den entsprechenden Antikörpern umgesetzt werden kann.
Die zwölf irregulären Antikörper, welche in Tabelle 3 gezeigt sind, wurden aufeinanderfolgend zweimal, viermal, sechzehnmal, ... mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt. 66,7 ul einer LISS-Lösung wurden bezogen auf 100 ul der verdünnten Lösung zugegeben, wodurch eine Reihe von mehrfach verdünnten Proben von jedem irregulären Antikörper hergestellt wurde.
Das folgende Experiment wurde unter Verwendung der Reihe von verdünnten Proben durchgeführt. Verdünnte Proben mit verschiedenen Konzentrationen wurden auf die Vertiefungen der Festphasenplatte in einer Menge von 25 ul pro Vertiefung verteilt und wurden 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die inkubierten Proben wurden sechsmal mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Nachfolgend wurden die magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] durch die anti-Human-IgG-Antikörper sensibilisiert wurden, in einer Menge von 25 ul/Vertiefung auf die Vertiefungen verteilt und wurden 2 Minuten lang auf dem Magneten stehen gelassen, worauf dieselben Prozesse wie oben beschrieben folgten, wodurch Sedimentationsmuster gebildet wurden. Wenn die präzipitierten magnetischen Latexkügelchen mit anti- Human-IgG gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche von jeder Vertiefung verteilt waren, wurde ihre Verteilung als stark positiv (++) bestimmt. Wenn die Kügelchen fast gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche verteilt waren, wurde ihre Vertiefung als positiv (+) bestimmt. Wenn die Kügelchen gering auf der Oberfläche von jeder Vertiefung verteilt waren, wurde ihre Verteilung als schwach positiv (±) bestimmt. Wenn die Kügelchen in dem zentralen Bereich des Bodens von jeder Vertiefung konzentriert waren, wurde ihre Verteilung als negativ (-) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
(b) Um ein Vergleichsbeispiel zur Auswertung der Messung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, wurde eine Messung durch das herkömmliche Verfahren auf der Basis des Assayverfahrens, welches von der Ortho Corp. vorgeschlagen wird, wie folgt durchgeführt.
Die zwölf irregulären Antikörper wurden, wie oben beschrieben, aufeinanderfolgend in einer mehrfachen Reihe verdünnt, 30 ul eines OAES (Ortho AES200) wurden zu 60 ul von jedem verdünnten Antikörper zugegeben, um jede Probe herzustellen. 30 ul eines reaktiven Surgescreens, welcher in Tabelle 2 gezeigt ist, wurden zu jeder Probe zugegeben und wurden 15 Minuten lang bei 30ºC inkubiert. Jede Probe wurde dreimal mit jeweils 3 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. 60 ul eines Coomb's Serum (Herstellungsnummer HH858Hl-1, erhältlich von der Ortho Corp.) wurden zu jeder Probe zugegeben. Jede Probe wurde dann 30 Sekunden lang bei 1.200 rpm einem Zentrifugationsvorgang unterworf en. Positive und negative Ergebnisse der Proben wurden basierend auf den Sedimentationsmustern gemäß den oben beschriebenen Standards bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Aus den Ergebnissen von Tabelle 4 ist klar, daß die Nachweisempfindlichkeit der vorliegenden Erfindung höher ist als die des herkömmlichen Verfahrens. Tabelle 4 Verfahren der vorliegenden Erfindung Herkömmliches Verfahren Irregulärer Antikörper

Beispiel 2

Direkter Antiglobulintest zum Autoantikörpernachweis

[A] Herstellung einer mit Erythrozyten beschichteten Mikroplatte

Eine WGA-behandelte Platte wurde durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt. Erythrozyten, welche von den interessierenden Blutproben abgetrennt wurden, welchen ein Antikoagulans zugegeben wurde, wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und wurden in der physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, um dadurch eine 0,3%ige Erythrozytensuspension herzustellen. Die Erythrozytensuspension wurde in einer Menge von 25 ul pro Vertiefung auf die Vertiefungen der WGA-behandelten Platte verteilt und wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Jede Probe wurde einmal mit 200 ul eines 0,01 M PBS mit pH 7,0 welcher 0,2% Gelatine enthielt, gewaschen.

