DE69512909T2

DE69512909T2 - Festphasen-filtrationsverfahren zur antigen- und antikörperprüfung in der blutgruppen-serologie, und testsatz

Info

Publication number: DE69512909T2
Application number: DE69512909T
Authority: DE
Inventors: Pieter Den Boer; Eric Van Der Donk; Ronald Van Eijk
Original assignee: Stichting Centraal Laboratorium Van de Bloedtransfusiedienst Van
Current assignee: Stichting Centraal Laboratorium Van de Bloedtransfusiedienst Van
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-09
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2015-05-10
Also published as: EP0760103A1; AU2375695A; ATE185900T1; EP0760103B1; NL9400777A; WO1995030904A1; DE69512909D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Der Zweck von Blutgruppenanalysen und Antikörper- Identifizierungen in der klinischen Tätigkeit ist häufig das Erhalten von kompatiblen Erythrozytenpräparationen zur Transfusion. Die Erfindung betrifft den Nachweis und die Identifizierung von Antikörpern und Antigenen und kann zur Blutgruppenanalyse, für Antikörper-Screening und - Identifizierung und zur Durchführung von Kreuztests verwendet werden. Der Test basiert nicht auf Hämagglutination sondern auf einem Festphasenprinzip unter Vermeidung von Waschschritten.
Bei einer Blutgruppe sind spezifische Antigene-Determinanten auf der Zellmembran beteiligt. Die Information zur Expression von Blutgruppenantigenen ist auf der genetischen Ebene festgelegt und vererbbar. Blutgruppenantigene können die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Spezifische Antikörper gegen Blutgruppenantigene werden meistens nach Immunisierung mit dem entsprechenden Antigen gebildet. Eine Ausnahme davon ist die Bildung der sogenannten "natürlich vorkommenden" Antikörper, die ohne offensichtliche Immunisierung in Serum nachweisbar sind (Anti-A und Anti-B). Die Anwesenheit von Antikörpern spielt eine wichtige Rolle bei der Bluttransfusion, Schwangerschaft und Autoimmunität.
Antikörper können unterschiedlich klassifiziert werden:
1. Xeno-, Allo- und Auto-Antikörper;
2. reguläre und irreguläre Antikörper;
3. natürlich vorkommende und erworbene Antikörper;
4. vollständige (IgM) und unvollständige (IgG) Antikörper.
Bluttransfusionsreaktionen, die durch Allo-Antikörper gegen Erythrozyten hervorgerufen werden, werden als hämolytische Transfusionsreaktionen bezeichnet, da sie meistens von einem sehr stark beschleunigten Abbau von Erythrozyten begleitet sind. Der Punkt ist daher, hämolytische Transfusionsreaktionen durch sorgfältige Blutgruppenbestimmung zu verhindern.
Blutgruppenantikörper sind fast immer Immunglobuline vom IgG- oder IgM-Typ. Die Antigen-Antikörper-Reaktion ist abhängig unter anderem von Ionenbindung, Wasserstoffbrücken und hydrophoben Effekten (Verdrängung von Wasser). Die Stärke einer Bindung zwischen einer Bindungsstelle eines Antikörpers und eines Epitops wird als Affinität bezeichnet. Antikörper, die in der Lage sind Erythrozyten unter allen Bedingungen zu agglutinieren, werden als Agglutinine oder komplette Antikörper (IgM) bezeichnet. Antikörper, die an Erythrozyten binden aber keine Agglutination (Sensibilisierung) hervorrufen, werden als unvollständige Antikörper (hauptsächlich IgG) bezeichnet.
Der Nachweis von Erythrozytenantigenen und entsprechenden Antikörpern findet häufig durch Agglutinationsreaktionen statt. Agglutinationsreaktionen können in einer physiologischen Salzlösung stattfinden. In der Praxis ist dies allerdings nicht immer optimal. Eine Vielzahl an Tests können sensitiver gemacht werden, indem eine Vielzahl von Hilfsmitteln verwendet werden, wie die Verwendung von Medium, das eine niedrige Ionenstärke (Medium mit niedriger ionischer Stärke) hat, proteolytischen Enzymen (z. B. Bromelin, Papain oder Ficin), Polykationen (z. B. Polybren), Makromolekülen (z. B. Albumin) oder Polymeren (z. B. Polyethylenglycol, PEG).
Ein wichtiger und häufig verwendeter Test ist der Antiglobulin- oder Coombs-Test. Der Antiglobulin-Test basiert im Prinzip darauf, daß Erythrozyten, die z. B. mit Antikörpern des IgG-Typs beladen sind, durch Antiglobulinseren agglutiniert werden können. Dies ist der wichtigste Test für den Nachweis von unvollständigen Antikörpern. Der Antiglobulin-Test wurde von Moreschi im Jahre 1908 (Zbl. Bakt. 46 : 49) beschrieben und 1945 durch Coombs et al (hancett 2 : 15, Brit. J. Exp. Path. 26 : 255) wieder eingeführt.
Der Antiglobulin-Test kann in drei Phasen unterschieden werden. Die erste Phase ist die Sensibilisierungsphase. In dieser Phase binden Antikörper an die entsprechenden Antigenstrukturen auf den Erythrozyten. Wenn ausreichende Bindung stattgefunden hat, findet die zweite Phase, nämlich die Waschphase, statt. In dieser Phase werden alle nicht gebundenen Antikörper aus der Inkubationsmischung entfernt. Unzureichendes Entfernen von nicht gebundenen Antikörpern kann zu einer Inaktivierung des Antiglobulinserums führen, indem diese Antikörper an das Antiglobulin binden. Die dritte Phase ist die Antiglobulin-Phase. Hier wird Antiglobulin zu den gewaschenen sensibilisierten Zellen gegeben, so daß diese sensibilisierten Zellen miteinander verbunden werden.
Es gibt eine große Breite an Blutgruppenanalyseverfahren. Die zur Zeit wichtigste Technik ist das Röhrchenverfahren, der Geltest und Tests in Mikrotiterplatten. Eine Unterscheidung kann zwischen Techniken gemacht werden, die auf Hämagglutination basieren und Techniken, die auf einem Festphasenprinzip basieren.
a. Tests, die auf Agglutination basieren:
Der Röhrchentest ist ein weitverbreiteter Test, der verlängerte Inkubationen erlaubt. Die Erythrozyten können sich absetzen oder können zentrifugiert werden, um die Agglutinationsreaktion zu beschleunigen. Die Auswertung der Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgt durch leichtes Schütteln des Röhrchens und anschließendem Rotieren des Röhrchens (antippen und rollen). Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß eine Automatisierung schwierig ist. Der Coombs-Test erfordert ein sehr intensives und häufiges Waschen. Des weiteren muß das Ablesen des Tests sofort durch eine erfahrene Person erfolgen und das Ergebnis des Tests kann nicht aufbewahrt werden. Da das Ablesen des Tests manuell geschieht, ist die Reproduzierbarkeit ebenfalls nicht optimal. Zusätzlich ist eine Automatisierung dieser Analysenmethode schwierig zu bewerkstelligen.
