DE68925185T2 - Verfahren zum Trocknen von Säugetierzellen zur Verwendung in Immunoassays fester Phase und diese enthaltende Artikel - Google Patents
Verfahren zum Trocknen von Säugetierzellen zur Verwendung in Immunoassays fester Phase und diese enthaltende ArtikelInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft allgemein Immunoassays in fester Phase und insbesondere ein Verfahren zum Trocknen von Säugerzellen, die an einen Festphasen-Träger adsorbiert sind, zur Verwendung im Immunoassays in fester Phase, und diese inkorporierende Artikel.
- Immunologische Assay-Verfahren in fester Phase sind entwickelt worden, um empfindliche und spezifische immunologische Assays bereitzustellen, die für Labortechniker bequemer und leichter durchzuführen sind. In einem Immunoassay in fester Phase ist eine Komponente der immunologischen Reaktion, entweder Antigen oder Antikörper, auf die Oberfläche eines Festphasen-Trägers immobilisiert. Das Antigen oder der Antikörper können direkt auf den Festphasen-Träger durch eine Vielfalt von Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, immobilisiert werden. Außer Antigenen oder Antikörpern können ganze Zellen, z.B. Erythrocyten, Leukozyten, Lymphozyten, Blutplättchen oder andere Säugerzellen, für immunologische Assays, die für solche Zellen spezifisch sind, auf die Oberfläche eines Festphasen- Trägers immobilisiert werden. Jeder dieser Zelltypen präsentiert Antigene auf seiner Zelloberfläche, die dazu verwendet werden können, um Antikörper in einer zu untersuchenden Probe eines biologischen Fluids nachzuweisen. Es können auch spezifische Antigene oder Antikörper an die Oberfläche der Zellen für andere Arten immunologischer Assays adsorbiert sein. So sind Immunoassays, an denen Zellen des oben beschriebenen Typs beteiligt sind, entwickelt worden, um die Anwesenheit von Antigenen oder Antikörpern in Assays für Blutgruppen und Agentien infektiöser Krankheiten zu bestimmen, insbesondere derjenigen, die direkt die zellulären Blutkomponenten betreffen.
- Wenn bei Immunoassays in fester Phase ganze Zellen verwendet werden, setzen die gegenwärtigen Techniken, die zur Fixierung dieser Zellen an den Festphasen-Träger verwendet werden, chemische Agentien ein, die funktionelle Gruppen auf der Oberfläche der Zellen mit funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Festphasen-Trägers vernetzen. Typische chemische Agentien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind Glutaraldehyd und Dimethylsuberimidat. Das Hauptproblem, das mit der Verwendung dieser Agentien für Immunoassays mit ganzen Säugerzellen verbunden ist, liegt darin, daß diese zwar die Zellen an den Träger fixieren, aber auch einige reaktive Gruppen blockieren, welche für die antigene Aktivität verantwortlich sind. Aufgrund der enormen Komplexität und Vielzahl von antigenen Determinanten, die auf der Oberfläche der Zellen gefunden werden, ist kein einziges chemisches Vernetzungsmittel gefunden worden, das die Antigenizität der Zellmembran nicht beeinträchtigt. Chemische Vernetzungsmittel können effektiv in denjenigen Assays eingesetzt werden, in denen nur eine einzige oder wenige antigene Determinanten aufrechterhalten werden müssen. Wenn jedoch alle antigenen Determinanten aufrechtzuerhalten sind, wie im Falle von Assays, die Monoschichten von roten Zellen zum Nachweis irregulärer Antikörper in Patientenseren verwenden, können chemische Vernetzungsmittel nicht verwendet werden, da sie einige der potentiellen reaktiven Gruppen blockieren.
- Ganze Säugerzellen können auch durch Agentien fixiert werden, die Wasser aus der Zelle ziehen. Typische Agentien, welche Wasser aus Zellen ziehen oder Wasser innerhalb von Zellen ersetzen, sind Methanol, Aceton und Dimethylsulfoxid. Methanol und Aceton sind zur Fixierung von Gewebescheiben für mikroskopische Untersuchungen verwendet worden, sind jedoch nicht anwendbar bei immobilisierten Monoschichten von Zellen wie Erythrozyten, Lymphozyten oder Blutplättchen, da sie dazu neigen, Antigene auf der Oberfläche der Zellen, insbesondere rote Blutkörperchen, zu zerstören. Zusätzliche Probleme mit Chemikalien wie Methanol und Aceton sind diejenigen Probleme, die mit den Anforderungen an die Entsorgung gefährlichen Abfalls verbunden sind, deren Entzündlichkeit und Schädlichkeit, falls Dämpfe in das Labor entweichen. Agentien wie Dimethylsulfoxid, Zucker und Aminosäuren, die Wasser in der Zelle ersetzen, sind ebenfalls zur Erhaltung suspendierter Zellen eingesetzt worden, aber diese Zellen müssen gefroren gelagert und vor Verwendung gewaschen werden.
- Bei der Lagerung von Zellen in gefrorenem Zustand besteht immer das Folgeproblem des Aufbrechens der Zellmembran während der Gefrier-Auftau-Zyklen und somit ein folglicher Verlust von Zellen. Zusätzliche Probleme, die mit Methoden, welche das Einfrieren der Zellen beinhalten, verbunden sind, sind die Betriebskosten für Gefrierschränke und der Verlust von Laborraum und die Unbequemlichkeit, die Zellen vor der Verwendung auf zutauen und zu waschen.
- Somit besteht auf dem Gebiet der Immunologie ein Bedürfnis für ein Verfahren zum Trocknen oder Fixieren von Monoschichten von Säugerzellen auf Festphasen-Träger zur Verwendung in Immunoassays, welches das oben erörterte Problem beseitigt.
- EP-A-0140489 offenbart die Stabilisierung einer immobilisierten immunaktiven Substanz durch Eintauchen des Systems in eine Lösung, welche einen Zucker oder ein Protein umfaßt.
- EP-A-0243818 offenbart die Fixierung von lebenfähigen Säugerzellen auf ein Substrat durch Beschichten des Substrats mit einer sterilen Formulierung, welche ein biohaftendes polyphenolisches Protein mit einer positiven Nettoladung umfaßt, und Aufbringen der lebensfähigen Zellen auf das beschichtete Substrat.
- Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Trocknung ganzer Säugezellen auf einem Festphasen-Träger die Schritte:
- Immobilisieren der Zellen auf dem Träger, wobei die Antigenizität der Zellen im wesentlichen intakt bleibt;
- Lysieren der immobilisierten Zellen;
- Inkontaktbringen der lysierten immobilisierten Zellen mit einer wäßrigen trocknenden Lösung, die ein Salz und einen aus Monosacchariden, Disacchariden, Trisacchariden und Cyclitolen ausgewählen Zucker umfaßt; und
- Entfernen der trocknenden Lösung aus dem Kontakt mit den immobilisierten Zellen.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt ein Artikel, der zur Durchführung von immunologischen Assays in fester Phase geeignet ist, einen Festphasen-Träger; eine Beschichtung eines organischen Farbstoffs mit einer positiven Nettoladung und einer hydrophoben aromatischen Ringstruktur, der an den Träger adsorbiert ist; und auf dem organischen Farbstoff immobilisiert eine getrocknete Monoschicht, die ganze Säugerzellen mit im wesentlichen intakter Immunogenizität, ein wie oben definiertes Salz und einen wie oben definierten Zucker umfaßt.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt ein Festphasen-Assay für die Anwesenheit einer immunologisch reaktiven Komponente in einem biologischen Fluid das Inkontaktbringen des biologischen Fluids mit einer festen Oberfläche, auf der sich eine wie oben definierte getrocknete Monoschicht befindet, wobei die Zellen Antigene auf ihren Zelloberflächen präsentieren; das Entfernen des biologischen Fluids aus dem Kontakt mit den Zellen, wobei die Antigenizität der Zellen im wesentlichen erhalten bleibt; und Analyse des Trägers hinsichtlich der Adhäsion oder mangelnden Adhäsion der immunologisch reaktiven Komponente an den Zellen.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine ein Monosaccharid, Disaccharid, Trisaccharid oder Cyclitol enthaltende Salzlösung geeigneter Hypotonizität dazu verwendet werden kann, Monoschichten von Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten und Blutplättchen, welche auf Festphasen-Träger immobilisiert sind, aufrechtzuerhalten, wobei die vollständige antigene Aktivität der Zellen immer noch erhalten bleibt. Monoschichten immobilisierter Zellen, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen wurden, können bei Raumtemperatur mindestens 6 Monate ohne signifikanten Verlust an Genauigkeit oder Empfindlichkeit gelagert werden.
- Das bevorzugte Verfahren zur Immobilisierung der vorliegenden Zellen an den Festphasen-Träger ist die Adsorption der Zellen an einen Festphasen-Träger, der vorher mit einem organischen Farbstoff mit einer positiven Nettoladung gefärbt wurde. Zu dieser Monoschicht immobilisierter Zellen wird die trocknende Lösung hinzugefügt. Der bevorzugte Konzentrationsbereich des Monosaccharids, Disaccharids, Trisaccharids oder Cyclitols in der trocknenden Lösung liegt zwischen 0,1 Mol/Liter-3,0 Mol/Liter. Der bevorzugte Bereich des Salzes in der trocknenden Lösung beträgt 50 mMol/Liter-377 mMol/Liter. Das bevorzugt einzusetzende Salz ist Natriumchlorid, aber andere Salze wie Kaliumchlorid und Natriumphosphat können mit gleicher Wirksamkeit und Eignung verwendet werden. Während jedes Monosaccharid, Disaccharid, Trisaccharid oder Cyclitol verwendet werden kann, ist die bevorzugte Substanz Dextrose oder D(-)glucose und die bevorzugte trocknende Lösung umfaßt 1,0 Mol/Liter Dextrose und 154 mMol/Liter NaCl.
- Bei Immunoassays in fester Phase wird ein breites Spektrum von Artikeln als Struktur des festen Trägers verwendet. Der Träger hat oft die Form von Reagenzgläsern, Materialfolien, Petrischalen, Membranen oder Mikrotiterplatten. Andere Typen von Trägern oder Formen von Trägern sind zur Durchführung der Ziele und Aufgaben der vorliegenden Erfindung geeignet und gleichermaßen einsetzbar.
- Die feste Phase kann aus einem organischen Polymer wie einem Polystyrol, Polypropylen, Polyvinylchlorid oder Nylon bestehen. Darüber hinaus sind Materialien, welche imstande sind, eine Monoschicht von Säugerzellen zu binden oder zur Bindung einer Monoschicht von Säugerzellen adaptiert werden können, gleichermaßen geeignet, z.B. Glas.
- Der am meisten bevorzugte Festphasen-Träger zur Durchführung von Immunoassays, welche die vorliegende Erfindung verkörpern, sind Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen. Die Mikrotiterplatten sind vorzugsweise aus einem organischen Polymer, und besonders bevorzugt aus Polystyrol, gefertigt.
- Zur Erreichung der Ziele und Aufgaben dieser Erfindung ist es wünschenswert, daß die Monoschicht von Zellen an die Oberfläche des Festphasen-Trägers auf eine Weise adsorbiert wird, welche die vollständige Antigenizität der verwendeten Säugerzelle intakt läßt. Dies wird am besten erreicht durch die Absorption von einem organischen Farbstoff oder Farbstoffen auf die Oberfläche einer organischen Polymer-Oberfläche. Zum Zweck der Immobilisierung von humanen Erythrozyten, Lymphozyten, Leukozyten oder Blutplättchen, die jeweils eine negative Oberflächennettoladung tragen, muß der Farbstoff eine positive Nettoladung aufweisen. Wenn die Zellen in physischen Kontakt mit dem Farbstoff kommen, werden die Zellen durch Adsorption an den Farbstoff durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, z.B. ionische Bindung, Wasserstoff-Bindung, Van der Waal's Kräfte und hydrophobe Bindung, immobilisiert. Auf diese Weise ergibt sich eine Monoschicht von immobilisierten Zellen nachdem ungebundene Zellen weggewaschen wurden. Die Zellmonoschicht kann dann in immunologischen Assays, z.B. Adhäsion von roten Zellen in fester Phase, zum Nachweis von Antikörpern gegen Antigene, die auf der Oberfläche der immobilisierten Zellen gefunden werden, eingesetzt werden. Es können auch spezifische Antikörper auf die Zellmonoschichten adsorbiert werden, um spezifische Antigene in biologischen Testlösungen nachzuweisen.
- Farbstoffe, die zur Adsorbierung von Säugerzellen am geeignetsten befunden wurden, sind organische Farbstoffe, welche eine positive Nettoladung aufweisen und eine hydrophobe aromatische Ringstruktur besitzen. Jeder Farbstoff, der eine solche positive Nettoladung und eine hydrophobe aromatische Ringstruktur aufweist, die an einem Festphasen-Träger haftet, ist als zur Immobilisierung von Säugerzellen, z .B. Erythrozyten, Lymphozyten, Leukozyten und Blutplättchen, imstande befunden worden. Die speziellen anwendbaren Farbstoffe und ein Verfahren zur Adsorption eines solchen Farbstoffs an den Festphasen-Träger sind in EP-A-0350233 erörtert.
- Im allgemeinen sind als die am meisten bevorzugten Farbstoffe für diesen Zweck Phthalocyaninblau und Alcian-Gelb befunden worden. Phthalocyaninblau ist ein Phthalocyanin und Alcian- Gelb ist ein Azofarbstoff, die jeweils eine positive Nettoladung aufweisen. Andere Farbstoffe mit einer positiven Nettoladung, die ebenfalls verwendet werden können, schließen Diazo- Farbstoffe, Polyazo-Farbstoffe, Diazonium- und Tetrazoniumsalze, Tetrazoliumsalze, Triphenylmethane, Xanthene oder Acridine, Chinolinfarbstoffe, Thiazole, Indamine, Azine, Aminoazine, Saffronine, Thiazine und Phthalocyanine ein.