[B] Herstellung von anti-Kaninchen-IgG-sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen

Magnetische Latexkügelchen, welche mit einem anti-Kaninchen-IgG (Herstellungsnummer 50-0115-16, erhältlich von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) sensibilisiert waren, wurden durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt, außer daß das anti-Kaninchen-IgG anstelle des in Beispiel 1 verwendeten anti-Human-IgG verwendet wurde.

[C] Nachweis von Autoantikörpern

Ein von Kaninchen stammendes Coomb's Serum (Ortho Corp.) wurde in einer Menge von 25 ul pro Vertiefung auf die Vertiefungen der mit Erythrozyten-Zellen beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, verteilt und wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Jede Vertiefung wurde dreimal mit jeweils 200 ul eines 0,01 M PBS mit pH 7,0 gewaschen und die magnetischen Latexkügelchen mit anti-Kaninchen-IgG, welche in [B] hergestellt wurden, wurden in einer Menge von 25 ul pro Vertiefung zu jeder Vertiefung zugegeben. Ein Magnetfeld von den Magneten wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 an die Vertiefungen angelegt, so daß die magnetischen Latexkügelchen mit anti- Kaninchen-IgG präzipitiert wurden, um Verteilungsmuster auf den Bodenoberflächen der Vertiefungen zu bilden, wodurch positive und negative Ergebnisse der Verteilungsmuster bestimmt wurden.
In Beispiel 2 kann die Zeit, welche zum Bestimmen der Verteilungsmuster benötigt wird, auf ca. 5 20% der Zeit vermindert werden, welche für das herkömmliche Verfahren benötigt wird.
Da das Verfahren, welches mit Bezug auf die Figuren 4A und 4C beschrieben wurde, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 verwendet wird, kann eine hohe Nachweisempfindlichkeit erhalten werden.

Beispiel 3

HBs-Antigen-Test (Nr. 1)

[A] Herstellung einer mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte

Ein Kaninchen-anti-HBs-Antikörper, welcher durch eine Affinitätsäule gereinigt wurde, wurde durch eine 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (PBS) mit pH 7 gepuffert, um eine Konzentration von 10 ug/ml aufzuweisen. Der anti-HBS-Antikörper wurde in einer Menge von 100 ul/Vertiefung zu den Vertiefungen einer Mikroplatte mit U-förmigem Boden zugegeben (Herstellungsnummer 464394, erhältlich von der NUNC Corp.) und wurde eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert und auf der Oberfläche der Vertiefungen adsorbiert. Jede Vertiefung wurde dreimal mit jeweils 250 ul eines 0,01 M PBS mit pH 7,0 gewaschen. 200 ul eines 0,01 M PBS mit pH 7,0, welcher 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und wurde eine Stunde lang bei 37ºC umgesetzt, um eine Blockierung durchzuführen. Zusätzlich wurde jede Vertiefung dreimal mit 250 ul pro Vertiefung (jedesmal) eines 0,01 M PBS mit pH 7,0, welcher 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Die Mikroplatte wurde dann bei Raumtemperatur getrocknet und bei 4ºC aufbewahrt.

[B] Herstellung von anti-HBs-Antikörper-sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen

Eine Lösung von magnetischen Latexkügelchen (Konzentration: 0,4%) wie in Beispiel 1 wurde hergestellt, indem eine 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,3 verwendet wurde. Durch Verwendung derselben Glycinpufferlösung wurde eine anti-HBs- Antikörperlösung (Konzentration: 2,5 ug/ml) hergestellt. 2 ml der Lösung von magnetischen Latexkügelchen wurden mit 2 ml der anti-HBs-Antikörperlösung gemischt und wurden damit eine Stunde lang bei 37ºC umgesetzt, wodurch die magnetischen Latexkügelchen mit den HBs-Antikörpern sensibilisiert wurden. Die sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen wurden dreimal mit 2 ml (jedesmal) einer 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,3, welche 1% BSA enthielt, gewaschen. Die Latexkügelchen wurden in derselben 2 ml-Pufferlösung 30 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt, um eine Blockierung durchzuführen. Zusätzlich wurden die Kügelchen dreimal mit 2 ml (jedesmal) eines 0,01 M PBS, welcher 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA enthielt, gewaschen. 4 ml desselben PBS wurden zu den Kügelchen zugegeben und die Kügelchen wurden in dem PBS aufbewahrt.