Ein weiterer Test, der auf Agglutination basiert, ist in EP-A-0 542 655 und FR-2 673 472 (Institut Jacques Boy) beschrieben. Der in diesen Anmeldungen beschriebene Test verwendet ein Filterprinzip. Nach Inkubation von Erythrozyten und (Anti)Serum werden gebildete Agglutinate auf einer Kombination von inerten Filtermaterialien, einschließlich einer Schicht von Glaskügelchen, zurückbehalten. Für den Transport der Erythrozyten, die agglutiniert oder nicht -agglutiniert sein können, wird ein Elutionsschritt verwendet (Durchsaugen des Medium unter Verwendung eines feuchtigkeitsabsorbierenden Materials). Dieses Verfahren kann direkt für das Durchführen von Tests, die agglutinierende Antikörper beinhalten, verwendet werden. Wenn allerdings nicht agglutinierende Antikörper (z. B. IgG-Antikörper im Coombs-Test) beteiligt sind, müssen die Erythrozyten erst nach der Inkubationszeit gewaschen werden, um die nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Nur dann können diese Erythrozyten in Anwesenheit eines Antiglobulinserums (sensibilisiert oder nicht) zu dem Testsystem gegeben werden, wonach anschließend eine Agglutination stattfinden kann. Der Nachteil dieses Testsystems ist also, daß bei dem Antiglobulin-Test die Inkubationsphase und die Waschphase nicht in dem gleichen Reaktionsgefäß stattfinden kann.
Der Waschschritt braucht, wie oben dargestellt, bei dem Coombs-Test viel Zeit. Graham et al (Transfusion 1982, 22: 408; P. L. Mollison, Blood transfusion in clinical medicine, Blackwell, Oxford, 1983, S. 512) entwickelten ein neues Prinzip, welches den Waschschritt überflüssig machte. Dieses Prinzip wurde von Ortho Diagnostic Systems Inc. in einem Testsystem (Simwash) verwendet. Gemäß diesem System werden die Erythrozyten von dem Serum mit Hilfe eines Zentrifugationsschritts abgetrennt. Die Abtrennung basiert auf der Tatsache, daß die spezifische Schwere des Serums (1,03) niedriger ist als die der Erythrozyten (1,09). Wenn eine Mischung von Zellen und Serum oben auf eine Schicht Medium mit einer Dichte zwischen der Dichte der Zellen und der des Serums aufgegeben wird, werden die Erythrozyten durch einen Zentrifugationsschritt vom Serum (enthaltend die nicht gebundenen Antikörper) abgetrennt. Das heißt, die (schwereren) Erythrozyten werden von der ursprünglichen Inkubationsmischung abzentrifugiert. Dadurch wird ein dreifacher oder vierfacher Waschschritt auf einen einzigen Zentrifugationsschritt reduziert. Anschließend können die sensibilisierten Zellen mit Antiglobulinserum inkubiert werden. Allerdings stellte sich heraus, daß dieses System nicht sensitiv genug ist. Eine weitere Vereinfachung wurde durch Zentrifugation der Erythrozyten durch ein Sephadexgel oder durch Glaskügelchen durchgeführt. Die Verwendung von transparenten, inerten, festen Partikeln zur Abtrennung von Agglutinaten und Nichtagglutinaten wurde von Dalton et al 1970 (Becton Dickinson & Co., US-Patent 3,492,396) beschrieben.
Ein System, bei dem ein Gelmaterial zum Nachweis der Erythrozyten-Antikörper-Reaktion verwendet wird, wurde durch LaPierre et al (Transfusion 30: 109-113, 1990 und EP-A-0 194 212 und EP-A-0 305 337 und US-Patent 5,338,689) beschrieben. Dieses System kombiniert die Prinzipien des Simwash und die Verwendung von festen Partikeln zur Trennung von Agglutinaten und Nichtagglutinaten und zum Nachweis der Agglutinate. In diesem Test wird von kleinen Säulen, die mit Sephadexgel gefüllt sind, Gebrauch gemacht. Für den Nachweis von Agglutininen wird von einem neutralen Gel Gebrauch gemacht und für den Antiglobulin-Test von einem Gel, welches Antiglobulinserum enthält. Als eine dritte Möglichkeit kann ein Gel auch spezifische Antikörper gegen Erythrozyten- Antigene enthalten. Nach einer Inkubation werden die Gelsäulen zentrifugiert. Im Falle einer negativen Reaktion landen alle Erythrvzyten am Boden des Röhrchens; wenn der Test positiv ist werden die Erythrozyten oben auf oder in dem Gel festgehalten, und im Fall von schwachen Reaktionen werden die Erythrozyten teilweise zurückbehalten.
Ein Hauptvorteil dieses Systems ist, daß der Antiglobulin- Test keine getrennten Waschschritte benötigt (wie es z. B. für den Röhrchentest und den Test beschrieben in EP-A-0 542 655 der Fall ist). Tatsächlich findet während der Zentrifugation eine Trennung der Erythrozyten und der Serum- oder Plasmabestandteile statt. Ein zweiter Vorteil ist die Tatsache, daß die Ergebnisse des Tests gut aufbewahrt werden können. Der beschriebene Test wird von DiaMed AG (DiaMed-ID Microtyping System) und Diagast Laboratoires (Chromatest) verwendet. Ein vergleichbares Systems, Ortho Biovue System (Ortho Diagnostic Systems), verwendet Glaskügelchen anstelle eines Gelmaterials. Ein Nachteil dieser Tests ist, daß eine spezielle Zentrifuge für die korrekte Durchführung des Tests benötigt wird. Automatisches Ablesen des Tests benötigt ebenfalls eine spezielle Ableseausrüstung. Des weiteren können gemischte Muster auftreten, wo ein Teil der Erythrozyten auf dem Boden des Röhrchens enden.
b. Tests, die auf dem Festphasenprinzip basieren:
Ein anderes Verfahren als eine Alternative zu Agglutinationsreaktionen zur Blutgruppenanalyse, für Antikörper-Screening und -Identifizierung und Kreuztests ist die Verwendung des Festphasenprinzips. Die Verwendung und die Vorteile der Verwendung von Festphasentechniken in den genannten Bereichen wurden von Rosenfield (Abstracts, 15. Cong. Int. Soc. Blood Trans., Paris, S. 27-33, 1976; US-Patent 4,275,053, 1981) beschrieben. Hier wurden unter anderem Erythrozyten verwendet, die an die Oberfläche der Plastikröhrchen gekoppelt waren. In jüngerer Zeit wurden Systeme von Plapp et al (Am. J. Clin. Path. 82: 719-721, 1984), Bayer et al (US-Patent 4,608,246, 1986), Rachel et ah (Transfusion 25: 24-26, 1985), Plapp et al (The Lancet 1465-1466, 1986) und Uthemann et al (US-Patent 4,925,786, Transfusion 30: 114-116, 1990) beschrieben.