- Wenn Phthalocyaninblau verwendet werden soll, wird es zuerst in isotonischer Salzlösung bei einer Konzentration von 1 ug/ml bis 1 g/ml gelöst. Die bevorzugte Konzentration beträgt 0,1 mg/ml und es werden 50 - 250 ul auf den organischen Polymer- Träger aufgebracht, um den Festphasen-Träger vollständig zu bedecken. Der Farbstoff wird für einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt mit dem Festphasen-Träger gelassen und dann überschüssiger Farbstoff weggewaschen. Für die meisten Farbstoffe braucht die Kontaktzeit nur ein sofortiger Kontakt sein, aber bei einigen anderen Farbstoffen ist eine längere Zeitspanne nötig, um die Absorption des Farbstoffs an den Festphasen- Träger zu erreichen. Wenn Alcian-Gelb verwendet werden soll, muß es zuerst in einer ausreichenden Menge von 100% Methanol gelöst werden, da Alcian-Gelb in wäßrigen Lösungen nicht löslich ist. Dann wird ein gleiches Volumen isotonischer Salzlösung zu dem gelösten Alcian-Gelb bis zu einem endgültigen Konzentrationsbereich von 1 ug/ml bis 1 g/ml, und besonders bevorzugt 0,1 mg/ml, zugegeben. Wieder werden 50 - 250 ul der Alcian-Gelb-Lösung auf den Festphasen-Träger, vorzugsweise eine Mikrotiterplatte, aufgebracht, um die Absorption des Farbstoffs auf dem Festphasen-Träger zu erreichen.
- Um die Zellmonoschichten auf dem Festphasen-Träger, der mit dem organischen Farbstoff mit einer positiven Nettoladung gefärbt ist, zu erzeugen, müssen die zu immobilisierenden Zellen zuerst frei von kontaminierenden Proteinen gewaschen werden. Geeignete Waschlösungen für rote Blutkörperchen sind isotonische Salzlösung, Verdünnungsreagenz für rote Blutkörperchen (von Immucor, Inc.) oder phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4. Für Blutplättchen kann eine Alsever'sche Lösung oder eine modifizierte Alsever'sche Lösung oder eine "Blutplättchen-Wasch- und Lagerungslösung" (von Immucor, Inc.) verwendet werden.
- Die bei dieser Erfindung verwendeten Zellen werden aus industriell bekannten Standardquellen erhalten. Nachdem die Zellen gewaschen sind, werden sie typischerweise in isotonischer Salzlösung suspendiert. Die Konzentration der Zellen in der Suspension für die Zwecke dieser Erfindung liegt im Bereich zwischen 0,1% bis 0,4% (V/V). Der geeignetste Bereich liegt zwischen 0,1% - 0,2% (V/V)
- Die gewaschene Zellsuspension wird zu dem mit Farbstoff beschichteten Festphasen-Träger zugegeben und man läßt die Zellen durch Absetzen der Zellen oder durch Zentrifugation in Kontakt mit dem Farbstoff kommen. Nachdem den Zellen eine ausreichende Zeitspanne zur Bindung an den organischen Farbstoff gegeben wurde, wird überschüssige Zell-Lösung abdekantiert, was eine Monoschicht von Zellen immobilisiert an den Farbstoff-beschichteten Festphasen-Träger hinterläßt. Typischerweise sind 1 bis 5 Minuten erforderlich, wenn das Zentrifugationsverfahren verwendet wird, und 40 - 60 Minuten, wenn man die Zellen durch Schwerkraft absetzen läßt. Wenn kleinere Zellen, z.B. Blutplättchen, verwendet werden, ist es am besten, wenn man sie über Nacht absetzen läßt, um einen vollständigen Kontakt und die Bildung einer gleichmäßigen Zellmonoschicht sicherzustellen.
- Sobald die Zellmonoschicht an den Festphasen-Träger adsorbiert worden ist, wird die trocknende Lösung der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, um die Zellen an den Festphasen- Träger zu trocknen oder zu fixieren. Es wurde gefunden, daß bei Verwendung roter Blutkörperchen als Zellmonoschicht hinsichtlich eines empfindlicheren Assays bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die Zellen, welche die Monoschicht ausmachen, vor der Zugabe der trocknenden Lösung mit einer geeigneten Lysierungslösung lysiert werden. Für Blutplättchen, Lymphozyten und Leukozyten ist der lysierende Schritt nicht erforderlich.
- Im allgemeinen umfaßt die trocknende Lösung eine wäßrige Lösung, die ein Salz und einen aus der Gruppe aus Monosacchariden, Disacchariden, Trisacchariden und Cyclitolen ausgewählten Zucker enthält. Das für die vorliegende Erfindung geeignete Monosaccharid, Trisaccharid oder Cyclitol kann ausgewählt werden aus der Gruppe aus D-(+)Raffinose, L-(-)Sorbose, D- (+)Trehalose, D-(+)Xylose, D-(-)Glucose, D-(-)Sorbit, Sucrose, L-(+)Arabinose, D-(-)Cellobiose, D-(-)Fructose, D-(+ )Galactose, myo-Inosit (ein Cyclitol), α-Lactose, D-(+)Lyxose, Maltose und D-(+)Mannose. Insbesondere sind die geeignetsten Substanzen aus dieser Gruppe D-(-)Glucose, Sucrose, D-(-)Sorbit, D-(+)Lyxose, myo-Inosit, D-(+)Cellobiose und L-(-)Sorbose. Der am meisten bevorzugte Zucker aus den oben genannten Gruppen ist Dextrose von D-(-)Glucose (von Fisher), die die chemische Formel C&sub6;H&sub1;&sub2;O&sub6;.H&sub2;O aufweist. Es versteht sich auch, daß die entsprechenden enantiomeren Zucker der oben aufgeführten ebenso verwendet werden können. Die trocknende Lösung wird mit einer Monosaccharid-, Disaccharid-, Trisaccharid- oder Cyclitol-Konzentration von 0,1 Mol/Liter-3,0 Mol/Liter hergestellt. Die bevorzugteste Konzentration ist 1,0 M Dextrose, die am besten bei Zellmonoschichten von Erythrozyten und Blutplättchen funktioniert.
- Die für die vorliegende Erfindung geeigneten Salze schließen diejenigen ein, welche die Gruppe aus Natriumchlorid (NaCl), Kaliumchlorid (KCl) und Natriumphosphat bilden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich des Salzes in der trocknenden Lösung beträgt 50 mMol/Liter bis 377 mMol/Liter. Das bevorzugte Salz ist Natriumchlorid, das in der trocknenden Lösung in einer Konzentration von 154 mM anwesend ist.
- Die trocknende Lösung wird mit destilliertem und/oder deionisiertem Wasser in sauberen Glasgefäßen hergestellt, um zu vermeiden, daß irgendwelche kontaminierenden Proteine in das Assay-System eingeführt werden.