[C] Nachweis von HBS-Antigen

Ein an HBs-Antigen positives Serum wurde als eine Probe zu jeder Vertiefung der mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte ohne Verdünnung in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zugegeben und wurde damit 15 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Zu derselben Zeit wurden 25 ul eines an HBs-Antigen negativen Serums ohne Verdünnung als eine Kontrolle zu einer Vertiefung zugegeben und wurden mit dem Antikörper umgesetzt. Die zugegebenen Seren wurden entfernt und jede Vertiefung wurde einmal mit 200 ul eines 0,01 M PBS mit pH 7,5 gewaschen. Die anti-HBs-Antikörper-sensibilierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurden, wurden in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zu den Vertiefungen zugegeben. Die magnetischen Latexkügelchen wurden unter Verwendung eines Magneten präzipitiert, um Verteilungsmuster zu bilden, wobei dieselben Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet wurden.
Die Zeit, welche zum Bestimmen der Verteilungsmuster in Beispiel 3 benötigt wurde, war auf ca. 5 20% der Zeit vermindert, welche für das herkömmliche Verfahren benötigt wurde.
Da das Verfahren, welches mit Bezug auf die Figuren 4A und 4C beschrieben wurde, wie in Beispiel 1 verwendet wird, kann eine hohe Nachweisempfindlichkeit erhalten werden.

Beispiel 4

HBs-Antigen-Test (Nr. 2)

[A] Herstellung einer mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte

Eine mit einem anti-HBs-Antikörper beschichtete Mikroplatte wurde durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 3 hergestellt.

[B) Herstellung von anti-HBs-Antikörper-sensibilisierten Latexkügelchen

Magnetische Latexkügelchen, welche mit anti-HBs-Antikörpern sensibilisiert waren, wurden durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 3 hergestellt.

[C] Nachweis von HBs-Antigen

Ein an HBs-Antigen positives Serum wurde als eine Probe zu jeder Vertiefung der mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, in einer Menge von 25 ul/Vertiefung ohne Verdünnung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 zugegeben. 25 ul eines an HBs-Antigen negativen Serums wurden ohne Verdünnung als eine Kontrolle zu einer Vertiefung zugegeben. Nachfolgend wurden die anti-HBs-Antikörper-sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurden, in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zu jeder Vertiefung zugegeben und wurden damit 15 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt.
0,01 M PBS mit pH 7,5, welcher 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA enthielt, wurde in einer Menge von 150 ul/Vertiefung zu jeder Vertiefung zugegeben. Ein Magnetfeld wurde von den Magneten an die Bodenoberflächen der Vertiefungen angelegt, um die magnetischen Latexkügelchen auf die Bodenoberflächen der Vertiefungen zu präzipitieren, und dadurch Verteilungsmuster auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 zu bilden.
Die Zeit, welche zum Bestimmen der Verteilungsmuster benötigt wird, kann auf ca. 5 20% der Zeit vermindert werden, welche in dem herkömmlichen Verfahren benötigt wird.
Ungleich zu Beispiel 3 wurde weder die Probe verschwendet noch wurde jede Vertiefung gewaschen, nachdem die Proben mit den magnetischen Markerpartikeln in Beispiel 3 umgesetzt wurden. Da jedoch die Proben, nachdem sie mit den magnetischen Markerpartikeln gemäß dem Verfahren, welches mit Bezug auf die Figuren 4B und 4C beschrieben wurde, umgesetzt sind, verdünnt werden, kann das Problem einer nicht-spezifischen Agglutinationsreaktion, welche in einem Probenserum mit einer hohen Konzentration auftritt, leicht vermieden werden, ohne die Durchführbarkeit zu verschlechtern. Das Problem von falschen Positiven, welche durch die nicht-spezifische Agglutinationsreaktion verursacht werden, kann gelöst werden, indem die Verdünnungsrate vergrößert wird. Da zusätzlich die Reaktion zwischen der Probe und den magnetischen Markerpartikeln vor der Verdünnung fortschreitet, tritt fast keine Verschlechterung der Empfindlichkeit auf, welche durch Verdünnung verursacht wird. Daher kann für ein Serum mit einer hohen Konzentration ein stabiles klares Muster gebildet werden.

Beispiel 5

HBs-Antigen-Test einer Blutprobe (Nr. 1)

[A] Herstellung einer mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte

Eine mit anti-HBs-Antikörpern beschichtete Mikroplatte wurde durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 3 hergestellt.