Mikrotiterplatten mit dem Festphasenprinzip werden unter anderem von Biotest AG (Solidscreen II zur Antikörper- Diagnose), Immucor Inc. (Immunocapture Capture-R systems für Antikörper-Screening und -Identifizierung) und CLB (Microtype zur Typisierung von Erythrozytenantigenen) eingesetzt. Das Capture-R System verwendet eine Festphase, an die Erythrozytenmembranen gebunden sind. Während der Inkubation mit Serum oder Plasma von Blutspendern oder Patienten können Erythrozyten-spezifische Antikörper an diese Membranen binden. Der Waschphase, bei der der Überschuß an nicht gebundenen Antikörpern entfernt wird, folgt eine Zugabe von Indikator-Erythrozyten, an die Anti-IgG gebunden sind. Wenn spezifische Antikörper im Plasma oder Serum anwesend waren, tritt eine Brückenbildung zwischen dem an die Festphase gebundenen Antikörper und den Indikator-Erythrozyten auf. Entsprechend betrifft das System eine Modifizierung des Antiglobulin-Tests. Solidscreen (Antikörper-Screening und -Identifizierung) und Microtype (Antigen-Typisierung) verwenden eine feste Phase, an die humanes IgG gebunden ist. In den Vertiefungen findet die Inkubation der Erythrozyten und des Plasmas oder Serums statt. Wenn entsprechende Antikörper anwesend sind, findet eine Sensibilisierung der Erythrozyten statt. Die sensibilisierten Zellen werden dann gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Der Nachweis findet durch Zugabe von Antiglobulinserum statt, so daß die sensibilisierten Zellen an das an der festen Phase gebundene IgG binden. Bei dieser Art von Systemen ist es für positive Reaktionen normal, daß sie durch eine einlagige Schicht an Erythrozyten an der festen Phase charakterisiert sind. Im Falle von negativen Ergebnissen wird keine einlagige Schicht gebildet.
Ein Nachteil der bekannten Tests ist, daß sie häufiges Waschen erfordern, um den Überschuß an nicht gebundenen Antikörpern zu entfernen. Unvollständiges Wegwaschen der Antikörper kann zu einer Inaktivierung des Antiglobulins führen. Ein Vorteil ist, daß kleine Mengen Probe ausreichen, so daß für die Durchführung der Tests Gebrauch von automatischen Pipettiervorrichtungen, die für Mikrotiterplatten geeignet sind, gemacht werden kann und daß automatische Verarbeitung der Ergebnisse möglich ist.
Vor kurzem wurde ein Testprinzip beschrieben, welches ebenfalls das Festphasenprinzip verwendet aber partikuläres Material anstatt einer Mikrotiterplatte als feste Phase einsetzt (EP-A-0 594 506; Pasteur Sanofi Diagnostics). Diese Veröffentlichung beschreibt ein säulenartiges Testsystem. In dem oberen Teil der Säule findet die Bildung des Immunkomplexes durch Inkubation in einem wäßrigen Medium statt. Dieser gebildete Immunkomplex wird durch Zentrifugation durch eine Gelmatrix, auf der eine Substanz immobilisiert wurde, die in der Lage ist Antikörper (oder Antigen) zu binden (poröse Affinitätsmatrix), transportiert. Die Reaktion kann aufgrund der Position der Immunkomplexe in der Gelsäule ausgewertet werden. Eine wichtige Anwendung dieses Tests liegt im Bereich der Blutgruppenserologie. In diesem Fall bestehen die Immunkomplexe aus sensibilisierten Erythrozyten, die in der Lage sind an die Affinitätsgelmatrix zu binden. Der Test kann sowohl in Röhrchen als auch in Plastikkartensäulen, wie von LaPierre (Transfusion 30: 109-113, 1990 und EP-A-0 194 212 und EP-A-0 305 337) beschrieben, durchgeführt werden.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist, daß eine spezielle Ausrüstung zur Ausführung des Tests benötigt wird. Die Zentrifugation dieser Säulenkarten sollte in speziellen Zentrifugen stattfinden. Die Karten müssen exakt in einem Radius in dem Rotor positioniert werden. Wenn das Ablesen automatisch erfolgt, ist die Verwendung einer speziellen Ableseausrüstung, basierend auf dem "Image Anälysis"-Prinzip, notwendig.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Darstellung von Antikörpern und Antigenen, deren Anwendung hauptsächlich im Bereich der Blutgruppenserologie liegt: Blutgruppenanalyse, Antikörper-Screening und -Identifizierung und Kreuztests. In der Erfindung wird eine durchlässige Festphase (Membran) verwendet, auf der ein oder mehrere Immunglobulin bindende Substanzen immobilisiert sind. Gemäß der Erfindung können sensibilisierte Erythrozyten an dieser durchlässigen festen Phase binden. Erythrozyten, auf denen keine Antikörper (Immunglobuline) vorhanden sind, werden nicht an der festen Phase gebunden und können diese einfach passieren, da die feste Phase durchlässig für Erythrozyten ist. Zur Durchführung der Tests wird keine separate Waschphase benötigt, wie es der Fall ist wenn derzeit erhältliche Festphasensysteme, basierend auf dem Mikrotiterplattensystem, verwendet werden. Ein Vorteil der Verwendung einer Membran als feste Phase gegenüber einer Gelmatrixsäule (wie in EP-A-0 594 506 beschrieben) ist, daß das Durchführen dieses Tests keine spezielle Ausrüstung, einschließlich speziellen Zentrifugen, Nachweisausrüstungen und Pipettiersystemen benötigt. Die Erfindung stellt eine Verbesserung des derzeitigen Festphasenprinzips dar.
Entsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyts bestehend aus einem auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigen, oder einem Antikörper, der an ein solches Blutgruppenantigen in einer Probe bindet, zur Verfügung, umfassend die Behandlung der Probe mit einem Reagens, das einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Blutgruppenantigen zu binden oder ein auf Erythrozyten vorhandenes Blutgruppenantigen enthält, wobei ein Komplex aus einem auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigen und einem daran gebundenen Antikörper gebildet wird, wenn das Reagens einen Antikörper enthält, der an ein in der Probe vorhandenes Blutgruppenantigen binden kann oder die Probe enthält einen Antikörper, der an ein im Reagens vorhandenes Blutgruppenantigen bindet; weiterhin umfassend die Trennung dieses Komplexes, wenn einer gebildet wurde, von nicht komplexierten Erythrozyten und der Nachweis davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrozyten-enthaltenden Komplexe, wenn welche geformt wurden, von nicht komplexierten Erythrozyten durch Filtration mit einer festen Phase, die eine poröse, für nicht komplexierte Erythrozyten durchlässige Membran ist, getrennt wird, wobei auf der Membran ein Immunglobulin bindendes Material immobilisiert ist.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Testkit zur Verfügung, welches zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung eines auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigens oder eines Antikörpers, der an ein solches Blutgruppenantigen bindet, geeignet ist, umfassend
(i) ein Reagens, welches einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Blutgruppenantigen zu binden, oder ein auf Erythrozyten vorhandenes Blutgruppenantigen enthält und
(ii) eine feste Phase, die eine für Erythrozyten durchlässige poröse Membran ist, auf der Immunglobulin bindendes Material immobilisiert ist.