- Nachdem die trocknende Lösung hergestellt wurde, wird sie anschließend der Oberfläche des Festphasen-Trägers zugegeben, der die Zellmonoschicht enthält, z.B. ein Reagenzglas oder bevorzugter eine Mikrotiterplatte mit Vertiefungen. Das erforderliche Volumen der trocknenden Lösung, das zugegeben werden muß, um eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte zu bedecken, sollte ausreichen, um die Zellmonoschicht vollständig zu bedecken. 25 ul - 150 ul ist eine ausreichende Menge, wobei 100 ul die bevorzugte Menge darstellt. Die optimale Zeitspanne, welche die trockende Lösung zur Inkubation auf der Zellenmonoschicht benötigt, und die optimale Inkubationstemperatur müssen für jeden verschiedenen Typ der zu testenden Zellmonoschicht bestimmt werden. Ein Verfahren, das zur Bestimmung der optimalen Zeitspanne und der optimalen Inkubationstemperatur verwendet werden kann, ist die Herstellung einer Vielzahl von Vertiefungen mit einer einzigen Quelle von Zellen und das Zugeben derselben Menge an trocknender Lösung zu jeder Vertiefung und das Entfernenlassen der Vertiefungen für Assays in Zeitintervallen, die von einem sofortigen Kontakt und Dekantieren bis zu 4-stündiger Inkubation reichen. Wenn alle anderen Parameter konstant gelassen werden, wird eine Bewertung der Assay-Ergebnisse die optimale Inkubationszeit ergeben, die zum Erhalt optimaler Ergebnisse erforderlich ist. Ein ähnlicher Test kann durchgeführt werden, wobei nur die Temperatur variiert wird. Die optimale Inkubationszeit und -temperatur für die Zugabe der trocknenden Lösung zu Monoschichten von humanen Blutplättchen, Leukozyten, Lymphozyten und Erythrozyten ist eine sofortige Zugabe und Dekantierung der trocknenden Lösung bei Raumtemperatur. Die trocknende Lösung wird am besten von den Zellmonoschichten entfernt, indem sie schnell über einen Abfluß ausgeleert wird oder durch Absaugen im Vakuum. Andere Verfahren zum Entfernen der trockenen Lösung sind gleichermaßen anwendbar.
- Das Reagenzglas oder die Mikrotiterplatte werden dann in ein(en) Folienbeutel oder Paket mit einem darin befindlichen Trocknungsmaterial eingebracht und versiegelt. Der Beutel sollte sehr geringe oder keine Wasserdurchlässigkeit aufweisen und das ganze Wasser in dem Reagenzglas oder der Mikrotiterplatte muß durch das Trocknungsmaterial absorbiert werden. Das bevorzugte Trocknungsmaterial für diesen Zweck sind Molekularsieb-Trocknungsmittel, die aus in der Industrie bekannten Quellen erhalten werden. Andere Trocknungsmaterialien wie Diatomeen-Erde und Silica-Partikel oder Vakuumtrocknung können ersatzweise verwendet werden, ergeben jedoch weniger zufriedenstellende Ergebnisse. Die Menge des erforderlichen Trocknungsmaterials ist eine Menge mit einer Kapazität zur Absorption einer größeren Wassermenge als diejenige, welche auf dem Festphasen-Träger vorhanden ist. Es ist festgestellt worden, daß bei Verwendung von Molekularsieb-Trocknungsmitteln mit 2 g Kapazität die Zugabe von 2 - 3 solcher Pakete ausreichend ist. Der annehmbare Temperaturbereich und die zur Absorption des Wassers auf dem Festphasen-Träger erforderliche Zeit durch das Trocknungsmittel in einem versiegelten Beutel wurde als 3 - 8 Tage bei 2 - 8ºC festgestellt, wobei der geeignetste Bereich 5 - 7 Tage bei 2 - 8ºC ist. Für humane Erythrozyten, Lymphozyten, Leukozyten und Blutplättchen beträgt die optimale Trocknungszeit 7 Tage bei 2 - 8ºC. Nach dieser Absorptionsperiode kann der versiegelte Festphasen-Träger bei Raumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen mindestens bis zu 6 Monate ohne jeglichen Verlust bei der Genauigkeit des Assays oder der Effizienz gelagert werden.
- Obwohl es nicht absolut erforderlich ist, werden die Monoschichten roter Blutkörperchen vorzugsweise vor der Zugabe der trocknenden Lösung lysiert, um die Zelle von einigem intrazellulären Inhalt zu befreien. Dies fördert das Trocknungsverfahren, indem es der trocknenden Lösung besseren Zugang zum Inneren der Zelle gestattet. Die Lysierungslösung kann aus einer Lösung von deionisiertem Wasser bis zu einer 120 mM NaCl- Salzlösung gewählt werden. Es können auch hypertonische Lösungen von 300 - 800 mM NaCl verwendet werden. Als Lysierungslösung ist 80 mM NaCl am meisten bevorzugt.
- Nachdem die Lösung roter Blutkörperchen in Kontakt mit dem gefärbten Festphasen-Träger gelassen wurde, wird überschüssige Zell-Lösung dekantiert und die Lysierungslösung wird direkt der Zellmonoschicht zugegeben und 1 bis 30 Minuten inkubieren gelassen. Es wurde festgestellt, daß die optimale Inkubationszeit für Erythrozyten 1 Minute beträgt. Die Lysierungslösung wird dekantiert und der Artikel zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Die trocknende Lösung wird dann wie oben beschrieben zugegeben.
- Es können für die Lysierungslösung auch andere Lösungen als NaCl verwendet werden, z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Kaliumchlorid, Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) und Gewebekulturmedien.
- Zur Verwendung des Festphasen-Trägers mit einer darauf befindlichen Monoschicht der getrockneten Säugerzellen wird der Beutel geöffnet und das zu testende biologische Fluid zu dem Reagenzglas oder der Mikrotiterplattenvertiefung zugegeben. Typischerweise ist das biologische Fluid humanes Serum oder Plasma. Ein Additiv niedriger Ionenstärke, z.B. eine Glycin- Lösung mit etwa 19 g/Liter, kann zu diesem Zeitpunkt ebenfalls zu den Vertiefungen gegeben werden. Die Glycin-Lösung kann zusätzlich ein Konservierungsmittel wie Thimerosol und einen Farbstoff enthalten. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden das Reagenzglas oder die Mikrotiterplattenvertiefungen gewaschen, um umgebundene Plasma- oder Serum-Komponenten zu entfernen. Die Anwesenheit von spezifisch an die immobilisierte Zellmonoschicht bindenden Antikörpern kann durch eine Anzahl von Verfahren nachgewiesen werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, z .B. Radioimmunoassays, Enzym-verknüpfte-Immunosorbens-Assays (ELISA), Immunfluoreszenz oder Adhäsion von roten Zellen in fester Phase.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Festphasen-Träger sind in einer breiten Vielfalt von immunologischen Assays verwendbar, einschließlich dem Antikörper-Screening für den Nachweis von unerwarteten Antikörpern gegen Human-Erythrozyten oder Human-Blutplättchen, Antikörper-Screening zur Bestimmung der Identität eines Antikörpers in einer biologischen Probe unter Verwendung einer Gruppe von Erythrozyten oder Blutplättchen mit variierenden bekannten Antigen-Mustern, reverser ABO-Gruppierung, direkter ABO-Gruppierung und D-Typen-Bestimmung, Erythrozyten-Phenotypen-Bestimmung und dem Nachweis von Antikörpern gegen Gewebezellen von Säugern.
- Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sind nicht als Beschränkung anzusehen.
- Zur Durchführung eines Immunoassays für den Nachweis unerwarteter Antikörper gegen Human-Erythrozyten unter Verwendung der Lehre der vorliegenden Erfindung wird zuerst eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen mit einer ausreichenden Menge Alcian-Gelb bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml behandelt, so daß alle Vertiefungen mit der Alcian- Gelb-Lösung bedeckt sind. Man läßt die Alcian-Gelb-Lösung etwa 30 Minuten in Kontakt mit der Mikrotiterplatte und überschüssige Farbstofflösung wird entfernt. Eine Monoschicht von Human-Erythrozyten oder roten Blutkörperchen wird auf der gefärbten Platte durch die Zugabe von 100 ul einer 0,2%-igen (V/V) Lösung humaner RBC's in Salzlösung oder Verdünnungsreagenz für rote Blutkörperchen pro Vertiefung gebildet. Man läßt die Erythrozyten durch Schwerkraft 1 Stunde lang bei Raumtemperatur absetzen. Die Zellen werden dann durch die Zugabe von 100 ul 80 mM NaCl pro Vertiefung lysiert. Man läßt die lysierende Lösung 1 Minute lang bei Raumtemperatur in den Vertiefungen inkubieren und entfernt sie dann durch Absaugen. Die Platte wird mindestens zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen, um ungebundene Erythrozyten durch eine automatische Waschvorrichtung oder durch manuelle Verfahren zu entfernen. 100 ul der trocknenden Lösung, die 1,0 M Dextrose und 154 mM Natriumchlorid enthält, werden zu jeder Vertiefung zugegeben. Unmittelbar nach der Zugabe der trocknenden Lösung wird jede Vertiefung abgesaugt, um jegliche überschüssige trocknende Lösung zu entfernen. Die Mikrotiterplatte wird dann in umgedrehter Position in ein Folienpaket oder einen Beutel mit mindestens zwei darin befindlichen Molekularsieb-Trocknungspaketen mit 2 g Kapazität eingebracht. Der Beutel wird hitzeversiegelt und 7 Tage bei 2 - 8ºC getrocknet.
- Um die Mikrotiterplatte in einem immunologischen Assay zu verwenden, wird die Folienpackung geöffnet und 1 Tropfen eines biologischen Fluids wie Serum oder Plasma oder einer Kontrolle wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Es werden ebenfalls 2 Tropfen einer 19 g/Liter-Lösung von Glycin mit einem Konservierungsmittel und einem Farbstoff zur Färbung zu jeder Vertiefung zugegeben. Man läßt diese Lösungen in den Vertiefungen 15 Minuten lang bei 37ºC inkubieren. Nach der Inkubationsperiode werden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte dreimal mit Salzlösung gewaschen, vorzugsweise mittels einer automatischen Waschvorrichtung wie dem Bio-Tek Modell EL-402. Dann wird 1 Tropfen von mit Anti-IgG beschichteten roten Indikator-Blutkörperchen zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Mikrotiterplatte wird bei 450 x g 1 Minute lang zentrifugiert. Die Platte wird dann auf die Adhäsion oder mangelnde Adhäsion der roten Indikator-Blutkörperchen an die Erythrozyten-Zellmonoschicht überprüft. Eine positive Reaktion wird durch Adhäsion der roten Indikator-Zellen über die Reaktionsoberfläche sichtbar. Eine negative Reaktion bildet einen diskreten Klumpen von roten Indikator-Blutkörperchen am Boden der Vertiefungen, die keine Adhäsion zeigen.
- Wenn somit das getestete biologische Fluid Antikörper gegen die Erythrozyten-Zellmonoschicht aufweist, bindet es an die Erythrozyten-Monoschicht. Die mit Anti-IgG beschichteten roten Indikator-Blutkörperchen binden dementsprechend an den so gebundenen Antikörper, wenn sie zu den Vertiefungen zugegeben werden. Dies ergibt die beschriebene positive Reaktion. Falls in dem zu testenden biologischen Fluid keine Antikörper gegen die Erythrozyten anwesend sind, würden die mit Anti-IgG beschichteten roten Indikator-Blutkörperchen keine komplementäre immunologische Komponente zur Bindung daran haben und würden sich als diskreter Klumpen am Boden der Vertiefung wie oben beschrieben ansammeln. Immunologische Assays unter Verwendung des obigen Verfahrens und Festphasen-Trägers ergeben konstant empfindlichere Ergebnisse als solche, die durch standardmäßige Röhrchentests erhalten werden.
- Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, um eine Mikrotiterplatte mit einer Antikörpergruppe für Assays für den Nachweis von unerwarteten Antikörpern gegen Human-Erythrozyten herzustellen. Eine Mikrotiterplatte wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß eine Gruppe von Human-Erythrozyten mit bekannten und variierenden Blutgruppenantigen-Phenotypen oder -Mustern an individuelle Vertiefungen der gefärbten Mikrotiterplatte adsorbiert ist. Die Erythrozyten werden lysiert, gewaschen und getrocknet wie in Beispiel 1 beschrieben. Um unerwartete Antikörper nachzuweisen und um den spezifischen Antikörper zu bestimmen, der in einer Probe von Testserum oder -plasma nachgewiesen wurde, wird ein Tropfen eines solchen Serums oder Plasmas zu jeder Vertiefung der Gruppe getrockneter Erythrozyten auf der Mikrotiterplatte zugegeben. Der Assay wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt und die Spezifität des Antikörpers in der Probe, die positive Reaktionen in einzelnen Vertiefungen verursacht, kann dann bestimmt werden durch Interpretation der Phenotypen der Gruppenmitglieder der einzelnen Vertiefungen, welche die positive Reaktion zeigen.
- Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, um Mikrotiterplatten herzustellen, die zum Antikörper-Screening für den Nachweis von unerwarteten Antikörpern gegen Human- Blutplättchen geeignet sind. Eine Mikrotiterplatte wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit Alcian-Gelb gefärbt. Eine Blutplättchen-Zellmonoschicht wird durch Zugabe von 100 ul einer 0,1%-igen (V/V) Suspension von Blutplättchen und modifizierter Alsever'scher Lösung (von Immucor) zu jeder der Mikrotiterplattenvertiefungen gebildet. Man läßt die Blutplättchen durch Schwerkraft 24 Stunden lang bei 2 - 8ºC absetzen. Überschüssige Blutplättchen-Lösung wird dekantiert und die Platte zweimal mit einer isotonischen Salzlösung gewaschen. 100 ul einer trocknenden Lösung, die 1,0 M Dextrose und 154 mM NaCl enthält, werden zu jeder Vertiefung zugegeben und sofort dekantiert. Die Platte wird in eine Folienpackung mit einem Molekularsieb-Trocknungsmittel eingebracht und 7 Tage lang bei 2 - 8ºC trocknengelassen. Um auf unerwartete Antikörper in humanem biologischen Fluid zu testen, wird ein Tropfen von Serum, Plasma oder Kontrolle zu jeder Vertiefung zugegeben und in den Vertiefungen 15 Minuten lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Die Vertiefungen werden dreimal mit einer isotonischen Salzlösung gewaschen und ein Tropfen roter Indikator-Blutkörperchen zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wird bei 900 x g 1 Minute lang zentrifugiert und dann auf die Adhäsion oder fehlende Adhäsion der roten Indikator-Blutkörperchen an der Blutplättchen-Monoschicht überprüft. Eine positive Reaktion zeigt eine Adhäsion der roten Indikator-Blutkörperchen über die Vertiefungsoberfläche. Eine negative Reaktion bildet einen diskreten Klumpen von roten Indikator-Blutkörperchen am Boden der Vertiefungen.
- Wenn somit das getestete biologische Fluid Antikörper gegen Blutplättchen aufweist, bindet es an die Blutplättchen-Monoschicht. Wenn keine solchen Antikörper in dem biologischen Fluid anwesend sind, sammeln sich die Indikatorzellen am Boden der Vertiefung an. Assays, die das obige Verfahren und Festphasen-Träger verwenden, ergeben konstant empfindlichere Resultate als diejenigen, die durch Standard-Röhrchentests erhalten werden.
- Eine gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Mikrotiterplatte kann verwendet werden zur Herstellung einer Antikörpergruppe für den Nachweis von unerwarteten Antikörpern gegen Human-Blutplättchen. Dieser Assay wird genauso hergestellt und durchgeführt wie der in Beispiel 3 beschriebene Immunoassay, mit der Ausnahme, daß eine Gruppe von Human-Blutplättchen mit bekannten und variierenden Antigen-Phenotypen oder -Mustern in individuellen Vertiefungen der Mikrotiterplatte hergestellt wird. Die Mikrotiterplatte wird gewaschen und durch Zugabe der trocknenden Lösung getrocknet, in einer Weise, die der in Beispiel 3 beschriebenen entspricht. Die Mikrotiterplatte wird in dem Immunoassay eingesetzt, indem ein Tropfen von Serum oder Plasma zu jeder individuellen Vertiefung getrockneter Blutplättchen zugegeben wird. Der Assay wird wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Spezifität des Antikörpers in der Probe in individuellen Vertiefungen, die positive Reaktionen verursachen, kann dann durch Interpretation der Phenotypen des individuellen Gruppenmitglieds bestimmt werden.
- Der Assay von Beispiel 4 kann dazu eingesetzt werden, um die Identifizierung anderer spezifischer Blutplättchen-Antikörper als HLA zu erlauben, indem das HLA-Antigen vor der Zugabe der trocknenden Lösung durch Chlorochin entfernt wird. Die in Beispiel 4 angegebene Prozedur wird wie folgt modifiziert: Nachdem die Blutplättchen-Monoschichten hergestellt wurden, werden 100 ul/Vertiefung von 100 mg/ml Chlorochin in 20 mM Puffer, pH 6,0, zugegeben. Die Kontrollvertiefungen enthalten lediglich 20 mM MES-Puffer. Die Mikrotiterplatte wird 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und viermal mit Salzlösung gewaschen. Die trocknende Lösung, wie in Beispiel 4 beschrieben, wird zugegeben und die endgültige Herstellung der Mikrotiterplatte und der Assay verläuft wie in Beispiel 4 beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, um Festphasen-Träger herzustellen, die zur Durchführung von reversen ABO-Gruppierungs-Assays geeignet sind. Eine Mikrotiterplatte wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Alcian-Gelb gefärbt und 100 ul eine 0,2%-igen (V/V) Suspension von roten A&sub1;- und eine ähnliche Suspension von roten B-Blutkörperchen in Salzlösung oder Verdünnungsreagenz für rote Blutkörperchen werden zu einer Vielzahl von separaten Vertiefungen zugegeben. Die roten Blutkörperchen werden durch Schwerkraft 40 - 60 Minuten bei Raumtemperatur absetzen gelassen. 100 ul von 80 mM Natriumchlorid werden zu jeder Vertiefung zugegeben, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die lysierende Lösung wird 1 Minute bei Raumtemperatur in den Vertiefungen inkubieren gelassen und dann durch Absaugen entfernt. Die Mikrotiterplatte wird dann zweimal mittels einer automatischen Waschvorrichtung mit isotonischer Salzlösung gewaschen. 100 ul einer trocknenden Lösung, umfassend 1,0 Mol/Liter Dextrose und 154 mMol/Liter Natriumchlorid, werden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die trocknende Lösung wird sofort nach ihrer Zugabe zu den Vertiefungen durch Absaugen entfernt und die Mikrotiterplatte in umgedrehter Position in einen Folienbeutel mit einem darin befindlichen Molekularsieb-Trocknungsmittel eingebracht. Der Beutel wird hitzeversiegelt und 5 Tage lang bei 2 - 8ºC trocknengelassen. Um die reversen ABO-Gruppierungs-Assays durchzuführen, wird die Folienpackung geöffnet und ein Tropfen von Serum, Plasma oder einer Kontrolle zu jeder Vertiefung zugegeben und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Die Mikrotiterplatte wird dreimal mittels einer automatischen Waschvorrichtung mit Salzlösung gewaschen. Ein Tropfen von roten A&sub1;B-Indikator-Blutkörperchen wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Mikrotiterplatte wird 1 Minute lang bei 450 x g zentrifugiert und die Platte auf die Adhäsion oder mangelnde Adhäsion der roten Indikator-Blutkörperchen an der Erythrozyten-Zellmonoschicht überprüft. Wenn die Probe des biologischen Fluids des Patienten Antikörper gegen rote Blutkörperchen vom A&sub1;-Typ aufweist, werden sie an Vertiefungen mit Monoschichten roter Blutkörperchen vom A&sub1;-Typ binden und eine positive Reaktion wird durch Adhäsion der Indikatorzellen über die Reaktionsoberfläche sichtbar. Falls das Serum oder Plasma des Patienten Antikörper gegen rote Blutkörperchen vom B-Typ aufweist, werden sie auf ähnliche Weise an Vertiefungen mit Monoschichten roter Blutkörperchen vom B-Typ binden. Eine negative Reaktion bildet einen diskreten Klumpen von roten Indikator- Blutkörperchen am Boden der Vertiefung, die keine Adhäsion zeigt.
- Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, um Festphasen-Träger herzustellen, die zur Durchführung von Assays zur Bestimmung direkter ABO-Gruppierung und D-Typenbestimmung geeignet sind. Eine mit Alcian-Gelb gefärbte Mikrotiterplatte wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und 100 ul von separaten 0,2%-igen (V/V) Suspensionen von roten A&sub1;-, B- und O-Rh-positiven Blutkörperchen in Salzlösung werden zu separaten Vertiefungen zugegeben. Die roten Blutkörperchen werden durch Schwerkraft 1 Stunde lang bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Nachdem sich die Zellen abgesetzt haben, wird überschüssige Zell-Lösung von der Platte dekantiert. Die Zellmonoschichten werden dann durch Zugabe von 100 ul der geeigneten Verdünnung von Anti-A, Anti-B und Anti-D in die geeigneten Vertiefungen sensibilisiert. Die Antiseren werden 60 Minuten lang bei 37ºC in der Vertiefung inkubiert und überschüssige Antiseren durch Absaugen entfernt. 100 ul von 80 mM Natriumchlorid als lysierende Lösung werden dann zu jeder Vertiefung zugegeben und 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die überschüssige lysierende Lösung wird durch Absaugen entfernt und die Platte zweimal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Eine trocknende Lösung, umfassend 100 u1 von 1,0 Mol/Liter Dextrose und 154 mMol/Liter Natriumchlorid mit 0,5% Bromelain, wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Die trocknende Lösung wird durch Absaugen unmittelbar nach ihrer Zugabe zu der Vertiefung entfernt und die Mikrotiterplatte in umgedrehter Position in eine Folienpackung mit Molekularsieb-Trocknungsmittel eingebracht. Die Folienpakkung wird mit Hitze versiegelt und 7 Tage bei 2 - 8ºC trocknen gelassen.
- Um Assays für direkte ABO-Gruppierungen und D-Typenbestimmung durchzuführen, welche die oben hergestellte Mikrotiterplatte verwenden, wird ein Tropfen einer 0,2 - 0,3%-igen (V/V) Suspension von roten Test-Blutkörperchen, in Salzlösung verdünnt, zu jeder Vertiefung zugegeben und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Die Mikrotiterplatte wird dann 1 Minute lang bei 450 x g zentrifugiert. Die Platte wird hinsichtlich der Adhäsion oder mangelnden Adhäsion der roten Test-Blutkörperchen an der sensibilisierten Erythrozyen-Monoschicht überprüft. Eine positive Reaktion wird durch Adhäsion der Zellen über die Reaktionsoberfläche sichtbar. Wenn die roten Test- Blutkörperchen an den Vertiefungen haften, die rote A&sub1;-Blutkörperchen mit Anti-A-Antiseren enthalten, sind die roten Test-Blutkörperchen Zellen vom A-Typ. Wenn die Test-Zellen vom B-Typ sind, werden sie an Vertiefungen mit an die Zellen adsorbierten Anti-B binden. Rote Blutkörperchen vom AB-Typ werden sowohl an Anti-A- als auch Anti-B-sensibilisierte Zellen binden und Blutkörperchen vom 0-Typ werden an keiner der Zellen haften. Rote Test-Blutkörperchen, die D+ sind, binden an die Zellen, welche Anti-D tragen, Zellen, die D- sind, jedoch nicht. Eine negative Reaktion bildet einen diskreten Klumpen roter Zellen am Boden der Vertiefung, welche keine Adhäsion zeigt.
- Die vorliegende Erfindung wird eingesetzt zur Herstellung von Festphasen-Trägern, die für Assays zur Bestimmung der Phenotypen von roten Blutkörperchen geeignet sind. Mikrotiterplatten werden wieder wie in Beispiel 1 beschrieben mit Alcian-Gelb gefärbt und Monoschichten von Zellen in individuellen Vertiefungen hergestellt durch Zugabe von 100 ul einer 1%-igen (V/V) Suspension von individuellen Lösungen roter Blutkörperchen in Salzlösung mit bekannten Antigen-Blutgruppen-Phenotypen. Die Zellsuspensionen werden durch Schwerkraft 1 Stunde lang bei Raumtemperatur absetzen gelassen und überschüssige Lösung wird durch Dekantieren entfernt. Die Zellmonoschichten werden dann mit 100 ul der geeigneten Verdünnung eines interessierenden Antiserums sensibilisiert und 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die interessierenden Antiseren werden die für ein spezielles bekanntes Antigen auf den Zellen, welche die Monoschicht bilden, spezifischen Antikörper sein. Die Zellmonoschicht wird dann lysiert durch Zugabe von 100 ul/Vertiefung von 80 mM Natriumchlorid, wobei die überschüssige lysierende Lösung durch Absaugen nach 1-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur entfernt wird. Die Platte wird dann zweimal mit isotonischer Salzlösung durch das geeignete Verfahren gewaschen. Dann werden 100 ul einer trocknenden Lösung zu jeder Vertiefung zugegeben, wobei die trocknende Lösung 1,0 Mol/Liter Dextrose und 154 mMol/Liter Natriumchlorid umfaßt. Die trocknende Lösung wird sofort durch Absaugen entfernt und die Mikrotiterplatte in umgekehrter Position mit einem Molekularsieb-Trocknungsmittel in ein Folienpaket eingebracht. Das Paket wird hitzeversiegelt und 7 Tage lang bei 4ºC trocknen gelassen.
- Um die Assays zur Phenotypenbestimmung roter Blutkörperchen durchzuführen, wird die Mikrotiterplatte aus der Folienpackung entfernt und 1 Tropfen einer 0,2 - 0,3%igen (V/V) Suspension von roten Test-Blutkörperchen, die vorher in Salzlösung verdünnt wurden, zu jeder Vertiefung zugegeben und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubierengelassen. Die Mikrotiterplatte wird 1 Minute bei 450 x g zentrifugiert und die Platte dann auf die Adhäsion oder mangelnde Adhäsion der roten Test-Blutkörperchen an der Erythrozyten-Zellmonoschicht überprüft. Eine positive Reaktion wird sichtbar durch Adhäsion der Zellen über die Reaktionsoberfläche und zeigt, daß die roten Test-Blutkörperchen das Antigen enthalten, das zu dem an die Zellmonoschicht sensibilisierten Antikörper komplementär ist. Eine negative Reaktion bildet einen diskreten Klumpen roter Blutkörperchen am Boden der Vertiefung, die keine Adhäsion zeigt. Auf diese Weise kann der Phenotyp von roten Test-Blutkörperchen bestimmt werden.
- Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um eine Mikrotiterplatte herzustellen für den Nachweis von unerwarteten Antikörpern gegen Human-Erythrozyten durch einen Enzymverknüpften Immunoabsorbens-Assay (ELISA). Die Mikroplatte wird wie in Beispiel 1 hergestellt. Um unerwartete Antikörper in einer Probe von Testserum- oder -plasma nachzuweisen, wird ein Tropfen eines solchen Serums oder Plasmas zu jeder Vertiefung getrockneter Erythrozyten zugegeben, gefolgt von 2 Tropfen einer Lösung niedriger Ionenstärke. Diese Lösungen werden 45 Minuten lang bei 37ºC in den Vertiefungen inkubieren gelassen. Nach der Inkubationszeit werden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte viermal mit Salzlösung gewaschen, vorzugsweise mittels einer automatischen Waschvorrichtung. Zu jeder Vertiefung werden 100 ul einer Lösung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Human-IGG zugegeben. Die Lösung von Enzym-konjugiertem Anti-IGG wird 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Der konjugierte Anti-Human-IGG wird immunologisch in denjenigen Vertiefungen binden, in denen IgG aus der Testprobe an die getrocknete Monoschicht roter Zellen (positiver Test) gebunden hat und im folgenden Waschschritt nicht weggewaschen wurde. Der konjugierte Anti-Human-IGG in einer negativen Vertiefung (kein IGG aus der Testprobe hat an die getrocknete Monoschicht roter Zellen gebunden) bindet nicht und wird im folgenden Waschschritt weggewaschen. Die Vertiefungen der Mikroplatten werden viermal mit Salzlösung gewaschen. 100 ul einer Lösung des Enzymsubstrats, umfassend 1,0 mg/ml p-Nitrophenolphosphat (PNPP) in 10% Diethanolamin-dH&sub2;O, wird zu den Vertiefungen zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Extinktion der Vertiefungen bei 405 nm durch ein Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen. Das Enzym alkalische Phosphatase, das in einer positiven Vertiefung an den Anti-Human-IgG konjugiert ist, spaltet das PNPP-Substrat enzymatisch, was eine gelbgrüne Farbe ergibt, die mit dem Auge oder mit einem Spektrophotometer bei 405 nm sichtbar ist. In einer negativen Vertiefung (kein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Anti-IGG anwesend) wird das PNPP-Substrat nicht enzymatisch abgebaut und erscheint visuell klar.
- Aus dem vorangegangenen ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung eine Vertiefung repräsentiert, die adaptiert ist, um alle oben angegebenen Aufgaben und Ziele zu erreichen.
- Es ist zu betonen, daß bestimmte Merkmale und Subkombinationen geeignet sind und ohne Bezug auf andere Merkmale und Subkombinationen eingesetzt werden können. Dies ist im Sinne und innerhalb des Umfangs der Ansprüche.
- Da viele Ausführungsformen der Erfindung möglich sind, ohne über deren Umfang hinauszugehen, ist zu betonen, daß alle hier ausgeführten Gegenstände nur erläuternd und nicht beschränkend zu verstehen sind.
Claims (19)
1. Verfahren zur Trocknung ganzer Säugerzellen auf einem
Festphasen-Träger, welches umfaßt die Schritte:
Immobilisieren der Zellen auf dem Träger, wobei die
Antigenizität der Zellen im wesentlichen intakt bleibt;
Lysieren der immobilisierten Zellen;
Inkontaktbringen der lysierten, immobilisierten
Zellen mit einer wäßrigen trocknenden Lösung, welche ein
Salz und einen aus Monosacchariden, Disacchariden,
Trisacchariden und Cyclitolen ausgewählten Zucker umfaßt;
und
Entfernen der trocknenden Lösung aus dem Kontakt
mit den immobilisierten Zellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die immobilisierten
Zellen durch die Zugabe von deionisiertem Wasser oder
einer Salzlösung lysiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der
Festphasen-Träger aus einem organischen Polymer oder Glas
gefertigt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Träger aus
Reagenzgläsern, Mikrotiterplatten, Perlen, Folien und Membranen
ausgewählt ist.
5. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der Zucker D-(-)Glucose, Sucrose, D-(-)- oder D-
(+)Xylose, myo-Inosit, D-(+)Cellobiose oder L-(-)Sorbose
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Zucker D- (-)Glucose
ist.
7. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das Salz Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder
Natriumphosphat ist.
8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die trocknende Lösung den Zucker in einer
Konzentration von 0,1 M - 3,0 M und das Salz in einer
Konzentration von 50 - 377 mM, z.B. 154 mM Natriumchlorid,
enthält.
9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die trocknende Lösung zu dem Festphasen-Träger in
einer Menge zugegeben wird, welche die immobilisierten
Zellen vollständig bedeckt.
10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der Entfernungsschritt das Dekantieren der
trocknenden Lösung von dem Träger und das Einbringen des
Festphasen-Trägers in einen versiegelten Behälter mit einem
darin befindlichen Trocknungsmaterial umfaßt.
11. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die Säugerzellen Erythrozyten, Blutplättchen,
Leukozyten, Lymphozyten oder Gewebezellen sind.
12. Artikel, geeignet zur Durchführung von immunologischen
Assays in fester Phase, umfassend
einen Festphasen-Träger;
eine Beschichtung eines organischen Farbstoffs mit
einer positiven Nettoladung und einer hydrophoben
aromatischen Ringstruktur, der an den Träger adsorbiert ist;
und
auf dem organischen Farbstoff immobilisiert eine
getrocknete Monoschicht, die ganze Säugerzellen mit im
wesentlicher intakter Immunogenizität, ein Salz wie in
Anspruch 1 oder Anspruch 7 definiert, und einen Zucker,
wie in irgendeinem der Ansprüche 1, 5 oder 6 definiert,
umfaßt.
13. Artikel nach Anspruch 12, worin die Zellen wie in
Anspruch 11 definiert sind.
14. Artikel nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin der
organische Farbstoff ausgewählt ist aus Azofarbstoffen,
Diazoniumsalzen, Tetrazoniumsalzen, Tetrazoliumsalzen,
Triphenylmethanen, Xanthenen, Acridinen, Chinolinen,
Thiazolen, Indaminen, Azinen, Aminoazinen, Thiazinen und
Phthalocyaninen.
15. Artikel nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, worin
der Festphasen-Träger wie in Anspruch 3 oder Anspruch 4
definiert ist.
16. Assay in fester Phase für die Anwesenheit einer
immunologisch reaktiven Komponente in einem biologischen Fluid,
umfassend das
Inkontaktbringen des biologischen Fluids mit einer
festen Oberfläche, auf der sich eine getrocknete
Monoschicht wie in irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15
definiert befindet, wobei die Zellen Antigene auf ihren
Zelloberflächen repräsentieren;
Entfernen des biologischen Fluids aus dem Kontakt
mit den Zellen, wobei die Antigenizität der Zellen im
wesentlichen erhalten bleibt; und die
Analyse des Trägers hinsichtlich der Adhäsion oder
mangelnden Adhäsion der immunologisch reaktiven
Komponente an den Zellen.
17. Assay nach Anspruch 16, worin das biologische Fluid
Plasma, eine Lösung roter Blutkörperchen oder eine
Blutplättchen-Lösung umfaßt.
18. Assay nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, umfassend den
zusätzlichen vorgelagerten Schritt der Sensibilisierung
der Monoschicht mit einem bekannten Antiserum, um das
Antiserum an sein komplementäres Antigen auf der
Zelloberfläche zu binden.
19. Assay nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18, worin die
Analyse eine Technik der Adhäsion roter Zellen, einen
Enzym-verknüpften Immunosorbens-Assay, Radioimmunoassay
oder Immunfluoreszenz umfaßt.
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| US07/267,014 US5030560A (en) | 1988-11-04 | 1988-11-04 | Method for drying mammalian cells for use in solid phase immunoassays and articles incorporating same |
Publications (2)
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Families Citing this family (37)
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