Eine Lösung von magnetischen Latexkügelchen (Konzentration: 0,4%) wie in Beispiel 1 wurde hergestellt, indem eine 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,3 verwendet wurde. Eine Kaninchen-anti-HBs-Antikörperlösung (Konzentration: 1 ug/ml) wurde hergestellt, indem das mit einer Affinitätssäule gereinigte Antigen, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einer Glycinpufferlösung gelöst wurde. 2 ml der Lösung der magnetischen Latexkügelchen wurden mit 2 ml der Kaninchen-anti- HBs-Antikörperlösung gemischt und damit eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die magnetischen Latexkügelchen mit den HBs-Antikörpern zu sensibilisieren. Die sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen wurden dreimal mit 2 ml (jedesmal) einer 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,3, welche 1% BSA enthielt, gewaschen. Die Latexkügelchen wurden 30 Minuten lang bei 37ºC in derselben 2 ml-Pufferlösung umgesetzt, um eine Blockierung durchzuführen. Zusätzlich wurden die Kügelchen dreimal mit 2 ml (jedesmal) eines 0,01 M PBS, welcher 0,01% Natrium-N-Lauroylsarcosinat als oberflächenaktives Mittel, welches von der Nikko Chemicals K.K. erhältlich ist, und 0,1% BSA enthielt, gewaschen. 4 ml des 0,01 M PBS wurden zu den Kügelchen zugegeben und die Kügelchen wurden aufbewahrt.

[C] Nachweis von HBs-Antigen

Eine an HBs-Antigen positive Blutprobe, welcher ein Antikoagulans zugesetzt war, wurde hergestellt. Ein HBs-Antigen (Midori Juji K.K.) mit einem Subtyp von ad wurde zu dieser Blutprobe zugegeben, um eine positive Probe herzustellen. Die Blutprobe ohne Zusätze wurde als eine negative Probe verwendet.
Der 0,01 M PBS mit pH 7,5, welcher 0,01% Natrium-N-Lauroylsarcosinat und 5% Dextran (Molekulargewicht: 200.000 bis 300.000; erhältlich von der Wako Junyaku K.K.) enthielt, wurde in einer Menge von 100 ul/Vertiefung zu jeder Vertiefung der mit anti-HBs-Antikörpern beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, zugegeben. 5 ul der positiven oder negativen Probe wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 25 ul der mit anti-HBs-Antikörpern sensibilisierten Latexkügelchen-Lösung, welche in [B] hergestellt wurde, wurden dazu zugegeben und wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt.
Ein Magnetfeld von den Magneten wurde wie in Beispiel 1 auf die Mikroplatte angewendet, um die anti-HBs-Antikörper-sensibilisierten Latexkügelchen auf die Bodenoberflächen der Vertiefungen zu präzipitieren. Die Verteilungsmuster, welche durch Sedimentation gebildet werden, können von unten beobachtet werden, um die Gegenwart der HBs-Antikörper nachzuweisen und zu bestätigen.

Beispiel 6

A B und 0 Blutgruppenbestimmung

[A) Herstellung einer mit Erythrozyten der Gruppen A, B und 0 beschichteten Mikroplatte

Eine Mikroplatte mit einem U-förmigen Boden (Herstellungsnummer 464,394, erhältlich von der NUNC Corp.) wurde hergestellt. 100 ul eines Weizenkeimlektins (WGA, erhältlich von der Seikagaku Kogyo K.K.) wurde hergestellt, um eine Konzentration von 10 ug/ml aufzuweisen, indem eine 0,01 M Phosphatpufferlösung (PBS) mit pH 7,0 verwendet wurde. Die WGA-Lösung wurde zu jeder Vertiefung der Mikroplatte zugegeben und wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Jede Vertiefung wurde fünfmal unter Verwendung von jeweils 300 ul des 0,01 M PBS mit pH 7,0 gewaschen. Die Mikroplatte wurde dann bei Raumtemperatur getrocknet, um eine WGA-behandelte Platte zu erhalten.
Eine 0,7%ige physiologische Kochsalzsuspension von Erythrozyten der Gruppe A wurde zu jeder Vertiefung der WGA-behandelten Platte in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zugegeben und wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Jede Vertiefung wurde dreimal mit 200 ul (jedesmal) einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, um eine mit Erythrozyten der Gruppe A beschichtete Mikroplatte herzustellen. Auf ähnliche Weise wurden mit Erythrozyten der Gruppen B und 0 beschichtete Mikroplatten hergestellt.