Vorteile der Erfindung

Die hier beschriebene Erfindung hat die folgenden Vorteile gegenüber den existierenden Techniken:
1. Die Sensitivität des Tests ist aufgrund der Verwendung von Immunglobulin bindenden Substanzen, die eine hohe Affinität zu verschiedenen Immunglobulinen haben, hoch;
2. kein Waschschritt wird für die Entfernung der überschüssigen, nicht gebundenen Immunglobuline benötigt;
3. es wird keine Verwendung des Agglutinationsprinzips gemacht;
4. die Analyse kann mit bestehenden Ausrüstungen durchgeführt werden;
5. Ablesen und Interpretation des Tests können einfach visuell durchgeführt werden, können aber auch schnell automatisiert werden;
6. es ist ein benutzerfreundliches, einheitliches System; und
7. das erhaltene Ergebnis kann aufbewahrt werden.

Variationen der Erfindung

Die beschriebene Erfindung kann in den derzeitigen Tests innerhalb der Blutgruppenserologie, einschließlich Screening- Tests für Antikörper, Identifizierung von Antikörpern, Serum- Reverse-Typisierung, Kreuztest, Antigenanalyse, Blutgruppenanalyse und Antikörper-Titration verwendet werden. · Die Erfindung kann z. B. zur Analyse der folgenden Blutgruppenantigene und Antikörpern zu diesen Antigenen verwendet werden: ABO, Kell (K), Cellano (k), Duffy (Fya und Fyb), Kidd (Jka und JKb), Lutheran (Lua und Lub), das Rhesussystem (D, E, e, C, c), MNS (S und s), Lewis (Lea und Leb) usw..
Die Erfindung kann, dargestellt anhand von Beispielen, für die folgenden Analysen verwendet werden:
- Tests, in denen Gebrauch von Antiserum einer bekannten Spezifität und von Erythrozyten, die eine unbekannte Antigenzusammensetzung (Antigenanalyse, ABO Blutgruppenbestimmung) haben, gemacht wird.
- Tests, in denen Gebrauch gemacht wird von Seren, die einen unbekannten Antikörper oder unbekannte Antikörper enthalten und Erythrozyten, die eine bekannte Antigenzusammensetzung haben (Antikörper-Screening, Antikörper-Identifizierung, reverse Blutgruppenbestimmung). In diesem Zusammenhang wird häufig Gebrauch von einer Liste von Erythrozyten mit bekannter Antigenzusammensetzung gemacht. Weiterhin kann der Test für den Nachweis von Auto-Antikörpern verwendet werden. In diesem Fall sind die Antikörper bereits an ihr korrespondierendes Antigen auf den Erythrozyten gebunden. Die Erythrozyten sind somit bereits sensibilisiert und können direkt an die durchlässige feste Phase binden.
- Tests, in denen Erythrozyten mit unbekannter Antigenzusammensetzung und Seren, die Antikörper unbekannter Spezifität enthalten, verwendet werden (Kreuztest).
Die Tests, die gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht werden, beruhen alle auf dem gleichen Prinzip. Erythrozyten, an denen Antikörper gebunden sind (sensibilisierte Erythrozyten), können an die durchlässige feste Phase binden, während nicht sensibilisierte Zellen die durchlässige feste Phase passieren.
Die Probe besteht typischerweise aus Blut oder einem Material, welches sich davon ableitet, wie Blutplasma, Blutserum oder einer Blutfraktion, z. B. Erythrozyten isoliert aus dem Blut. Da die Erfindung aber auch für andere Zwecke verwendet werden kann, wie die Auswahl von Hybridomen, die monoklonale Antikörper produzieren die an Blutgruppenantigene binden, kann die Probe auch aus anderen Materialien bestehen, z. B. Überstand eines Hybridoms.
Essentiell ist, daß die feste Phase durchlässig ist. Als geeignetes Filtermaterial für die feste Phase können poröse Membranen verwendet werden. Weiterhin ist die Auswahl der Immunglobulin bindenden Substanzen von essentieller Wichtigkeit. Beide Punkte werden hier kurz erklärt.