[B] Herstellung von Antikörper-sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen

Eine Lösung von magnetischen Latexkügelchen (eine Lösung, welche 50 mal verdünnt wurde) wie in Beispiel 1 wurde hergestellt, indem eine 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,5 verwendet wurde. Eine Lösung (Konzentration: 20 ug/ml) eines anti-Human-IgM-Antikörpers, erhältlich von der KPL Corp., wurde hergestellt, indem eine Glycinpufferlösung wie in Beispiel 1 verwendet wurde. 500 ul der Lösung der magnetischen Latexkügelchen wurde mit der anti-Human-IgM-Antikörperlösung gemischt und damit 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die magnetischen Latexkügelchen mit dem anti-Human-IgM zu sensibilisieren. Die sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen wurden zweimal mit 2 ml (jedes-mal) einer 0,02 M Glycinpufferlösung mit pH 8,5, welche 0,2% BSA und 0,14 M NaCl enthielt, gewaschen. Das Waschen wurde durch Zentrifugationswaschen bei 3.000 rpm durchgeführt. Danach wurden die sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen in derselben 2 ml-Pufferlösung suspendiert und wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Blockierung durchzuführen. Die resultierenden Kügelchen wurden gekühlt und aufbewahrt.

[C] A, B und 0 Blutgruppenbestimmung

Eine verdünnte Lösung einer physiologischen Kochsalzlösung eines kommerziell erhältlichen anti-A-Serums (Herstellungsnummer SA960A-1, erhältlich von der Ortho Corp.) wurde auf einige Vertiefungen der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Mikroplatte in einer Menge von 25 ul/Vertiefung verteilt. Eine verdünnte Lösung einer physiologischen Kochsalzlösung eines kommerziell erhältlichen anti-B-Serums (Herstellungsnummer SB445A-1, erhältlich von der Ortho Corp.), wurde auf andere Vertiefungen der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Mikroplatte in einer Menge von 25 ul/Vertiefung verteilt. Die Lösungen wurden 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und die Vertiefungen wurden fünfmal mit einer physiologischen Kochsalzlösung mit 200 ul-Vertiefung gewaschen. Die Suspension der mit anti-Human-IgM- Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurde, wurde in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zu jeder Vertiefung zugegeben und wurde zwei Minuten lang über den Magneten stehengelassen, wodurch Sedimentationsmuster der magnetischen Latexkügelchen gebildet wurden und aus den Sedimentationsmustern positive (+) oder negative (-) Ergebnisse bestimmt wurden. Ein Test unter Verwendung der mit Erythrozyten der Gruppen A und 0 beschichteten Mikroplatten wurde durch dieselben Verfahren wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Erythrozyten Blutgruppe der Mikroplatte zugebener Antiserumtyp anti-A-Serum
In dem Assay unter Verwendung der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Mikroplatte trat eine positive Reaktion nur in den anti-A-Serumproben auf. In dem Assay unter Verwendung der mit Erythrozyten der Gruppe B beschichteten Mikroplatte trat eine positive Reaktion nur in den anti-B- Serumproben auf. In dem Assay unter Verwendung der mit Erythrozyten der Gruppe 0 beschichteten Mikroplatte traten positive Reaktionen weder in den anti-A- noch in den anti- B-Serumproben auf.
Aus dem obigen Ergebnis ist es klar, daß Blutproben der Gruppen A, 0 und B bestimmt werden können.

Beispiel 7

Kreuzveraleichstests

[A] Herstellung einer mit Erythrozyten der Gruppen A und B beschichteten Mikroplatte

Eine mit Erythrozyten der Gruppe A beschichtete Mikroplatte und eine mit Erythrozyten der Gruppe B beschichtete Mikroplatte wurden mit denselben Verfahren wie in Beispiel 6 hergestellt, außer daß die Erythrozyten der Gruppe A und die Erythrozyten der Gruppe B von einem Spender des A-Typs bzw. einem Spender des B-Typs gesammelt wurden.

[B] Herstellung von Antikörper-sensibilisierten Latexkügelchen

Eine Suspension von mit anti-Human-IgM-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen wurde durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 6 hergestellt.

[C] Kreuzvergleichstest

Seren der Gruppe A, welche von Spendern des A-Typs gesammelt wurden, wurden zu einigen Vertiefungen der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Platte, welche in [A] hergestellt wurde, zugegeben, und Seren der Gruppe B, welche von Spendern des B-Typs gesammelt wurden, wurden zu anderen Vertiefungen in einer Menge von 200 ul/Vertiefung zugegeben. Die Serumproben wurden 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und die Vertiefungen wurden fünfmal mit 200 ul/Vertiefung (jedesmal) einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Die Suspension der mit anti-Human-IgM-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurde, wurde in einer Menge von 25 ul/Vertiefung zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen wurden über den Magneten stehengelassen, um Sedimentationsmuster der magnetischen Latexkügelchen zu bilden, und dadurch positive (+) oder negative (-) Ergebnisse aus den Sedimentationsmustern zu bestimmen.
Ein ähnlicher Test wurde unter Verwendung der mit Erythrozyten der Gruppe B beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, durchgeführt. Die Testergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Erythrozytentyp der Mikroplatte zugegebenes Serum Gruppe
Wie oben beschrieben, traten positive Reaktionen in einer Kombination der Erythrozyten der Gruppe A und des Serums der Gruppe B und einer Kombination der Erythrozyten der Gruppe B und des Serums der Gruppe A auf. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Kreuzvergleichstest durchgeführt werden kann. Es ist möglich, die Bluttransfusionsverträglichkeit durch Kombinieren des Kreuzvergleichstests mit dem Screenen von irregulären Antikörpern in Beispiel 1 vollständig zu bestimmen.
Da ein Nachweis von irregulären Antikörpern in Beispiel 1 durchgeführt werden kann, ist es möglich, einen Kreuzverträglichkeitstest unter Verwendung von mit anti-Human-IgG- Antikörpern sensibilisierten magnetischen Partikeln und mit anti-Human-IgM-Antikörper-sensibilisierten magnetischen Partikeln einzeln oder in einer Kombination durchzuführen.

Beispiel 8

AB0-Blutgruppenbestimmung von beschichteten Erythrozyten unter Verwendung von mit monoklonalen Antikörpern sensibilisierten magnetischen Markerpartikeln

[A] Herstellung der mit Erythrozyten der Gruppen A, B und 0 beschichteten Mikroplatten

Mit Erythrozyten der Gruppen A, B und 0 beschichtete Mikroplatten wurden durch dieselben Verfahren wie in Beispiel 6 hergestellt.

[B] Herstellung von Antikörper-sensibilisierten Latexkügelchen

Eine Lösung von magnetischen Latexkügelchen (eine 50 mal verdünnte Lösung) wie in Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer 0,1 M Glycinpufferlösung mit pH 8,5 hergestellt. Eine Lösung (Konzentration: 20 ug/ml) eines monoklonalen anti-A- Antikörpers, welcher von der Olympus Optical Co., Ltd. erhältlich ist, wurde hergestellt, indem wie in Beispiel 1 eine Glycinpufferlösung verwendet wurde. 500 ul der Lösung der magnetischen Latexkügelchen wurden mit 500 ul der Lösung der monoklonalen anti-A-Antikörper gemischt und wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die magnetischen Latexkügelchen mit den monoklonalen anti-A- Antikörpern zu sensibilisieren. Die sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen wurden zweimal mit 2 ml (jedesmal) einer 0,02 M Glycinpufferlösung mit pH 8,5, welche 0,2% BSA und 0,14% NaCl enthielt, gewaschen. Das Waschen wurde durch Zentrifugationswaschen bei 3.000 rpm durchgeführt. Danach wurden die sensibilisierten Latexkügelchen in den 2 ml derselben Pufferlösung suspendiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Blockierung durchzuführen. Die Kügelchen wurden dann gekühlt und aufbewahrt.
Mit monoklonalen anti-B-Antikörpern sensibilisierte magnetische Latexkügelchen wurden durch dieselben Verfahren wie oben beschrieben hergestellt, außer daß ein monoklonaler anti-B-Antikörper, welcher von der Olympus Optical Co., Ltd. erhältlich ist, anstelle des monoklonalen anti-A-Antikörpers verwendet wurde.