a. Filtermaterial

Poröse Membranen, wie sie als Filtermaterial verwendet werden können, müssen eine Anzahl von Bedingungen erfüllen. Die Membrane müssen ausreichend große Poren haben, damit nicht sensibilisierte Erythrozyten diese passieren können, die Porengröße sollte daher größer als ca. 2 um, bevorzugt größer als ca. 3 um sein. Tatsächlich haben Erythrozyten einen Durchmesser von 6-8 um, aber aufgrund ihrer Deformierbarkeit können sie durch solche Poren mit einem schmaleren Durchmesser als dem ihren passieren. Die verwendete Porengröße hängt von dem verwendeten Material und der Anzahl der Poren pro Flächeneinheit ab. Eine zu geringe Anzahl von Poren würde zu einer Verstopfung führen. Bei einer relativ großen Porengröße würde die Bindung der sensibilisierten Erythrozyten uneffizient verlaufen, so daß nicht genügend Zellen binden können. Eine feinere Membranstruktur wird zu einem intensiveren Kontakt zwischen den sensibilisierten Zellen und der Immunglobulin bindenden Substanz führen, was eine optimale Bindung der Zellen ermöglicht. Um eine Inkubation zu ermöglichen kann in Kombination mit der festen Phase ein hydrophober Filter verwendet werden, der verhindert, daß die Inkubationsmischung die feste Phase zu schnell passiert.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der festen Phase ist die Fähigkeit, die Immunglobulin bindende Substanz zu immobilisieren. Die Bindung muß so fest sein, daß die gebundenen Erythrozyten an der festen Phase gekoppelt bleiben. Beispiele für das Filtermaterial für die Festphase sind z. B. Zellulose-Esterpolymer, Nitrozellulose, (modifiziertes) Polyvinylidenfluorid (PVDF), (modifiziertes) Polytetrafluorethylen (PTFE), (modifiziertes) Polyethersulfon, Glasfaser, Polycarbonat und modifiziertes Nylon. Nitrozellulose ist ein als Membran aufgrund ihrer hohen Affinität gegenüber Proteinen und zellulären Makromolekülen häufig verwendetes Material. Materialien wie Nitrozellulose und Nylon können modifiziert sein, um eine kovalente Bindung von Makromolekülen zu ermöglichen. Ein wichtiger Vorteil von Polycarbonat ist die niedrige unspezifische Bindung von Reagenzien (Penney et al. 1989; J. Immunol. Meth. 123: 185-192).