[C] Bestimmung von Blutproben der Gruppen A, B und 0

Die Suspension der mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurde, wurde auf einige Vertiefungen der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, in einer Menge von 25 ul/Vertiefung verteilt. Die Suspension der mit monoklonalen anti-B- Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen, welche in [B] hergestellt wurden, wurde auf andere Vertiefungen der mit Erythrozyten der Gruppe A beschichteten Mikroplatte, welche in [A] hergestellt wurde, in einer Menge von 25 ul/Vertiefung verteilt. Die Proben wurden zwei Minuten lang über die Magneten gestellt, um Sedimentationsmuster der magnetischen Latexkügelchen zu bilden, und dadurch positive (+) oder negative (-) Ergebnisse zu bestimmen. Ähnliche Tests wurden durchgeführt, indem die mit Erythrozyten der Gruppen B und 0 beschichteten Mikroplatten, welche in [A] hergestellt wurden, verwendet wurden. Die Testergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Erythrozytentyp der Mikroplatte zugebenes Serum anti-A
Wie oben beschrieben, können Blutproben der Gruppen A, B und 0 auch bestimmt werden, indem die mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen und die mit monoklonalen anti-B-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Latexkügelchen verwendet werden.

Beispiel 9

AB0-Blutgruppenbestimmung unter Verwendung von mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Markerpartikeln

[A] Herstellung von mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Gelatinekügelchen

200 ul einer 5%igen physiologischen Kochsalzsuspension von gefärbten magnetischen Gelatinekügelchen, welche von der Olympus Optical Co., Ltd. erhältlich sind, wurden zweimal durch Zentrifugationswaschen (2.000 g; fünf Minuten) gewaschen, indem 2 ml (jedesmal) PBS verwendet wurden. 2 ml einer Tanninsäurelösung (Konzentration: 20 ug/ml) in PBS wurde zu den gefärbten magnetischen Gelatinekügelchen zugegeben und wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die gefärbten magnetischen Gelatinekügelchen wurden dann zweimal durch Zentrifugationswaschen (2.000 g; fünf Minuten), unter Verwendung von 2 ml (jedesmal) PBS, gewaschen.
Die monoklonalen anti-A-Antikörper, welche von der Olympus Optical Co., Ltd erhältlich sind, wurden durch PBS verdünnt, um eine Lösung herzustellen, welche eine Konzentration von 10 ug/ml aufweist. 2 ml dieser Lösung wurden zu den magnetischen Gelatinekügelchen, welche mit Tanninsäure behandelt wurden, zugegeben und wurden 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um die magnetischen Gelatinekügelchen mit den monoklonalen anti-A-Antikörpern zu sensibilisieren. Die sensibilisierten magnetischen Gelatinekügelchen wurden dreimal durch Zentrifugationswaschen (1.500 g; fünf Minuten), unter Verwendung von 2 ml (jedesmal) PBS, gewaschen.
Die sensibilisierten Gelatinekügelchen wurden in einer Phosphorsäure-Zitronensäure-Pufferlösung mit pH 6, welche 0,5% BPS und 0,05% Natriumazid enthielt, gewaschen und wurden 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um eine Blockierung durchzuführen. Die Gelatinekügelchen wurden dann gekühlt und aufbewahrt.

[B] Bestimmung von Erythrozytenantigen

Eine 0,2%ige verdünnte Suspension der Erythrozyten der Gruppe A wurde hergestellt, indem eine isotonische Phosphorsäure-Zitronensäure-Pufferlösung mit pH 6, welche 0,5% BSA enthielt, verwendet wurde. 50 ul der Suspension der mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Gelatinekügelchen, welche in [A] hergestellt wurden, wurden zu 50 ul der Suspension der Erythrozyten der Gruppe A zugegeben und wurden in den Vertiefungen einer Mikroplatte mit einer halbkugelförmigen Bodenoberfläche 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Zusätzlich wurde die resultierende Suspension 3 Minuten lang über den Magneten stehengelassen, um Sedimentationsmuster der magnetischen Latexkügelchen zu bilden, und dadurch positive (+) oder negative (-) Ergebnisse aus den Sedimentationsmustern zu bestimmen. Ähnliche Tests wurden unter Verwendung der Erythrozytenproben der Gruppen B und 0 anstelle der Erythrozytenprobe der Gruppe A durchgeführt. Die Testergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Tabelle 8 Erythrozyt Kügelchen monoklonale anti-A nicht sensibilisierte
Die Gegenwart der Erythrozyten der Gruppe A konnte innerhalb von ca. 13 Minuten bestimmt werden, nachdem die mit monoklonalen anti-A-Antikörpern sensibilisierten magnetischen Gelatinekügelchen zugegeben wurden.