b. Immunglobulin bindende Substanzen

Die Auswahl an Immunglobulin bindenden Substanzen, die auf der festen Phase immobilisiert sein können, ist groß. Brauchbar sind z. B. polyklonale oder monoklonale Antikörper, die gegen Immunglobulin G (IgG), Immunglobulin A (IgA) und/oder Immunglobulin M (IgM) gerichtet sind. Um die Sensitivität zu erhöhen oder den größtmöglichsten Bereich an Antikörpern nachzuweisen, ist es möglich, eine Kombination von verschiedenen Immunglobulin bindenden Substanzen auf die feste Phase zu immobilisieren oder Anti-Ig zu verwenden. Antikörper gegen das Komplementsystem können auch verwendet werden.
Eine weitere Möglichkeit ist das Ausgehen von Immunglobulin bindenden Substanzen von einem anderen Ursprung, z. B. von Bakterien. Immunglobulin bindende bakterielle Proteine haben bereits Aufmerksamkeit erregt und werden u. a. in der Immunologie, Biochemie und Biotechnologie verwendet. Eine Anzahl von Ig bindenden Proteinen wurden isoliert und charakterisiert.
Ein wichtiger Vertreter ist das Protein A, beschrieben 1966, aus Staphylococcus aureus (Forsgren et al. J. Immunol. 97: 822). Dieses Zellwandprotein hat eine hohe Affinität unter anderen zu humanem Immunglobulin G (Subklassen IgG&sub1;, IgG&sub2; und IgG&sub4;).
1984 wurde Protein G, ein Zellwandprotein, welches von Gruppe C und G Streptococcus stammt, beschrieben (Björck et al. J. Immunol. 133: 969; Reis et al. J. Immunol. 132: 3091). Dieses Protein bindet IgG Antikörper aller vier Subklassen mit einer hohen Affinität. Diese Eigenschaft macht es für die Verwendung in Immunhämatologie und insbesondere für Antikörper- und Antigenanalysen bei der Blutgruppenserologie sehr geeignet. Weiterhin ist die Affinität von Protein G zu Immunglobulinen größer als die von Protein A, so daß es ein wirkungsvolles Reagens zum Nachweis von Immunglobulinen ist. Protein G ist auch als Immunglobulin bindende Substanz auf Membranen verwendbar.
Kürzlich wurden zwei bakterielle Proteine beschrieben, die Immunglobuline mit einer hohen Affinität binden können, nämlich Protein L und Protein H.
Protein L kommt auf der Oberfläche von einigen Stämmen der Bakterienart Peptostreptococcus magnus (Infect. Immun. 58: 1217-1222; 1990) vor. Es ist ein Protein, das in der Lage ist, die leichte Kette x von Immunglobulinen zu binden (J. Immunol. Methods 164: 33-40, 1993), IgG, IgA und IgM binden mit einer hohen Affinität (J. Biol. Chem. 264: 19740-19746; 1989). Das Protein kann insbesondere an den variablen Teil der leichten Kette binden, ohne daß sie die Antigen- Bindungsstelle stört.
Protein H ist ein neues IgG bindendes bakterielles Protein (Streptococcus spec.). Dieses Protein hat eine hohe Affinität zur schweren Kette und den Fc-Fragmenten von IgG. Es findet keine Bindung zu IgM, IgA, IgD oder IgE statt (Akesson et al. Mol. Immunol. 27: 523-531; 1990).
Es können aber auch Substanzen nützlich sein, bei denen durch Veränderung des genetischen Materials Bindungseigenschaften von verschiedenen Proteinen zusammengebracht wurden.
Beispiele schließen Protein L/G (Kihlberg et al. J. Biol. Chem. 267: 25583; 1992) und Protein A/G (ImmunoPure Immobilized Protein A/G, Pierce) ein. Im L/G Protein wurden die Ig bindenden Teile des Proteins L und des Proteins G in ein Molekül zusammengebracht, welches zusätzlich zu der großen Anzahl an intaken humanen Immunglobulinen auch die leichten Ketten der Immunglobuline und Fc- und Fab-Fragmente binden kann. Bei dem A/G Protein wurden die Bindungseigenschaften der Proteine A und G in einem Molekül zusammengebracht. Weiterhin können Zellsuspensionen der genannten Bakterien (Sigma) oder IgG bindende Fragmente des Proteins A (Sigma) als Immunglobulin bindende Substanz geeignet sein.
Eine mögliche Variante ist die Verwendung von genetisch veränderten Bakteriophagen (A. S. Kang et al. Proc. Natl. Acad. Scie. USA 88: 4363-4366). Auf der Oberfläche dieser Bakteriophagen wurden funktionale Fab-Fragmente eingefügt. Diese Fab-Fragmente können Antikörper binden und Erythrozyten sensibilisieren. Diese Bakteriophagen können auf einer durchlässigen festen Phase immobilisiert werden und können als Immunglobulin bindende Substanz dienen.
In Kombination mit der beschriebenen Erfindung kann ein Zentrifugationsschritt durchgeführt werden, so daß die sensibilisierten Zellen vom Serum oder Plasma getrennt werden. Dieser Schritt ist vergleichbar mit dem vorher dargestellten Verfahren, welches von Diamed AG, Ortho Diagnostic Systems, Diagast Laboratoires und Sanofi Pasteur verwendet wird. Ein Vorteil dieser Kombination ist, daß wesentlich weniger Immunglobulin bindende Substanz auf der festen Phase vorhanden sein muß.
Für das Blutgruppen-Analyseverfahren, wo IgM Antikörper wichtig sind (ABO System), kann als feste Phase eine poröse Membran verwendet werden, an der eine IgM bindende Substanz immobilisiert ist. Es ergibt sich daraus, daß dieses System auch für die Analyse von anderen Antigenen verwendet werden kann, wo der korrespondierende Antikörper von der IgM Klasse ist. In diesem System findet also eine Bindung von IgM sensibilisierten Erythrozyten statt.
Für die Antigentypisierung beinhaltend IgG Antikörper kann eine feste Phase verwendet werden, wo eine IgG bindende Substanz mit einer hohen Affinität verwendet wird, um eine optimale Bindung der sensibilisierten Zellen an die feste Phase sicherzustellen. Als Immunglobulin bindende Substanz kann Protein G verwendet werden. Die Affinität von Protein G zu IgG ist größer als die von Protein A, des weiteren bindet Protein G alle vier IgG Subklassen, während Protein A nicht IgG&sub3; bindet. Der Vorteil dieses Systems ist, daß es auch für Antikörper-Identifizierung, Antikörper-Screening und Kreuztests, wo IgG Antikörper involviert sind, verwendet werden kann. Eine feste Phase, an der ein oder mehrere Immunglobulin bindende Substanzen vorhanden ist, die IgA, IgG, IgM und Komplementfaktoren binden, ist am idealsten, da eine große Breite an Antikörper-Spezifitäten dargestellt werden können.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des Tests ist ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der gegen ein auf Erythrozyten vorhandenes Antigen gerichtet ist, auf der festen Phase immobilisiert. Hierbei ist es nicht wichtig, ob ein IgG oder ein IgM Antikörper involviert ist, da keine Agglutination stattfinden muß, wie beim Röhrchen- oder Geltest. Erythrozyten, die das Antigen gegen das der Antikörper, der auf dem Filter immobilisiert ist, gerichtet ist, besitzen, können an die feste Phase binden. Dieses Verfahren ist sehr gut für Blutgruppenbestimmungen, z. B. für das ABO- und Rhesussystem, geeignet.
Das Festphasenprinzip kann weiterhin zur Darstellung von IgM Antikörpern durch Verwenden der vorhergenannten festen Phase bestehend aus einer Membran, die z. B. immobilisiertes Protein G hat, verwendet werden. In diesem Fall ist ein Anti-IgM Antikörper der IgG Klasse an das Protein G gekoppelt. Dieser Test kann z. B. verwendet werden für "reverses Typisieren" der ABO Blutgruppe (bei dieser Bestimmung wird die Spezifität der natürlich vorkommenden Allo-Agglutinine in dem Serum oder Plasma des Patienten oder Spenders untersucht). IgM Allo- Antikörper aus dem Serum/Plasma von Patienten oder Spendern kann an den Anti-IgM Antikörper binden. Dann wird die Spezifität des gebundenen IgM Allo-Antikörpers durch Zugabe von Testerythrozyten bestimmt. Testerythrozyten von z. B. Blutgruppe B würden an die feste Phase binden, wenn der gebundene IgM Allo-Antikörper eine Anti-B Spezifität besitzt.
Zur Durchführung des Tests wird bevorzugt ein Testsystem im Mikrotiterplattenformat verwendet (mit der Möglichkeit zur Durchführung von einzelnen oder multiplen Tests), wo der Boden ersetzt wurde durch die durchlässige feste Phase in Kombination mit einem hydrophoben Filter. Die feste Phase umfaßt bevorzugt einen Filter, auf dem Protein G immobilisiert ist. Nach der Inkubationsphase, bei der Zellen und (Anti)Serum eine Bindung eingehen können, kann ein Transport mittels eines Zentrifugationsschritts der Zellen, die sensibilisiert sein können oder nicht, stattfinden, wobei die sensibilisierten Zellen an die feste Phase haften und nicht sensibilisierte Zellen die feste Phase passieren. In diesem Fall benötigt das Durchführen des Tests eine Anordnung eines flüssig gefüllten Feldes unter der festen Phase. Ein Vorteil dieses Zentrifugationsschritts ist der, daß dadurch die Erythrozyten, die sensibilisiert sein können oder nicht, vom Inkubationsmedium abgetrennt werden. Ein Nachweis der gebundenen Zellen auf dem Filter kann einfach sowohl visuell als auch automatisch durchgeführt werden.

Beispiele

Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter erklärt. Es ist allerdings wichtig zu sehen, daß diese Beispiele nur zu Darstellungszwecken gemacht werden und zum Erläutern der Durchführbarkeit der Erfindung, aber in keiner Weise definierte Zustände der verschiedenen Analyseverfahren darstellen.

Beispiel 1

Nitrozellulose-Membranfilter (AE 99; Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) mit einer Porengröße von 8 um wurden als Filtermaterial verwendet. Die Membranen (Oberflächenfläche 80 mm²) wurden mit Protein G (Pharmacia, Schweden) durch Inkubation (18 Stunden bei 4ºC) in 400 ul PBS enthaltend 500 ug Protein G/ml beschichtet. Nach dem Beschichten wurden die Membranen in PBS gespült und mit Blockierungspuffer (PBS mit 1% Rinderalbumin) für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Die Membranen wurden in Membranbehälter gelegt (Swinnex SX, Millipore, Molsheim, Frankreich). Unter dem Membranbehälter wurde ein Sperrhahn aufgestellt. Die Membranen wurden mit einer Kochsalzlösung niedriger ionischer Stärke gespült: LISS (niedrige ionische Stärke Kochsalzlösung) besteht aus 3 mM Natriumphosphat, 61 mM Natriumchlorid und 240 mM Glycin, pH 6,6.
Dann wurden 200 ul Anti-D sensibilisierte -0&spplus; Erythrozyten (3% Suspension in PBS) auf die Membran gegeben. Solange der Sperrhahn unter dem Membrancontainer geschlossen war, verblieben die zugegebenen Erythrozyten auf der Membran, so daß ein Inkubationszeitraum geschaffen wurde. Nach einer kurzen Inkubationszeit (Raumtemperatur) fand eine Elution mit PBS statt. Eine Elution wurde durchgeführt, indem der Sperrhahn geöffnet wurde und Puffer zugegeben wurde. Die Elution fand unter Einfluß der Schwerkraft statt. Die sensibilisierten Erythrozyten stellten sich als an die Membran gebunden heraus. Die Erythrozyten konnten von der Membran durch Elution mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 3,0 entfernt werden.
Als Kontrolle wurde das Verfahren mit 0&spplus; Erythrozyten, die nicht sensibilisiert waren, wiederholt. Hier wurde keine Bindung der Zellen an den Membranfilter festgestellt.
Identische Ergebnisse wurden erhalten, wenn LISS anstelle von PBS verwendet wurde.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde hinsichtlich dem Duffy Blutgruppensystem durchgeführt. 100 ul Erythrozytensuspension (Genotyp Fya+b-) wurden mit 100 ul Anti-Fya Serum für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Sensibilisierungsphase wurden die Erythrozyten mit PBS gewaschen und letztendlich in 200 ul LISS suspendiert. Von dieser Suspesion (3%) wurden 100 ul auf die Membran gegeben. Ein Inkubationszeitraum von 15 Minuten wurde von einer Elution mit 2 ml PBS gefolgt. Es stellte sich heraus, daß alle Erythrozyten an die Membran gebunden waren. Die Erythrozyten konnten durch Elution mit 1 ml 0,1 M Glycin/HCL, pH 3,0 entfernt werden.
Als Kontrolle wurde das Verfahren mit 0&supmin; Erythrozyten (Phenotyp Fya-b+) wiederholt. Hier konnte keine Bindung der Erythrozyten an die Membran beobachtet werden.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde der Test in einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Nitrozellulose-Membranfilter (AE 99; Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) mit einer Porengröße von 8 um wurden als Festphase-Filtermaterial verwendet. Die Membranen (Oberfläche 30 mm²) wurden mit Protein G (Pharmacia, Schweden) durch Inkubation (18 Stunden bei 4ºC) in 800 ul PBS enthaltend 200 ug Protein G/ml beschichtet. Nach dem Beschichten wurden die Membranen mit PBS gespült und mit Blockierungspuffer (PBS mit 1% Rinderalbumin) für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die Membranen wurden in Multiscreen-Mikrotiterplatten (Millipore, Bedford, Massachusetts) gelegt. In diesen Mikrotiterplatten wurde der Boden durch eine Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 5 um ersetzt. Dieses Material ist hydrophob und erlaubt unter normalen Umständen nicht das Durchlaufen der Flüssigkeit des Überstands. Als Ergebnis verbleiben die zugegebenen Erythrozyten auf der Membran, so daß eine Inkubationsphase stattfindet. Ein Transport der Erythrozyten kann durch Zentrifugation oder durch Elution durch Pressen der Mikrotiterplatten auf Filterpapier durchgeführt werden.
Die Membranen wurden mit PBS enthaltend 1% Dextran gespült. Dann wurden 50 ul Anti-D sensibilisierte 0&spplus; Erythrozyten (3% Suspension in PBS) auf die Membran gegeben. Einer kurzen Inkubationszeit (Raumtemperatur) folgte eine Elution mit PBS enthaltend 1% Dextran. Es stellte sich heraus, daß die Erythrozyten an die Membran gebunden waren. Die Erythrozyten konnten von der Membran durch Elution mit 0,1 M Glycin/HCL, pH 3,0 entfernt werden.
Als Kontrolle wurde das Verfahren mit 0&spplus; Erythrozyten, die nicht sensibilisiert wurden, wiederholt. Hier konnte keine Bindung der Erythrozyten auf der Membran beobachtet werden.