Claims

1. Immunassayverfahren, welches magnetische Partikel verwendet, auf deren Oberfläche eine Substanz immobilisiert ist (magnetische Markerpartikel) (5), welche spezifisch an eine zu messende Substanz gebunden werden kann oder welche damit spezifisch im Wettbewerb stehen kann, die folgenden Schritte umfassend:

Immunreagieren einer Probe, welche eine zu bestimmende Substanz (6) enthält, mit den magnetischen Markerpartikeln (5), welche spezifisch an die Substanz (6) gebunden werden können, oder

Immunreagieren einer Probe, welche eine zu bestimmende Substanz (6) enthält, mit den magnetischen Markerpartikeln (5), welche mit der Substanz (6) im Wettbewerb stehen können, und mit einer Quervernetzungssubstanz, die sowohl an die zu bestimmende Substanz (6) als auch an die magnetischen Markerpartikel (5) bindet; und

Ansammeln der magnetischen Markerpartikel (5) in der Reaktionslösung innerhalb eines vorbestiinmten Wandoberflächenbereiches, in einem Meßbehälter (2) durch Anlegen eines magnetischen Feldes von einem Magneten (4) an die Reaktionslösung, die in dem Meßbehälter (2) enthalten ist, wobei der Magnet an der Außenseite des vorbestimmten Wandoberflächenbereiches des Meßbehälters (2) angeordnet ist,

gekennzeichnet durch

Bestimmen der Substanz (6), die in der Probe enthalten ist auf der Basis eines Verteilungsmusters der präzipierten magnetischen Markerpartikel (5), welche sich in dem vorbestimmten Wandoberflächenbereich angesammelt haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner gekennzeichnet durch die Schritte:

Immobilisieren einer gegebenen Substanz, welche spezifisch an eine zu messende Substanz binden kann oder damit im Wettbewerb stehen kann, an wenigstens dem vorbestimmten Wandoberflächenbereich des Meßbehälters (2); und

Verdünnen der Reaktionslösung der Probe und der magnetischen Markerpartikel.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der vorbestimmte Wandoberflächenbereich eine Bodenoberfläche des Meßbehälters (2) ist.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der vorbestimmte Wandoberflächenbereich eine kugelförmige Wandoberfläche ist.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der vorbestimmte Wandoberflächenbereich eine konische Wandoberfläche ist.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet ein nadelartiger Magnet (8) ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die folgenden Schritte vor dem Ausführen des Immunreaktionsschrittes umfaßt:

Immobilisieren einer gegebenen Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz (6) gebunden werden kann oder mit dieser im Wettbewerb stehen kann, auf wenigstens einem vorbestimmten Wandoberflächenbereich des Meßbehälters (2).

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der vorbestimmte Wandoberflächenbereich eine halbkugelförmige Wandoberfläche ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Markerpartikel (5) dem Meßbehälter (2) zugegeben werden nach den Schritten der Probenzugabe zu dem Meßbehälter (2), um eine Reaktion zwischen der Probe und der gegebenen Substanz zu bewirken, Entfernen der Probe und Waschen des Meßbehälters.

10. Reaktionsbeschleunigende Vorrichtung für einen Immunassay mit:

einer Trägerbasis (10) mit einer oberen Oberfläche, auf welcher eine Platte mit einer Mehrzahl von Reaktionsbehältern darauf angeordnet ist, kann montiert werden, wobei die vorbestimmten Wandoberflächenbereiche geeignet sind zum Ansammeln der magnetischen Markerpartikel in einem vorbestimmten Bereich; und

eine Mehrzahl von Magneten (12, 14), angeordnet auf der Trägerbasis außerhalb der vorbestimmten Wandoberflächenbereiche der Meßbehälter, wobei die Magneten auf Positionen angeordnet sind, welche jenen entsprechen, bei welchen die Behälter angeordnet sind, wenn die Platte auf der Trägerbasis (10) angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnete (12) in Form einer Nadel vorliegen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnete (14) die Form einer Säule oder eines Prismas aufweisen.

13. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß positive Gewinde in die Magneten (14) geschnitten sind, negative Gewinde in die Trägerbasis geschnitten sind und diese positiven und negativen Gewinde derart ineinander eingreifen, daß die Magnete (14) an der Trägerbasis (10) befestigt werden können.

14. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kante der Trägerbasis (10) derart erhaben ist, daß die Platte zuverlässig getragen werden kann.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Vertiefungen (15) - und + auf den Kopf eines jeden Magneten (14) eingraviert ist.