Beispiel 4

Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde mit Nitrozellulose-Membranfiltern durchgeführt, die allerdings nicht mit Protein G sondern mit monoklonalen IgM Antikörpern in der Reihenfolge Anti-A, Anti-B, Anti-AB oder Anti-D beschichtet waren.
Dann wurden 50 ul Erythrozytensuspension (3% in PBS) (50 ul von je A-, B-, AB- und 0&spplus; Erythrozyten) auf die Membran gegeben. Nach einer kurzen Inkubationszeit (Raumtemperatur) folgte eine Elution mit PBS enthaltend 1% Dextran. In den vier beschriebenen Fällen stellte sich heraus, daß alle Erythrozyten an die Membran gebunden hatten. Die Erythrozyten konnten von der Membran durch Elution mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 3,0 entfernt werden.
Als Kontrolle wurde das Verfahren mit 0&supmin; Erythrozyten wiederholt. In den vier beschriebenen Fällen konnte keine Bindung der Erythrozyten an die Membran beobachtet werden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts bestehend aus einem auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigen, oder einem Antikörper, der an ein solches Blutgruppenantigen bindet in einer Probe, umfassend die Behandlung der Probe mit einem Reagenz, das einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Blutgruppenantigen zu binden oder ein auf Erythrozyten vorhandenes Blutgruppenantigen enthält, wobei ein Komplex aus einem auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigen und einem daran gebundenen Antikörper gebildet wird, wenn das Reagens einen Antikörper enthält, der an ein in der Probe vorhandenes Blutgruppenantigen binden kann oder die Probe enthält einen Antikörper, der an ein im Reagens vorhandenes Blutgruppenantigen bindet; weiterhin umfassend die Trennung dieses Komplexes, wenn einer gebildet wurde, von nicht komplexierten Erythrozyten und der Nachweis davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrozyt-enthaltenden Komplexe, wenn welche geformt werden, von nicht komplexierten Erythrozyten durch Filtration mit einer festen Phase, die eine poröse, für nicht komplexierte Erythrozyten durchlässige Membran ist, getrennt wird, wobei auf der Membran ein Immunglobulin bindendes Material immobilisiert ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus Blut, Blutplasma, Blutserum, einer Blutfraktion oder einem Überstand eines Hybridoms besteht.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran aus Zellulose- Esterpolymer, Nitrozellulose, (modifiziertem) Polyvinylidenfluorid (PVDF), (modifiziertem) Polytetrafluorethylen (PTFE), (modifiziertem) Polyethersulfon, Glasfaser, (modifiziertem) Polycarbonat oder (modifiziertem) Polyamid (Nylon welches modifiziert oder nicht modifiziert sein kann) verwendet wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Membran Poren von wenigstens rund 2 um, bevorzugt von wenigstens rund 3 um hat.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Kombination mit der porösen Membran ein hydrophober Filter verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulin bindendes Material ein Anti-Ig, Anti-IgG, Anti-IgA oder Anti-IgM verwendet wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulin bindendes Material ein Immunglobulin bindendes bakterielles Protein verwendet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulin bindendes bakterielles Protein Protein A, Protein G, Protein L oder Protein H verwendet wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulin bindendes Material ein rekombinantes Protein, welches Immunglobulin bindende Eigenschaften hat, wie Protein L/G oder Protein A/G, verwendet wird:

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtration durch Zentrifugation gefördert wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtration eine Zentrifugation vorangeht, bei der die Erythrozyten, die komplexiert oder nicht komplexiert sein können, von der Probe abgetrennt werden.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtration durch eine Zentrifugation gefördert wird, während gleichzeitig die komplexierten oder nicht komplexierten Erythrozyten von der Probe abgetrennt werden.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein auf Erythrozyten vorhandenes Blutgruppenantigen ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist, der an ein Blutgruppenantigen bindet.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kreuztest durchgeführt wird, wobei Erythrozyten mit einer unbekannten Blutgruppenantigen- Zusammensetzung und Antikörper mit einer unbekannten Blutgruppen-Spezifität verwendet werden.

16. Testkit, das geeignet ist, in einem Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche zur Bestimmung eines auf Erythrozyten vorhandenen Blutgruppenantigens oder eines Antikörpers, der an ein solches Blutgruppenantigen bindet, verwendet zu werden, umfassend

(i) ein Reagens, welches einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Blutgruppenantigen zu binden oder ein auf Erythrozyten vorhandenes Blutgruppenantigen enthält, und

(ii) eine feste Phase, die eine für Erythrozyten durchlässige poröse Membran ist, auf der Immunglobulin bindendes Material immobilisiert ist.